專利名稱：化學(xué)上定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子和其偶聯(lián)物的制作方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1994年9月8日，申請(qǐng)?zhí)枮?4193993.6，發(fā)明名稱為“化學(xué)上定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子和其偶聯(lián)物”的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及用于治療諸如自身免疫疾病全身性紅斑狼瘡(SLE或“狼瘡”)的含有與生物或合成分子如多核苷酸偶聯(lián)的化學(xué)上定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子(valency platform molecule)的偶聯(lián)物。本發(fā)明還涉及這種化學(xué)上定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子。
已有多種化合物作為生物有用分子的載體用于制備被認(rèn)為是致免疫耐受的偶聯(lián)物。例如，Benacerraf、katz和他們的同事研究并介紹了D-谷氨酸/D-賴氨酸無規(guī)共聚物與半抗原和各種抗原的偶聯(lián)物用于誘導(dǎo)特異的免疫耐受性，這種無規(guī)共聚物在早期文獻(xiàn)中稱為D-GL(以下稱為D-EK)。見美國(guó)專利4,191,668和4,220,565。
其他研究者已研究了核苷或DNA與其他載體的偶聯(lián)物。 Borel等(Science(1973)18276)在年青NZB系小鼠中評(píng)價(jià)了同源鼠IgG-核苷偶聯(lián)物降低對(duì)變性DNA抗體反應(yīng)的能力。Parker(J.Im-munol.(1974)113292)等獨(dú)立研究評(píng)價(jià)了與聚-D-賴氨酸和/或環(huán)磷酰胺偶聯(lián)的變性DNA對(duì)上述綜合癥在NZB小鼠中發(fā)展的作用。
在后期的文章(Ann NY Acad.Sci.(1986)475296-306)中，Borel等描述了寡核苷酸-免疫球蛋白偶聯(lián)物。Borel等(J.Clin.In-vest.(1988)821901-1907或美國(guó)專利4,650,675)描述了使用人免疫球蛋白與DNA偶聯(lián)物的體外研究。美國(guó)專利5,126,131(Dintzis等)還涉及包含載體和免疫應(yīng)答中所涉及分子的偶聯(lián)物。
其他文獻(xiàn)描述了非免疫原性聚合物和免疫原的偶聯(lián)物(Saski等，Scand.J.Immun.(1982)16191-200；Sehon，Prog.Allergy(1982)32161-202；Wilkinson等，J.Immunol.(1987)139326-331，和Borel等，J.Immunol.Methods(1990)126159-168)。
公有的美國(guó)專利流水號(hào)07/914 869，美國(guó)專利5,162,515和07/652,658中描述了含聚合載體如D-EK、聚乙二醇、聚-D-賴氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮以及免疫球蛋白的偶聯(lián)物。
總之，申請(qǐng)人相信現(xiàn)有技術(shù)中顯示的只是具有許多非特異性結(jié)合位點(diǎn)的定義不清的化學(xué)化合物用作偶聯(lián)物中的價(jià)平臺(tái)分子。因?yàn)檫@種化合物的價(jià)、結(jié)合位點(diǎn)的具體位置、和結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目都是不可預(yù)測(cè)的并且變化范圍寬，所以含有這種化合物的現(xiàn)有技術(shù)偶聯(lián)物不能重現(xiàn)，并且報(bào)導(dǎo)的活性范圍寬。
與上述的現(xiàn)有技術(shù)不同，申請(qǐng)人開發(fā)了含化學(xué)上定義的、非聚合的價(jià)平臺(tái)分子的偶聯(lián)物，其中價(jià)平臺(tái)分子的價(jià)是預(yù)先確定的，而且其中每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可供結(jié)合生物或合成分子。在本發(fā)明中用化學(xué)結(jié)構(gòu)、價(jià)、均一性和適于與適當(dāng)生物和/或合成分子有效偶聯(lián)的確定的化學(xué)特性來定義價(jià)平臺(tái)分子。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及含有這種化學(xué)上定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子和生物和/或合成分子的偶聯(lián)物。適于與化學(xué)上定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子偶聯(lián)形成本發(fā)明偶聯(lián)物的生物和/或合成分子的例子為糖、藥物、脂類、脂多糖、肽、蛋白、糖蛋白、單鏈或雙鏈寡核苷酸和其化學(xué)類似物、免疫原類似物、半抗原、擬表位(mimotope)、ap-tamer等。在本發(fā)明中適用的化學(xué)上定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子包括但不限于下式的生物相容的非免疫原性碳基化合物的衍生物G[1]{T[1].}n[1]]]>式1或G[2]{L[2]-J[2]-Z[2](T[2])p[2]}n[2]]]>式2其中每個(gè)G[1]和G[2]存在時(shí)獨(dú)立地為含有1-2000(更優(yōu)選1-1000)個(gè)選自C、N、O、Si、P和S的鏈原子的線性、支化或多支化鏈；更優(yōu)選，G[2]存在時(shí)為從聚醇、聚胺或聚酯衍生的殘基；最優(yōu)選G[2]選自-(CH2)q-(其中q＝0到20)、-CH2(CH2OCH2)rCH2-(其中r＝0到300)和C(CH2OCH2CH2-)s(OH)4-s(其中s＝1到4，更優(yōu)選s＝3到4)；n[1]個(gè)T[1]所示殘基和p[2]×n[2]個(gè)T[2]所示殘基中每個(gè)獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)，C(＝O)NHNHRSUB(酰肼)，NHNHRSUB(肼)，C(＝O)OH(羧酸)，C(＝O)ORESTER(活化酯)，C(＝O)OC(＝O)RB(酸酐)，C(＝O)X(羧酰鹵)，S(＝O)2X(磺酰鹵)，C(＝NRSUB)ORSUB(亞氨酸酯)，NCO(異氰酸酯)，NCS(異硫氰酸酯)，OC(＝O)X(鹵代甲酸酯)，C(＝O)OC(＝NRSUB)NHRSUB(碳化二亞胺加成物)，C(＝O)H(醛)，C(＝O)RB(酮)，SH(巰基或硫醇)、OH(醇)，C(＝O)CH2X(鹵代乙?；?，RAlkX(鹵代烷)，S(＝O)2ORAlkX(磺酸烷酯)，其中R1R2為-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(馬來酰亞胺)，C(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不飽和羰基)，RAlk-Hg-X(烷基汞化合物)和S(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不飽和砜)；更優(yōu)選，n[1]個(gè)T[1]所示殘基和p[2]×n[2]個(gè)T[2]所示殘基中每個(gè)獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)，C(＝O)CH2X(鹵代乙酰)，RAlkX(鹵代烷)，S(＝O)2ORAlkX(磺酸烷酯)，其中R1R2為-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(馬來酰亞胺)，C(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不飽和羰基)，RAlk-Hg-X(烷基汞化合物)，和S(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不飽和砜)；更優(yōu)選，n[1]個(gè)T[1]所示殘基和p[2]×n[2]個(gè)T[2]所示殘基中，每個(gè)獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)，C(＝O)CH2X(鹵代乙酰)，其中R1R2為-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(馬來酰亞胺)和C(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不飽和羰基)；最優(yōu)選，n[1]個(gè)T[1]所示殘基和p[2]×n[2]個(gè)T[2]所示殘基均相同；其中每個(gè)X獨(dú)立地為原子序數(shù)大于16而小于54的鹵素或其他好的離去基團(tuán)(即，在此情形中與鹵素作用相似的弱堿，如烷基或烷基取代的磺酸酯或硫酸酯和類似物，芳基或芳基取代的磺酸酯或硫酸酯和類似物)；每個(gè)RAlk獨(dú)立地為H，線性、支化或環(huán)形烷基(1-20C)；
每個(gè)RSUB獨(dú)立地為H，線性、支化或環(huán)形烷基(1-20C)，芳基(6-20C)，或烷芳基(7-30C)；每個(gè)RESTER獨(dú)立地為N-琥珀酰亞氨基，對(duì)硝基苯基，五氟苯基，四氟苯基，五氯苯基，2，4，5-三氯苯基，2，4-二硝基苯基，氰基甲基等，或其他活化基團(tuán)如5-氯-8-喹諾酮-1-基，1-哌啶基，1-苯并三唑基等；每個(gè)RB獨(dú)立地為含1-50個(gè)選自C、H、N、O、Si、P和S的原子的基團(tuán)；n[2]個(gè)L[2]所示殘基，存在時(shí)每個(gè)獨(dú)立地選自O(shè)、NRSUB和S；n[2]個(gè)J[2]所示殘基，存在時(shí)每個(gè)獨(dú)立地選自C(＝O)和C(＝S)；n[1]＝1-32，更優(yōu)選n[1]＝2-16，更優(yōu)選n[1]＝2-8，最優(yōu)選n[1]＝2-4；n[2]＝1-32，更優(yōu)選n[2]＝1-16，更優(yōu)選n[2]＝1-8，更優(yōu)選n[2]＝1-4，最優(yōu)選n[1]＝1-2；p[2]＝1-8，更優(yōu)選p[2]＝1-4，最優(yōu)選p[2]＝1-2；條件是n[2]×p[2]的值大于1而小于33；n[2]個(gè)Z[2]所示殘基每個(gè)獨(dú)立地為包含1-200個(gè)選自C、H、N、O、Si、P和S的原子的基團(tuán)，并在烷基、鏈烯基、或芳香碳原子上，含有供至少p[2]個(gè)功能團(tuán)結(jié)合的位點(diǎn)；更優(yōu)n[2]個(gè)Z[2]所示殘基都相同；更優(yōu)選，n[2]個(gè)Z[2]所示殘基每個(gè)獨(dú)立地由選自下組的化學(xué)式表示
Z[2]為W[3]-Y[3](結(jié)合位點(diǎn))p[2]式3Z[2]為W[4]-N{Y[4](結(jié)合位點(diǎn))p[2]/2}2式4Z[2]為W[5]-CH{Y[5](結(jié)合位點(diǎn))p[2]/2}2式5其中n[2]個(gè)W[3]、W[4]或W[5]所示殘基，存在時(shí)每個(gè)獨(dú)立地為包含1-100個(gè)選自C、H、N、O、Si、P和S的原子的基團(tuán)；n[2]個(gè)Y[3]所示殘基、2×n[2]個(gè)Y[4]所示殘基和2×n[2]個(gè)Y[5]所示殘基，每個(gè)獨(dú)立地為包含選自C、H、N、O、Si、P和S的1-100個(gè)原子的基團(tuán)，并在烷基、鏈烯基、或芳香碳原子上含有供至少p[2](對(duì)Y[3]而言)或p[2]/2(對(duì)Y[4]和Y[5]而言，其中p[2]/2為整數(shù))個(gè)功能團(tuán)結(jié)合的位點(diǎn)；更優(yōu)選，n[2]個(gè)W[3]所示殘基存在時(shí)每個(gè)獨(dú)立地選自(CH2)r，(CH2CH2O)r，NRSUB(CH2CH2O)rCH2CH2，和NRSUB(CH2)rNRSUBC(＝O)，中r＝1-10；更優(yōu)選，n[2]個(gè)Y[3]所示殘基每個(gè)獨(dú)立地為線性、支化或環(huán)形烷基(1-20C)，芳基(6-20C)，或烷芳基(7-30C)；最優(yōu)選n[2]個(gè)Y[3]表示的殘基每個(gè)獨(dú)立地選自C6H4(苯-1，4-二基)，C6H3(苯-1，3，5-三基)和(CH2)r，其中r＝1-10；更優(yōu)選，n[2]個(gè)W[4]所示殘基每個(gè)存在時(shí)獨(dú)立地選自(CH2)rC(＝O)和(CH2)rNRSUBC(＝O)，其中r＝1-10；更優(yōu)選，2×n[2]個(gè)Y[4]所示殘基獨(dú)立地選自(CH2)r，
(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)q，(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q，(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r，(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r，(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2CH2O)qCH2CH2，和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2CH2O)qCH2CH2，其中r＝1-10，更優(yōu)選r＝2-6，及q＝1-10，更優(yōu)選q＝1-3；更優(yōu)選，n[2]個(gè)W[5]表示的殘基每個(gè)存在時(shí)獨(dú)立地選自(CH2)rC(＝O)NRSUB和(CH2)rNRSUBC(＝O)NRSUB，其中r＝1-10；更優(yōu)選2×n[2]個(gè)Y[5]所示殘基每個(gè)獨(dú)立地選自(CH2)r和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q，其中r＝1-10，q＝1-10。
