專利名稱：結(jié)核桿菌抗原融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及至少含有兩種結(jié)核桿菌抗原的融合蛋白。詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及含有兩種單一結(jié)核桿菌抗原的二體融合蛋白、含有三種結(jié)核桿菌抗原的三體融合蛋白、含有四種結(jié)核桿菌抗原的四體融合蛋白和含有五種結(jié)核桿菌抗原的五體融合蛋白，以及這些蛋白在結(jié)核病感染的診斷、治療和預(yù)防中的應(yīng)用。
2.背景技術(shù)結(jié)核病是一種由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病。它在發(fā)展中國家是一種主要的疾病，并且在世界上的發(fā)達(dá)地區(qū)也是一個(gè)日益嚴(yán)重的問題，它每年約導(dǎo)致800萬的新病例和300萬人的死亡。盡管其感染在相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)并不產(chǎn)生癥狀，但該疾病最常見的表現(xiàn)是肺部的急性炎癥，并導(dǎo)致發(fā)熱和無痰干咳。若不加治療，通常會導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥甚至死亡。
盡管結(jié)核病通?？衫脧V泛的抗生素療法來加以控制，但這種治療并不足以防止該疾病的傳播。有時(shí)被感染的個(gè)體并不表現(xiàn)出癥狀，但卻具有觸染性。此外，盡管遵守治療方案十分關(guān)鍵，但患者的行為卻難以監(jiān)控。一些患者沒有完成治療課程，這將會導(dǎo)致治療無效，甚至產(chǎn)生耐藥性。
為了控制結(jié)核病的傳播，針對該疾病的有效接種以及精確的早期診斷顯得至關(guān)重要。利用活細(xì)菌進(jìn)行接種是目前誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的最有效方法。用于此用途的最常見的分支桿菌是卡介苗(BCG)，它是牛型結(jié)核菌的一種無致病性菌株。但對BCG的安全性和有效性仍有爭議，而美國等一些國家則不用該制劑對公眾進(jìn)行接種。
結(jié)核病的診斷通常采用皮膚試驗(yàn)，該試驗(yàn)涉及將結(jié)核菌素PPD(純蛋白衍生物)暴露于真皮內(nèi)。抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答可在注射48-72小時(shí)后導(dǎo)致注射部位產(chǎn)生可測量的硬結(jié)。但該試驗(yàn)的靈敏性和特異性是一個(gè)問題，并且也不能把BCG接種的個(gè)體與感染的個(gè)體區(qū)分開來。
盡管巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為結(jié)核桿菌免疫的主要效應(yīng)物，但T細(xì)胞卻是這種免疫的主要誘發(fā)物。在由于與人免疫缺陷病毒(HIV)感染相關(guān)的CD4+T細(xì)胞缺失而導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合癥的患者中，利用結(jié)核桿菌的經(jīng)常出現(xiàn)可證明T細(xì)胞在預(yù)防結(jié)核桿菌感染中的基本作用。分支桿菌反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞是干擾素-γ(IFN-γ)的有效生產(chǎn)者，而IFN-γ在小鼠中又表現(xiàn)出可觸發(fā)巨噬細(xì)胞的抗分支桿菌效應(yīng)。IFN-γ在人體內(nèi)的作用還不是很清楚，但研究顯示，單獨(dú)使用或與IFN-γ或腫瘤壞死因子α聯(lián)合使用1，25-二羥基-維生素D3可激活人巨噬細(xì)胞來抑制結(jié)核桿菌感染。此外，已了解IFN-γ可刺激人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生1，25-二羥基-維生素D3。同樣，白細(xì)胞介素-12(IL-12)顯示出可在刺激對結(jié)核桿菌感染的抗性中發(fā)揮作用。欲對結(jié)核桿菌感染的免疫學(xué)進(jìn)行回顧，可參考Chan and Kaufmann，1994，結(jié)核病發(fā)病機(jī)理、保護(hù)與控制，Bloom(ed.)，ASM Press，Wshington，DC。
因此有必要將用于結(jié)核病診斷、預(yù)防和治療的疫苗及方法加以改進(jìn)。
3.發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及結(jié)核桿菌抗原的融合蛋白。詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及含有兩種或多種結(jié)核桿菌抗原的融合多肽、編碼這些多肽的多聚核苷酸，以及這些多肽和多聚核苷酸在結(jié)核桿菌感染的診斷、治療和預(yù)防中的使用方法。
在某種程度上，本發(fā)明的基礎(chǔ)是該發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有2-5種結(jié)核桿菌編碼序列的多聚核苷酸可產(chǎn)生能夠保持其單一組分的免疫原性和抗原性的重組融合蛋白。通過T細(xì)胞增殖測定發(fā)現(xiàn)，文中所述融合蛋白可誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答和B細(xì)胞應(yīng)答，并導(dǎo)致細(xì)胞因子和抗體的產(chǎn)生。而且還用一種融合蛋白作為免疫原與佐劑一同在體內(nèi)誘導(dǎo)對結(jié)核桿菌的細(xì)胞介導(dǎo)免疫和體液免疫。此外還由融合構(gòu)建體產(chǎn)生了一種融合蛋白，并將其與佐劑一同用在疫苗制劑中，以使動(dòng)物具有長期預(yù)防結(jié)核病產(chǎn)生的能力。與單一蛋白組分的混合物相比，融合蛋白是一種更有效的免疫原。
在本發(fā)明的一項(xiàng)具體實(shí)施方案中，分離或純化的本發(fā)明所述結(jié)核桿菌多肽可被配制成藥用組合物，用于為受試者給藥以預(yù)防和/或治療結(jié)核桿菌感染。通過加入一種佐劑可增強(qiáng)該融合蛋白的免疫原性。
作為本發(fā)明的另一方面，分離或純化的多聚核苷酸可用于重組融合多肽抗原的體外生產(chǎn)。作為選擇，也可將多聚核苷酸作為DNA疫苗直接向受試者給藥，以引起受試者的抗原表達(dá)，繼而誘導(dǎo)抗結(jié)核桿菌的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的另一目的是在體外測定中使用這些多肽來檢測抗結(jié)核桿菌的體液性抗體或細(xì)胞介導(dǎo)免疫，以診斷感染或監(jiān)控疾病的發(fā)展。此外，還可將多肽作為體內(nèi)診斷劑以真皮內(nèi)皮膚試驗(yàn)的形式加以使用。作為選擇，也可將多肽作為免疫原用于在非人類動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗結(jié)核桿菌抗體。這些抗體則可用于靶抗原的體內(nèi)和體外檢測。
4.


圖1A和1B三體融合蛋白Ra12-TbH9-Ra35(表示為Mtb32A)的核苷酸序列(序列編號1)和氨基酸序列(序列編號2)。
圖2三體融合蛋白Erd14-DPV-MTI(表示為Mtb39A)的核苷酸序列(序列編號3)和氨基酸序列(序列編號4)。
圖3A-3D三體融合蛋白TbRa 3-38kD-Tb38-1的核苷酸序列(序列編號5)和氨基酸序列(序列編號6)。
圖4A-4D二體融合蛋白TbH9-Tb38-1的核苷酸序列(序列編號7)和氨基酸序列(序列編號8)。
圖5A-5J四體融合蛋白TbRa 3-38kD-Tb38-1-DPEP(表示為TbF-2)的核苷酸序列(序列編號9)和氨基酸序列(序列編號10)。
圖6A和6B五體融合蛋白Erd14-DPV-MTI-MSL-MTCC2(表示為Mtb88f)的核苷酸序列(序列編號11)和氨基酸序列(序列編號12)。
圖7A和7B四體融合蛋白Erd14-DPV-MTI-MSL(表示為Mtb46f)的核苷酸序列(序列編號13)和氨基酸序列(序列編號14)。
圖8A和8B四體融合蛋白DPV-MTI-MSL-MTCC2(表示為Mtb71f)的核苷酸序列(序列編號15)和氨基酸序列(序列編號16)。
圖9A和9B三體融合蛋白DPV-MTI-MSL(表示為Mtb31f)的核苷酸序列(序列編號17)和氨基酸序列(序列編號18)。
圖10A和10B三體融合蛋白TbH9-DPV-MTI(表示為Mtb61f)的核苷酸序列(序列編號19)和氨基酸序列(序列編號20)。
圖11A和11B三體融合蛋白Erd14-DPV-MTI(表示為Mtb36f)的核苷酸序列(序列編號21)和氨基酸序列(序列編號22)。
圖12A和12B二體融合蛋白TbH9-Ra35(表示為Mtb59f)的核苷酸序列(序列編號23)和氨基酸序列(序列編號24)。
圖13A和13B二體融合蛋白Ra12-DPPD(表示為Mtb24)的核苷酸序列(序列編號25)和氨基酸序列(序列編號26)。
圖14A-14F當(dāng)六個(gè)PPD+受試者用兩種融合蛋白及其單一組分刺激時(shí)的T細(xì)胞增殖應(yīng)答。
圖15A-15F當(dāng)六個(gè)PPD+受試者用兩種融合蛋白及其單一組分刺激時(shí)的IFN-γ產(chǎn)生。
圖16A-16F用一種融合蛋白或其單一組分加佐劑免疫的小鼠的T細(xì)胞增殖。
圖17用一種融合蛋白或其單一組分加佐劑免疫的小鼠的IFN-γ產(chǎn)生。
圖18用一種融合蛋白或其單一組分加佐劑免疫的小鼠的IL-4產(chǎn)生。
圖19A-19F用一種融合蛋白或其單一組分加佐劑免疫的小鼠的血清抗體濃度。
圖20A-20C豚鼠經(jīng)結(jié)核桿菌氣霧劑攻擊后的存活率。融合蛋白Mtb32A和Mtb39A配制于佐劑SBAS1c(20A)、SBAS2(20B)或SBAS7(20C)中，并用作細(xì)菌誘發(fā)前豚鼠內(nèi)的免疫原。BCG作為陽性對照。
圖21A和21B融合蛋白TbH9-Tb38-1對TbH9特異性T細(xì)胞的增殖和IFN-γ產(chǎn)生的刺激作用。
圖22A和22B融合蛋白TbH9-Tb38-1對Tb38-1特異性T細(xì)胞的增殖和IFN-γ產(chǎn)生的刺激作用。
圖23A和23B融合蛋白TbH9-Tb38-1對預(yù)先顯示出對TbH-9抗原和Tb38-1抗原均產(chǎn)生應(yīng)答的T細(xì)胞的增殖和IFN-γ產(chǎn)生的刺激作用。
5.具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及具有治療和預(yù)防結(jié)核病用途的抗原、編碼這些抗原的多肽，及其使用方法。本發(fā)明所述抗原為結(jié)核桿菌抗原的融合多肽及其變異體。更明確而言，本發(fā)明所述抗原至少含有兩種結(jié)核桿菌多肽，并且這些多肽被融合成更大的融合多肽分子。本發(fā)明所述抗原可進(jìn)一步含有其它組分，這些組分經(jīng)設(shè)計(jì)可增強(qiáng)抗原的免疫原性，或可在其它方面對抗原加以改進(jìn)，如通過在抗原的一端加入一段組氨酸殘基來改進(jìn)這些抗原的分離。
5.1.結(jié)核桿菌特異性抗原圖1A-13B例證了本發(fā)明所述抗原，其中包括抗原的同源物和變異體。這些抗原可通過，例如，按下文所述加入銜接肽序列而被修飾。這些銜接肽可插入到構(gòu)成圖1A-13B所示各融合蛋白的一個(gè)或多個(gè)多肽之間。本發(fā)明的其它抗原包括與一種已知結(jié)核桿菌抗原，如前人所述的38kD(序列編號27)抗原(Anderson and Hansen，1989，Infect.Immun.572481-2488；Genbank登記號M30046)，相連接的圖1A-13B所述抗原。
