專利名稱：一種核酸轉運載體和核酸轉運系統(tǒng)及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及核酸轉運系統(tǒng)及其應用領域，尤其是載體材料在基因工程技術和生物醫(yī)藥等領域的應用。
背景技術：
核酸轉運系統(tǒng)是實現核酸轉運和核酸治療的關鍵，適宜的核酸載體可將目的核酸安全、高效、可控、簡便地轉運至細胞或細菌，實現其生物學作用。而與核酸載體相關的免疫反應，細胞毒性與安全性問題是核酸應用領域急待解決的問題之一。介導核酸轉運的載體一般有病毒載體和非病毒載體兩種，其中病毒載體占主要地位。但由于病毒載體系統(tǒng)具有無法避免地缺點，如病毒本身地免疫反應和自身毒性等，越來越多的研究者開始重視非病毒載體系統(tǒng)。而非病毒型核酸載體也并非沒有缺點。例如正電荷脂質體血漿清除率偏快，核酸信息攜帶量偏少，且具有一定的免疫原性和毒性。隨著科技發(fā)展，微粒、納米?；蚓酆衔锍霈F在非病毒載體領域。其具有核酸信息攜帶量大、靶向性強、穩(wěn)定性好、易于控制等特點。但仍存在問題，例如無機納米粒不能在體內降解；某些有機聚合物具有免疫原性等。且大部分聚合物在轉運基因時可表現出較好效果，一旦用于寡核苷酸和RNA的轉運，仍存在不能有效保護核酸和效率低下等缺點。因此，人們仍在繼續(xù)對新型核酸轉運系統(tǒng)的研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的任務是提供一種新的核酸轉運系統(tǒng)，其具有良好的靶向性、穩(wěn)定性和生物相容性，同時還具有核酸信息攜帶量大、宿主免疫原性低、無毒副作用、材料易得、成本低廉等特點，特別適宜用于寡核苷酸和RNA的轉運。本發(fā)明還同時提供了該核酸轉運系統(tǒng)的制備方法。
本發(fā)明提供的核酸轉運載體由殼聚糖構成。本發(fā)明的實質貢獻在于殼聚糖作為核酸轉運載體之應用為。殼聚糖與被轉運核酸的聚合物構成本發(fā)明核酸轉運系統(tǒng)。
本發(fā)明核酸轉運系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟a.將殼聚糖溶于濃度為1％至5％的鹽酸、谷氨酸、醋酸或檸檬酸中，制備濃度為0.5％殼聚糖稀酸溶液，再用氫氧化鈉調pH到5.5，然后用1％醋酸溶液將其稀釋至0.02％，再調一次pH至5.5，過慮除菌得0.02％殼聚糖稀酸溶液；b.將被轉運核酸溶于水溶液或10至50mM硫酸鈉溶液制備濃度為200μg/ml的核酸溶液；c.將以上步驟制得的0.02％殼聚糖稀酸溶液和濃度為200μg/ml的核酸溶液以體積比0.125∶1至10∶1的比例混合，優(yōu)選為1∶1的體積比混合，在合適條件下使殼聚糖與核酸發(fā)生聚合反應，得到含有殼聚糖-核酸聚合物的溶液。
進一步將以上所得的含有殼聚糖-核酸聚合物溶液經離心或真空冷凍干燥后可得到殼聚糖-核酸聚合物。
殼聚糖稀酸溶液與核酸溶液的混合方式是將核酸溶液逐滴加入殼聚糖溶液中，或者將殼聚糖溶液和核酸溶液分別同時置55℃水浴30分鐘，將核酸溶液迅速吸出加入殼聚糖溶液；使殼聚糖與核酸發(fā)生聚合反應的合適條件是置殼聚糖稀酸溶液與核酸溶液的混合溶液于搖床上以500rpm搖1小時，或者將殼聚糖稀酸溶液與核酸溶液的混合溶液渦流振蕩1分鐘。
