專利名稱：臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種物質(zhì)在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用，更具體地說它是臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大量的醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明成纖維細胞的增殖和膠原合成具有正性調(diào)控效應(yīng)，它們在瘢痕的形成中具有重要作用，正常的真皮成纖維細胞中某種生長因子及其受體為陰性或低表達，現(xiàn)已證實胎兒創(chuàng)傷的無疤痕愈合與轉(zhuǎn)移生長因子β(TGFβ)的缺乏直接有關(guān)。相反成年人的皮膚創(chuàng)傷后，愈合的纖維化瘢痕特性又與TGFβ的過量和I、III前膠原mRNA表達增強相關(guān)。增生性瘢痕成纖維母細胞在傷口愈合時，如果過分活化，分泌大量的TGF-β1，則會造成傷口中累積大量細胞間質(zhì)，愈合后疤痕顯著。某些對TGF-β1具有拮抗作用藥物能抑制瘢痕疙瘩的形成使這類藥物成為治療瘢痕疙瘩的有效藥物。在創(chuàng)傷愈合及纖維化疾病中應(yīng)用抗TGFβ的特殊療法可能成為減輕疤痕的形成的有效手段。但由于這類藥物往往又具有較強的毒付效應(yīng)，因而，其臨床應(yīng)用受到制約。新近有人用反義技術(shù)和RNA干擾技術(shù)等方法能有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的體外增殖，誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡，為應(yīng)用基因藥物方法改善創(chuàng)傷愈合提供了實驗依據(jù)。但基因治療技術(shù)尚不能完全為醫(yī)學(xué)工作者認同和患者所接受。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述背景技術(shù)的不足之處而提供一種臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用，它是一種經(jīng)濟、簡便、無毒副作用的全新皮膚傷口無疤痕愈合和無功能障礙的應(yīng)用技術(shù)。
本發(fā)明的目的是通過如下措施來達到的臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用，它是在無菌條件下采集健康孕婦娩出胎盤臍帶血血清，抗凝后放置-30℃冰箱內(nèi)保存，所述臍帶血血清在用于傷口瘢痕治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明方法簡便、經(jīng)濟、不抑制機體免疫功能，亦無TGF-b基因封閉所致的毒副作用。


圖1為血清作用下巨噬細胞TGF-beta I PT-PCR結(jié)果；圖2為血清作用下巨噬細胞TGF-betaR II PT-PCR結(jié)果；圖3為血清作用下巨噬細胞TGF-b受體II蛋白Western blot結(jié)果；圖4為本發(fā)明在體實驗的空白對照組和外周血清組實驗切口愈合后，在切口處取材切片，經(jīng)HE染色后鏡下觀察到的組織學(xué)變化圖，可見組織中纖維母細胞和細胞外基質(zhì)(炎癥細胞、膠原纖維和新生血管)明顯多于臍帶血清組(圖5)。
圖5為本發(fā)明在體實驗的臍帶血清組實驗切口愈合后，在切口處取材切片，經(jīng)HE染色后鏡下觀察到的組織學(xué)變化圖，可見臍血處理組傷口愈合組織中纖維母細胞和細胞外基質(zhì)(炎癥細胞、膠原纖維和新生血管)較空白對照組和外周血清組(圖4)明顯減少。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和相關(guān)實驗對本發(fā)明作進一步說明。
1.離體實驗采用小鼠RAW264.7巨噬細胞株為TGF-beta及其受體表達模型，細胞常規(guī)培養(yǎng)后接種于6孔板，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時后，按下列分組進行實驗空白對照、LPS(100ng/ml)、10％臍帶血清組。10％臍帶血清作用1小時后，加入LPS(100ng/ml)，4小時后，Trizol(Invitrogen)法提取細胞總RNA。經(jīng)紫外分光光度法定量后，取4ugRNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取1ulcDNA作為模板進行PCR，以actin為內(nèi)參，觀察各組TGF-beta及其受體的基因表達情況(結(jié)果見圖1、圖2)。