在治療狼瘡的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，偶聯(lián)物包括化學(xué)上定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子和各自與此平臺(tái)分子結(jié)合的至少約20個(gè)堿基對(duì)、并對(duì)人SLE抗dsDNA自身抗體有顯著的結(jié)合活性的多個(gè)多核苷酸雙鏈體。這些優(yōu)選實(shí)施方案中，多核苷酸雙鏈體在長(zhǎng)度上是基本均一的，雙鏈體的一條鏈直接或通過一接頭分子與價(jià)平臺(tái)分子偶聯(lián)。通常在偶聯(lián)到價(jià)平臺(tái)分子上之前，合成多核苷酸與一接頭分子偶聯(lián)。含接頭的雙鏈體鏈通常在或接近(即，約5個(gè)bp內(nèi))其一個(gè)末端處偶聯(lián)，使每個(gè)鏈形成一個(gè)至少約20個(gè)bp的側(cè)鏈，從該鏈與接頭分子的結(jié)合位點(diǎn)起算。然后將第二條鏈退火至第一條鏈上形成雙鏈體。因此，本發(fā)明的一類偶聯(lián)物可由下式綜合表示[(PN)n-接頭]m-價(jià)平臺(tái)分子其中PN＝具有n個(gè)核苷酸的雙鏈多核苷酸，其中n至少為約20，m＝2-8。
本發(fā)明的適宜接頭分子的例子為六碳硫醇如HAD，硫代六碳鏈磷酸酯和HADPS，即硫代六碳鏈硫代磷酸酯。本發(fā)明的化學(xué)上定義的價(jià)平臺(tái)分子例如通過氨基修飾的PEG與下列物質(zhì)反應(yīng)制得3，5-二-(碘代乙酰氨基)苯甲酰氯(以下稱為“IA-DABA”)；3-羧基丙酰胺-N，N-二-[(6’-N’-芐氧羰基氨基己基)乙酰胺]4”-硝基苯酯(以下稱為“BAHA”)；3-羧基丙酰胺-N，N-二-[(8’-N’-芐氧羰基氨基-3’，6’-二氧雜辛基)乙酰胺]4”-硝基苯酯(以下稱為“BAHAox”)；或通過PEG-二-氯代甲酸酯與N，N-二(2-[6’-N’-芐氧羰基氨基己酰氨基]乙基)胺(以下稱為“AHAB”)反應(yīng)形成化學(xué)上定義的價(jià)平臺(tái)分子。
當(dāng)與現(xiàn)有技術(shù)中描述的聚合載體相比時(shí)，令人驚異地發(fā)現(xiàn)使用含本發(fā)明的化學(xué)上定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子和生物或合成分子(不是半抗原)的偶聯(lián)物，獲得的免疫抑制結(jié)果提高了至少約10倍到100倍以上。例如與含現(xiàn)有技術(shù)限定不明的載體的偶聯(lián)物相比，使用含化學(xué)定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子的本發(fā)明偶聯(lián)物，如本文所述抗dsDNA自體抗體的免疫抑制提高了至少100倍。
本發(fā)明的另一方面是具有(a)和(b)的偶聯(lián)物，(a)化學(xué)定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子，(b)多個(gè)多核苷酸雙鏈體，其中每個(gè)通過雙鏈體一條鏈末端或近末端的功能團(tuán)與價(jià)平臺(tái)分子結(jié)合，所述偶聯(lián)物為人SLE耐受原。
含有上述偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物是本發(fā)明的另一方面。
本發(fā)明的又一方面是在需要治療的個(gè)體上治療SLE的方法，包括給予該個(gè)體有效量的上述偶聯(lián)物。
本發(fā)明的再一方面是誘導(dǎo)個(gè)體中特異B細(xì)胞對(duì)免疫原無反應(yīng)的方法，其包括給予該個(gè)體有效量的上述偶聯(lián)物。
本發(fā)明的另一方面是治療個(gè)體中抗體所介導(dǎo)的病理過程的方法，該病理過程中對(duì)一種免疫原應(yīng)答產(chǎn)生了不良的抗體，該方法包括給予所述個(gè)體有效量的上述偶聯(lián)物。
本發(fā)明的又一方面是上述治療SLE的偶聯(lián)物的制備方法，包括將各自長(zhǎng)至少為約20個(gè)核苷酸并在或接近其一個(gè)末端處帶有功能團(tuán)的多個(gè)單鏈多核苷酸，與化學(xué)定義的價(jià)平臺(tái)分子上的功能團(tuán)反應(yīng)以形成偶聯(lián)物，并將互補(bǔ)的單鏈多核苷酸退火到與化學(xué)定義的價(jià)平臺(tái)分子偶聯(lián)的單鏈多核苷酸上，以形成雙鏈DNA側(cè)鏈。
本發(fā)明的再一方面涉及下式的化學(xué)定義的非聚合新價(jià)平臺(tái)分子G[6]{O-C(=O)-NRSUB-Q[6](T[6])p[6]}n[6]]]>式6或G[7]{O-C(=O)-N[Q[7](T[7])p[7]/2]2}n[7]]]>式7其中每個(gè)G[6]和G[7]存在時(shí)獨(dú)立地為含有1-2000(更優(yōu)選1-1000)個(gè)選自C、N、O、Si、P和S的鏈原子的線性、支化或多支化鏈；更優(yōu)選，G[6]和G[7]各自為從聚醇、聚胺或聚二醇衍生的殘基；最優(yōu)選G[6]和G[7]各自選自-(CH2)q-(其中q＝0到20)、-CH2(CH2OCH2)rCH2-(其中r＝0到300)和C(CH2OCH2CH2-)s(OH)4-s(其中s＝1到4，更優(yōu)選s＝3到4)；
n[6]×p[6]個(gè)T[6]所示殘基和n[7]×p[7]個(gè)T[7]所示殘基中每個(gè)獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)，C(＝O)NHNHRSUB(酰肼)，NHNHRSUB(肼)，C(＝O)OH(羧酸)，C(＝O)ORESTER(活化酯)，C(＝O)OC(＝O)RB(酸酐)，C(＝O)X(羧酰鹵)，S(＝O)2X(磺酰鹵)，C(＝NRSUB)ORSUB(亞氨酸酯)，NCO(異氰酸酯)，NCS(異硫氰酸酯)，OC(＝O)X(鹵代甲酸酯)，C(＝O)OC(＝NRSUB)NHRSUB(碳化二亞胺加成物)，C(＝O)H(醛)，C(＝O)RB(酮)，SH(巰基或硫醇)、OH(醇)，C(＝O)CH2X(鹵代乙?；?，RAlkX(鹵代烷)，S(＝O)2ORAlkX(磺酸烷酯)，其中R1R2為-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(馬來酰亞胺)，C(＝O)CRB＝C2B(α，β-不飽和羰基)，RAlk-Hg-X(烷基汞化合物)和S(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不飽和砜)；更優(yōu)選，n[6]×p[6]個(gè)T[6]所示殘基和n[7]×p[7]個(gè)T[7]所示殘基中每個(gè)獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)，C(＝O)CH2X(鹵代乙酰)，RAlkX(鹵代烷)、S(＝O)2ORAlkX(磺酸烷酯)，其中R1R2為-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(馬來酰亞胺)，C(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不飽和羰基)，RAlk-Hg-X(烷基汞化合物)，和S(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不飽和砜)；更優(yōu)選，n[6]×p[6]個(gè)T[6]所示殘基和n[7]×p[7]個(gè)T[7]所示殘基中，每個(gè)獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)，C(＝O)CH2X(鹵代乙酰)，其中R1R2為-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-的NR1R2(馬來酰亞胺)和C(＝O)CRB＝CR2B(α，β-不飽和羰基)；最優(yōu)選，n[6]×p[6]個(gè)T[6]所示殘基和n[7]×p[7]個(gè)T[7]所示殘基均相同；
其中每個(gè)X獨(dú)立地為原子序數(shù)大于16而小于54的鹵素或其他好的離去基團(tuán)；每個(gè)RAlk獨(dú)立地為H，線性、支化或環(huán)形烷基(1-20C)；每個(gè)RSUB獨(dú)立地為H，線性、支化或環(huán)形烷基(1-20C)，芳基(6-20C)，或烷芳基(7-30C)；每個(gè)RESTER獨(dú)立地為N-琥珀酰亞氨蜞，對(duì)硝基苯基，五氟苯基，四氟苯基，五氯苯基，2，4，5-三氯苯基，2，4-二硝基苯基，氰基甲基等；每個(gè)RB獨(dú)立地為含1-50個(gè)選自C、H、N、O、Si、P和S的原子的基團(tuán)；n[6]＝1-32，優(yōu)選n[6]＝1-16，更優(yōu)選n[6]＝1-8，更優(yōu)選n[6]＝1-4，最優(yōu)選n[6]＝1-2；p[6]＝1-8，更優(yōu)選p[6]＝1-4，最優(yōu)選p[6]＝1-2；條件是n[6]×p[6]的值大于1而小于33；n[7]＝1-32，更優(yōu)選n[7]＝1-16，更優(yōu)選n[7]＝1-8，更優(yōu)選n[7]＝1-4，最優(yōu)選n[7]＝1-2；p[7]＝1-8，更優(yōu)選p[7]＝1-4，最優(yōu)選p[7]＝1-2；條件是，n[7]×p[7]的值大于1而小于33；n[6]個(gè)Q[6]所示殘基和2×n[7]個(gè)Q[7]所示殘基每個(gè)獨(dú)立地為包含1-100個(gè)選自C、H、N、O、Si、P和S的原子的基團(tuán)，并在烷基、鏈烯基、或芳香碳原子上含有供至少p[6]個(gè)(對(duì)Q[6]而言)或p[7]/2個(gè)(對(duì)Q[7]而言，其中p[7]/2為整數(shù))功能團(tuán)結(jié)合的位點(diǎn)；更優(yōu)選，n[6]個(gè)Q[6]所示殘基相同；
更優(yōu)選，2×n[7]個(gè)Z[7]所示殘基都相同；更優(yōu)選，n[6]個(gè)Q[6]所示殘基每個(gè)獨(dú)立地選自CH[(CH2)r(結(jié)合位點(diǎn))]2和CH[(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q(結(jié)合位點(diǎn))]2，其中r＝1-10，q＝1-10；更優(yōu)選，2×n[7]個(gè)Q[7]所示基團(tuán)每個(gè)獨(dú)立地選自(CH2)r，(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)q，(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q，(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r，(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r，(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2CH2O)qCH2CH2，和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2CH2O)qCH2CH2，其中r＝1-10，更優(yōu)選r＝2-6，q＝1-10，更優(yōu)選q＝1-3。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1表示用PN-KLH致敏的小鼠中抗PN的應(yīng)答，小鼠用所示劑量的偶聯(lián)物17-II-[(PN)20-BAHA]-EDDA-處理，或用鹽水處理并注射加強(qiáng)劑量的PN-KLH，5天后放血。按Farr檢測(cè)法用10-8M的放射標(biāo)記PN檢測(cè)血清的3個(gè)稀釋度，結(jié)果用抗PN抗體的降低百分?jǐn)?shù)來表示。每組5只小鼠。
圖2表示用PN-KLH致敏的小鼠中抗KLH的應(yīng)答，小鼠用所示劑量的偶聯(lián)物17-II-[(PN)20-BAHA]-EDDA-處理，并注射加強(qiáng)劑量的的PN-KLH，5天后放血。通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA，檢測(cè)抗KLH的抗體。結(jié)果用抗血清標(biāo)準(zhǔn)品的百分?jǐn)?shù)表示。每組5只小鼠。
圖3表示用PN-KLH致敏的小鼠中抗PN的應(yīng)答，小鼠用所示劑量的[(PN)16-BAHAOX]-EDDA(偶聯(lián)物11-IV)、[(PN)20-BAHAOX]-EDDA(偶聯(lián)物11-II)、[(PN)24-BAHAOX]-EDDA(偶聯(lián)物11-VI)或[(PN)32-BAHAOX]-EDDA(偶聯(lián)物11-VIII)處理，并注射加強(qiáng)劑量的PN-KLH，5天后放血。按Farr檢測(cè)法，用10-8放射標(biāo)記PN檢測(cè)血清。每組5只小鼠。
圖4表示在用PN-KLH致敏的小鼠中抗PN的應(yīng)答，小鼠用所示劑量的(PN)20-HAD-AHAB-TEG(偶聯(lián)物20-II)、或僅用HAD-AHAB、或僅用PN、或用它們的混合物處理，然后加強(qiáng)注射PN-KLH，5天后放血。按Farr檢測(cè)法，用10-8M濃度的放射標(biāo)記PN檢測(cè)血清。計(jì)算降低百分率并給出數(shù)據(jù)。每組5只小鼠。
圖5表示PN-KLH致敏的小鼠中抗-PN的應(yīng)答，小鼠用所示劑量的(PN)20-HADPS-TEG(偶聯(lián)物20-IV)處理，然后用PN-KLH加強(qiáng)，5天后放血。按Farr檢測(cè)法，用10-8M濃度的放射標(biāo)記PN檢測(cè)血清。每組5只小鼠。
圖6A-B表示偶聯(lián)物3-I、3-II、11-I、11-II、11-IV、11-VI、11-VIII、17-I、17-II、20-I、20-II、20-III和20-IV中，衍化的價(jià)平臺(tái)分子和將多核苷酸偶聯(lián)到平臺(tái)分子上的接頭的結(jié)構(gòu)。
圖7表示衍化的價(jià)平臺(tái)分子“HAD-AHAD-TEG”的結(jié)構(gòu)。
圖8比較蜂毒蛋白(melittin)肽誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖水平。
圖9比較用蜂毒蛋白肽偶聯(lián)物2處理的小鼠產(chǎn)生的抗-蜂毒蛋白肽2抗體水平和用配制緩沖液處理的對(duì)照組小鼠的水平。
圖10比較用蜂毒蛋白肽偶聯(lián)物2處理的小鼠產(chǎn)生的抗蜂毒蛋白抗體水平和用配制緩沖液處理的對(duì)照組小鼠的水平。
圖11比較用蜂毒蛋白肽偶聯(lián)物2處理的小鼠中產(chǎn)生蜂毒蛋白肽2抗體的細(xì)胞水平和用配制緩沖液處理的對(duì)照小鼠的水平。
圖12證明蜂毒蛋白肽偶聯(lián)物4，即含T細(xì)胞表位的#5肽的偶聯(lián)物不是耐受原。
圖13闡明本發(fā)明的蜂毒肽偶聯(lián)物。
圖14證明用本發(fā)明的偶聯(lián)物L(fēng)JP-249 A和LJP-249B(均為偶聯(lián)物3-II)與用含D-EK和(PN)50的現(xiàn)有技術(shù)偶聯(lián)物(LJP-105)相比，提高了抗dsPN抗體的降低百分率。