殼聚糖是由葡萄糖胺單體及N-乙酰基葡萄糖胺單體按不同比例聚合形成的多糖，由于葡萄糖胺單體上有游離的氨基，故帶有正電荷，其pKa值為6.5。當PH在6以下時，殼聚糖才能溶解，其一級氨基會質子化。帶有正電荷的殼聚糖和帶有負電荷的核酸會形成聚合物，且?guī)в姓姾桑着c帶負電荷的細胞結合〔參見L.Illum，I.Jabbal-Gill，M.Hinchcliffe，A.N.Fisher，S.S.Davis，Chitosan as a novel nasal delivery system for vaccines，Advanced DrugDelivery Reviews 51(2001)81-96)。根據方法不同，通過復凝聚法形成的殼聚糖-核酸聚合物直徑分別在在1微米至1.5微米之間或100-500納米之間。殼聚糖和核酸結合后可以保護核酸免受酶的降解，增加核酸的穩(wěn)定性。
本發(fā)明利用殼聚糖作為載體制備核酸轉運系統(tǒng)。利用復凝聚法、離子膠凝法或共價交聯法等方法，殼聚糖和核酸在一定條件下形成殼聚糖-核酸聚合物。
本發(fā)明提供兩種殼聚糖-核酸聚合物的制備方法。
第一種包括以下步驟a.將殼聚糖溶于1％醋酸溶液得到0.5％殼聚糖溶液，攪拌24小時使其完全溶解；b.加入等體積1％的氨水，使溶解的殼聚糖沉淀，過濾，真空冷凍干燥得到殼聚糖沉淀物；c.將干燥后所得殼聚糖重復步驟a得0.5％殼聚糖溶液；d.用氫氧化鈉調PH到5.5，然后用1％醋酸溶液將其稀釋至0.02％，再調一次PH至5.5，過慮除菌；e.將被轉運的核酸溶于10mM硫酸鈉溶液中使其終濃度為200μg/ml；f.將等體積核酸溶液逐滴加入殼聚糖溶液中，置混和溶液于搖床上以500rpm搖1小時；g.將混和溶液12000rpm離心10分鐘以收集微粒得殼聚糖與被轉運核酸的聚合物。
第二種包括以下步驟a.將殼聚糖溶于1％醋酸溶液得到1％的殼聚糖溶液，攪拌24小時使其完全溶解b.加入等體積1％的氨水，使溶解的殼聚糖沉淀，過濾，真空冷凍干燥得到殼聚糖沉淀物c.將干燥后所得殼聚糖重復步驟a得0.5％殼聚糖溶液d.用氫氧化鈉調PH到5.5，然后用1％醋酸溶液將其稀釋至0.02％，再調一次PH至5.5，過慮除菌e.將需轉運的核酸溶于10mM硫酸鈉溶液，終濃度為200μg/mlf.等體積的殼聚糖溶液和核酸溶液同時置55℃水浴30分鐘g.將核酸溶液迅速吸出加入殼聚糖溶液，渦流振蕩1分鐘，得到殼聚糖-核酸聚合物溶液以殼聚糖作為核酸轉運載體，可把目的核酸帶入各種細胞或細菌，實現其生物學功能。殼聚糖-核酸聚合物作為核酸轉運系統(tǒng)，其應用包括(1)殼聚糖-寡核苷酸聚合物抗細菌作用選擇對細菌的生長和毒力具有重要作用的基因，人工合成若干與該基因反義配對的寡核苷酸，制備殼聚糖-寡核苷酸聚合物，與細菌共培養(yǎng)，細菌的生長受到明顯抑制，毒力下降。結果表明殼聚糖-寡核苷酸聚合物能有效幫助寡核苷酸進入細菌，并實現寡核苷酸的生物學功能。
(2)殼聚糖-iRNA聚合物提高iRNA免疫活性iRNA是一類來自免疫器官并能傳遞免疫功能的RNA，但進入人體后極易受人體內RNase降解而失去活性，因此其免疫活性仍有爭議。制備殼聚糖-iRNA聚合物致敏動物，發(fā)現動物的免疫功能增強。結果表明殼聚糖-iRNA聚合物能夠有效保護iRNA免受RNase降解，增強其免疫活性。