5.2.免疫原性測定文中所述抗原及其免疫原性部分可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。更明確而言，這些抗原能夠誘導(dǎo)來源于結(jié)核桿菌免疫個(gè)體的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的增殖和/或細(xì)胞因子的產(chǎn)生(即干擾素-γ和/或白細(xì)胞介素12的產(chǎn)生)。將根據(jù)所需的應(yīng)答來選擇用于評價(jià)對抗原的免疫應(yīng)答的細(xì)胞類型。舉例來說，使用含有B細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的制品最容易對白細(xì)胞介素12的產(chǎn)生進(jìn)行評價(jià)。結(jié)核桿菌免疫個(gè)體是指已建立對結(jié)核桿菌的有效T細(xì)胞應(yīng)答，因而被認(rèn)為可抵抗結(jié)核病產(chǎn)生(即基本不表現(xiàn)疾病癥狀)的個(gè)體。根據(jù)真皮內(nèi)皮膚試驗(yàn)中產(chǎn)生對結(jié)核病蛋白(PPD)的強(qiáng)陽性(即大于約10mm直徑的硬結(jié))應(yīng)答但又不表現(xiàn)任何結(jié)核病跡象或癥狀即可對這些個(gè)體加以鑒別。來源于結(jié)核桿菌免疫個(gè)體的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的制備可使用該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的方法。如PBMCs(即周圍血單核細(xì)胞)制品無需進(jìn)一步分離細(xì)胞組分即可加以使用。PBMCs的制備通常采用，例如，“FICOLL”(Winthrop Laboratories，NY)的密度離心。也可直接由PBMCs純化出用于文中所述測定的T細(xì)胞。作為選擇，還可采用對分支桿菌蛋白起反應(yīng)的富集T細(xì)胞系或?qū)我环种U菌蛋白起反應(yīng)的T細(xì)胞克隆。這類T細(xì)胞克隆可通過，例如，將來源于結(jié)核桿菌免疫個(gè)體的PBMCs與分支桿菌蛋白一同培養(yǎng)2-4周而產(chǎn)生。這樣可以僅增加分支桿菌蛋白特異性T細(xì)胞，從而產(chǎn)生只含有這類細(xì)胞的細(xì)胞系。然后可將這些細(xì)胞克隆，并通過該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的方法用單一蛋白進(jìn)行測試，以更加精確地判定單一的T細(xì)胞特異性。一般而言，在利用來源于結(jié)核桿菌免疫個(gè)體的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞進(jìn)行的增殖和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生(即干擾素-γ和/或白細(xì)胞介素12的產(chǎn)生)測定中表現(xiàn)為陽性的抗原可被認(rèn)為具有免疫原性。這些測定的實(shí)施可采用，例如，下文所述的典型方法。通過類似測定可鑒別出這些抗原的免疫原性部分，并可將其加到文中所述的多肽中。
評定多肽(如一種免疫原性抗原或其部分或其它變異體)對細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)能力是將這些細(xì)胞(如T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞)與多肽相接觸并測量細(xì)胞的增殖。一般而言，足以用來對約105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評定的多肽的量約為10ng/mL-100mg/mL，優(yōu)選的約為10mg/mL。通常是將多肽與細(xì)胞在37℃下保溫約6天。對與多肽保溫后的細(xì)胞進(jìn)行增殖應(yīng)答測定，其評定可采用該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的方法，如將細(xì)胞暴露于放射性標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷以對細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記，然后對摻入細(xì)胞DNA的標(biāo)記進(jìn)行測量。一般而言，導(dǎo)致增殖至少比本底(即不加多肽培養(yǎng)的細(xì)胞所觀測到的增殖)高三倍的多肽可被認(rèn)為能夠誘導(dǎo)增殖。
評定多肽對細(xì)胞內(nèi)干擾素-γ和/或白細(xì)胞介素12產(chǎn)生的刺激能力是將細(xì)胞與多肽相接觸，并測量細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ或白細(xì)胞介素12的水平。一般而言，足以用來對約105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評定的多肽的量約為10ng/mL-100mg/mL，優(yōu)選的約為10mg/mL。多肽可以被固定在小珠或可生物降解的微球等固體支持物上，如按照美國專利號4,897,268和5,075,109所述進(jìn)行，但并非必需如此。通常是將多肽與細(xì)胞在37℃下保溫約6天。對與多肽保溫后的細(xì)胞進(jìn)行干擾素-γ和/或白細(xì)胞介素12(或其一種或多種亞基)測定，其評定可采用該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的方法，例如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，或測定IL12P70亞基時(shí)采用的T細(xì)胞增殖測定等生物測定方法。一般而言，導(dǎo)致每毫升培養(yǎng)物上清液(每毫升含有104-105個(gè)T細(xì)胞)至少產(chǎn)生50pg干擾素-γ的多肽可被認(rèn)為能夠刺激干擾素-γ的產(chǎn)生。導(dǎo)致每105個(gè)巨噬細(xì)胞或T細(xì)胞(或每3×105個(gè)PBMC)至少產(chǎn)生10pg/mL的IL12 P70亞基和/或至少100pg/mL的IL12 P40亞基的多肽可被認(rèn)為能夠刺激IL12的產(chǎn)生。
一般而言，免疫原性抗原是指能夠刺激來源于至少約25％的結(jié)核桿菌免疫個(gè)體的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的增殖和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生(即干擾素-γ和/或白細(xì)胞介素12的產(chǎn)生)的那些抗原。根據(jù)上述測定中的應(yīng)答量和觀測到應(yīng)答的個(gè)體的百分率可從這些免疫原性抗原中鑒別出具有較佳治療性能的多肽。此外，具有較佳治療性能的抗原將不會刺激來源于約25％以上非結(jié)核桿菌免疫個(gè)體的細(xì)胞的體外增殖和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而消除了由結(jié)核桿菌應(yīng)答性細(xì)胞造成的非特異性應(yīng)答。能夠以高比率誘導(dǎo)來源于結(jié)核桿菌免疫個(gè)體的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞制品產(chǎn)生應(yīng)答(并且來源于其他個(gè)體的細(xì)胞制品產(chǎn)生應(yīng)答的發(fā)生率很低)的那些抗原則具有較佳的治療性能。
具有較佳治療性能的抗原也可根據(jù)其作為疫苗進(jìn)行給藥時(shí)使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的結(jié)核桿菌感染嚴(yán)重程度減少的能力來加以鑒別?？捎糜趯?shí)驗(yàn)動(dòng)物的適當(dāng)疫苗制劑將在下文作詳細(xì)描述。根據(jù)抗原在實(shí)驗(yàn)性注射后引起細(xì)菌數(shù)量至少減少約50％和/或死亡率至少下降約40％的能力可對其效能加以測定。適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物則包括小鼠、豚鼠和靈長類動(dòng)物。
5.3.編碼序列的分離本發(fā)明還涉及編碼結(jié)核桿菌融合多肽的核苷酸分子。在下文第6節(jié)以實(shí)例方式給出的特定實(shí)施方案中構(gòu)建了13種結(jié)核桿菌融合編碼序列。根據(jù)本項(xiàng)發(fā)明，任意一種可編碼融合蛋白氨基酸序列的核苷酸序列均可用來產(chǎn)生能夠控制編碼序列表達(dá)的重組分子。
為了克隆全長編碼序列或同種變異體以產(chǎn)生融合多肽，由文中公開的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的任意部分設(shè)計(jì)出的標(biāo)記DNA探針均可用來篩選由不同結(jié)核桿菌菌株制備的基因組文庫或cDNA文庫，以確定各單一組分的編碼序列。編碼序列的分離也可通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用兩種根據(jù)文中公開的編碼序列設(shè)計(jì)出的簡并寡核苷酸引物庫來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明還涉及與序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的核苷酸序列互補(bǔ)的分離或純化的多聚核苷酸，以及能夠與這些互補(bǔ)序列選擇性雜交的多聚核苷酸。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中提供了一種多聚核苷酸，該多聚核苷酸能夠在低嚴(yán)格條件下與序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25或其互補(bǔ)序列雜交，并編碼一種可保持序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26的融合蛋白的免疫原性的蛋白。作為非限定性實(shí)例，典型的低嚴(yán)格條件如下(也可參考Shilo and Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 786789-6792)將含有DNA的過濾器置于包含35％甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％ PVP、0.1％ Ficoll、1％ BSA和500mg/ml變性鮭魚精DNA的溶液中于40℃預(yù)處理6小時(shí)。雜交是在具有以下修改的相同溶液中進(jìn)行0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.2％ BSA、100mg/ml鮭魚精DNA、10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯，并且使用了5-20×106cpm的32P標(biāo)記探針。將過濾器置于雜交混合液中40℃保溫18-20小時(shí)，然后置于包含2×SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中55℃清洗1.5小時(shí)。用新溶液替換清洗液，并于60℃再保溫1.5小時(shí)。過濾器用濾紙吸干，并進(jìn)行放射自顯影。如果需要，也可將過濾器于65-68℃第三次清洗并再暴露于膠片。其它可使用的低嚴(yán)格條件已為該領(lǐng)域所熟知(如種間雜交所采用的條件)。