圖15表明用LJP-394(偶聯(lián)物20-II)處理的雄性BXSB小鼠中循環(huán)血清IgG抗-DNA抗體的抑制。用ELISA試驗(yàn)測(cè)定抗與D-EK偶聯(lián)的(PN)50的IgG抗體。分析了每組8只小鼠的每個(gè)血清。
本文中所用的“價(jià)平臺(tái)分子”指含有預(yù)期數(shù)目生物和/或化學(xué)分子易于結(jié)合之位點(diǎn)的、化學(xué)定義的非聚合的非免疫原性分子。
“非免疫原性”用于描述價(jià)平臺(tái)分子，指單獨(dú)或作為偶聯(lián)物平臺(tái)部分給予個(gè)體時(shí)，價(jià)平臺(tái)分子基本不激起免疫應(yīng)答。
這里所用的“個(gè)體”指哺乳動(dòng)物種類的成員，包括人、靈長(zhǎng)類、小鼠和家養(yǎng)動(dòng)物如牛和羊，運(yùn)動(dòng)動(dòng)物如馬，和寵物如狗和貓。
這里所用的術(shù)語“免疫原”指當(dāng)注入動(dòng)物時(shí)能激起體液免疫應(yīng)答的化學(xué)單位。免疫原同時(shí)具有B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。
免疫原的“類似物”指(a)與免疫原所特異性結(jié)合的抗體特異性結(jié)合，而(b)缺乏T細(xì)胞表位。雖然此類似物一般是免疫原的片段或衍生物，因而與免疫原具有相同的化學(xué)類別(如，免疫原為多肽，類似物也為多肽)，但化學(xué)相似性并不是必要的。因此，類似物可與免疫原具有不同的化學(xué)類別(如，免疫原為糖，而類似物為多肽)，只要它具有以上(a)和(b)的功能特征。類似物可為蛋白質(zhì)、糖、脂、脂蛋白、糖蛋白、脂多糖、核酸或其他化學(xué)或生化單位。
免疫原類似物還可包括“擬表位”。術(shù)語“擬表位”指競(jìng)爭(zhēng)性抑制抗體與免疫原結(jié)合的合成分子。因?yàn)樗禺愋缘亟Y(jié)合抗體，認(rèn)為擬表位模擬了免疫原的抗原決定簇。類似免疫原類似物，擬表位(a)與免疫原所特異結(jié)合的抗體特異性結(jié)合，而(b)缺乏T細(xì)胞表位。
免疫原類似物還可包括“aptamer”。術(shù)語“aptamer”指競(jìng)爭(zhēng)性抑制抗體與免疫原結(jié)合的合成寡核苷酸。正如免疫原類似物，aptamer(a)免疫原所特異地結(jié)合的抗體特異性結(jié)合，而(b)缺乏T細(xì)胞表位。
本文所用術(shù)語“B細(xì)胞無反應(yīng)性”指那些要求T細(xì)胞輔助產(chǎn)生并分泌抗體的B細(xì)胞的無反應(yīng)性，包括但不限于未成熟和/或成熟B細(xì)胞的克隆缺失，和/或B細(xì)胞不能產(chǎn)生抗體，和/或細(xì)胞程序死亡?！盁o反應(yīng)性”指與免疫原的體液應(yīng)答的治療學(xué)上有效的降低。定量地講，這種降低(按抗體產(chǎn)生的降低測(cè)得)為至少50％，優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選100％。
“抗體”指那些其產(chǎn)生依賴于T細(xì)胞的抗體。
本發(fā)明的化學(xué)定義的價(jià)平臺(tái)分子的價(jià)可通過加入平臺(tái)分子的支化基團(tuán)數(shù)目而預(yù)先確定。適宜的支化基團(tuán)典型地衍生自二氨基酸、三胺和氨基二酸。本發(fā)明的偶聯(lián)物是生物穩(wěn)定的即顯示體內(nèi)分泌半壽期為幾小時(shí)到幾天到幾個(gè)月，以提供治療效力。本發(fā)明的化學(xué)定義的價(jià)平臺(tái)分子是基本非免疫原性的(即，當(dāng)給予動(dòng)物時(shí)，它們不顯示或僅顯示輕微的免疫原性)，在給定劑量下為無毒的(即，它們足夠無毒可用作治療劑)，優(yōu)選由確定的化學(xué)結(jié)構(gòu)組成。它們提供了一種非免疫原性、無毒多功能團(tuán)底物，多個(gè)生物或合成分子如多核苷酸雙鏈體可與之共價(jià)結(jié)合。它們一般平均分子量范圍為約200到約200,000，通常為約200到約20,000，與現(xiàn)有技術(shù)聚合物(分子量變化范圍很大的化合物的混合物)相比是均一的。對(duì)本發(fā)明的均一的價(jià)平臺(tái)分子，特別優(yōu)選的例子是衍生化的2，2’-亞乙二氧基二乙基胺(EDDA)、三乙二醇(TEG)和分子量為約200-8,000的聚乙二醇(PEG)。
生物或合成分子與化學(xué)定義的平臺(tái)分子的偶聯(lián)可以任何途徑進(jìn)行，一般涉及一種或多種交聯(lián)劑和生物或合成分子及價(jià)平臺(tái)分子上的功能團(tuán)。
與價(jià)平臺(tái)分子偶聯(lián)的合成多核苷酸雙鏈體由至少約20pb，優(yōu)選20-50bp組成。本文描述的多核苷酸除非另有說明外均為脫氧核苷酸，并以5’到3’的方向給出。雙鏈體的長(zhǎng)度優(yōu)選是基本均一的；即，雙鏈體群中長(zhǎng)度差異一般不超過平均雙鏈體長(zhǎng)度堿基對(duì)的約±20％，優(yōu)選±10％。它們還優(yōu)選在核苷酸組成上是基本均一的；即，雙鏈體間堿基組成和順序的變化將不大于約10％。最優(yōu)選它們的雙鏈體核苷酸組成完全一致。
基于圓二色譜(CD)的解釋，認(rèn)為用于本發(fā)明的雙鏈體具有B-DNA型螺旋結(jié)構(gòu)。應(yīng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明無意限于這種認(rèn)定，通過更確定性的分析可認(rèn)定雙鏈體可具有Z-DNA和/或A-DNA型螺旋結(jié)構(gòu)。
這些多核苷酸雙鏈體可從天然DNA合成或用化學(xué)或重組技術(shù)合成。具有較長(zhǎng)長(zhǎng)度的天然存在的或重組產(chǎn)生的dsDNA可經(jīng)消化(如酶法、化學(xué)方法或機(jī)械切割)和分級(jí)分離(如經(jīng)瓊脂糖凝膠或Sephadex柱)得到目標(biāo)長(zhǎng)度的多核苷酸。
或者，用市場(chǎng)上可得到的DNA合成儀容易制得多達(dá)約70個(gè)堿基長(zhǎng)的互補(bǔ)單鏈多核苷酸鏈對(duì)，然后按常規(guī)方法退火以形雙鏈體?；瘜W(xué)制備的短鏈經(jīng)酶延伸(5’-磷酸化，然后連接)可獲得更長(zhǎng)的合成dsDNA。
還可通過分子克隆制備多核苷酸。例如，按如上方法合成目標(biāo)長(zhǎng)和序列的多核苷酸?？梢栽O(shè)計(jì)這些多核苷酸使其具有適當(dāng)?shù)哪┒耍赃B接到特異的限制性位點(diǎn)上。多個(gè)重復(fù)的這些寡聚物可前后連接以提供多拷貝復(fù)制。將形成的構(gòu)建物插入標(biāo)準(zhǔn)克隆載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)化將載體引入適當(dāng)?shù)奈⑸?細(xì)胞中。用標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物鑒定轉(zhuǎn)化子并在有利于DNA復(fù)制的條件下生長(zhǎng)。用限制酶處理和常規(guī)的大小分級(jí)(如，瓊脂糖凝膠，Sephadex柱)，可將此多核苷酸與細(xì)胞/微生物的其他DNA分離。
或者，可用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)復(fù)制這些多核苷酸。Saiki，R.K.，等，Science(1985)2301350；Sacki等，Science(1988)239487；Sambrook等，In Molecular Coloning TechniguesA laboratoryManual，Vol.12，p14.1-14.35 Cold Spring Harbor Press(1989)。
按實(shí)施例中描述的檢測(cè)方法用SLE抗血清篩選多核苷酸的結(jié)合活性。改良的Farr檢測(cè)法是優(yōu)選的檢測(cè)方法，其中結(jié)合活性可用I50表示，即達(dá)到半數(shù)最大抑制時(shí)多核苷酸的摩爾濃度。I50小于約500nM，優(yōu)選小于50nM的多核苷酸雙鏈體視為具有顯著的結(jié)合活性，從而可用于制備本發(fā)明的偶聯(lián)物。
以適當(dāng)?shù)姆绞綄⑦@些多核苷酸偶聯(lián)在化學(xué)定義的價(jià)平臺(tái)分子上并保留其抗體結(jié)合活性。這可通過將多核苷酸以其鏈上預(yù)定位點(diǎn)與價(jià)平臺(tái)分子偶聯(lián)而實(shí)現(xiàn)，以使該多核苷酸形成至少約20個(gè)堿基對(duì)的側(cè)鏈(從該鏈的偶聯(lián)位點(diǎn)到游離末端計(jì)算)。
在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明偶聯(lián)物的多核苷酸在或接近其一個(gè)末端處與一接頭分子偶聯(lián)。然后接頭分子與化學(xué)定義的價(jià)平臺(tái)分子偶聯(lián)。例如，可按如下方法將一確定的雙鏈多核苷酸偶聯(lián)到價(jià)平臺(tái)分子上先制備由約20個(gè)交替的胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)核苷酸組成的單鏈。然后可將4條CA鏈通過接頭如HAD(三苯甲基HAD或二甲基HAD一般用于描述反應(yīng)路線11中所述的二硫化物接頭)共價(jià)偶聯(lián)到衍生化平臺(tái)分子如三乙二醇的4個(gè)反應(yīng)活性位點(diǎn)上。合成價(jià)平臺(tái)分子使其包含諸如溴代乙酰的基團(tuán)。在偶聯(lián)過程中，離去基團(tuán)被硫置換。然后可將由約20個(gè)交替的胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)核苷酸組成的第二條單鏈多核苷酸退火至CA鏈上，形成下式的雙鏈多核苷酸偶聯(lián)物[(PN)20-接頭]4-價(jià)平臺(tái)分子。
或者，在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，多核苷酸可通過一嗎啉代橋以3’-末端偶聯(lián)到衍生化的價(jià)平臺(tái)分子上，通過一個(gè)多核苷酸鏈的氧化的3’末端核糖與衍生化平臺(tái)分子上的游離氨蜞縮合，然后將此加合物置于還原條件下形成嗎啉代橋。這種偶聯(lián)要求衍化的平臺(tái)分子至少有與要結(jié)合到平臺(tái)分子上的多核苷酸雙鏈體數(shù)目相等的游離氨基。這種偶聯(lián)物的合成分兩步進(jìn)行。第一步是將多核苷酸雙鏈體的一條鏈通過上述縮合/還原反應(yīng)偶聯(lián)到衍生化的平臺(tái)分子上。用高碘酸處理將3’末端核糖基轉(zhuǎn)化為氧化的核糖基，從而在單多核苷酸鏈上形成氧化的3’-末端核糖。然后將單鏈多核苷酸慢慢加到衍生化的平臺(tái)分子pH約6.0-8.0、2-8℃的水溶液中。在所有的偶聯(lián)策略中，多核苷酸與平臺(tái)分子的摩爾比范圍一般為約2∶1到約30∶1，常常為2∶1到約8∶1，優(yōu)選約4∶1到6∶1。關(guān)于這一點(diǎn)，優(yōu)選偶聯(lián)物的分子量不要過大，因?yàn)榉肿恿看笥?00,000的大分子，特別是具有重復(fù)單元的大分子可能是非T細(xì)胞依賴性免疫原。見Dintzis等，J.Immun.(1983)1312196和J.Immun，(1989)1431239。在縮合反應(yīng)過程中或以后(反應(yīng)時(shí)間一般為24-48小時(shí))，加入強(qiáng)還原劑，如氰基硼氫化鈉，以形成嗎啉代基團(tuán)。然后向偶聯(lián)物中加入雙鏈體的互補(bǔ)鏈，加熱混合物并慢慢冷卻以使鏈退火。此偶聯(lián)物可經(jīng)凝膠滲透色譜純化。
對(duì)此核糖策略的一種替代方法是在多核苷酸上形成醛功能團(tuán)，并利用這些功能團(tuán)和平臺(tái)分子上的活性功能團(tuán)將多核苷酸偶聯(lián)到平臺(tái)分子上?？捎欣乩枚嗪塑账?’或5’末端的成對(duì)連二醇，可用過碘酸鈉將其氧化成醛，醛再與平臺(tái)分子上的功能氨基基團(tuán)縮合。當(dāng)此二醇在一環(huán)系中(如五元環(huán))，則生成的縮合產(chǎn)物為含氮的雜環(huán)，如六元嗎啉代或哌啶子環(huán)。亞氨基縮合產(chǎn)物可經(jīng)還原穩(wěn)定化，使用適當(dāng)?shù)倪€原劑，如硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉。當(dāng)二醇為非環(huán)狀時(shí)，生成的氧化產(chǎn)物只含有一個(gè)醛，縮合產(chǎn)物為仲胺。
另一方法包括通過適當(dāng)?shù)暮塑账峄瘜W(xué)(如氨基亞磷酸酯化學(xué))向多核苷酸的3’或5’末端引入烷氨基或烷硫基。然后這些親核基團(tuán)用于與雙官能交聯(lián)試劑反應(yīng)對(duì)烷基胺衍生物而言，使用大大過量的同型雙官能交聯(lián)劑如庚二亞氨酸二甲酯；對(duì)烷基巰基衍生物而言，使用過量的異型雙官能交聯(lián)劑如間馬來酰亞氨基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)或4-(碘代乙酰)氨基苯甲酸琥珀酰亞胺酯。除去過量的交聯(lián)劑后，多核苷酸衍生物即與平臺(tái)分子上的氨基反應(yīng)?；蛘?，這種巰基可與平臺(tái)上的親電中心反應(yīng)，如馬來酰亞胺或α-鹵代乙?；鶊F(tuán)或其他適當(dāng)?shù)腗ichael受體。
還有一種使用經(jīng)修飾核苷的策略。可通過標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成化學(xué)將適當(dāng)?shù)拿撗鹾塑昭苌镆雰?yōu)選5’或3’末端的多核苷酸中的目標(biāo)位點(diǎn)。然后這些核苷衍生物可直接特異性地與平臺(tái)分子上的烷氨蜞反應(yīng)?；蛘?，上述二醛化學(xué)中見到的副反應(yīng)如胺催化β-消除，可通過使用適當(dāng)?shù)暮塑昭苌镒鳛榇渔湹?’末端而防止。這樣的實(shí)例如是核糖5’-亞甲基延伸，即用5’(2-羥乙基)基團(tuán)代替5’-羥甲基基團(tuán)?；蛘咴?接到平臺(tái)分子上的多核苷酸3’末端二核苷酸中使用膦酸酯或次膦酸酯橋。
免疫原類似物在抗體介導(dǎo)的病理中涉及的免疫原可是以外來的(對(duì)個(gè)體而言是外源的)免疫原，如變應(yīng)原、與不育有關(guān)的精子、風(fēng)濕熱糖復(fù)合物、與新生兒溶血病有關(guān)的RBC Rh/D抗原、生物藥，包括對(duì)個(gè)體外源的天然生物物質(zhì)如治療用蛋白、肽和抗體等等，或者自免疫原(自體免疫原)如與甲狀腺炎(甲狀腺球蛋白)、中風(fēng)(心脂)和重癥肌無力(乙酰膽堿受體)有關(guān)的那些。