(3)殼聚糖-發(fā)夾狀RNA聚合物的抗病毒效應21-23nt的發(fā)夾狀RNA可以引發(fā)轉錄后的基因沉默，但需要合適的載體將其導入細胞。以殼聚糖為轉運載體制備殼聚糖-發(fā)夾狀RNA聚合物，與被病毒感染的細胞共培養(yǎng)，發(fā)現病毒的靶基因沉默，相應的蛋白質水平明顯降低。說明殼聚糖-發(fā)夾狀RNA聚合物能將發(fā)夾狀RNA有效導入細胞，并具有良好的靶向性。
與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于1、本發(fā)明所用原材料為殼聚糖，是一種天然的生物材料，無毒性，無副作用，是一種綠色環(huán)保型核酸載體，使用者易于接受。
2、本方法制備殼聚糖-核酸聚合物，相比其他聚合物的制備方法，具有時間更短，方法更為簡便(比如與多酰胺基樹枝狀分子等陽離子聚合物相比)，粒徑均勻，分散性好〔見圖1〕等優(yōu)點。
3、以殼聚糖制備聚合物，易于修飾殼聚糖的某些基團，進一步提高聚合物的穩(wěn)定性及轉運效率。
4、與傳統(tǒng)核酸載體比較，殼聚糖聚合物的核酸攜帶大，效率高，無免疫原性，無細胞毒性，且具有生物可降解性等優(yōu)點〔參見S.Hirano，H.Seino，Y.Akiyama，I.Nonaka，Biocompatibility of chitosan by oral and intravenous administration，Polym.Eng.Sci.(1998)897-901〕。
5、該發(fā)明制備工藝簡單，設備要求不高，反應時間短，條件溫和，易于操作。而且材料易得，成本低廉(殼聚糖廣泛存在于蟹蝦等水產品中)。


圖1為在原子力顯微鏡下顯示的殼聚糖-質粒DNA聚合物的形態(tài)，由圖可見殼聚糖-質粒DNA聚合物呈球形，直徑在100-200nm之間，在溶液中均勻分布。
圖2為聚合物粒徑分布圖。該圖是用ZetaPALS無機/有機多功能Zeta電位/粒度分析儀測定的殼聚糖-RNA聚合物的粒徑大小，由圖可見殼聚糖-iRNA聚合物的平均粒徑132.6nm。
圖3為聚合物表面電位分布圖。該圖是用ZetaPALS無機/有機多功能Zeta電位/粒度分析儀測定的殼聚糖-RNA聚合物的表面電位，由圖可見殼聚糖-iRNA聚合物的平均表面電位+12.8mv。
圖4為殼聚糖-質粒DNA聚合物酶保護試驗結果第1條帶未和殼聚糖結合的寡核苷酸；第2條帶寡核苷酸在0.1μg DNase I作用15分鐘后，有明顯降解；第3條帶寡核苷酸與1μg DNase I反應15min后被完全降解；第4條帶殼聚糖-寡核苷酸聚合物；第5條帶聚合物與0.1μg DNase I反應15min后，聚合物中的寡核苷酸未發(fā)生明顯降解；第6條帶聚合物與1μg DNase I反應15min后，聚合物中的寡核苷酸部分被降解聚合物與1μg DNase I反應15min后，聚合物中的寡核苷酸部分被降解結果顯示殼聚糖起到了保護寡核苷酸不受DNase I降解的作用。顯示本發(fā)明核酸載體有效保護核酸免受酶的降解。
圖5為殼聚糖-寡核苷酸聚合物對結核桿菌菌落數的影響(cfu為菌落形成單位)，即結核桿菌在本發(fā)明提供的殼聚糖-寡核苷酸聚合物存在下的細菌存活率，表明殼聚糖-寡核苷酸聚合物能有效幫助反義寡核苷酸進入結核桿菌，抑制基因的表達，從而細菌的生長受到抑制。
具體實施例方式