在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中提供了一種多聚核苷酸，該多聚核苷酸能夠在高嚴(yán)格條件下與序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25或其互補(bǔ)序列雜交，并編碼一種可保持序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26的融合蛋白的免疫原性的蛋白。作為非限定性實(shí)例，典型的高嚴(yán)格條件如下將含有DNA的過濾器置于包含6×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％ PVP、0.03％ Ficoll、0.02％ BSA和500μg/ml變性鮭魚精DNA的溶液中于65℃預(yù)雜交8小時(shí)至過夜。將過濾器置于含有100μg/ml變性鮭魚精DNA和5-20×106cpm32P標(biāo)記探針的預(yù)雜交混合液中于65℃雜交48小時(shí)。將過濾器置于包含2×SSC、0.01％ PVP、0.01％Ficoll和0.01％ BSA的溶液中于37℃清洗1小時(shí)。再置0.1×SSC中于50℃清洗45分鐘，然后進(jìn)行放射自顯影。其它可使用的高嚴(yán)格條件已為該領(lǐng)域所熟知。
在又一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中提供了一種多聚核苷酸，該多聚核苷酸能夠在中等嚴(yán)格條件下與序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25或其互補(bǔ)序列雜交，并編碼一種可保持序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26的融合蛋白的免疫原性的蛋白。典型的中等嚴(yán)格條件如下將含有DNA的過濾器置于包含6×SSC、5×Denhart’s溶液、0.5％SDS和100μg/ml變性鮭魚精DNA的溶液中于55℃預(yù)處理6小時(shí)。在相同溶液中進(jìn)行雜交，并使用5-20×106cpm的32P標(biāo)記探針。過濾器在雜交混合液中于55℃保溫18-20小時(shí)，然后在含有1×SSC和0.1％ SDS的溶液中于60℃清洗兩次，每次30分鐘。過濾器用濾紙吸干，并進(jìn)行放射自顯影。其它可使用的中等嚴(yán)格條件已為該領(lǐng)域所熟知。過濾器的清洗是在含有2×SSC和0.1％ SDS的溶液中于37℃進(jìn)行，時(shí)間1小時(shí)。
5.4.由編碼序列編碼的多肽根據(jù)本項(xiàng)發(fā)明，可利用編碼融合蛋白、融合蛋白片段或其功能等價(jià)物的本發(fā)明所述多聚核苷酸來產(chǎn)生能夠在適當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)控制該融合蛋白、融合蛋白片段或其功能等價(jià)物的表達(dá)的重組核酸分子。通過對編碼序列的分子操作可改變由這些多聚核苷酸編碼的融合多肽產(chǎn)物。
由于遺傳密碼的固有簡并性，因而在本發(fā)明的實(shí)施中可將編碼基本相同或功能上等價(jià)的氨基酸序列的其它DNA序列用于融合多肽的表達(dá)。這些DNA序列包括那些能夠在上文5.3節(jié)所述的低嚴(yán)格、中等嚴(yán)格或高嚴(yán)格條件下與本文公開的編碼序列或其互補(bǔ)序列雜交的序列。
可按照本項(xiàng)發(fā)明加以使用的改變了的核苷酸序列包括不同核苷酸殘基的缺失、添加或取代，其所得的序列可編碼相同的或功能上等價(jià)的基因產(chǎn)物。該基因產(chǎn)物本身可含有能夠?qū)е鲁良鸥淖儚亩a(chǎn)生功能上等價(jià)的抗原決定簇的氨基酸殘基缺失、添加或取代。此類保守氨基酸取代可依據(jù)所涉及殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性的相似性來進(jìn)行。舉例來說，帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸、組氨酸和精氨酸；具有不帶電荷的極性頭部基團(tuán)和類似親水性值的氨基酸包括甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；具有非極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
為了改變?nèi)诤系鞍椎木幋a序列使其具有不同的末端，可將本發(fā)明的核苷酸序列加以設(shè)計(jì)，其中包括，但不局限于，能夠改變基因產(chǎn)物的加工和表達(dá)的變化。例如，可采用定點(diǎn)誘變等該領(lǐng)域所熟知的技術(shù)來引入突變，以插入新限制性位點(diǎn)，以此來改變糖基化、磷酸化模式等。
在本發(fā)明的一項(xiàng)可替代的實(shí)施方案中，可利用本領(lǐng)域所熟知的化學(xué)方法完整地或部分地合成融合蛋白的編碼序列。例如，可參考Caruthers et al.，1980，Nuc.Acids Res.Symp.Ser.7215-233；Crea and Horn，180，Nuc.Acids Res.9(10)2331；Matteucci andCaruthers，1980，Tetrahedron Letter 21719；和Chow and Kempe，1981，Nuc.Acids Res.9(12)2807-2817。作為選擇，也可利用完整地或部分地合成氨基酸序列的化學(xué)方法來直接產(chǎn)生多肽。舉例來說，可通過固相技術(shù)將肽合成，然后由樹脂上分離，并通過制備型高效液相色譜加以純化(參考Creighton，1983，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與分子機(jī)理，W.H.Freeman and Co.，N.Y.pp.50-60)。合成的多肽組合物可通過氨基酸分析或測序(如Edman降解法；參考Creighton，1983，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與分子機(jī)理，W.H.Freeman and Co.，N.Y.pp.34-49)作進(jìn)一步驗(yàn)證。
此外，還可對融合蛋白的編碼序列進(jìn)行體外或體內(nèi)突變，以創(chuàng)建和/或破壞翻譯序列、起始序列和/或終止序列，或引起編碼區(qū)變異并且/或者形成新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或破壞已有的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以此來簡化進(jìn)一步的體外修飾。該領(lǐng)域所了解的任何誘變技術(shù)均可使用，其中包括，但不局限于，化學(xué)誘變、體外定點(diǎn)誘變(Hutchinson，C.，et al.，1978，J.Biol.Chem 2536551)、使用TAB聯(lián)結(jié)子(Pharmacia)等。重要的是這些操作不會破壞融合多肽的免疫原性。
另外，也可將非經(jīng)典氨基酸或氨基酸化學(xué)類似物作為取代物或附加物引入該序列。非經(jīng)典氨基酸包括，但不局限于，常見氨基酸的D型異構(gòu)體、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸，以及β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸等設(shè)計(jì)的氨基酸，和一般的氨基酸類似物。并且氨基酸可以是D型(右旋型)或L型(左旋型)。
在一項(xiàng)特定實(shí)施方案中，融合蛋白內(nèi)各抗原的編碼序列可按照任何順序由肽鍵將其氨基端或羧基端連接。作為選擇，也可使用肽銜接序列來隔離構(gòu)成融合多肽的各單一多肽，其間的距離足以確保各多肽能夠折疊成可最大程度實(shí)現(xiàn)其預(yù)防和治療結(jié)核病的抗原有效性的二級和三級結(jié)構(gòu)。這種肽銜接序列可通過該領(lǐng)域所熟知的常規(guī)技術(shù)被摻入到融合蛋白中。適當(dāng)肽銜接序列的選擇可基于以下因素(1)能夠采取一種柔性的伸展構(gòu)象；(2)不會形成可影響第一和第二多肽上的功能性決定簇的二級結(jié)構(gòu)；以及(3)不含有可能與多肽的功能性決定簇反應(yīng)的疏水性殘基或帶電荷的殘基。優(yōu)選的肽銜接序列含有Gly、Asn和Ser殘基。其它近中性的氨基酸，如Thr和Ala，也可在銜接序列中使用?？捎行в米縻暯游锏陌被嵝蛄邪∕aratea et al.，Gene4039-46，1985；Murphy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838258-8262，1986；美國專利號4,935,233和美國專利號4,751,180中所描述的那些序列。銜接序列的長度可約為1-50個(gè)氨基酸。如果第一和第二多肽具有可隔離功能結(jié)構(gòu)域并防止位阻效應(yīng)的N端非必需氨基酸區(qū)，則可無需使用肽序列。舉例來說，融合蛋白中的各抗原可通過柔性銜接物，如重復(fù)1-3次的Gly-Cys-Gly或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(Bird et al.，1988，Science 242423-426；chaudhary et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.871066-1070)，而相互連接。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，這種蛋白是通過將編碼該蛋白的核酸進(jìn)行重組表達(dá)而產(chǎn)生的。這種融合產(chǎn)物是利用該領(lǐng)域所了解的方法將編碼所需氨基酸序列的適當(dāng)核酸序列相互連接，并利用該領(lǐng)域所了解的方法將其產(chǎn)物進(jìn)行表達(dá)而得到的。作為選擇，也可利用蛋白合成技術(shù)，如使用肽合成儀，來制備這種產(chǎn)物。也可將細(xì)胞因子或佐劑等其它分子的編碼序列加入到融合多肽中。
5.5.融合蛋白的產(chǎn)生為了產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)核桿菌融合蛋白，可在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，即含有對插入編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件的載體，中插入編碼該蛋白的核苷酸序列或功能等價(jià)物。由重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系可用于多種用途。其中包括，但不局限于，融合蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。
含有融合編碼序列及適當(dāng)轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控信號的表達(dá)載體的構(gòu)建可采用該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法。其中包括DNA體外重組技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)重組/遺傳重組(例如，可參考Sambrook et al.，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.及Ausubel et al.，1989，新編分子生物學(xué)指南，Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.中描述的技術(shù))。也可通過化學(xué)方法合成能夠編碼多肽的RNA(Gait，ed.，1984，寡核苷酸合成，IRL Press，Oxford)。