通過篩選候選分子確定它們是否(a)與抗該抗原的血清抗體特異性結(jié)合，(b)缺乏T細(xì)胞表位，可鑒定這種免疫原的類似物。與血清抗體的特異性結(jié)合可用常規(guī)免疫檢測(cè)法測(cè)定，T細(xì)胞的存在與否可經(jīng)常規(guī)T細(xì)胞激活法來確定。此處，與抗此免疫原的抗血清特異性結(jié)合的類似物顯示與此抗體的相當(dāng)親合力。此處還應(yīng)認(rèn)識(shí)到T細(xì)胞表位檢測(cè)是在每個(gè)對(duì)象基礎(chǔ)上用來自目標(biāo)受者或代表受者靶人群的T細(xì)胞進(jìn)行的。T細(xì)胞表位的存在與否可用實(shí)施例中描述的氚標(biāo)胸苷摻入法來測(cè)定。還可按本領(lǐng)域熟知的方法測(cè)定T細(xì)胞衍生的淋巴因子來確定T細(xì)胞表位的存在與否。沒能誘導(dǎo)背景以上統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的胸苷摻入的類似物視為缺乏T細(xì)胞表位。應(yīng)認(rèn)識(shí)到胸苷摻入量可與免疫原的不同。一般刺激指數(shù)低于約2-3，更優(yōu)選約1-2時(shí)，說明缺乏T細(xì)胞表位。
一般鑒定有用類似物的第一步是制備一系列待選物或其文庫。例如對(duì)蛋白或肽類似物而言，可用合成或重組技術(shù)制備文庫，如Geysen等在Synthetic Peptides as Antigens；Ciba Symposium(1986)119131-149；Devlin等在Science(1990)249404-406；Scott等，Science(1990)249386-390；和Cwirla等，PNAS USA(1990)876378-6382中描述的方法。在一種合成技術(shù)中，按這樣的方式合成約5-30個(gè)氨基酸的肽使每個(gè)肽與下一個(gè)重疊，且代表了所有的線性表位。這可通過羧基和氨基末端均重疊來完成，重疊殘基數(shù)比B細(xì)胞表位所要求的少一個(gè)殘基。例如，假定B細(xì)胞表位最低要求是6個(gè)氨基酸，則每個(gè)肽必須與相鄰的肽重疊5個(gè)氨基酸。在此方案中，用抗天然免疫原產(chǎn)生的抗血清篩選每個(gè)肽以鑒定B細(xì)胞表位是否存在，抗血清是通過免疫接種動(dòng)物或從病人中獲得。具有抗體結(jié)合活性的那些分子再用于按實(shí)施例中所述篩選，以確定T細(xì)胞表位是否存在。缺如T細(xì)胞表位的分子可用作本發(fā)明的類似物。
如果免疫原的T細(xì)胞表位已知或可被鑒定，則不必進(jìn)行候選類似物的T細(xì)胞隨機(jī)篩選。在此情形下，可通過合成或重組方法改變T細(xì)胞表位(如通過化學(xué)衍生，或消除表位的一個(gè)或多個(gè)成分)以使其無作用或完全消除，如對(duì)肽的情況。
按常規(guī)方法合成擬表位和aptamers，并按其他免疫原類似物相同的方法篩選。
將這些類似物偶聯(lián)在非免疫原性價(jià)平臺(tái)分子上以制備本發(fā)明的偶聯(lián)物。利用本文所例舉的化學(xué)方法合成包含價(jià)平臺(tái)分子和生物活性分子如糖、脂、脂多糖、蛋白、糖蛋白、藥物、和有用類似物的偶聯(lián)物。合成的一種優(yōu)選方法是按已知方法在生物分子上引入接頭分子，按具體情況選擇不同的方法。
當(dāng)向價(jià)平臺(tái)分子上偶聯(lián)藥物如阿霉素(doxorubicin)時(shí)，糖環(huán)上的氨基可與含活性酯的平臺(tái)分子反應(yīng)。還可修飾阿霉素使含有硫醇基團(tuán)，以與鹵代乙?；脚_(tái)偶聯(lián)(Kaneko，T，等，Bioconjugate Chem-istry，2133(1991))。
可修飾糖如寡糖使其含有含巰基的接頭(Wood，S.J.和Wetzel，R.，Bioconjugate Chemistry，3391(1992))。巰基用于與鹵代乙?；脚_(tái)的偶聯(lián)?；蛘撸裳趸巧扇笳呖稍贜aCNBH3存在下與氨基平臺(tái)反應(yīng)形成偶聯(lián)物。
含乙醇胺基團(tuán)的脂如糖脂與平臺(tái)上的活化羧基反應(yīng)。氧化含糖單位的脂多糖生成醛，醛再在NaCNBH3存在下與平臺(tái)氨基反應(yīng)還原胺化形成偶聯(lián)物。
對(duì)于其他的蛋白如Fab’抗體片段，蛋白上的巰基通過鹵代乙?；c平臺(tái)偶聯(lián)。使用亞氨基硫醇鹽，用硫醇接頭修飾糖蛋白。該硫醇與含有鹵代乙?；钠脚_(tái)反應(yīng)。
用實(shí)施例中描述的鼠模型評(píng)價(jià)偶聯(lián)物作為耐受原和特異性抑制抗體產(chǎn)生的能力。
一般配制偶聯(lián)物以適于注射給藥(如腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)等)。因此，它們一般與藥學(xué)上可接受的水性載體如鹽水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液等結(jié)合。偶聯(lián)物一般占配方重的0.01％到10％。給個(gè)體注射一定量的偶聯(lián)物，該量應(yīng)足以至少部分重建對(duì)引起SLE自體抗原的耐受性。這種量文中有時(shí)稱為“治療有效”量。個(gè)別給藥方案，即劑量、時(shí)間和重復(fù)次數(shù)，將依具體的個(gè)體和個(gè)體的病歷來確定。一般給予約1-1000μg偶聯(lián)物/kg體重的劑量。要獲得和/或保持免疫耐受狀態(tài)要求重復(fù)給藥。
下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明和其對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的非顯而易見性。這些實(shí)施例決無意限制本發(fā)明。
實(shí)施例1下列反應(yīng)方案說明本發(fā)明的衍生化化學(xué)定義的價(jià)平臺(tái)分子的合成方法。在此實(shí)施例中，DMTr＝4，4’-二甲氧基三甲基苯基；Tr＝三苯甲基；Bz＝苯甲酰基；Cp＝脫氧胞苷單磷酸酯；CE＝氰基乙基，CPG＝可控泡玻璃DMF＝二甲基甲酰胺；DCC＝二環(huán)己基碳化二亞胺；TFA＝三氟乙酸；CDI＝羰基二咪唑；Ts＝對(duì)甲苯碘酰；DIPAT＝二異丙基銨四唑鹽；TBMSCI＝叔丁基二甲基甲硅烷基氯；TBAF＝氟化四丁基銨；NMMO＝N-甲基嗎啉氧化物。
反應(yīng)方案1
反應(yīng)方案2
反應(yīng)方案3
反應(yīng)方案4
反應(yīng)方案5
反應(yīng)方案6
反應(yīng)方案7
反應(yīng)方案8
方案9
反應(yīng)方案10
在以下反應(yīng)方案11中描述了用于以二硫醚接頭修飾(CA)8、(CA)10、(CA)12和(CA)16的試劑的合成反應(yīng)方案11
以下反應(yīng)方案12中描述了用于以連位二醇接頭修飾(CA)25的試劑的合成。
反應(yīng)方案12
反應(yīng)方案13
實(shí)施例2化學(xué)定義的價(jià)平臺(tái)分子的合成化合物1[3，5-二-(碘代乙酰氨基)苯甲酸]將2.93g(8.28mmol，2.2eq)碘代乙酸酐于室溫N2氛下加到572mg(3.76mmol)3，5-二氨基苯甲酸于19ml二噁烷中攪拌下的懸液中。攪拌混合物，用箔封口20小時(shí)，并在50ml乙酸乙酯和50ml 1N HCl溶液間分配。用鹽水洗滌乙酸乙酯層，用MgSO4干燥，過濾，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，得到3.3g褐色固體。經(jīng)硅膠層析(94/5/1的CH2Cl2/MeOH/HOAc)純化此物，得到992mg(54％)化合物1，白色固體NMR(DMSO)3.84(s，4H)，7.91(s，2H)，8.14(s，1H)，10.56(s，2H)。
化合物2[3，5-二-(碘化乙酰氨基)苯甲酰氯]向390mg(0.8mmol)化合物1在34ml THF中的溶液中加入117μl(1.6mmol，190mg)SOCl2。將此混合物在N2氛下回流直到固體全部溶解(約30分鐘)，形成一清澈的紅棕色溶液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮此混合物并置于真空下，得到化合物2粗產(chǎn)品-一泡沫狀固體，它直接用于下一步。
化合物3[α，ω-二-(N-2-氨基乙基氨基甲?；?聚乙二醇的N，N’-二(3，5-二-(碘代乙酰氨基)苯甲酰)衍生物]將570mgα，ω-二-(N-2-氨基乙基氨基甲?；?聚乙二醇(0.16mmol，3350g/mol，Sigma)置于一配衡燒瓶中。加入甲苯(20ml)并通過共沸蒸餾除去水。真空干燥殘余物得549mg固體，將其溶于4ml含89μl(0.64mmol)二異丙基乙基胺的THF中。將酰氯粗品溶于4ml無水THF中并在N2下30秒內(nèi)加到上述混合物中。此混合物在室溫下攪拌16小時(shí)，并在25ml 0.1N HCl和25mlCH2Cl2間分配。水層再用CH2Cl2萃取，合并有機(jī)層，用25ml H2O，然后50mlNaHCO3水溶液洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，過濾并濃縮，得784mg橙色油。經(jīng)硅膠層析(9/1的CH2Cl2/MeOH)得190mg無色油，在熱EtOH/Et2O中結(jié)晶，并在N2下在燒結(jié)玻璃濾器上收集，真空干燥得到177mg白色固體化合物3。NMR(CDCl3)3.40(bdm，8H)，3.59(bd s，(CH2CH2O)n，因積分太大無法與其他積分一起積分)，3.91(s，8H)，4.21(m，4H)，6.04(bd m，2H)，7.55(bd m，2H)，7.78(bd s，4H)，8.10(bd s，2H)，9.30(bd m，4H)碘代乙酰的測(cè)定(European Journal of Biochemistry(1984)14063-71)計(jì)算值，0.92mmol/g；實(shí)測(cè)值，0.96mmol/g。
化合物4[單-N-芐氧羰基-3，6-二氧雜-1，8-二氨基辛烷]將14.3ml(17.1g，100mmol)氯甲酸芐酯在200ml CH2Cl2中的溶液在1小時(shí)內(nèi)滴加到29.0ml(29.6g，200mmol)1，2-二-(2’-氨基乙氧基)乙烷(Fluka)在100mlCH2Cl2中的0℃溶液中。將混合物在室溫下攪拌24小時(shí)，加入1N HCl直到水層保持為酸性(pH低于2)。水層用每份50ml CH2Cl2洗3次，用1N NaOH中和至pH 13以上。用每份75ml CH2Cl2萃取該堿性水層5次。合并CH2Cl2層并干燥(MgSO4)、過濾及濃縮，得12.7g(41％)化合物4，為粘稠油品。1H NMR(CDCl3)d 2.82(bd s，2H)，3.30-3.60(m，12H)，5.10(s，2H)，5.75(bd s，1H)，7.20-7.40(m，5H)；13C NMR(CDCl3)d 41.1，41.8，66.5，70.0，70.2，70.4，73.5，127.9，128.0，128.4，136.9.156.4.
化合5[N-叔丁氧羰基亞氨基二乙酸]按Garrigues，B.和Lazraq，E.M.在Tetrahedron Letters(1986)27，1685-1686中報(bào)道的相似方法合成該化合物。于室溫、攪拌下向22.0g(169mmol)亞氨基二乙酸和36.8g(169mmol)二碳酸二叔丁酯在169ml 50/50二噁烷/H2O中的溶液中加入47ml(34.2g，338mmol)Et3N。攪拌該混合物24小時(shí)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去大部分二噁烷。將混合物在350ml 1N HCl和每份100ml乙酸乙酯共5份間分配。合并有機(jī)層，用MgSO4干燥、過濾，并濃縮得一白色固體。在己烷/EtOAc中重結(jié)晶得35.3g(90％)晶狀化合物5。m.p.131-132℃(熔化)。1H NMR(DMSO)d 1.35(s，9H)，3.87(s，2H)，3.91(s，2H)，12.6(bds，2H)；13C NMR(DMSO)d 27.9，49.6，79.6，154.8，171.2.
化合物6將9.99g(48.5mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺加到4.52g 73(19.4mmol)化合物5和4.46g(38.8mmol)N-羥基琥珀酰亞胺于100mlTHF中的0℃溶液中。在0℃下攪拌此混合物3小時(shí)，加入5.39ml(3.92g，38.8mmol)Et3N和10.9g(38.7mmol)化合物4在83mlTHF中的溶液，于5℃攪拌混合物17小時(shí)。過濾此混合物除去固體，濃縮濾液成油狀，在400ml EtOAc和2份100ml 1N HCl間分配。EtOAc層用3×100ml 1N Na2CO3、100ml鹽水洗滌，干燥(MgSO4)、過濾并濃縮，得化合物6，為一粘稠油品。
1H NMR(CDCl3)d 1.41(s，9H)，3.30-3.70(m，24H)，3.70-3.90(m，4H)，5.10(s，4H)，5.50(bd s，2H)，7.12(bd s，1H)，7.30-7.40(m，10H)，8.24(bd s，1H).
化合物7向14.2g(18.6mmol)化合物6在111ml CH2Cl2中的溶液中加入26.3ml(38.9g，156mmol)三氟乙酸，于室溫下攪拌混合物3小時(shí)。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮混合物得一粘性油，將此油溶于93ml THF中。將溶液冷卻至0℃，加入3.72g(37.2mmol)琥珀酸酐，再加入5.18ml(3.76g，37.2mmol)Et3N。除去冷浴，于室溫下攪拌混合物18小時(shí)。減壓除去溶劑，生成的油在300ml CH2Cl2和3×100ml H2O之間分配。CH2Cl2層用MgSO4干燥，過濾，并濃縮，得一油品，在硅膠上層析(9/1/0.1 EtOAc/MeOH/乙酸)純化之，得10.5g(74％)化合物7，為一粘性油。1H NMR(CDCl3)d 2.50-2.60(m，4H)，3.30-3.60(m，24H)，3.88(s，2H)，4.03(s，2H)，5.07(s，4H)，5.77(bd s，2H)，7.20-7.30(m 10H)，7.91(bd s，2H)，8.88(bd s，1H)；13C(CDCl3)d 27.7，29.0，39.4，41.0，52.9，53.8，66.5，69.3，69.8，70.0，70.1，127.8，128.1，128.3，136.7，156.6，169.1，169.6，173.3，174.5.