實施例一殼聚糖-寡核苷酸聚合物的制備(一)殼聚糖溶液的制備1、稱量殼聚糖溶于1％的醋酸溶液，得到殼聚糖含量1％的溶液，攪拌24小時使其完全溶解。
2、在所得溶液中加入等體積1％氨水，使溶解的殼聚糖沉淀出來，過濾；沉淀置-80℃預冷過夜，然后真空冷凍干燥沉淀；再溶于1％的醋酸溶液(這一步可選，有條件最好做，主要是去除殼聚糖里面的蛋白等雜質)。
3、用氫氧化鈉調PH至5.5。
4、用1％醋酸溶液稀釋至濃度為0.02％，然后再次調PH至5.5。
5、在無菌室中過濾除菌，置于4℃冷藏。
(二)寡核苷酸溶液的制備將寡核苷酸200μg/ml溶液和等體積10mM的硫酸鈉溶液混合，使溶液的寡核苷酸終濃度為100μg/ml，硫酸鈉的終濃度為5mM。
(三)制備殼聚糖-寡核苷酸聚合物1、殼聚糖和寡核苷酸溶液各200μl，置55℃水浴30分鐘。
2、用無菌TIP頭將寡核苷酸溶液迅速吸出加入殼聚糖溶液中，渦流振蕩1分鐘，得到殼聚糖-寡核苷酸聚合物溶液，經真空冷凍干燥后得到殼聚糖-核酸聚合物。
實施例二殼聚糖-RNA聚合物的制備(一)殼聚糖溶液的制備1、稱量殼聚糖溶于1％的醋酸溶液，得到殼聚糖含量1％的溶液，攪拌24小時使其完全溶解。
2、在所得溶液中加入等體積1％氨水，使溶解的殼聚糖沉淀出來，過濾；沉淀置-80℃預冷過夜，然后真空冷凍干燥沉淀；再溶于1％的醋酸溶液(這一步可選，有條件最好做，主要是去除殼聚糖里面的蛋白等雜質)。
3、用氫氧化鈉調PH至5.5。
4、用1％醋酸溶液稀釋至濃度為0.25％，然后再次調PH至5.5。
5、在無菌室中過濾除菌，置于4℃冷藏。
(二)RNA溶液的制備將RNA溶于20％硫酸鈉溶液中，RNA終濃度為200μg/ml(三)制備殼聚糖-RNA聚合物將等體積RNA溶液逐滴加入殼聚糖溶液中，然后置混和溶液于搖床上以500rpm搖1小時，最后將混和溶液12000rpm離心10分鐘以收集微粒得到殼聚糖-RNA聚合物。
實施例三殼聚糖-寡核苷酸聚合物在抑制結核桿菌方面的應用。
1、ino1基因是對結核桿菌生長和毒力具有重要作用的基因，選擇結核桿菌ino1基因為想要抑制的基因。
2、在Genebank上查得ino1基因的全序列。根據OLIGO-5 SECONDARY STRUCTURE ANALYSIS軟件設計出4段反義寡核苷酸。序列如下5’-CGACGGGCTCCGCGTCGGAG-3’，5’-TCGGTGAACTTCTTGGCCCA-3’，5’-CTTGGAGATCTTCTTGGACT-3’，5’-TTGGCGATCTTGGCCGCCCG-3’。
3、將殼聚糖和反義寡核苷酸按方法一制成殼聚糖-寡核苷酸聚合物。
4、將聚合物用PBS溶解為0.5mg/ml后加入培養(yǎng)有結核桿菌的培養(yǎng)液中，共同培養(yǎng)2-4周。
5、取少量菌液經過足夠稀釋，涂于培養(yǎng)皿中得固體培養(yǎng)基上，2周后計數菌落數。結果參見圖5。結果表明殼聚糖-寡核苷酸聚合物能有效幫助反義寡核苷酸進入結核桿菌，抑制基因的表達，從而細菌的生長受到抑制。
實施例四殼聚糖-iRNA聚合物提高iRNA免疫活性實驗(一)體內白細胞粘附抑制(LAI)試驗1、選擇抗乙肝免疫核糖核酸，配制成所需濃度的溶液。
2、和殼聚糖溶液按前述方法二制成殼聚糖-iRNA聚合物溶液。
3、小白鼠30只，體重28～34g，雌性，隨機分4組，腋下和腹股溝皮下多點注射藥物，每3天1次，共7次，30天后重復注射5次。