5.5.1.表達(dá)系統(tǒng)有多種宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)可用來表達(dá)融合蛋白編碼序列。其中包括微生物，如利用含有編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；利用含有編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(如酵母屬、畢赤酵母屬)；利用含有編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；利用含有編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染或利用含有編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(如COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、293細(xì)胞、3T3細(xì)胞)，但并不局限于此。這些系統(tǒng)的表達(dá)元件在強(qiáng)度和特異性方面各不相同。
表達(dá)載體中可使用眾多轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，其中包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，中的任意一種，這將取決于所使用的宿主/載體系統(tǒng)。舉例來說，若在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆，則可使用λ嗜菌體的pL或plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜交啟動(dòng)子；巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子)等誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；若在昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中克隆，則可使用桿狀病毒多角體啟動(dòng)子等啟動(dòng)子；若在植物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆，則可使用來源于植物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(如熱休克啟動(dòng)子；RUBISCO小亞基啟動(dòng)子；α/β葉綠素結(jié)合蛋白啟動(dòng)子)或來源于植物病毒的啟動(dòng)子(如CaMV的35S RNA啟動(dòng)子；TMV的外殼蛋白啟動(dòng)子)；若在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆，則可使用源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來源于哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(如腺病毒晚期啟動(dòng)子；痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子)；若要產(chǎn)生含有多拷貝抗原編碼序列的細(xì)胞系，則可使用基于SV40、BPV和EBV的帶有適當(dāng)選擇標(biāo)記的載體。
細(xì)菌系統(tǒng)是優(yōu)選的用于結(jié)核桿菌抗原表達(dá)的系統(tǒng)。為了便于體內(nèi)傳輸，可將卡介苗等細(xì)菌設(shè)計(jì)成在其細(xì)胞表面表達(dá)本發(fā)明所述融合多肽。也可根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的預(yù)期用途對其它眾多的細(xì)菌表達(dá)載體進(jìn)行有利地選擇。舉例來說，若要產(chǎn)生大量的融合蛋白用于藥物的配制，則理想的載體要能夠指導(dǎo)便于純化的融合蛋白產(chǎn)物的高水平表達(dá)。此類載體包括，但不局限于，大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther et al.，1983，EMBO J.21791)，其中可按照lacZ編碼區(qū)的讀碼框?qū)⒕幋a序列連接到載體中以產(chǎn)生一種雜交蛋白；pIN載體(Inouye and Inouye，1985，Nucleic Acids Res.133101-3109；Van Heeke and Schuster，1989，J.Biol.Chem.2645503-5509)；等。也可使用pGEX載體將外源多肽作為與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合的蛋白加以表達(dá)。這些融合蛋白一般為可溶性，并可通過谷胱甘肽瓊脂糖小珠吸附然后于存在游離谷胱甘肽的情況下洗脫而方便地從裂解細(xì)胞中純化。pGEX載體被設(shè)計(jì)成含有凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位點(diǎn)，使得克隆的所需融合多肽可釋放GST部分。
5.5.2.蛋白純化一旦重組蛋白被表達(dá)，即可根據(jù)該產(chǎn)物的物理特性或功能特性測定對其加以鑒定，包括對產(chǎn)物進(jìn)行放射性標(biāo)記，然后通過凝膠電泳、放射免疫測定、ELISA、生物測定等進(jìn)行分析。
一旦編碼的蛋白經(jīng)過鑒定，即可利用標(biāo)準(zhǔn)方法對其加以分離和純化，其中包括層析法(如高效液相層析法、離子交換層析法、親和層析法以及填料柱層析法(sizing column chromatography))、離心、差示溶解度，或任何用于蛋白純化的其它技術(shù)。所使用的實(shí)際條件在某種程度上取決于凈電荷、疏水性、親水性等因素，這對該領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。功能特性的評定可使用任何適當(dāng)?shù)臏y定方法，如抗體結(jié)合、誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖、刺激IL2、IL-4和IFN-γ等細(xì)胞因子產(chǎn)生。就本發(fā)明的實(shí)施而言，優(yōu)選的是各融合蛋白自其它蛋白純化的程度至少達(dá)80％。更優(yōu)選的是其純化程度至少達(dá)90％。對體內(nèi)給藥而言，優(yōu)選的是該蛋白的純化程度高于95％。
5.6.融合蛋白編碼序列的應(yīng)用本發(fā)明的融合蛋白編碼序列可用來編碼一種蛋白產(chǎn)物，以作為免疫原來誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)對結(jié)核桿菌的免疫應(yīng)答。此外，該編碼序列可與細(xì)胞因子或佐劑等其它分子的編碼序列相連接。這些多聚核苷酸可在體內(nèi)用作DNA疫苗(美國專利號5,589,466；5,679,647；5,703,055)。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，這種多聚核苷酸可在受者體內(nèi)表達(dá)其編碼的蛋白，以直接誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。可將該多聚核苷酸注入首次用于實(shí)驗(yàn)的受試者中以誘發(fā)對其編碼產(chǎn)物的免疫應(yīng)答，或可向感染的或已免疫的受試者給藥以增強(qiáng)其二次免疫應(yīng)答。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，治療性組合物含有一種融合蛋白編碼序列或其相當(dāng)于表達(dá)載體一部分的片段。詳細(xì)而言，該多聚核苷酸含有一種經(jīng)操作與其編碼區(qū)相連接的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型或組成型，作為選擇，也可以是組織特異型。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，多聚核苷酸含有一種編碼序列，序列兩側(cè)為能夠促進(jìn)其同源重組到基因組內(nèi)所需位點(diǎn)，從而使該編碼序列能夠在染色體內(nèi)表達(dá)的區(qū)域(Kollerand Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra et al.，1989，Nature 342435-438)。
將核酸輸入受試者可采用直接方式或間接方式，直接方式是將受試者直接暴露于核酸或攜帶有核酸的載體，間接方式是先于體外用核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植到受試者體內(nèi)。這兩種方法分別被稱作體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和先體外后體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。
在一項(xiàng)特定實(shí)施方案中，可將核酸直接進(jìn)行體內(nèi)給藥，核酸則在體內(nèi)表達(dá)以產(chǎn)生其編碼的融合蛋白產(chǎn)物。這可通過該領(lǐng)域所了解的眾多方法中的任意一種來實(shí)現(xiàn)，舉例來說，可構(gòu)建一種將該核酸作為一部分的適當(dāng)核酸表達(dá)載體，并將其給藥以使它進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其方法可通過，例如，用一種缺損的或減毒的反轉(zhuǎn)錄病毒的載體或其它病毒的載體進(jìn)行感染(參考美國專利號4,980,286)、或?qū)⒙懵禗NA直接注射、或采用微粒轟擊(如基因槍；Dupont的Biolistic)、或用脂類或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑進(jìn)行包被，或包裹于脂質(zhì)體、微顆?；蛭⒛z囊(美國專利號5,407,609；5,853,763；5,814,344和5,820,883)、或與已知可進(jìn)入細(xì)胞核的肽相連接而將其給藥、或與可進(jìn)行受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的配體相連接而將其給藥(例如，參考Wu and Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-44 32)，該方法甚至可用來定向于特異表達(dá)該受體等類型的細(xì)胞。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，則可形成一種核酸-配體復(fù)合物，其中的配體含有一種可破壞內(nèi)涵體的溶源性病毒肽，使核酸能夠避免溶酶體的降解。在又一項(xiàng)實(shí)施方案中，可通過導(dǎo)入一段特異受體而定制出可被特定細(xì)胞吸收和表達(dá)的核酸(例如，參考PCT公開中1992年4月16日的WO 92/06180；1992年12月23日的WO92/22635；1992年11月26日的WO 92/20316；1993年7月22日的WO 93/14188；1993年10月14日的WO 93/20221)。作為選擇，也可通過同源重組將核酸引入細(xì)胞并使其插入宿主細(xì)胞DNA來進(jìn)行表達(dá)(Koller and Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra et al.，1989，Nature 342435-438)。