化合物8[化合物7的4-硝基苯酯]將1.61g(7.83mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺加到3.98g(5.22mmol)化合物7和800mg(5.75mmol)4-硝基苯酚在26ml CH2Cl2中的0℃溶液中。N2下于室溫?cái)嚢杌旌衔?4小時(shí)。將此混合物冷卻至0℃，加入1ml HOAc，保持在0℃ 2小時(shí)。過濾除去固體，濃縮濾液。在硅膠上層析(91/8/1到84/15/1 CH2Cl2/IPA/HOAc的梯度)純化殘余物，得粘性油狀化合物8。
1H NMR(CDCl3)d 2.66(t，2H)，2.84(t，2H)，3.32-3.68(m，24H)，3.90(bd s，2H)，4.01(bd s，2H)，5.06(s，4H)，5.58(bd m，2H)，6.91(bd m，1H)，7.27(d，2H)，7.33(s，10H)，8.23(d，2H)，9.01(bd m，1H).
化合物10[溴代乙酸4-硝基苯酯]攪拌下于0℃將9.28g(45mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺加到5.0g(35.9mmol)溴代乙酸和8.50g(61.1mmol)4-硝基苯酚在180ml E-tOAc中的溶液中。于5℃攪拌此混合物16小時(shí)，加入1ml乙酸。于室溫?cái)嚢杌旌衔?0分鐘，然后置于冰箱中20分鐘。濾出固體，濃縮濾液得一粘性油，在乙醚/己烷中結(jié)晶，得7.73g(83％)化合物10，絮片狀。m.p.86-87℃；TLC Rf＝0.63(50/50/1己烷/乙酸乙酯/乙酸)。1H NMR(CDCl3)d 4.13(s，2H)，7.36(d，J＝12Hz，2H)，8.32(d，J＝12Hz，2H)；13C NMR(CDCl3)d24.9，122.1，125.3，155.5 164.9；Anal.calc’d forC2H6BrNO4C，36.95；H，2.33；N，5.39.FoundC，37.24；H，2.33；N，5.42.
化合物9向2.37g(2.68mmol)化合物8在15ml二噁烷和8ml水中的溶液中加入300mg(3.57mmol)NaHCO3，然后加入162ml(1.09mmol)2，2’-(亞乙二氧基)-二-乙基胺(Fluka)。于室溫下攪拌混合物24小時(shí)，真空濃縮至大約原始體積的一半。將此濃縮物在40mlCH2Cl2和40ml飽和NaHCO3溶液之間分配。然后用40ml 0.5NHCl洗滌CH2Cl2層2次，再用NaCl溶液洗，干燥(MgSO4)，過濾，并濃縮得2.8g油。此粗產(chǎn)品在硅膠上層析(3/6/1 CH2Cl2/THF/MeOH)純化，得940mg(59％)油狀化合物9。TLC Rf＝0.21(3/6/1CH2Cl2/THF/MeOH)。1H NMR(CDCl3)d 2.45(m，4H)，2.59(m，4H)，3.25-3.55(m，60H)，3.87(s，4H)，4.05(s，4H)，5.07(s，8H)，5.62(bd s，4H)，6.78(bd s，2H)，7.34(bd s，20H)，8.56(bd s，2H)；13C NMR(CDCl3)d 28.1，30.3，31.1，39.4，41.1，52.9，53.9，66.5，69.4，69.7，69.9，70.2，128.3，127.8，128.3，136.8，156.5，168.8，169.4，172.1，173.5.
化合物34在氮?dú)庀孪?81mg(0.175mmol)化合物9在5ml乙醇中的溶液中加入110mg 10％Pd/碳，并在氮?dú)庀禄亓?小時(shí)。冷卻后在硅藻土上過濾此混合物，并在真空下濃縮，得170mg(92％)油狀化合物34，不經(jīng)純化直接用于下一步。
1H NMR數(shù)據(jù)如下(CDCl3)d 2.45(m，4H)，2.53(m，4H)，2.62(m，4H)，2.86(m，8H)，3.42-3.60(m，52H)，4.00(s，4H)，4.14(s，4H)；13C NMR(CDCl3)d 28.2，30.3，31.1，39.4，41.1，46.5，48.6，52.9，53.8，69.4，69.7，70.2，72.4，168.9，169.5，172.3，173.8.
化合物11將128mg(1.4mmol)NaHCO3和200mg(0.85mmol)化合物10加至165mg(0.155mmol)化合物34在6ml二噁烷和3ml水中的溶液中。于室溫下攪拌此混合物24小時(shí)。再真空濃縮。濃縮物在SephadexG-10(MeOH)上層析純化，得114mg(46％)粘性油狀化合物11。用制備性HPLC(C18；15/85/0.1到30/70/0.1 CH3CN/H2O/CF3CO2H的梯度，50分鐘，225nm，)制備分析用樣品。
1H NMR(CDCl3)d 2.58(m，4H)，2.65(m，4H)，3.43-3.62(m，60H)，3.92，(s，8H)，4.03(s，4H)，4.16(s，4H)；MS(FAB)m/e(relativeintensity)MNa+1605(100)，MH+1579(1)，1581(5)，1583(7)，1585(6)，1587(2).
化合物12[單-N-芐氧羰基-1，6-二氨基己烷]攪拌下0℃將21ml(25.7g，150mmol)氯甲酸芐酯在200ml二噁烷中的溶液滴加到17.49g(150mmol)1，6-己二胺和19.58g(196mmol)KHCO3在100ml二噁烷和300ml水中的溶液中。于室溫?cái)嚢璐嘶旌衔?8小時(shí)，然后冷卻至0℃。用12N HCl酸化此混合物，并用2×100ml乙醚萃取。用10N NaOH中和水層并用8×100ml乙醚萃取。合并堿性萃取液，干燥(Na2SO4)并濃縮，得5.03g(13％)半固態(tài)殘余物，即化合物12粗產(chǎn)品。
1H NMR(DMSO)d 1.22-1.51(m，8H)，2.54(t，2H)，3.02(dof t，2H)，5.05(s，2H)，7.30-7.48(m，5H).
化合物13于0℃下向417mg(1.78mmol)化合物5和409mg(3.56mmol)NHS在15ml THF中的溶液加入918mg(4.45mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺。在0℃下攪拌混合物4.5小時(shí)，并加入1.02g(4.08mmol)化合物12在4ml THF中的溶液。N2下5℃攪拌此混合物18小時(shí)。濃縮物在30ml EtOAc和2×30ml 1N HCl間分配。合并的EtOAc層相繼用30ml水和30ml飽和NaHCO3溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并濃縮，得1.48g粘性殘余物。在硅膠上層析(5/95 MeOH/CH2Cl2純化得1.04g(84％)化合物13，為粘稠固體。
1H NMR(CDCl3)d 1.33(m，8H)，1.43(s，9H)，1.51(m，8H)，3.18(m，4H)，3.26(m，4H)，3.81(s，2H)，3.85(s，2H)，4.90(bd s，2H)，5.10(s，4H)，6.81(bd s，1H)，7.28-7.40(m，10H)，8.05(bd s，1H).
化合物14向5.16g(7.45mmol)化合物13在14.9ml二氯甲烷中的溶液加入14.9ml三氟乙酸，于室溫下攪拌混合物3小時(shí)。真空濃縮混合物，再溶于57ml THF中。加入2.07ml(1.51g，14.9mmol)三乙胺。再加入1.5g(14.9mmol)琥珀酸酐，然后攪拌混合物18小時(shí)。將此混合物在75ml 1N HCl和4×75ml CH2Cl2間分配。合并CH2Cl2層，干燥(MgSO4)，過濾并濃縮得一固體。在CH2Cl2/EtOAc/己烷中結(jié)晶得3.84g(24％)白色固體化合物14。
m.p.122°；1H NMR(MeoH)d 1.32(m，8H)，1.48(m，81)，2.56(m，4H)，3.10(t，4H)，3.23(m，4H)，4.00(s，2H)，4.18(s，2H)，5.05(s，4H)，7.33(m，10H).
化合物15[化合物14的N-硝基苯酯]0℃下向2.0g(2.87mmol)化合物14和438mg(3.15mmol)4-硝基苯酚在15ml THF中的溶液加入887mg(4.30mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺。讓混合物升至室溫并攪拌18小時(shí)，然后冷卻至0℃。然后加入200μl乙酸并在0℃攪拌混合物1小時(shí)。濾去固體，并將濾液濃縮成油。在硅膠上層析純化(92/8 CH2Cl2/IPA)，并在CH2Cl2/乙烷中重結(jié)晶，得1.52g(64％)白色固體化合物15。
m.p.65-68°；1H NMR(CDCl3)d 1.30(m，8H)，1.47(m，8H)，2.71(t，2H)，2.90(t，2H)，3.17(m，4H)，3.25(m，4H)，3.92(s，2H)，4.08(s，2H)，4.86(bd t，1H)，4.95(bd t，1H)，5.09(s，4H)，6.28(bd t，1H)，7.23(d，J＝9Hz，2H)，7.32(m，10H)，8.22(d，J＝9Hz，2H)，8.95(bd t，1H).
化合物16將830mg(0.99mmol)化合物15在7.5ml二噁烷中的溶液加至58μl(59mg，0.40mmol)2，2’-(亞乙二氧基)-二-乙基胺(Fluka)和111mg(1.31mmol)NaHCO3在7.5ml H2O中的溶液中。室溫下攪拌此混合物18小時(shí)?；旌衔镌?0ml 1N HCl和50ml CH2Cl2間分配。CH2Cl2層經(jīng)干燥(Na2SO4)，過濾及濃縮，得1.28g粘性油。在硅膠上層析純化(84/15/1 CH2Cl2/MeOH/HOAc)得670mg蠟狀固體化合物16。1H NMR(CDCl3)d 1.32(m，16H)，1.49(m，16H)，2.46(m，4H)，2.58(m，4H)，3.10-3.23(m，16H)，3.34(m，4H)3.48(m，4H)，3.53(s，4H)，3.85(s，4H)，4.02(s，4H)，5.05(s，8H)，5.07(underlying bd t，2H)，5.15(bd t，2H)，7.30(m，20H)，7.40(bd t，2H)，8.60(bd t，2H).
化合物35攪拌613mg(0.41mmol)化合物16在20.3ml乙醇和10.1ml環(huán)己烯中的溶液，并用N2吹洗。加入20mg 10％Pd/C(Aldrich)，并在85℃油浴中加熱1.5小時(shí)。冷卻后，將混合物濾過硅藻土，并用50/50H2O/丙酮清洗燒瓶和濾器。真空濃縮濾液得448mg(114％)蠟狀固體化合物35。1H NMR(D2O)d 1.39(m，16H)，1.59(m，16H)，2.57(t，4H)，2.65(t，4H)，2.88(t，8H)，3.23(t，4H)，3.29(t，4H)，3.42(t，4H)，3.65(t，4H)，3.71(s，4H)，4.06(s，4H)，4.30(s，4H).
化合物17向445mg(0.406mmol)化合物35在9.5ml水中的溶液加入546mg(6.50mmol)NaHCO3。向混合物中加入838mg(3.25mmol)化合物10于14.4ml二噁烷中的溶液。室溫下攪拌此混合物7小時(shí)，并在50ml 0.1N H2SO4和50mg CH2Cl2之間分配。棄去CH2Cl2層，水相用2×50ml CH2Cl2、2×50ml 9/1 CH2Cl2/MeOH、50ml 4/1CH2Cl2/MeOH和50ml 3/2 CH2Cl2/MeOH萃取。合并萃取液，經(jīng)干燥(Na2SO4)、過濾并濃縮，得282mg固體。在EtOH/EtOAc/EteO中結(jié)晶得143mg(24％)白然固體化合物17。
1H NMR(CDCl3/MeOH)d 1.33(m，16H)，1.55(m，16H)，2.55(m，8H)，3.21(m，16H)，3.39(m，4H)，3.55(m，4H)，3.81(s，8H)，3.95(s，4H)，4.12(s，4H).元素分析，計(jì)算C54H94N12O14Br4C，44.57；H，6.51；N，11.55；Br，21.97.實(shí)測(cè)C，45.85；H，6.49；N，11.37；Br，19.90.
化合物18[1，5-二(N-芐氧羰基-6-氨基己酰氨基)-3-氮雜戊烷]向5.05g(19.0mmol)N-芐氧羰基-6-氨基乙酸在25ml E-tOAc中的溶液中室溫下加入3.09g(19.0mmol)羰基二咪唑。攪拌15分鐘后加入1.02ml(982mg，19.52mmol)二亞乙基三胺，再加入2.65mg(1.93g，19.0mmol)三乙胺。攪拌混合物4小時(shí)，過濾收集固體產(chǎn)物。重結(jié)晶(MeOH/EtOAc)得4.27g化合物18，為一細(xì)粒狀固體。m.p.132-133℃。
1H NMR(CDCl3)d 1.33(m，4H)，1.52(m，4H)，1.64(m，4H)，2.18(t，4H)，2.73(t，4H)，3.16(m，4H)，3.35(m，4H)，4.96(bd s，2H)，5.09(s，4H)，6.13(bd s，2H)，7.33(s，10H)；元素分析，計(jì)算C32H47N5O6C，64.29；H，7.50；N，11.72.實(shí)測(cè)C，63.54；H，7.75；N，11.91.
化合物19向20℃水浴中的4.86g(8.1mmol)化合物10在162ml吡啶中的溶液加入657μl(880mg，3.2mmol)三乙二醇-二-氯甲酸酯(Aldrich)?；旌衔镏辛⒓葱纬沙恋?。攪拌混合物16小時(shí)，真空濃縮生成的混蝕黃色溶液。濃縮液在150ml EtOAc和2×150ml 1NHCl間分配(保證水層為酸性)。合并水層并再用150ml EtOAc萃取。合并EtOAc層，干燥(MgSO4)、過濾并濃縮。殘余物結(jié)晶(EtOAc/己烷/CHCl3)得到1.92g化合物19，為細(xì)小的黃色結(jié)晶。m.p.86-91℃；1HNMR數(shù)據(jù)如下
(CDCl3)1.31(m，8H)，1.52(m，8H)，1.62(m，8H)，2.20(m，8H)，3.20(m，8H)，3.39(s，16H)，3.62(s，4H)，3.68(m，4H)，4.26(m，4H)，5.08(s，8H)，5.32(bd s，4H)，7.31(bd s，4H)，7.37(s，20H)；13C NMR(CDCl3)d 25.1，26.2，26.4，29.6，36.0，36.2，38.5，38.8，40.8，64.5，66.4，69.1，70.3，128.0，128.4，136.7，156.5，156.9，173.6；元素分析，計(jì)算C72H104N10O18C，61.87；H，7.50；N，10.02.實(shí)測(cè)C，61.68；H，7.63；N，9.95.