生理鹽水組生理鹽水1ml；殼聚糖組0.02％殼聚糖0.5ml+蒸餾水0.5ml；iRNA組iRNA溶液1ml(50μg)；殼聚糖-iRNA聚合物組聚合物1ml(含iRNA組50μg)。
4、末次注射48小時后，頸椎脫臼處死小鼠，制備脾細胞懸液。
5、分別測量各組白細胞粘附抑制率LAI。
結果參見表1。
表1、經殼聚糖-iRNA聚合物致敏的小鼠的白細胞粘附指數比較體內給藥小鼠LAI值(％，X±S)

F＝24.17，P＝0.00四組小鼠LAI值兩兩比較P值

表1為經殼聚糖-iRNA聚合物致敏的小鼠的白細胞粘附指數的比較。由表可見殼聚糖-iRNA聚合物試驗組的白細胞粘附抑制率高于其他三組，與其他各組差別均有顯著性。表明殼聚糖-iRNA聚合物能夠有效保護iRNA免受RNase降解，增強其免疫活性。
(二)利用乙型肝炎病毒表面抗體診斷試劑盒進行脾細胞識別HBsAg ELISA試驗取96孔板，按下述加樣，各組設5復孔上述四組小鼠脾細胞懸液50μl乙肝疫苗 50μl10％小牛血清RPMI-1640液 100μl②5％CO2、37℃培養(yǎng)2h，離心微孔板(1000g、15min)，輕輕棄去上清，加入含10％小牛血清的RPMI-1640液50μl；③設陽性對照孔(陽性血清50μl)和陰性對照孔(陰性血清50μl)，均設5復孔；④各孔內加入酶標記抗體50μl，輕拍混勻；⑤37℃孵育25min，室溫平衡5min；⑥用洗滌液洗滌后，離心后棄上清，重復5次，洗滌完后扣干(每次保持30-60s浸泡時間)；⑦向各孔內加入底物A、B各50μl，輕拍混勻，37℃暗置15min；⑧每孔加入終止液50μl，混勻；⑨酶標儀波長雙波長450/630nm測定各孔的OD值(A值)，按試劑盒標準判斷結果。
結果參見表2表2、小鼠脾細胞識別HBsAgELISA結果

表2為小鼠脾細胞識別HBsAgELISA結果，表明殼聚糖-iRNA聚合物組小鼠脾細胞吸附HBsAg能力明顯高于其他兩組，這一結果進一步說明了小鼠脾細胞已致敏，具有識別特異性抗原的能力，當二者相遇時，脾細胞識別吸附HBsAg，特異性結合，殼聚糖-iRNA聚合物致敏作用最強。
(三)體外白細胞粘附抑制試驗1、取健康小鼠1只，制備脾細胞懸液，96孔板中加樣
實驗孔，共3組殼聚糖-iRNA聚合物組健康小鼠脾細胞懸液 100μl乙肝疫苗50μl殼聚糖-iRNA聚合物 50μliRNA溶液組健康小鼠脾細胞懸液 100μl乙肝疫苗50μliRNA50μl0.02％殼聚糖組健康小鼠脾細胞懸液100μl乙肝疫苗50μl0.02％殼聚糖50μl對照孔各孔不加乙肝疫苗，健康小鼠脾細胞懸液100μl，用含10％小牛血清的RPMI-1640補足總體積至200μl。
2、分別測量各組白細胞粘附抑制率LAI。
結果顯示體外白細胞粘附抑制指數殼聚糖-iRNA納米粒的LAI為31.00％，iRNA納米粒的LAI為26.55％，殼聚糖的LAI為7.12％，殼聚糖-iRNA納米粒白細胞粘附抑制率高于其他組。
實施例五殼聚糖-發(fā)夾狀RNA聚合物抗病毒效應研究1、人乳頭瘤病毒(HPV)和宮頸癌的發(fā)生密切相關，且以HPV-16、18的E6和E7蛋白和腫瘤細胞的永生化相關性最強。因此在HPV-16的序列中選取前端為G的序列GAATAAATATGCTGTATGT作為靶基因。