在一項(xiàng)特定實(shí)施方案中，可使用諸如反轉(zhuǎn)錄病毒載體等病毒載體(參考Miller et al.，1993，Meth.Enzymol.217581-599)。反轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)過修飾已去除了那些不是病毒基因組包裝和整合至宿主細(xì)胞DNA內(nèi)所必需的反轉(zhuǎn)錄病毒序列。將融合編碼序列克隆到載體內(nèi)，該載體使核酸易于輸送到受者體內(nèi)。有關(guān)反轉(zhuǎn)錄病毒載體的更詳細(xì)情況可從Boesen et al.，1994，Biotherapy 6291-302中查明，該文獻(xiàn)對使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體將mdrI基因輸送到造血干細(xì)胞內(nèi)以使干細(xì)胞對化療更具有抗性作了描述。說明反轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因治療中的應(yīng)用的其它參考文獻(xiàn)有Clowes et al.，1994，J.Clin.Invest.93644-651；Kiem et al.，1994，Blood 831467-1473；Salmonsand Gunzberg，1993，Human Gene Therapy 4129-141；和Grossmanand Wilson，1993，Curr.Opin.In genetics and Devel.3110-114。
腺病毒是其它可在基因治療中使用的病毒載體。腺病毒是尤其適合于將基因傳送到呼吸上皮細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸工具。在自然狀態(tài)下，腺病毒可感染呼吸上皮細(xì)胞并導(dǎo)致一種輕度的疾病?；谙俨《镜膫魉拖到y(tǒng)的其它目標(biāo)有肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒的優(yōu)勢在于能夠感染不分裂的細(xì)胞。也有提議將腺相關(guān)病毒(AAV)用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的(Walsh et al.，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300)。
涉及把構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)物的細(xì)胞內(nèi)的其它方法如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或病毒感染。轉(zhuǎn)移方法通常包括將選定標(biāo)記轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。再將細(xì)胞置于選擇環(huán)境下，以分離出那些已將轉(zhuǎn)移的基因吸收并正在進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞。然后將細(xì)胞輸送給受試者。
在該實(shí)施方案中是將核酸引入細(xì)胞，然后將所得重組細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)給藥。其引入的實(shí)現(xiàn)可采用該領(lǐng)域所了解的任何方法，其中包括，但不局限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、用含有核酸序列的病毒或嗜菌體載體進(jìn)行感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球狀體融合等。該領(lǐng)域中有多種方法可用來將外源基因引入細(xì)胞(例如，參考Loeffler and Behr，1993，Meth.Enzymol.217599-618；Cohen et al.，1993，Meth.Enzymol.217618-644；Cline，1985，Pharmac.Ther.2969-92)，并且均可根據(jù)本發(fā)明加以使用。
本發(fā)明的多聚核苷酸也可以在結(jié)核病的診斷中用來檢測患者體內(nèi)的結(jié)核桿菌特異性多聚核苷酸序列。該檢測可通過，例如，從來源于疑為細(xì)菌感染患者的生物樣品中分離多聚核苷酸而實(shí)現(xiàn)。一旦從生物樣品中分離出多聚核苷酸，即可利用該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的核酸雜交方法將本發(fā)明所述與一種或多種多聚核苷酸互補(bǔ)的標(biāo)記多聚核苷酸與生物樣品中的多聚核苷酸進(jìn)行雜交。舉例來說，這種雜交可在溶液中或使用一種結(jié)合在固體支持物上的雜交配對體來實(shí)現(xiàn)。
5.7.融合蛋白的治療性和預(yù)防性應(yīng)用純化或部分純化的融合蛋白或其片段可作為疫苗或治療組合物加以配制。該組合物可含有佐劑以加強(qiáng)免疫應(yīng)答。此外，這些蛋白可進(jìn)一步懸浮于油乳劑中，使注射后的蛋白在體內(nèi)更緩慢地釋放。配方中各組分的最佳比例可通過該領(lǐng)域所熟知的技術(shù)來加以確定。
為了加強(qiáng)免疫應(yīng)答，可在本發(fā)明所述疫苗中使用眾多佐劑中的任意一種。大多數(shù)佐劑都含有一種用來保護(hù)抗原不被快速分解的物質(zhì)，如氫氧化鋁或礦物油，和一種免疫應(yīng)答的非特異性刺激劑，如脂質(zhì)A、百日咳博氏桿菌或結(jié)核桿菌。適當(dāng)?shù)淖魟┛捎缮唐沸问劫彽?，其中包括，例如，弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐?Difco Laboratories)及默克佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)。其它適當(dāng)?shù)淖魟┯忻鞯\、可生物降解的微球體、單磷酰脂質(zhì)A、quil A、SBAS1c、SBAS2(Ling et al.，1997，Vaccine 151562-1567)、SBAS7和氫氧化鋁。
優(yōu)選而言，本發(fā)明所述疫苗中的佐劑可誘導(dǎo)一種涉及Th1的免疫應(yīng)答。適當(dāng)?shù)淖魟┫到y(tǒng)包括，例如，單磷酰脂質(zhì)A，優(yōu)選的為3-脫氧?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MLP)，與鋁鹽的組合物。單磷酰脂質(zhì)A與皂甙衍生物的組合物可作為一種增強(qiáng)的系統(tǒng)，特別是WO 94/00153中公開的3D-MLP與皂甙QS21的組合物，或WO 96/33739中公開的用膽固醇抑制皂甙QS21的較低反應(yīng)源性組合物。此前的實(shí)驗(yàn)已明確證明了3D-MLP與QS21的組合物在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答中的協(xié)同作用。WO 95/17210中描述的在水包油型乳劑中含有WS21、3D-MLP和生育酚的強(qiáng)效佐劑配方則為優(yōu)選的配方。
含有本發(fā)明所述抗原的制劑可按照本來形式向受試者給藥，或以藥用組合物或治療組合物的形式給藥。含有蛋白的藥用組合物可利用傳統(tǒng)的混合、溶解、?；?、包裹糖衣、粉碎、乳化、封裝、包載或凍干方法來制造。藥用組合物可按照傳統(tǒng)方式用一種或多種有利于將多肽加工成藥用制品的生理容許的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑來進(jìn)行配制。適當(dāng)?shù)膭┬蛣t取決于所選擇的給藥途徑。
對局部給藥而言，可將蛋白配制為溶液、凝膠體、軟膏劑、乳膏劑、懸浮液等該領(lǐng)域所熟知的形式。
全身型制劑包括那些計(jì)劃由皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)注射等注射方式給藥的制劑，以及那些計(jì)劃由穿皮、穿粘膜、經(jīng)口或經(jīng)肺方式給藥的制劑。
對注射而言，可將蛋白配制在水性溶液中，優(yōu)選的是配制在Hanks溶液、Ringer溶液或生理鹽水緩沖液等生理容許的緩沖液中。溶液可含有懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑等配劑。作為選擇，也可將蛋白制成粉末形式，在使用前則以適當(dāng)載體，如無熱原的無菌水，進(jìn)行構(gòu)建。
對穿粘膜給藥而言，可在制劑中使用適于透過屏障的滲透劑。這些滲透劑通常為該領(lǐng)域所了解。
對經(jīng)口給藥而言，可通過將蛋白與該領(lǐng)域所熟知的藥學(xué)容許的載體向混合而很容易地配制組合物。這些載體使蛋白可被配制成適于處理的受試者經(jīng)口攝入的片劑、丸劑、糖錠、膠囊、流體、凝膠體、糖漿劑、膏劑、懸浮液等。舉例來說，對粉末、膠囊和片劑等固體口服制劑而言，適當(dāng)?shù)馁x形劑包括糖類等填充劑，如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等纖維素制品；成粒劑以及粘合劑。如果需要，也可加入崩解劑，如交連的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂，或海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。
如果需要，也可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將固體劑型包裹糖衣或腸溶衣。
舉例來說，對懸浮液、酏劑和溶液等液體口服制劑而言，適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑或稀釋劑包括水、乙二醇、油類、乙醇等。另外也可加入調(diào)味劑、防腐劑、著色劑等。
對口腔給藥而言，可按照傳統(tǒng)方式將蛋白配制成片劑、錠劑等形式。
對通過吸入給藥而言，可利用由加壓包裝或噴霧器進(jìn)行噴霧的形式方便地提供用于按本發(fā)明所述加以使用的蛋白，其中需使用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適當(dāng)氣體。在使用加壓噴霧劑的情況下，可通過使用一種閥門來確定劑量單位，以此來顯示測量的量。用于在吸入器或吹藥器中使用的如明膠的膠囊或藥筒可配制成含有蛋白與適當(dāng)粉基，如乳糖或淀粉，所構(gòu)成的粉狀混合物。
也可將蛋白配制在直腸用或陰道用組合物中，例如含有可可脂或其它甘油酯等傳統(tǒng)栓劑主劑的栓劑或滯留灌腸劑。
除上述劑型外，還可將蛋白配制成長效制劑。這種長效制劑可通過植入(如皮下或肌內(nèi))或肌內(nèi)注射方式給藥。因此，舉例來說，可將蛋白與適當(dāng)聚合材料或疏水性材料(如在容許的油中形成乳劑)或離子交換樹脂或其微溶衍生物，如微溶鹽，一同進(jìn)行配制。
作為選擇，也可使用其它的藥物遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是公認(rèn)的可用來傳遞抗原的遞送載體實(shí)例。盡管二甲亞砜等某些有機(jī)乳劑具有較高毒性，但也可以使用。另外也可將融合蛋白封裝在微球體中(美國專利號5,407,609；5,853,763；5,814,344和5,820,883)。此外，還可利用緩釋系統(tǒng)來遞送蛋白，如含有治療劑或接種劑的固體聚合物的半透性基體。目前已確定了多種緩釋材料，并且為該領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。緩釋膠囊釋放蛋白的時(shí)間可持續(xù)數(shù)周直至100天以上，這取決于其化學(xué)性質(zhì)。根據(jù)試劑的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定性情況，可使用額外的策略來穩(wěn)定蛋白。
根據(jù)本文提供的詳細(xì)公開內(nèi)容，該領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地確定該融合蛋白在受試者內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有效劑量。