化合物36向800mg(0.57mmol)化合物19在5ml無水乙醇中的溶液加入3.5ml環(huán)己烯。將此溶液置于氮?dú)庀?，加?00mg 10％Pd/C，攪拌下回流2小時(shí)。冷卻后經(jīng)硅藻土過濾并濃縮，得500mg(100％)化合物36，油狀。
1H NMR(50/50 CDCl3/CD3OD)d 1.21(m，8H)，1.49(m，8H)，1.62(m，8H)，2.19(t，J＝7.4Hz，8H)，2.67(t，J＝7.4Hz，8H)，3.36(bd s，16H)，3.67(s，4H)，3.71(m，4H)，4.21(m，4H).
化合物20向5.0g(5.8mmol)化合物36在37.5ml二噁烷和12.5ml水中的溶液加入3.9g(46.4mmol)NaHCO3。在冰浴中冷卻混合物至0℃，加入8.7g(34.8mmol)溴代乙酸4-硝基苯酯(化合物10)。于0℃攪拌混合物1小時(shí)，慢慢加入1N H2SO4。用3×50ml EtOAC萃取該混合物。棄去乙酸乙酯萃取物，水層用6×10ml 20/80甲醇/二氯甲烷萃取。合并的甲醇/二氯甲烷層用Na2SO4干燥，過濾并濃縮。殘余物經(jīng)硅膠層析(9/1 CH2Cl2/MeOH然后85/15/5 CH2Cl2/MeOH/THF的階梯)得3.62g(46％)白色固體化合物20。熔點(diǎn)66.0-70.5℃。用制備性HPLC(C18反相柱，25/75/0.1到35/65/0.1 CH3CN/H2O/CF3COOH的50分鐘梯度，225nm)制備分析用樣品，得一清澈油，真空靜置固化得一白色固體。熔點(diǎn)87-89℃。
1H NMR(CDCl3)d 1.35(m，8H)，1.55(m，8H)，1.64(m，8H)，2.26(m，8H)，3.28(m，8H)，3.42(bd s，16H)，3.66(s，4H)，3.70(m，4H)，3.89(s，8H)，4.19(m，4H)；13C NMR(CDCl3)d 25.1，26.2，28.8，29.0，38.5，39.1，40.0，47.8，48.3，64.7，69.1，70.3，157.0，166.3，174.9；MS(FAB)m/e(相對(duì)強(qiáng)度)MH+[1341(25)，1343(60)，1345(70)，1347(56)，1349(21)]，705.6(100)；元素分析，計(jì)算C48H84N10O14Br4C，42.86；H，6.29；N，9.27；Br，23.77.
實(shí)測(cè)C，42.15；H，6.28；N，9.87；Br，25.33.
化合物21[四-(2-氰基乙氧基甲基)甲烷]按Bruson，H.A.報(bào)道的相似方法(美國(guó)專利2,401,607；1946年6月4日)制備該化合物。向8.0g(58.8mmol)季戊四醇和1.76ml40％氫氧化芐基三甲基銨的水溶液在50ml水中的溶液加入27.3ml(21.8g，411mmol)丙烯腈。裝一回流冷凝器，在N2氛下加熱混合物至40℃16小時(shí)，然后60℃24小時(shí)。冷卻后用1ml濃鹽酸酸化并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中。收集沉底的油，水相用3×40ml CH2Cl2萃取。合并油和萃取液，用MgSO4干燥，過濾并濃縮，得23.5g油。在110℃和0.25托下Khugelrhor蒸餾除去二氰乙基醚。釜中殘余物在1升水中結(jié)晶得8.43g(41％)白色針狀化合物21。
m.p.42.5°[報(bào)道數(shù)據(jù)(Macromolecules1991，24，1443-1444.)39-40°]；1H NMR(CDCl3)d 2.61(t，J＝6Hz，8H)，3.50(s，8H)，3.6(t，J＝6Hz，8H).
化合物22[四-(2-羧基乙氧甲基)甲烷]將5.0g(14.35mmol)化合物21在21.5ml濃HCl中的溶液于75℃攪拌3小時(shí)，在此期間形成了白色沉淀。真空除去鹽酸水溶液，將混合物在25ml水中濃縮2次。將生成的9.68g固體物質(zhì)載于一含有16.5cm床的氫氧化形式DOW-1-X2樹脂的45mm i.d.柱上，用200ml H2O，再用1N HCl洗脫此柱。用TLC(80/20/1CH3CN/H2O/HOAc)檢測(cè)產(chǎn)品，濃縮含產(chǎn)品的流份得1.21g(21％)油狀化合物22。1H NMR數(shù)據(jù)如下(D2O)d 2.46(t，J＝6Hz，8H)，3.22(s，8H)，3.55(t，J＝6Hz，8H).
化合物23向1.12g(2.85mmol)化合物22在7.0ml THF中的溶液加入3.71ml(6.06g，50.8mmol)亞硫酰氯。室溫下攪拌混合物3小時(shí)，真空除去溶劑。殘余的酰氯溶解在7ml THF中。然后向此溶液中加入2.12ml(1.54g，15.24mmol)三乙胺。在氮?dú)庀聰嚢杌旌衔锊⒗鋮s至0℃。1分鐘內(nèi)加入3.60g(12.74mmol)化合物4在5ml THF中的溶液。撤掉冷浴，在室溫下攪拌混合物5.5小時(shí)，然后在25ml1N鹽酸和4×25ml乙酸乙酯之間分配。合并乙酸乙酯層，用鹽水洗，干燥(MgSO4)，過濾并濃縮得到3.46g粘性油。在硅膠上層析純化(95/5二氯甲烷/甲醇)得1.26g粘性油狀化合物23。
1H NMR(CDCl3)d 2.40(t，8H)，3.29(s，8H)，3.35(m，16H)，3.48-3.77(m，48H)，5.12(s，8H)，5.60(bd，4H)，6.85(bd，4H)，7.34(s，20H).
化合物37向氮?dú)庀孪?42mg(0.093mmol)化合物23在8.4ml乙醇中的溶液加入4.0ml環(huán)己烯和83g 10％的Pd/C。在90℃油浴中攪拌下回流混合物3小時(shí)，冷卻后經(jīng)過硅藻土過濾用二氯甲烷洗滌濾器和燒瓶。濃縮濾液得70mg(78％)油狀化合物37。1H NMR(CDCl3)d2.90(t，8H)，3.3(s，8H)，3.45(t，8H)，3.52-3.73(m，48H)。
化合物24向70mg(0.098mmol)化合物37在2ml二噁烷和0.67ml水中的溶液加入40mg(0.48mmol)碳酸氫鈉和104mg(0.40mmol)化合物10。室溫下攪拌混合物17小時(shí)，加入0.5ml 1N H2SO4調(diào)pH值至4。濃縮混合物并在G-10 Sephadex(MeOH)上層析純化濃縮液。真空濃縮含產(chǎn)物的流份得91mg油。該粗產(chǎn)品36mg經(jīng)HPLC(C18，20/80/0.1到35/65/0.1 CH3CN/H2O/CF3CO2H的梯度)純化得到19mg(44％)的油狀化合物24。1H NMR(CDCl3)d2.50(t，8H)，3.31(s，8H)，3.36-3.72(m，56H)，3.91(s，8H)；13C NMR(CDCl3)d 28.8，36.5，39.7，40.0，67.2，69.3，69.5，70.3，166.6，173.0.MS(FAB)m/e(相對(duì)強(qiáng)度)MH+[1425(15)，1427(63)，1429(75)，1431(64)，1433(12)]，577(100).
化合物25a[PEG3350的二-對(duì)甲苯磺酸酯]向16.75g(5.0mmol)聚乙二醇于40ml二氯甲烷中的溶液加入6.47ml吡啶，聚乙二醇(J.T.Baker，平均分子量為3350g/mol)已經(jīng)共沸蒸餾(甲苯)干燥。將此溶液置于氮?dú)庀虏⒗鋮s至0℃。25分鐘內(nèi)加入7.63g(40mmol)對(duì)甲苯磺酰氯在40ml二氯甲烷中的溶液。撤去冷浴在室溫下攪拌混合物16小時(shí)。將混合物與80ml 1N HCl一起震搖，二氯甲烷層(含乳化物)用100ml水洗滌。用MgSO4干燥二氯甲烷層，過濾并濃縮。殘余物在二氯甲烷/乙醚中結(jié)晶得16.82g(92％)白色固體化合物25a。1H NMR(CDCl3)d 2.50(s，6H)，3.48(t，J＝5Hz，4H)，3.55-3.77(m，大于600H，積分太大無法精確測(cè)定)，3.83(t，J＝5Hz，4H)，7.44(d，J＝7Hz，4H)，7.94(d，J＝7Hz，4H).
化合物26a二疊氮基-PEG3350將10.83g(2.96mmol)化合物25a和1.92g(29.6mmol)NaN3在30ml DMF中的溶液在120℃油浴中氮?dú)庀录訜?小時(shí)。冷卻后混合物在100ml水和100ml二氯甲烷間分配。二氯甲烷層用200ml二氯甲烷稀釋并用100ml 1N HCl洗滌，Na2SO4干燥，過濾并濃縮。生成的蠟狀固體在二氯甲烷/乙醚中重結(jié)晶，生成的固體再在硅膠上層析純化(98/2到95/5 CH2Cl2/MeOH的梯度)得4.75g(47％)的蠟狀固體化合物26a。TLC Rf 0.41(9/1 CH2Cl2/MeOH)。1H NMR(CDCl3)d 3.35(t，J＝5Hz，4H)，3.44(t，J＝5Hz，2H)，3.54-3.77(m，約300H，積分太大無法精確測(cè)定)，3.79(t，J＝5Hz，2H)。
化合物27a[二氨基-PEG3350]向4.75g(1.39mmol)化合物26a在140ml乙醇中的溶液加入473mg 10％的Pd/C(Aldrich)。在60psi H2下震搖混合物30小時(shí)。因?yàn)榉磻?yīng)不完全(TLC，9/1 CH2Cl2/MeOH)，再加入473mg10％的Pd/C，混合物在60psi H2下再震搖5小時(shí)。然后混合物經(jīng)硅藻土過濾，真空濃縮，濃縮物結(jié)晶(CH2Cl2/Et2O)得4.03g(86％)的白色固體化合物27a。1H NMR(CDCl3)d2.92(t，4H)， 3.49(t，2H)，3.66(t，4H)，3.67(m，約300H，積分太大無法精確測(cè)定)，3.86(t，2H)。
化合物28[化合物7的N-羥基琥珀酰亞胺基酯]向1.84g(2.41mmol)化合物7和278mg(2.41mmol)NHS在12ml THF中的溶液于0℃氮?dú)庀录尤?96mg(2.89mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺。除去冷浴并在室溫下攪拌混合物16小時(shí)，向混合物中加入250μl乙酸，在室溫下繼續(xù)攪拌1小時(shí)。然后將混合物置于冰箱中2小時(shí)。濾掉固體，濃縮濾液得2.27g(110％)粘性油狀化合物28的粗品?；衔?8難以在不分解的情況下純化，所以直接用于酰化二氨基-PEG。
化合物29a將900mg(1.05mmol)化合物28在4.68ml二噁烷中的溶液加至877mg(0.26mmol)化合物27a和176mg(2.10mmol)NaHCO3在3.12ml水中的0℃溶液中。攪拌混合物2小時(shí)，然后在25ml 1NHCl和2×25ml二氯甲烷之間分配。合并二氯甲烷層，干燥(Na2SO4)、過濾并濃縮得一粘性油。經(jīng)硅膠層析純化(95/5到87/13CH2Cl2/MeOH的梯度)得695mg(55％)蠟狀固體化合物29a。
1H NMR(CDCl3)d 2.55(bd，8H)，3.39(m，16H)，3.44-3.72(m，約432H，積分太大無法精確測(cè)定)3.89(s，4H)，4.03(s，4H)，5.09(s，8H)，7.36(s，20H).
化合物38a向688mg(0.142mmol)化合物29a在14.2ml乙醇中的溶液在N2下加入7.1ml環(huán)己烯。加入284mg(10％Pd/C，回流混合物2小時(shí)。冷卻后將混合物通過硅藻土過濾，用乙醇洗，真空濃縮濾液得550mg(90％)蠟狀固體化合物38a。
1H NMR(CDCl3)d 2.58(m，8H)，2.93(m，8H)，3.38-376(m，約550H)，4.00(s，4H)，4.13，(s，4H).
化合物30a向550mg(0.13mmol)化合物38a和175mg(2.08mmol)NaH-CO3在3.11ml水中的0℃溶液中加入268mg(1.04mmol)化合物10在4.65ml二噁烷中的溶液。攪拌混合物20小時(shí)，并在50ml 1N硫酸和2×50ml CH2Cl2之間分配。合并CH2Cl2層并用Na2SO4干燥，過濾并濃縮成油。在G-10 Sephadex上層純化(MeOH)得一無定形固體，在乙醇/乙醚中結(jié)晶，得378mg(61％)白色固體化合物30a。1H NMR(CDCl3)d 2.59(bd S，8H)，3.38-3.82(m，約500H，積分太大無法準(zhǔn)確測(cè)定)，3.88(s，8H)，3.98(s，4H)，4.10(S，4H)；溴化乙酰測(cè)定(European Journal of Biochemistry，1984，140，63-71)計(jì)算值0.84mmol/g；實(shí)測(cè)值0.50mmol/g。
化合物25b[PEG8000的二-對(duì)甲苯磺酸酯]向12.0g(1.5mmol)PEG8000(Aldrich，平均分子量8000g/mmol)(已用甲苯共沸蒸餾干燥過)在30ml CH2Cl2中的溶液中加入2.3ml(16.5mmol)三乙胺，再加入3.15g(16.5mmol)TsCl。室溫下攪拌混合物18小時(shí)，并用4×50ml 1N HCl，再用50ml飽和NaCl2溶液萃取。CH2Cl2層經(jīng)干燥(Na2SO4)、過濾并真空濃縮，得一蠟狀固體。在CH2Cl2/Et2O中重結(jié)晶得11.0g(92％)白色固體化合物25b。
1H NMR(CDCl3)d 2.38(s，6H)，3.40-3.89(m.約800H，積分太大無法準(zhǔn)確測(cè)定)，4.14(m，4H)，7.34(d，J＝8.2Hz，4H)，7.79(d，J＝8.2Hz，4H).