2、用MEGAscriptTMRNAi試劑盒體外轉錄合成發(fā)夾狀RNA，序列如下5’-GAATCGATATGCTGTATGTTTCGACATACAGCATATCGATTCTTTT-3’。
3、另外設計單正義鏈GAATCGATATGCTGTATGTTTCGTTTT和單反義鏈ACATACAGCATATCGATTCTTTT作為對照。
4、配制殼聚糖溶液，按方法一制備殼聚糖-發(fā)夾狀RNA聚合物及殼聚糖-寡核苷酸聚合物。
5、將聚合物加入培養(yǎng)有人宮頸癌細胞株CaSKi的培養(yǎng)液中，72小時候收集細胞。
6、通過半定量RT-PCR和蛋白印跡法分別檢測殼聚糖-發(fā)夾狀RNA聚合物對HPV-16mRNA及蛋白表達的影響。結果見表3。
表3轉染質粒對HPV-E6 mRNA及蛋白表達的影響

注*與各組相比P＜0.05，**與各組相比P＜0.01表3為殼聚糖-發(fā)夾狀RNA聚合物對HPV-16mRNA及蛋白表達的影響。由表可見發(fā)夾狀序列組HPV-16mRNA及蛋白的水平明顯低于其他組，其差異具有統(tǒng)計學意義。表明殼聚糖-發(fā)夾狀RNA聚合物能將發(fā)夾狀RNA有效導入細胞，并具有良好的靶向性。
本發(fā)明所用到的核酸序列如下①5’-CGACGGGCTCCGCGTCGGAG-3’針對部分結核桿菌ino1基因的反義寡核苷酸序列1②5’-TCGGTGAACTTCTTGGCCCA-3’針對部分結核桿菌ino1基因的反義寡核苷酸序列2③5’-CTTGGAGATCTTCTTGGACT-3’針對部分結核桿菌ino1基因的反義寡核苷酸序列3④5’-TTGGCGATCTTGGCCGCCCG-3’針對部分結核桿菌ino1基因的反義寡核苷酸序列4⑤5’-GAATCGATATGCTGTATGTTTCGTTTT-3’針對部分人乳頭瘤病毒(HPV)-16的單正義鏈⑥5’-ACATACAGCATATCGATTCTTTT-3’針對部分人乳頭瘤病毒(HPV)-16的單反義鏈⑦5’-GAATCGATATGCTGTATGTTTCGACATACAGCATATCGATTCTTTT-3’針對部分人乳頭瘤病毒(HPV)-16的發(fā)夾狀RNA以上序列前6條均為人工合成，第7條為體外轉錄形成。
以下為上述核酸序列之序列表。
序列表<110>華中科技大學同濟醫(yī)學院<120>一種核酸轉運載體和核酸轉運系統(tǒng)及其應用<130>1<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Mycobacterium tuberculosis<400>1cgacgggctc cgcgtcggag 20<210>2<211>20<212>DNA<213>Mycobacterium tuberculosis<400>2tcggtgaact tcttggccca 20<210>3<211>20<212>DNA<213>Mycobacterium tuberculosis<400>3cttggagatc ttcttggact 20<210>4<211>20<212>DNA<213>Mycobacterium tuberculosis<400>4ttggcgatct tggccgcccg 20<210>5<211>27<212>DNA<213>Human papillomavirus<400>5gaatcgatat gctgtatgtt tcgtttt 27<210>6<211>23<212>DNA<213>Human papillomavirus<400>6acatacagca tatcgattct ttt 23<210>7<211>46<212>DNA<213>Human papillomavirus<400>7gaatcgatat gctgtatgtt tcgacataca gcatatcgat tctttt4權利要求