首先可以由體外測定對有效劑量進(jìn)行估計(jì)。例如可使用該領(lǐng)域所熟知的技術(shù)來確定能夠在動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)對免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)的一服劑量。根據(jù)由動(dòng)物得到的數(shù)據(jù)，該領(lǐng)域的普通技術(shù)人員則能夠很容易地優(yōu)化向人類的給藥方法。劑量和間隔可作個(gè)別調(diào)整。舉例來說，當(dāng)作為疫苗使用時(shí)，可在1-36周的時(shí)間內(nèi)將約1-3服劑量的本發(fā)明所述多肽和/或多聚核苷酸給藥。優(yōu)選的是每隔約3-4周給藥3服劑量，并在此后定期進(jìn)行促升接種。個(gè)別患者也可使用備用方案。適當(dāng)劑量是指，當(dāng)按照上文所述給藥時(shí)，能夠在一個(gè)免疫患者體內(nèi)引發(fā)一種足以在至少1-2年內(nèi)保護(hù)該患者不受結(jié)核桿菌感染的免疫應(yīng)答的多肽或DNA的量。一般而言，一服劑量中提供的(或由一服劑量中的DNA原位產(chǎn)生的)多肽的量約為每公斤宿主1pg-100mg，典型的約為10pg-1mg，優(yōu)選的則約為100pg-1mg。適當(dāng)?shù)膭┝糠秶鷮㈦S患者的體重而變化，但典型的約為0.1mL-5mL。
5.8.融合蛋白的診斷性應(yīng)用本發(fā)明的融合多肽可用于結(jié)核病感染的體外和體內(nèi)診斷。利用上文5.2節(jié)公開的方法可測定本發(fā)明所述多肽誘導(dǎo)細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力。
另一方面，本發(fā)明提供通過皮膚試驗(yàn)用一種或多種融合多肽進(jìn)行結(jié)核病活體診斷的方法。文中使用的皮膚試驗(yàn)是指在經(jīng)皮注射本發(fā)明的一種或多種多肽后對遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)(如腫脹、發(fā)紅或皮炎)進(jìn)行測量的任何直接對患者實(shí)施的測定方法。這種注射的實(shí)現(xiàn)可使用任何足以使多肽與患者的真皮細(xì)胞相接觸的適當(dāng)裝置，舉例來說，如結(jié)核桿菌注射器或1mL注射器。優(yōu)選的是至少在注射約48小時(shí)后測量其反應(yīng)，更優(yōu)選的則在注射約48-72小時(shí)后。
DTH反應(yīng)是一種由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，此前已暴露于測試抗原(即所用多肽的免疫原性部分或其變異體)的患者體內(nèi)的該反應(yīng)較為強(qiáng)烈。該應(yīng)答可利用標(biāo)尺進(jìn)行目測。一般而言，直徑約大于0.5cm，優(yōu)選的則直徑約大于1.0cm，的應(yīng)答為表現(xiàn)出結(jié)核病感染的陽性應(yīng)答，這可能表示一種活動(dòng)性疾病，也可能不是。
對于在皮膚試驗(yàn)中使用而言，優(yōu)選的是將本發(fā)明的融合多肽配制成含有一種多肽和一種生理容許的載體的藥用組合物。此類組合物通?？珊幸环N或多種上述多肽，其含量約為1μg-100μg，優(yōu)選的則在0.1mL體積中含有約10mg-50mg。優(yōu)選而言，此類藥用組合物中使用的載體為含有苯酚和/或吐溫80TM等防腐劑的鹽溶液。
另一方面，本發(fā)明提供利用多肽進(jìn)行結(jié)核病診斷的方法。此方面提供的方法是用來以單獨(dú)的或聯(lián)合的融合多肽檢測生物樣品中的結(jié)核桿菌感染。文中使用的“生物樣品”是指來源于患者的任何含有抗體的樣品。優(yōu)選而言，該樣品為全血、痰、血清、血漿、唾液、腦脊液或尿。更優(yōu)選而言，該樣品為來源于患者或供血的血液、血清或血漿樣品。如下文所述，可在測定中利用多肽來確定樣品中的多肽抗體相對于預(yù)定截止值的存在與否。該抗體的存在則表明此前已被分支桿菌抗原致敏，這可表明患有結(jié)核病。
在使用一種以上融合多肽的實(shí)施方案中，優(yōu)選的是使用互補(bǔ)的多肽(即樣品中傾向于被一種多肽組分檢測出的感染則不能被其它多肽組分所檢測)。利用每種多肽單獨(dú)鑒定來源于已知被結(jié)核桿菌感染的一系列患者的血清樣品，由此通?？设b定出互補(bǔ)的多肽。在確定利用各種多肽檢測出的陽性樣品(如下文所述)之后，即可將兩種或多種融合多肽配制成組合物，使其能夠檢測大多數(shù)或所有測試樣品中的感染。在來源于結(jié)核病感染個(gè)體的血清中，使用任意一種單一蛋白都顯示抗體陰性結(jié)果的約占25-30％。因此，結(jié)合使用互補(bǔ)多肽可提高診斷測試的靈敏性。
對使用一種或多種多肽來檢測樣品中的抗體而言，有多種已被該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的測試形式。例如，見Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988，其內(nèi)容在此引入作為參考。一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中的測試方法涉及利用固定在固體支持物上的多肽來結(jié)合抗體，并將抗體從樣品中去除。然后可利用含有報(bào)告基團(tuán)的檢測試劑來檢測結(jié)合的抗體。適當(dāng)?shù)臋z測試劑包括可與抗體/多肽復(fù)合物結(jié)合的抗體以及用報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的游離多肽(如在半競爭性測定中使用)。作為選擇，也可使用競爭性測定法，該方法是用報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記能夠與多肽結(jié)合的抗體，并在抗原與樣品保溫后使其與固定的抗原結(jié)合。樣品的組分對標(biāo)記抗體與多肽結(jié)合的抑制程度可表明該樣品與固定多肽的反應(yīng)能力。
固體支持物可以是該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的能夠附著抗原的任何固體材料。舉例來說，該固體支持物可以是微量滴定板的測試孔或硝酸纖維素膜或其它適當(dāng)?shù)哪?。作為選擇，該支持物也可以是玻璃、玻璃纖維、乳膠或諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材料的小珠或盤。它也可以是磁性顆?；蚬饫w傳感器，例如美國專利號5,359,681中公開的那些支持物。
將多肽與固體支持物結(jié)合可采用該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的多種技術(shù)。本文中的“結(jié)合”包括非共價(jià)結(jié)合，如吸附，和共價(jià)結(jié)合(可以是抗原與支持物上的功能基團(tuán)之間的直接連接或經(jīng)由交聯(lián)劑的連接)。優(yōu)選的是通過吸附結(jié)合到微量滴定板的孔上或膜上。在此情況下，可通過在適當(dāng)緩沖液中將多肽與固體支持物接觸適當(dāng)?shù)臅r(shí)間來實(shí)現(xiàn)吸附。接觸時(shí)間隨溫度而變化，但典型的約為1小時(shí)-1天。一般而言，將約為10ng-1mg，優(yōu)選的則約為100ng，的多肽與塑料微量滴定板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的一個(gè)孔相接觸即足以結(jié)合足夠量的抗原。
多肽與固體支持物共價(jià)結(jié)合的實(shí)現(xiàn)通?？上葘⒅С治锱c能夠同該支持物反應(yīng)并能夠同多肽上的一種功能基團(tuán)，如羥基或氨基，發(fā)生反應(yīng)的雙功能試劑進(jìn)行反應(yīng)。例如，可使用苯醌或通過多肽上的胺和活性氫與支持物上醛基的縮合而將多肽結(jié)合到帶有適當(dāng)聚合物包被的支持物上(例如，參考Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook，1991，at A12-A13)。
某些實(shí)施方案中的測定采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。該測定法是先將固定在固體支持物，通常是微量滴定板孔，上的融合多肽抗原與樣品相接觸，使樣品中的多肽抗體能夠與固定的多肽相結(jié)合。然后從固定的多肽中去除未結(jié)合的多肽，并加入一種能夠與固定的抗體-多肽復(fù)合物相結(jié)合的檢測試劑。然后用適于該特異檢測試劑的方法測定仍與固體支持物結(jié)合的檢測試劑的量。
更詳細(xì)而言，一旦如上文所述將多肽固定在支持物上，通常要將支持物上剩余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)阻斷。該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的任何適當(dāng)阻斷劑，如牛血清白蛋白或吐溫20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，均可使用。然后將固定的多肽與樣品保溫，使抗體能夠與抗原結(jié)合。樣品在保溫前可用適當(dāng)?shù)南♂屢?，如磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，進(jìn)行稀釋。一般而言，適當(dāng)?shù)慕佑|時(shí)間是指足以對結(jié)核桿菌感染的樣品中的抗體存在情況進(jìn)行檢測的一段時(shí)間。優(yōu)選的接觸時(shí)間是指足以使結(jié)合的水平達(dá)到結(jié)合抗體與未結(jié)合抗體間實(shí)現(xiàn)平衡的水平的至少95％。該領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都將認(rèn)可，通過對一段時(shí)間內(nèi)的結(jié)合水平的測定可容易地確定出實(shí)現(xiàn)平衡所需的時(shí)間。在室溫的情況下，約30分鐘的保溫時(shí)間通常已經(jīng)足夠。
然后通過用適當(dāng)緩沖液，如含有0.1％吐溫20TM的PBS，清洗固體支持物來去除未結(jié)合的樣品。再把檢測試劑加到固體支持物上。適當(dāng)?shù)臋z測試劑是指能夠與固定的抗體-多肽復(fù)合物結(jié)合，并可利用該領(lǐng)域已知的多種方法中的任意一種加以檢測的任何組合物。優(yōu)選的檢測試劑可含有一種與報(bào)告基團(tuán)相連接的結(jié)合劑(如蛋白A、蛋白G、外源凝集素或游離抗原)。優(yōu)選的報(bào)告基團(tuán)包括酶(如辣根過氧化物酶)、底物、協(xié)同因子、抑制劑、染料、放射性核素、發(fā)光基團(tuán)、熒光基團(tuán)、生物素以及膠體金和膠體硒等膠粒。結(jié)合劑與報(bào)告基團(tuán)的結(jié)合可利用該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的標(biāo)準(zhǔn)方法來實(shí)現(xiàn)。也可由商品形式購得與多種報(bào)告基團(tuán)連接的常用結(jié)合劑(如Zymed Laboratories，SanFrancisco，CA，and Pierce，Rockford.IL)。
然后將檢測試劑與固定的抗體-多肽復(fù)合物保溫一段時(shí)間，該時(shí)間要足以檢測出結(jié)合抗體。通常由廠商說明或通過測定一段時(shí)間內(nèi)的結(jié)合水平即可確定適當(dāng)?shù)臅r(shí)間長度，然后去除未結(jié)合的檢測試劑，并利用報(bào)告基團(tuán)檢測結(jié)合的檢測試劑。檢測報(bào)告基團(tuán)所使用的方法取決于報(bào)告基團(tuán)的性質(zhì)。對放射性基團(tuán)而言，通常適于采用閃爍計(jì)數(shù)法或放射自顯影法。分光鏡法可用來檢測染料、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)。生物素則可利用結(jié)合有不同報(bào)告基團(tuán)(通常為放射性基團(tuán)或熒光基團(tuán)或酶)的抗生物素蛋白來檢測。酶報(bào)告基團(tuán)一般可通過加入底物(通常需保持一段特定的時(shí)間)，然后由分光鏡或其它分析反應(yīng)產(chǎn)物的方法來檢測。