從圖1可知正常RAW264.7巨噬細胞TGF-b mRNA呈強表達；LPS輕度抑制TGF-b mRNA表達；臍血血清明顯抑制上述兩種狀況巨噬細胞TCF-b mRNA表達。
從圖2可知正常RAW264.7巨噬細胞TGF-b受體IImRNA呈強表達；LPS對RAW264.7巨噬細胞TGF-b受體IImRNA呈強表達幾無影響。臍血血清明顯抑制上述兩種狀況巨噬細胞TGF-b受體II mRNA表達。
小鼠RAW264.7巨噬細胞株常規(guī)培養(yǎng)后接種于6cm培養(yǎng)皿，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時后，按上述分組進行實驗。
24小時后提取細胞總蛋白，用于western blot檢測炎癥因子COX-2及TGF-beta受體II蛋白表達水平的檢測。(結(jié)果見圖3)
從圖3可知正常RAW264.7巨噬細胞TGF-b受體II蛋白呈強表達；LPS對RAW264.7巨噬細胞TGF-b受體II蛋白表達幾無影響。臍血血清明顯抑制上述兩種狀況巨噬細胞TGF-b受體II蛋白的表達。
2.在體實驗選取雄性SD大鼠24只，隨機分為3組(每組8只)空白對照組、外周血清組及臍帶血清組。3％戊巴比妥(3mg/kg)肌肉注射麻醉，背部剪毛后，于無菌條件下，在背部正中作1cm長與脊柱平行的切口，深達筋膜?？瞻讓φ战M切口內(nèi)注入0.2ml生理鹽水；外周血清組切口內(nèi)注入0.2ml健康孕婦外周血清；臍帶血清組切口內(nèi)注入0.2ml臍帶血清。3-0絲線縫合切口，術(shù)后一周每日肌注2萬單位青霉素。4周后處死動物，肉眼觀察切口愈合情況及疤痕大小，切口處取材切片HE染色，鏡下觀察切口處組織學(xué)變化。(結(jié)果見圖4、圖5)從圖4-1、4-2可知臍血處理組傷口愈合組織中纖維母細胞和細胞外基質(zhì)(炎癥細胞、膠原纖維和新生血管)較對照組明顯減少。
我們根據(jù)胎兒創(chuàng)傷的無疤痕愈合現(xiàn)象得到啟示，創(chuàng)造性研究出臍帶血減輕疤痕的形成的有效方法。體外實驗證實臍帶血能更加有效的抑制巨噬細胞TGFβ的表達，下調(diào)TGFβ受體；在體實驗證實傷口局部注射臍帶血能有效抑制I、III前膠原mRNA表達增強，減少瘢痕形成。從而為成年人的皮膚無疤痕愈合創(chuàng)造了一種全新方法。
本方法通過一次性傷口局部注射適量臍帶血血清可有效減少傷口疤痕形成，切口處取材切片，經(jīng)HE染色證實傷口愈合組織中纖維母細胞和細胞外基質(zhì)(炎癥細胞、膠原纖維和新生血管)較對照組明顯減少。離體實驗證實臍帶血清可有效減少巨噬細胞TGF-b及其受體基因表達，下調(diào)TGF-b受體II。我們認為臍帶血清可能主要通過抑制相關(guān)細胞TGF-b及其受體表達，進而抑制膠原纖維和新生血管生成，從而減少傷口疤痕形成。本方法較通過抑制免疫或封閉TGF-b基因等方法具有很大優(yōu)勢方法簡便、經(jīng)濟、不抑制機體免疫功能，亦無TGF-b基因封閉所致的毒副作用。
權(quán)利要求
1.臍帶血血清在制備用于治療傷口瘢痕藥物中的應(yīng)用。
2.一種用于治療傷口瘢痕的藥物，其特征在于它是在無菌條件下采集的健康孕婦娩出的胎盤臍帶血血清。
3.制備權(quán)利要求2所述治療傷口瘢痕藥物的方法，包括以下步驟a.在無菌條件下采集健康孕婦娩出胎盤的臍帶血血清；b.抗凝后放置-30℃保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
臍帶血血清在治療傷口瘢痕中的應(yīng)用，它是在無菌條件下采集健康孕婦娩出胎盤臍帶血血清，抗凝后放置－30℃冰箱內(nèi)保存，所述臍帶血血清可用于治療傷口瘢痕。它克服了現(xiàn)有藥物具有較強的毒副效應(yīng)，因而，其臨床應(yīng)用受到制約的不足；本發(fā)明方法簡便、經(jīng)濟、不抑制機體免疫功能。為皮膚創(chuàng)傷無疤痕愈合創(chuàng)造了一種全新方法。
文檔編號A61P17/02GK1795872SQ200410061470
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者葉篤筠 申請人:華中科技大學(xué)