1.一種核酸轉運載體，其特征在于它是殼聚糖。
2.殼聚糖作為核酸轉運載體之應用。
3.一種核酸轉運系統(tǒng)，其特征在于它是殼聚糖與被轉運核酸的聚合物。
4.權利要求3所述核酸轉運系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟a.將殼聚糖溶于濃度為1％至5％的鹽酸、谷氨酸、醋酸或檸檬酸中，制備濃度為0.5％殼聚糖稀酸溶液，再用氫氧化鈉調pH到5.5，然后用1％醋酸溶液將其稀釋至0.02％，再調一次pH至5.5，過慮除菌得0.02％殼聚糖稀酸溶液；b.將被轉運核酸溶于水溶液或10至50mM硫酸鈉溶液制備濃度為200μg/ml的核酸溶液；c.將以上步驟制得的0.02％殼聚糖稀酸溶液和濃度為200μg/ml的核酸溶液以體積比0.125∶1至10∶1的比例混合，在合適條件下使殼聚糖與核酸發(fā)生聚合反應，得到含有殼聚糖-核酸聚合物的溶液。
5.權利要求3所述核酸轉運系統(tǒng)的制備方法，其特征在于將權利要求4所得的含有殼聚糖-核酸聚合物溶液經離心或真空冷凍干燥后得到殼聚糖-核酸聚合物。
6.根據權利要求3所述核酸轉運系統(tǒng)的制備方法，其特征在于殼聚糖溶液和核酸溶液是以1∶1的體積比混合。
7.權利要求4所述核酸轉運系統(tǒng)的制備方法，其特征在于所述的殼聚糖稀酸溶液與核酸溶液的混合方式是將核酸溶液逐滴加入殼聚糖溶液中；所述使殼聚糖與核酸發(fā)生聚合反應的合適條件是置殼聚糖稀酸溶液與核酸溶液的混合溶液于搖床上以500rpm搖1小時。
8.權利要求4所述核酸轉運系統(tǒng)的制備方法，其特征在于所述的殼聚糖稀酸溶液與核酸溶液的混合方式是將殼聚糖溶液和核酸溶液分別同時置55℃水浴30分鐘，將核酸溶液迅速吸出加入殼聚糖溶液；所述使殼聚糖與核酸發(fā)生聚合反應的合適條件是將殼聚糖稀酸溶液與核酸溶液的混合溶液渦流振蕩1分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種核酸轉運載體和以該轉運載體為基礎的核酸轉運系統(tǒng)及其制備方法。本發(fā)明提供的核酸轉運載體由殼聚糖構成；本發(fā)明提供的核酸轉運系統(tǒng)為殼聚糖與被轉運核酸的聚合物。本發(fā)明核酸轉運載體和以其為基礎構建的核酸轉運系統(tǒng)具有良好的靶向性、穩(wěn)定性和生物相容性，同時還具有核酸信息攜帶量大、宿主免疫原性低、無毒副作用、材料易得、成本低廉等特點，特別適宜用于寡核苷酸和RNA的轉運。
文檔編號A61K47/36GK1800408SQ200410061478
公開日2006年7月12日 申請日期2004年12月31日 優(yōu)先權日2004年12月31日
發(fā)明者徐順清, 李媛媛, 張紅菱, 孫納 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院