為了檢測樣品中抗結(jié)核桿菌抗體的存在與否，通常需要將檢測與固體支持物保持結(jié)合的報(bào)告基團(tuán)所得到的信號與相當(dāng)于預(yù)定截止值的信號進(jìn)行比較。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該截止值為固定抗原與未感染患者的樣品保溫時(shí)所得信號的平均值。一般而言，所產(chǎn)生的信號比預(yù)定截止值的標(biāo)準(zhǔn)偏差大3倍的樣品被認(rèn)為是結(jié)核病陽性。在一項(xiàng)備用的優(yōu)選實(shí)施方案中，該截止值是按照Sackett et al.，1985，Clinical EpidemiologyA Basic Science for Clinical Medicine，Little Brown and Co.，pp.106-107中的方法利用ReceiverOperator Curve來確定。簡單地說，該實(shí)施方案中的截止值可根據(jù)成對的真陽性率(即靈敏度)和假陽性率(100％特異性)的曲線來確定，該曲線相當(dāng)于診斷測試結(jié)果中每種可能的截止值。在最接近左上角的曲線上的截止值(即圍有最大面積的值)為最精確的截止值，而所產(chǎn)生的信號大于由該方法確定的截止值的樣品可被認(rèn)為是陽性。作為選擇，也可將截止值沿圖左移使假陽性率最小化，或右移使假陰性率最小化。一般而言，所產(chǎn)生的信號大于由該方法確定的截止值的樣品可被認(rèn)為是結(jié)核病陽性。
在一項(xiàng)相關(guān)實(shí)施方案中，該測定是以快速流通或條型測試形式進(jìn)行，其中的抗原被固定在硝酸纖維素等膜上。在流通測試中，樣品中的抗體隨著樣品流過膜而與固定多肽結(jié)合。然后是檢測試劑(如蛋白A-膠體金)隨著含有檢測試劑的溶液流過膜而與抗體-多肽復(fù)合物結(jié)合。然后按上文所述對結(jié)合的檢測試劑進(jìn)行檢測。在條型測試形式中，將膜上結(jié)合有多肽的一端浸沒在含有樣品的溶液中。樣品沿著膜遷移而經(jīng)過含有檢測試劑的區(qū)域，并遷移到固定多肽區(qū)。檢測試劑在多肽區(qū)聚集則表明樣品中存在抗結(jié)核桿菌抗體。檢測試劑在該位置的聚集通常會形成一種可見的圖案，如一條直線。若沒有該圖案則表明一種陰性結(jié)果。為了產(chǎn)生可從視覺上加以辨別的圖案，一般需對固定在膜上的多肽量進(jìn)行選擇，使生物樣品所含抗體的水平足以在ELISA測定中產(chǎn)生如上文所述的陽性信號。固定在膜上的優(yōu)選多肽量約為5ng-1mg，更優(yōu)選的則約為50ng-500ng。這些測試通常只需使用極少量(如一滴)患者血清或血液即可進(jìn)行。
以下實(shí)施例將作為非限定性例證來對本發(fā)明加以描述。
6.實(shí)施例結(jié)核桿菌抗原的融合蛋白可保持其單一組分的免疫原性6.1.材料與方法6.1.1.融合蛋白的構(gòu)建利用PCR對結(jié)核桿菌抗原的編碼序列進(jìn)行修飾，以促進(jìn)其融合以及隨后的融合蛋白表達(dá)。DNA擴(kuò)增使用10μl 10×Pfu緩沖液、2μl 10mMdNTPs、10μM濃度的每種PCR引物各2μl、81.5μl水、1.5μl PfuDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)和1μl 70ng/μl濃度(用于TbRa3抗原)或50ng/μl濃度(用于38kD和Tb38-1抗原)的DNA。對TbRa3抗原而言，是在94℃下變性2分鐘。然后以96℃下15秒、72℃下1分鐘為一個(gè)循環(huán)，共作40個(gè)循環(huán)，最后是72℃下4分鐘。對38kD抗原而言，是在96℃下變性2分鐘。然后以96℃下30秒、68℃下15秒及72℃下3分鐘為一個(gè)循環(huán)，共作40個(gè)循環(huán)，最后是72℃下4分鐘。對Tb38-1抗原而言，是在94℃下變性2分鐘。然后以96℃下15秒、68℃下15秒及72℃下1.5分鐘為一個(gè)循環(huán)，共作10個(gè)循環(huán)，再以96℃下15秒、64℃下15秒及72℃下1.5分鐘為一個(gè)循環(huán)，共作30個(gè)循環(huán)，最后是72℃下4分鐘。
用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，以產(chǎn)生所需的粘末端或平末端，然后將各融合多肽的特異性多聚核苷酸與表達(dá)質(zhì)粒相連接。所得的各質(zhì)粒則含有各融合多肽的單一抗原的編碼序列。所用的表達(dá)載體為pET-12b和pT7^L2 IL1。
連接抗原Ra12、TbH9和Ra35的三種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號1和2)(圖1A和2B)。連接抗原Erd14、DPV和MTI的三種編碼序列使其編碼第二種融合蛋白(序列編號3和4)(圖2)。連接抗原TbRa3、38kD和Tb38-1的三種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號5和6)(圖3A-3D)。連接抗原TbH9和Tb38-1的兩種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號7和8)(圖4A-4D)。連接抗原TbRa3、38kD、Tb38-1和DPEP的四種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號9和10)(圖5A-5J)。連接抗原Erd14、DPV、MTI、MSL和MTCC2的五種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號11和12)(圖6A和6B)。連接抗原Erd14、DPV、MTI和MSL的四種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號13和14)(圖7A和7B)。連接抗原DPV、MTI、MSL和MTCC2的四種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號15和16)(圖8A和8B)。連接抗原DPV、MTI和MSL的三種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號17和18)(圖9A和9B)。連接抗原TbH9、DPV和MTI的三種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號19和20)(圖10A和10B)。連接抗原Erd14、DPV和MTI的三種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號21和22)(圖11A和11B)。連接抗原TbH9和Ra35的兩種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號23和24)(圖12A和12B)。連接抗原Ra12和DPPD的兩種編碼序列使其編碼一種融合蛋白(序列編號25和26)(圖13A和13B)。
利用pET質(zhì)粒載體(pET-17b)和T7 RNA聚合酶表達(dá)系統(tǒng)(Novagen，Madison，WI)于大腸桿菌中表達(dá)出在氨基端部分帶有6個(gè)組氨酸殘基的重組蛋白。高水平表達(dá)則采用大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLysE(Novagen)。根據(jù)親和層析法用單步QLAexpress Ni-NTA瓊脂糖填料在存在8M脲的情況下從IPTG誘導(dǎo)的500ml批量培養(yǎng)物的可溶性上清或不溶性包涵體中純化重組(His標(biāo)記)融合蛋白。簡單地說，將含有pET構(gòu)建體的BL21的過夜飽和生長培養(yǎng)物共20ml加到500ml含有50μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素的2×YT培養(yǎng)基中，并于37℃下振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD560為0.3時(shí)用2mM IPTG誘導(dǎo)細(xì)菌培養(yǎng)物，并再培養(yǎng)3小時(shí)(OD＝1.3-1.9)。通過離心從500ml批量培養(yǎng)物中收集細(xì)胞，并重懸于20ml含有2mM PMSF和20μg/ml亮肽素并且每25ml還加入1片全蛋白酶抑制劑藥片(Boehringer Mannheim)的結(jié)合緩沖液(0.1M磷酸鈉，pH8.0；10mM Tris-HCl，pH8.0)中。將大腸桿菌簡短超聲后利用凍熔法使其裂解，然后于12k rpm下離心30分鐘，使包涵體沉淀。
用溶于10mM Tris-HCl(pH8.0)的1％CHAPS將包涵體清洗3次。該步驟可使LPS污染的水平大大降低。最后將包涵體溶于20ml含有8M脲的結(jié)合緩沖液中，或直接將8M脲加到可溶上清液中。將帶有His標(biāo)記殘基的重組融合蛋白與Ni-NTA瓊脂糖樹脂(每500ml誘導(dǎo)物使用5ml樹脂)批量結(jié)合，方法是將其于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)并將混合物流經(jīng)一個(gè)層析柱。使流出物再流經(jīng)相同的柱兩次，再用同樣含有8M脲的清洗緩沖液(0.1M磷酸鈉和10mM Tris-HCl，pH6.3)將柱清洗3次，每次30ml。用30ml溶有150mM咪唑的清洗緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白，并按每組份5ml進(jìn)行收集。將含有各重組融合蛋白的組份匯集，并對10mM Tris-HCl(pH8.0)透析，再次與Ni-NTA填料結(jié)合，洗脫，并對10mM Tris-HCl(pH7.8)透析。重組蛋白的產(chǎn)量為每升誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物25-150mg不等，蛋白的純度在98％以上。利用Limulus測定法(BioWhittaker)測定重組蛋白的內(nèi)毒素污染，結(jié)果顯示其含量小于10E.U.Img。
6.1.2.T細(xì)胞增殖測定測定純化的融合多肽在周圍血單核細(xì)胞(PBMC)制品中誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的能力。已知PBMCs的供體在PPD皮膚試驗(yàn)中顯示陽性，并且其T細(xì)胞在對PPD的應(yīng)答中顯示出增殖，結(jié)核桿菌的粗制可溶蛋白則培養(yǎng)在補(bǔ)加有10％收集的人血清和50μg/ml慶大霉素的RPMI1640中。加入0.5-10μg/ml濃度的純化蛋白，一式兩份。在200μl體積的圓底96孔板中培養(yǎng)6天，然后從每個(gè)孔中吸出50μl，用于按下文第6.1.3節(jié)測定IFN-γ的水平。然后再用1μCi/孔的氚化胸腺嘧啶核苷將板脈沖標(biāo)記18小時(shí)，收集，并利用氣體閃爍計(jì)數(shù)儀測定吸收的氚。在兩份測試中均使增殖比僅在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所觀測到的增殖高3倍以上的組份被認(rèn)為是陽性。
6.1.3.干擾素-γ測定在無菌條件下取小鼠脾臟，使紅細(xì)胞裂解后制備出懸浮于完全RPMI的單細(xì)胞懸浮液。在96孔平底微量滴定板中每孔加100μl細(xì)胞(2×105細(xì)胞)。培養(yǎng)物用標(biāo)記的重組蛋白刺激24小時(shí)，測定上清中的IFN-γ。