化合物26b[二疊氮基-PEG8000]向10.8g(1.3mmol)化合物25b在30ml無水DMF中的溶液加入1.86g(28.6mmol)NaN3。在N2下120℃加熱混合物2.5小時(shí)。冷卻后混合物在240ml CH2Cl2和3×50ml 0.5N HCl間分配。CH2Cl2層用50ml飽和NaCl溶液洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮，得到一固體。在硅膠上層析(2/98到6/94 MeOH/CH2Cl2梯度)純化，純化產(chǎn)物在MeOH/Et2O中重結(jié)晶得6.95(66％)白色固體化合物26b。TLC(Rf＝0.33，12/88 MeOH/CH2Cl2)；1H NMR(CDCl3)3.39-3.86(m)。
化合物27b[二氨基-PEG8000]用氮?dú)獯迪?.9g(0.86mmol)化合物26b在150ml氨飽和甲醇中的溶液。加入1.5g 10％Pd/C，在65psi H2下振動(dòng)混合物。20小時(shí)后，TLC分析表明反應(yīng)不完全。因而加入200mg 10％Pd/C并在65psi H2下繼續(xù)振動(dòng)20小時(shí)。將混合物濾過硅藻土，真空濃縮濾液。生成的蠟狀固體在MeOH/Et2O中重結(jié)晶得6.0g(89％)白色固體化合物27b。1H NMR (CDCl3)d 2.96(t，J＝5.1Hz，4H)，3.40-3.89(m，約700H，積分太大無法精確測(cè)定)。
化合物29b向3.0g(0.375mmol)化合物27b在10ml水和3ml二噁烷中的溶液中加入221mg(2.63mmol)NaHCO3。加入溶于10ml二噁烷中的1.3(1.51mmol)化合物28。攪拌混合物24小時(shí)，然后加入40ml0.5N HCl。用4×25ml CH2Cl2萃取混合物。合并的CH2Cl2層經(jīng)干燥(MgSO4)，過濾和濃縮成為油。在MeOH/Et2O中結(jié)晶，得2.0g(58％)化合物29b。1H NMR(CDCl3)d 2.52(m，8H)，3.40-3.64(m，約700H，積分太大無法精確測(cè)定)，3.89(s，4H)，4.02(s，4H)，5.09(s，8H)，7.35(s，20H).
化合物38b向600mg(0.063mmol)化合物29b在5ml無水乙醇和2.5ml環(huán)己烯中的溶液在N2下加入123mg 10％Pd/C。在N2下回流混合物2小時(shí)。將混合物濾過硅藻土并蒸發(fā)，得549mg(97％)化合物38b，白色固體。1H NNR(CDCl3)d 2.58(m，8H)，2.90(m，8H)，3.39-3.70(m，約700H，積分太大無法精確測(cè)定)4.05(s，4H)，4.15(s，4H).
化合物30b向529mg(0.059mmol)化合物38b在2ml二噁烷和5ml水中的溶液加入100mg(1.2mmol)NaHCO3，再加入84mg(0.32mmol)化合物10。攪拌12小時(shí)后，用1N硫酸酸化反應(yīng)混合物，用4×40mlCHCl3萃取。合并CHCl3層，干燥(MgSO4)、過濾并濃縮得503mg半固態(tài)殘余物。殘余物經(jīng)G-10 Sephadex(MeOH)層析純化，在MeOH/Et2O/己烷中結(jié)晶得215mg(39％)白色固體化合物30b。1HNMR(CDCl3)d 2.58(m，8H，3.35-3.70(m，約700H，積分太大無法精確測(cè)定)，3.89(s，8H)，4.01(s，4H)，4.16(s，4H)；溴代乙酰測(cè)定(European Journal of Biochemistry 1984，140，63-71)計(jì)算值0.42mmol/g，實(shí)測(cè)值0.27mmol/g。
化合物31[PEG3350-二-氯代甲酸酯]向1.0g(0.249mmol)聚乙二醇(J.T.Baker，平均分子量為3350g/mol)(已用甲苯共沸蒸餾干燥)在12ml CH2Cl2中的溶液加入2滴無水吡啶，再加入125mg(0.418mmol)三光氣。在室溫下攪拌混合物20小時(shí)，真空蒸去溶劑，得到1.0g白色固體1.0g(100％)化合物31。1H NMR(CDCl3)d 3.40-3.65(m，約300H，積分太大無法精確測(cè)定)，3.77(m，4H)，4.46(m，4H)。
化合物32向600mg(1.0mmol)化合物18在10ml二噁烷和1.5ml吡啶中的50℃溶液中滴加1.0g(0.25mmol)化合物31在12ml 5∶1 CH2Cl2/二噁烷中的溶液。攪拌此渾濁溶液72小時(shí)。加入25ml CH2Cl2，然后過濾。蒸發(fā)濾液，半固態(tài)殘余物在G-10 Sephadex上層析純化。形成的固體在CH2Cl2/Et2O中結(jié)晶，得829mg(75％)淺黃色固體化合物32。1H NMR(CDCl3)d1.30(m，8H)，1.40(m，8H)，1.61(m，8H)，2.18(m，8H)，3.17(m，8H)，3.40(m，16H)，3.62(m，約300H，積分太大無法精確測(cè)定)，4.15(m，4H)，5.07(s，8H)，7.33(m，20H).
化合物39氮?dú)庀孪?00mg(0.065mmol)化合物32在5ml無水乙醇和2ml環(huán)己烯中的溶液加入100ml 10％Pd/C。在N2下回流該混合物2小時(shí)。將混合物濾過硅藻土并蒸去溶劑，得237mg(90％)白色固態(tài)化合物39。
1H NMR(CDCl3)d 1.37(m，8H)，1.48(m，8H)，1.65(m，8H)，2.21(m，8H)，2.50(m，8H)，3.39(m，16H)，3.64(m，約300H，積分太大無法精確測(cè)定)，4.19(m，4H).
化合物33向225mg(0.055mmol)化合物39在5ml二噁烷和5ml水中的溶液加入125mg(0.67mmol)NaHCO3和115mg(0.44mmol)化合物10。生成的黃色溶液在室溫下攪拌12小時(shí)。然后用3×30mlCH2Cl2萃取該溶液。用1N硫酸酸化水層，用3×30ml CH2Cl2萃取。合并CH2Cl2層，干燥(MgSO4)，過濾，并濃縮得一黃色油。在G-10 Sephadex(MeOH)上層析純化并將形成的油在EtOH/Et2O中重結(jié)晶，得182mg(73％)白色固態(tài)化合物33。1H NMR(CD-Cl3)d 1.55(m，8H)，1.55(m，8H)，1.65(m，8H)，2.22(m，8H)，3.28(m，8H)，3.42(m，16H)，3.50-3.64(m，約300H，積分太大無法精確測(cè)定)，3.87(s，8H)，4.18(m，4H)；溴代乙酰測(cè)定(Europeon Jour-nal of Biochemistry 1984，140，63-71)計(jì)算值，0.87mmol/g；實(shí)測(cè)值，0.73mmol/g。元素分析，C191H375O87N10Br4的計(jì)算值C，50.84；H，8.33；N，3.09；Br，7.05。實(shí)測(cè)值C，51.98；H，8.34；N，2.45；Br，10.19。
化合物40[碘代乙酸4-硝基苯酯]向3.72g(200mmol)碘代乙酸的0℃溶液中加入100ml EtOAc中的5.15g(25mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺和2.92g(2.92mmol)4-硝基苯酚。0℃下攪拌混合物1小時(shí)。于室溫下攪拌2小時(shí)。濾去固體，真空濃縮濾液。形成的黃色固體在EtOAc/己烷/痕量HOAc中重結(jié)晶，得4.82g(78％)黃棕色固態(tài)化合物40。1H NMR(CDCl3)d 4.00(s，2H)，7.39(d，2H)，8.40(m，2H)。
化合物41向110mg(0.104mmol)化合物34在5ml二噁烷和5ml H2O中的溶液加入103mg(1.22mmol)NaHCO3，再加入211mg(0.692mmol)化合物40。攪拌混合物18小時(shí)，真空濃縮。在Sephadex(MeOH)上層析純化，得140mg(87％)油狀化合物41。用制備性HPLC(C18，20/80/0.1到25/75/0.1 CH3CN/H2O/TFA在60分鐘內(nèi)的梯度，225nm)制備分析用樣品。1H NMR數(shù)據(jù)如下(CDCl3)d 2.59(m，4H)，2.65(m，4H)，3.44-3.62(m，60H)，3.77(s，4H)，3.78(s，4H)，4.02(s，4H)，4.21(s，4H).
化合物42在0℃及劇烈攪拌下向171mg(0.161mmol)化合物34在8ml二噁烷、2ml飽和NaHCO3溶液和2ml水中的溶液加入145mg(0.935mmol)N-甲氧羰基馬來酰亞胺。(The Practice of PeptideSynthesis，M.Bodansky和A.Bodansky，Springer-Verlag，NewYork，1984，p 29-31.Keller，O.，Rudinger，J.Helv.Chem.Acta1975，58，531)。15分鐘后加入25ml二噁烷，除去冷浴，在室溫下繼續(xù)攪拌45分鐘。用2×30ml CHCl3萃取此混合物，合并CHCl3層并用MgSO4干燥，過濾并濃縮成油。在G-10 Sephadex(MeOH)上層析純化，得103mg(45％)油狀化合物42。用制備性HPLC(C18，20/80/0.1-25/75/0.1 CH3CN/H2O/TFA 65分鐘梯度，225nm)制備分析用樣品，得一油品。
1H NMR(CDCl3)d 2.57(m，4H)，2.67(m，4H)，3.42-3.65(m，52H)，3.72(m，8H)，4.03(s，4H)，4.17(s4H)，6.74(s，4H)，6.75(s，4H).
化合物43[羥甲基-三-(2-氰乙氧基甲基)甲烷]向6.8g(50mmol)季戊四醇在50ml水中的溶液加入0.30g(5.41mmol)KOH，再加入23ml(18.6g，350mmol)丙烯腈。在室溫下攪拌混合物16小時(shí)，用1.5ml濃HCl溶液酸化，用2×50mlCH2Cl2萃取。合并CH2Cl2層，經(jīng)干燥(MgSO4)、過濾及濃縮得16.97g液體。在硅膠上層析純化(EtOAc)得8.49g(51％)粘性油化合物43。
TLC，Rf＝0.15(EtOAc)；1H NMR(CDCl3)d 2.62(t，6H)，3.54(s，6H)，3.68(t，6H)，3.70(s，2H).
化合物44[羥甲基-三-(2-甲氧羰基乙氧基甲基)甲烷]向5.45g(15.6mmol)化合物43中加入78ml HCl的飽和甲醇溶液。加熱回流混合物1小時(shí)，冷卻后在100ml H2O和4×100mlEt2O間分配。合并Et2O層，相繼用100ml飽和NaHCO3溶液和100ml飽和NaCl溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并濃縮得4.74g粘性液體。在硅膠上層析純化得3.05g(50％)油狀化合物44。
TLC，Rf＝0.27(80/20 EtOAc/己烷)；1H NMR(CDCl3)d 2.58(t，6H)，3.43(s，6H)，3.61(s，2H)，3.69(t，6H)，3.70(s，9H)；13C NMR(CDCl3)d 34.8，44.9，51.6，65.2，66.9，71.0，172.1.
化合物45將560mg(1.4mmol)化合物44和1.69g(6.0mmol)化合物4在氮?dú)庀?50℃加熱4小時(shí)。將混合物在50ml EtOAc和25ml 1N HCl間分配，HCl層用25ml CH2Cl2萃取。合并EtOAc和CH2Cl2萃取物，用飽和NaHCO3溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并濃縮得粘性殘余物。在硅膠上層析純化(95/5-90/10 CH2Cl2/MeOH梯度)得300mg(19％)化合物45，為粘性油品。
TLC，Rf＝0.24(90/10 CH2Cl2/MeOH)；1H NMR(CDCl3)d 2.40(t，6H)，3.38(s，6H)，3.39-3.48(m，12H)，3.52-3.67(m，32H)，5.13(s，6H)，5.62(bd s，3H)6.80(bd s，3H)，7.40(s，15H).
化合物46在N2下向308mg(0.269mmol)化合物45在10.4ml乙醇和5.2ml環(huán)己烯中的溶液加入104mg 10％Pd/C。裝一回流冷凝器，在85℃油浴中加熱混合物1.5小時(shí)。冷卻后，混合物通過硅藻土過濾，濃縮濾液得177mg殘余物。將殘余物部分溶解在5.98ml二噁烷中。將形成的混合物加到386mg(1.49mmol)化合物10中，再加入251mg(2.99mmol)NaHCO3在3.99ml水中的溶液。在N2下攪拌該混合物18小時(shí)，并在25ml 1N HCl和3×25ml CH2Cl2間分配。水相用3×25ml 3/1 CH2Cl2/MeOH和3×25ml 1/1 CH2Cl2/MeOH萃取。棄去前兩部分CH2Cl2萃取液，其余萃取液合并，干燥(Mg-SO4)，過濾并濃縮得102mg粘性油。用HPLC純化(C18，23/77/0.1CH3CN/H2O/CF3CO2H，234nm檢測(cè))得43mg(14％)粘性油狀化合物46。1H NMR(CDCl3)d 2.48(t，6H)，3.40(s，6H)，3.44-3.54(m，14H)，3.56-3.62(m，12H)，3.63(s，12H)，3.67(t，6H)，3.91(s，6H)，6.90(t，3H)，7.10(t，3H)； MS(FAB)m/e(相對(duì)強(qiáng)度)MH+[1103(17)，1105(42)，1107(41)，1109(18)]，MNa+[1125(38)，1127(100)，1129(99)，1131(39)].
化合物47[S-(6-羥己基)異硫脲鎓氯化物]向16.6ml(20.0g，146mmol)6-氯己醇在49ml乙醇中的溶液加入11.1g(146mmol)硫脲，回流混合物24小時(shí)。冷卻至0℃，產(chǎn)物結(jié)晶。真空過濾收集晶體，干燥得28.4g(92％)白色固體化合物47。
mp 122-124°；1H-NMR(DMSO)1.40(m，4H)，1.65(m，2H)，3.21(t，2H)，3.41(t，2H)，9.27和9.33(重疊的寬單峰，4H)；元素分析，計(jì)算C7H17ClN2OSC，39.51；H，8.06；N，13.17；S，15.07.