利用PharMingen的配對抗體及方法通過夾層ELISA法分析上清液中的IFN-γ水平。利用重組小鼠細(xì)胞因子繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用50μl/孔(以1μg/ml濃度溶于0.1M碳酸氫鈉包被緩沖液)的細(xì)胞因子捕獲mAb(大鼠抗小鼠IFN-γ(PharMingen；目錄號18181D))包被ELISA板(Corning)，并在室溫下保溫4小時(shí)。倒出板中的液體，并在4℃下用PBS-0.05％吐溫、1.0％BSA(200μl/孔)阻斷過夜，再用PBS-0.1％吐溫清洗6次。然后加入稀釋于PBS-0.05％吐溫、0.1％BSA的標(biāo)準(zhǔn)樣品(小鼠IFN-γ)和上清液樣品，室溫下放置2小時(shí)。按上文所述清洗板，然后加入100μl/孔以0.5μg/ml濃度稀釋于PBS-0.05％吐溫、0.1％BSA的二抗(生物素大鼠α小鼠IFN-γ(目錄號18112D；PharMingen))，室溫下保溫2小時(shí)。清洗板，然后加入100μl/孔以1∶2500稀釋度稀釋于PBS-0.05％吐溫、0.1％BSA的抗生蛋白鏈菌素-HRP(Zymed)，室溫下保溫1小時(shí)。最后一次清洗板，然后用100μl/孔的TMB底物(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺，Kirkegaard and Perry，Gaithersburg，MD)顯色，并在顯出顏色后用50μl/孔的H2SO4終止反應(yīng)。以570nm為參比波長在450nm下測量吸光度(OD)，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子的濃度。
6.2.結(jié)果6.2.1.三體融合蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答將三種結(jié)核桿菌抗原的編碼序列插入表達(dá)載體中產(chǎn)生一種融合蛋白。將表示為Ra12、TbH9和Ra35的抗原以一種重組融合蛋白形式產(chǎn)生(圖1A和1B)?？乖璄rd14、DPV和MTI以第二種融合蛋白形式產(chǎn)生(圖2)。將這兩種融合蛋白親和純化，并用于體外及體內(nèi)測定。
測試這兩種融合蛋白對6個(gè)PPD+受試者的T細(xì)胞應(yīng)答的刺激能力。在T細(xì)胞增殖測定中，這兩種融合蛋白均顯示出與其單一組分相類似的反應(yīng)性模式(圖14A-14F)。對IFN-γ產(chǎn)生的測定也獲得了類似的結(jié)果(圖15A-15F)。例如，受試者D160單一的TbH9和MTI抗原均產(chǎn)生應(yīng)答。該受試者也對含有這些抗原的融合蛋白產(chǎn)生應(yīng)答(圖14B和15B)。相比之下，未觀測到D160對其它單一抗原產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答。另一受試者D201不對單一的Erd14、DPV和MTI抗原起反應(yīng)，同時(shí)也不對含有這些抗原的融合蛋白起反應(yīng)。應(yīng)注意到的是，T細(xì)胞對融合蛋白的各單一組分的應(yīng)答并不是特別強(qiáng)，而在大多數(shù)情況下，由融合蛋白刺激的應(yīng)答要等于或高于由單一抗原誘導(dǎo)的應(yīng)答。
另外也將Ra12-TbH9-Ra35三體融合蛋白作為免疫原進(jìn)行了體內(nèi)測試。在這些實(shí)驗(yàn)中是將融合蛋白注射到小鼠腳墊中來進(jìn)行免疫。以三只小鼠為一組，每組注射與不同佐劑混合的蛋白SBAS1c、SBAS2(Ling et al.，1997，Vaccine 151562-1567)、SBAS 7和AL(OH)3。每隔3周進(jìn)行一次皮下免疫，如此進(jìn)行2次，然后于1周后處死小鼠，并收集引流淋巴節(jié)，以作為應(yīng)答細(xì)胞在T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生測定中使用。
無論在免疫中使用哪種佐劑，將TbH9作為單一抗原使用時(shí)均可誘導(dǎo)出對TbH9的強(qiáng)T細(xì)胞增殖應(yīng)答(圖16A)。誘導(dǎo)的對Ra35和Ra12的應(yīng)答則較弱(圖16B和16C)。當(dāng)把Ra12-TbH9-Ra35融合蛋白作為免疫原使用時(shí)，則觀測到與其單一組分所誘導(dǎo)的應(yīng)答相類似的應(yīng)答。
在細(xì)胞因子產(chǎn)生測定中，使用SBAS1c和SBAS2佐劑的樣品產(chǎn)生了相似的IFN-γ(圖17)和IL-4應(yīng)答(圖18)。而聯(lián)合使用SBAS7和氫氧化鋁的樣品卻產(chǎn)生了所有三種抗原中最強(qiáng)IFN-γ應(yīng)答和最低的IL-4產(chǎn)生水平。對體內(nèi)的體液抗體應(yīng)答而言，圖19A-19F表明融合蛋白與三種佐劑中的如何一種共同使用均可誘導(dǎo)出IgG1及IgG2a抗原特異性應(yīng)答。
此外，還利用各含有Ra12-TbH9-Ra35(Mtb32A)或Erd14-DPV-MTI(Mtb39A)編碼序列的兩種表達(dá)構(gòu)建體的聯(lián)合物作為DNA疫苗對C57BL/6小鼠進(jìn)行了免疫。免疫動(dòng)物在隨后的以活細(xì)菌噴霧劑進(jìn)行誘發(fā)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的防結(jié)核病能力。根據(jù)這些結(jié)果，還制備了含有Mtb32A和Mtb39A編碼序列的融合構(gòu)建體，并在豚鼠的長期保護(hù)模型中測試了其編碼產(chǎn)物。這些研究是在含有一種佐劑的制劑中使用單一重組融合蛋白或Mtb32A蛋白與Mtb3A蛋白的混合物對豚鼠進(jìn)行免疫。圖20A-20C表明，利用與SBAS1c或SBAS2混合的融合蛋白免疫的小鼠與利用相同佐劑及兩種抗原的混合物免疫的動(dòng)物相比可在隨后的誘發(fā)實(shí)驗(yàn)中顯示出更好的防結(jié)核病發(fā)生能力。與SBAS2制劑混合的融合蛋白為動(dòng)物提供了最強(qiáng)的保護(hù)。因此，各種結(jié)核桿菌抗原的融合蛋白可作為比其單一組分的混合物更有效的免疫原在疫苗制劑中使用。
6.2.2.二體融合蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答利用重組方法產(chǎn)生含有TbH9和Tb38-1抗原并且無連接序列的二體融合蛋白。測定TbH9-Tb38-1融合蛋白誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖及IFN-γ產(chǎn)生的能力。所使用的PBMC來自三個(gè)供體一個(gè)供體此前已顯示出可對TbH9應(yīng)答但不對Tb38-1應(yīng)答(供體131)；一個(gè)供體已顯示出可對Tb38-1應(yīng)答但不對TbH9應(yīng)答(供體184)；一個(gè)供體已顯示出對兩種抗原均可應(yīng)答(供體201)。這些研究的結(jié)果可表明融合蛋白中兩種抗原的功能活性(圖21A和21B，22A和22B，及23A和23B)。
6.2.3.結(jié)核病患者的血清與四體融合蛋白的反應(yīng)利用重組方法產(chǎn)生含有TbRa3、38KD抗原、Tb38-1和DPEP的融合蛋白。通過ELISA檢測該表示為TbF-2的四體融合蛋白與結(jié)核桿菌感染患者的血清的反應(yīng)性。這些研究的結(jié)果(表1)說明，所有四種抗原可在該融合蛋白中獨(dú)立發(fā)揮功能。
該領(lǐng)域的技術(shù)人員都將認(rèn)可，單一抗原在各融合蛋白內(nèi)的順序可有所改變，并且若每種抗原決定簇仍能夠具有功能，則也可獲得類似的活性。此外，含有活性抗原決定簇的截尾形式的蛋白也可在融合蛋白的構(gòu)建中使用。
本發(fā)明并不局限于實(shí)例性實(shí)施方案的范圍內(nèi)，這些實(shí)施方案只作為本發(fā)明的個(gè)別方面的例證，而任何在功能上等價(jià)的克隆、核苷酸序列或氨基酸序列均處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實(shí)上，根據(jù)上文的描述以及附圖，除文中所述之外的其它多種變化形式對該領(lǐng)域的技術(shù)人員而言均是顯而易見的。附加權(quán)利要求將會把這些變化形式均包括在內(nèi)。還應(yīng)了解的是，所有核苷酸的堿基數(shù)都是近似值，并且使用這些數(shù)字的目的是為了進(jìn)行描述。
文中引用的所有出版物均被全面包含在內(nèi)以作為參考。
表1TBF-2融合蛋白與TB血清和正常血清的反應(yīng)性
權(quán)利要求
1.一種純化的多肽，該多肽由選自SEQ ID NOS4、12、14、16、18、20、22和24的氨基酸序列組成，所述氨基酸序列可以任選包含一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸替代。
2.權(quán)利要求1的多肽，該多肽為一種可溶性多肽。
3.權(quán)利要求1的多肽，該多肽是經(jīng)重組DNA方法產(chǎn)生。
4.權(quán)利要求1的多肽，該多肽是經(jīng)化學(xué)合成方法產(chǎn)生。
5.權(quán)利要求1的多肽，該多肽可誘導(dǎo)一種抗體應(yīng)答。
6.權(quán)利要求1的多肽，該多肽可誘導(dǎo)一種T細(xì)胞應(yīng)答。
7.權(quán)利要求1的多肽，該多肽可與異源的第二多肽融合。
8.一種藥用組合物，該組合物含有權(quán)利要求1的多肽。
9.一種藥用組合物，該組合物含有編碼權(quán)利要求1的多肽的多核苷酸。
10.權(quán)利要求8的藥用組合物，進(jìn)一步包含一種佐劑。
11.權(quán)利要求10的藥用組合物，其中該佐劑包含至少一種選自3D-MPL和QS21的成分。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中該組合物在水包油乳劑中配制。
13.一種純化的多肽，該多肽由SEQ ID NO24的氨基酸序列組成，所述氨基酸序列可以任選包含一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸替代。
14.一種藥用組合物，該組合物含有權(quán)利要求13的多肽。
15.權(quán)利要求14的藥用組合物，進(jìn)一步包含一種佐劑。
16.權(quán)利要求15的藥用組合物，其中該佐劑包含至少一種選自3D-MPL和QS21的成分。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中該組合物在水包油乳劑中配制。
18.一種純化的多核苷酸，該多核苷酸由選自SEQ ID NOS3、11、13、15、17、19、21和23的核苷酸序列組成，所述核苷酸序列可以任選編碼一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸替代。
19.一種純化的多核苷酸，該多核苷酸由SEQ ID NO23的核苷酸序列組成，所述核苷酸序列可以任選編碼一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸替代。
20.由選自SEQ ID NOS4、12、14、16、18、20、22和24的氨基酸序列組成的純化融合蛋白在制備用于預(yù)防或治療結(jié)核病的藥物中的用途。
21.編碼由選自SEQ ID NOS4、12、14、16、18、20、22和24的氨基酸序列組成的融合蛋白的純化多核苷酸在制備用于預(yù)防或治療結(jié)核病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及至少含有兩種結(jié)核桿菌抗原的融合蛋白。詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及含有兩種單一結(jié)核桿菌抗原的二體融合蛋白、含有三種結(jié)核桿菌抗原的三體融合蛋白、含有四種結(jié)核桿菌抗原的四體融合蛋白和含有五種結(jié)核桿菌抗原的五體融合蛋白，以及這些蛋白在結(jié)核病感染的診斷、治療和預(yù)防中的應(yīng)用。
文檔編號A61P31/06GK1629185SQ20041006184
公開日2005年6月22日 申請日期1999年4月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月7日
發(fā)明者Y·A·W·斯凱基, M·阿爾德森, A·坎波斯-尼托 申請人:科里克薩公司