實(shí)測(cè)C，39.69；H，8.00；N，13.01；S，15.16.
化合物48[6-巰基己-1-醇]將9.25g NaOH片加至17.8mg(83.6mmol)化合物47在120ml水和120ml乙醇中的溶液中?；亓骰旌衔?小時(shí)。仔細(xì)濃縮混合物至約75ml，真空蒸餾純化濃縮物，得7.4g(66％)化合物48bp 95-105℃，5mmHg。
1H NMR(CDCl3)1.41(m，9H)，2.59(dt，2H)，3.69(t底下有寬單峰，3H)；13C NMR(CDCl3)d 24.5，25.2，28.0，32.5，33.9，62.7；元素分析，計(jì)算C6H14OSC，53.68，H，10.51；S，23.89.實(shí)測(cè)C，53.35；H，10.72；S，23.60.
化合物49[二-(6-羥己基)二硫化物]將4.02g(15.8mmol)I2在90ml甲醇中的溶液在N2下10分鐘內(nèi)滴加到4.26g(31.7mmol)化合物48在10ml甲醇和13.7ml(9.97g，98.5mmol)三乙胺中的溶液中，并在冰浴中冷卻。除去冷浴，于室溫下攪拌混合物4小時(shí)。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮混合物，經(jīng)硅膠層析純化(1∶1己烷/EtOAc)得3.12g(73％)灰黃色固態(tài)化合物49。 TLC Rf.18(1∶1己烷/EtOAc)；mp 38-48°；1H NMR(CDCl3)1.15-2.20(m，16H)，2.73(t，4H)，3.70(t，4H)；元素分析，計(jì)算C12H26S2O2C，54.09；H，9.84；S，24.06.實(shí)測(cè)C，54.85，H，9.86；S，24.11.
化合物50單-O-(4’，4”-二甲氧基三苯甲基)-二-(6-羥己基)二硫化物向3.12g(11.7mmol)化合物49在45ml吡啶中的溶液加入3.97g(11.7mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯。在室溫下攪拌混合物16小時(shí)。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去大部分吡啶。殘余物在100ml飽和NaHCO3溶液和100ml EtOAC之間分配。 EtOAc層用50ml飽和NaCl溶液洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮成油。在硅膠上層析純化(9/1 CH2Cl2/EtOAc)得2.84g(43％)粘性油化合物50。TLCRf0.35(9/1 CH2Cl2/EtOAc)。
1H NMR(CDCl3)1.41(m，8H)，1.65(m，8H)，2.70(兩個(gè)重疊的三重峰，4H)，3.08(t，2H)，3.65(t，2H)，3.81(s，6H)，6.85(d，4H)，7.32(m，7H)，7.47(d，2H)；HRMS(FAB，M+)，計(jì)算C33H44O4S2568.2681.實(shí)測(cè)568.2665.
化合物51O-[14-(4’，4”-二甲氧基三苯甲氧基)-7，8-二硫雜十四基]-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙基氨基亞磷酸酯
氮?dú)庀孪?71mg(1.36mmol)化合物50和116mg(0.68mmol)二異丙基銨四唑鹽在6.8ml CH2Cl2中的溶液加入458mg(1.52mmol)O-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基二氨基亞磷酸酯在0.5mlCH2Cl2中的溶液。攪拌混合物4小時(shí)，并在25ml NaHCO3和3×25ml CH2Cl2間分配。合并CH2Cl2層，用飽和NaCl溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并濃縮成油。通過一25mm柱中的2”plug的堿性氧化鋁過濾，用9/1 CH2Cl2/Et3N洗脫，純化得到831mg(80％)粘性油狀化合物51。1H NMR(CDCl3)d 1.25(m，12H)，1.45(m，8H)，1.70(m，8H)，2.72(m，6H)，3.09(t，2H)，3.65(m，4H)，3.87(s，6H)，3.91(m，2H)，6.89(d，4H)，7.35(m，7H)，7.49(d，2H)；31P NMR(CDCl3以15％H3PO4為內(nèi)標(biāo))147.69；HRMS(FAB，MH+)計(jì)算for C42H62N2O5PS2769.3839，實(shí)測(cè)769.3 853.
化合物52三苯甲基-HAD醇向57g(0.21mol)化合物49在60ml吡啶中的溶液加入60g(0.21mol)三苯甲基氯。在100℃攪拌此混合物19小時(shí)。冷卻至室溫并過濾。用300ml二氯甲烷稀釋濾液，用200ml飽和碳酸氫鈉萃取。用Na2SO4干燥有機(jī)層，過濾并濃縮成油。經(jīng)硅膠層析純化(9/1己烷/乙酸乙酯到3/1己烷/乙酸乙酯的梯度)得55g化合物52(50％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.38(m，8H)，1.63(m，8H)，2.66(m，4H)，3.04(t，2H)，3.62(t，2H)，7.25(m，9H)，7.42(m，6H).HRMS(FAB，M+)ca計(jì)算or C31H40O2S 508.2470，實(shí)測(cè)化合物53三苯甲基HAD氨基亞磷酸酯0℃及氬氣下向10g(19.7mmol)化合物52和6.3ml(36.2mmol)二異丙基乙基胺在90ml二氯甲烷中的溶液慢慢加入4.5ml(20.2mmol)2-氰乙基-N，N-二異丙基氯代氨基亞磷酸酯。攪拌90分鐘后用100ml飽和碳酸氫鈉萃取反應(yīng)混合物2次。二氯甲烷溶液用Na2SO4干燥，過濾并濃縮成油。經(jīng)堿性氧化鋁層析(75/24/1，己烷/乙酸乙酯/三乙胺)純化得11.3g油狀化合物53(81％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.18(m，12H)，1.37(m，8H)，1.62(m，8H)，2.6(m，6H)，3.04(t，2H)，3.60(m，4H)，3.82(m，2H)，7.26(m，6H)，7.44(m，9H).HRMS(FAB，MH+)計(jì)算C40H58N2O3PS2709.3626，實(shí)測(cè)709.3621.
化合物54O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-5-己烯醇向12.47ml(10.4g，104mmol)5-己烯-1-醇在104ml DMF中的溶液中加入15.66g(230mmol)咪唑和20.0g(130mmol)叔丁基二甲基甲硅烷基氯。在室溫下攪拌混合物4小時(shí)，并在200ml E-tOAc和100ml飽和NaHCO3溶液之間分配。EtOAc層用100ml飽和NaHCO3溶液、100ml飽和NaCl溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并濃縮至約100ml體積。真空蒸餾得70.07g(90％)化合物54。
bp 130-143°@100mm Hg；1H NMR(CDCl3)0.11(s，6H)，0.95(s，9H)，1.48(m，2H)，1.57(m，2H)，2.11(dt，2H)，3.66(t，2H)，5.03(m，2H)，5.86(m，1H)；13C NMR(CDCl3)-5.25，18.40，25.21，26.01，32.35，33.60，63.09，114.40，138.92；元素分析，計(jì)算 C12H26OSiC，67.22；H，12.22.實(shí)測(cè)C，66.96；H，12.16.
化合物551-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-1，5，6-己三醇向9.86g(46.0mmol)化合物54在92ml丙酮的溶液中加入6.46g(55.2mmol)N-甲基嗎啉氧化物在23ml水中的溶液。向此混合物中加入443μl 2.5％ OsO4/叔丁醇溶液(360mg溶液，9.0mgOsO4，35μmol)和50μl 30％ H2O2。攪拌混合物16小時(shí)，加入474mg連二硫酸鈉在14ml H2O中的溶液。再過0.5小時(shí)后，將混合物濾過硅藻土。用MgSO4干燥濾液，在一150ml Buchner漏斗中濾過1”硅膠，用250ml(每份)EtOAc洗脫。濃縮含產(chǎn)物的流份得11.0g(96％)粘性油狀化合物55。
TLC Rf0.2(1∶1己烷/EtOAc)；1H NMR(CDCl3)0.05(s，6H)，0.89(s，9H)，1.25(m，4H)，1.55(m，2H)，3.41(dd，2H)，3.62(t，2H)，3.71(m，1H)；13CNMR(CDCl3)-5.23，18.42，21.91，26.02，32.68，32.81，63.16，66.74，72.24；HRMS(FAB，MH+)，計(jì)算C12H29O3Si249.1886.實(shí)測(cè)249.1889.
化合物565，6-(二-O-苯甲?；?-1-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-1，5，6-己三醇將6.18ml(7.48g，53.2mmol)苯甲酰氯加至5.29g(21.3mmol)化合物55在106ml吡啶中的溶液中。攪拌混合物18小時(shí)并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮?；旌衔镌?00ml冷1N HCl和100ml EtOAc間分配。檢查水層的pH值，保證其為酸性。相繼用100ml水和100ml飽和NaCl洗滌EtOAc層，干燥(MgSO4)、過濾并濃縮，得10.33g(99％)粘性黃色油狀化合物56。 TLC Rf＝0.45(1/4；EtOAc/己烷)。1H NMR(CDCl3)d 0.05(s，6H)，0.88(s，9H)，1.59(m，4H)，1.85(m，2H)，3.14(t，2H)，4.49(dd，1H)，4.59(dd，1H)，5.54(m，1H)，7.45(m，4H)，7.58(m，2H)，8.05(m，4H).
化合物575，6-(二-O-苯甲?；?-1，5，6-己三醇將10.7ml(10.7mmol)1N氟化四丁銨的THF溶液加到2.62g(5.35mmol)化合物56于10.9ml THF中的溶液中。攪拌混合物16小時(shí)。將混合物在25ml飽和NaHCO3溶液和3×25ml EtOAc之間分配。合并EtOAc層，用飽和NaCl溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并濃縮成粘性油，經(jīng)硅膠層析純化(1/1己烷/EtOAc)得823mg(41％)粘性油狀化合物57。 Rf＝0.14(1/1，己烷/EtOAc)。
1H NMR(CDCl3)d 1.58(m，2H)，1.68(m，2H)，1.88(m，2H)，3.68(t，2H)，4.52(dd，1H)，4.62(dd，1H)，5.56(m，1H)，7.46(m，4H)，7.58(m，2H)，8.05(m，4H)；13C NMR(CDCl3)d 22.08，31.20，31.30，32.88，62.92，66.17，72.63，128.93，130.19，130.57，133.62，166.72，166.86；HRMS(FAB MH+)，計(jì)算C20H23O5；343.1545.
實(shí)測(cè)343.1553.
化合物58O-[5，6-(二-O-苯甲酰氧基)己基]-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙基氨基亞磷酸酯將989mg(3.28mmol)O-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基二氨基亞磷酸酯的CH2Cl2(2.0ml)溶液加到1.02g(2.98mmol)化合物57和255mg(1.49mmol)二異丙銨四唑鹽(將二異丙胺和四唑的乙腈溶液按1∶1的摩爾比混合并濃縮至白色固體而制得)的二氯甲烷(14.9ml)溶液中。攪拌混合物4小時(shí)，然后在25ml二氯甲烷和25ml冷的飽和NaHCO3溶液間分配。二氯甲烷層用飽和NaCl溶液洗滌，干燥(Na2SO4)、過濾并濃縮。濾過25mm柱中2”plug堿性氧化鋁，用9∶1 EtOAc/Et3N洗脫純化得1.5g(93％)粘性油化合物58。1H NMR(CDCl3)d 1.19(m，12H)，1.62(m，2H)，1.73(m，2H)，1.90(m，2H)，2.62(dd，2H)，3.53-3.92(m，6H)，4.53(dd，1H)，4.62(dd，1H)，5.58(m，1H)，7.48(m，4H)，7.60(m，2H)，8.09(m，4H)；31P NMR(CDCl3以15％H3PO4為內(nèi)標(biāo))d 148.2；HRMS(FAB，MH+)，計(jì)算C29H40O6N2P 543.2624. 實(shí)測(cè)，543.2619.
化合物59[4-(碘代乙酰氨基)苯甲酸]按Weltman.J.K.，1983 Biotechniques 1148-152中描述的方法制備該化合物。簡(jiǎn)單講，向137mg(1.0mmol)對(duì)氨基苯甲酸的二惡烷(10ml)溶液中加入708mg(2.0mmol)碘代乙酸酐。避光攪拌混合物18小時(shí)，并在25ml水和25ml EtOAc間分配。乙酸乙酯層用飽和氯化鈉溶液洗，用MgSO4干燥，過濾并濃縮得797mg桃紅色固體。在己烷/乙酸乙酯中重結(jié)晶得22lmg(72％)白色固態(tài)4-(碘代乙酰氨基)苯甲酸。mp 220-230℃。1H NMR(CDCl3)d 3.86(s，2H)，7.68(d，2H)，7.91(d，2H)，10.60(s，1H)。
化合物60[α，ω-二-(N-2-氨基乙基氨基甲?；?聚乙二醇的4-(碘代乙酰氨基)苯甲酰衍生物]向185mg(0.606mmol)4-(碘代乙酰氨基)苯甲酸和406mg(0.121mmol)α，ω-二(N-2-氨基乙基氨基甲?；?聚乙二醇(Sig-ma Chemical Co.，St.Louis，MO.，用甲苯共沸蒸餾干燥)的THF(2ml)溶液中，加入188mg(0.909mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺。攪拌混合物2小時(shí)，然后加入6滴乙酸。加入10ml二氯甲烷并將混合物在冷箱中保持30分鐘。過濾除去固體，濃縮濾液成粘性殘余物。硅膠層析純化(99/1～96/4 CH2Cl2/MeOH的梯度)得一固體，與MeOH研制得292mg奶油色固體。1H(CDCl3)NMR數(shù)據(jù)如下3.48(m，8H)，3.63(bd s，(CH2CH2O)n，積分太大無法精確測(cè)定)，3.98(s，4H)，4.18(bd m，4H)，5.91(bd m，2H)，7.48(bd m，2H)，7.76(d，4H)，7.88(d，4H)，9.38(bd m，2H)碘代乙酰測(cè)定(European Journalof Biochemistry1984，140，63-71)計(jì)算0.46mmol/g；實(shí)測(cè)0.37mmol/g.
實(shí)施例3活化價(jià)平臺(tái)分子和偶聯(lián)物的制備有許多方法可制備生物或合成分子與價(jià)平臺(tái)分子的偶聯(lián)物。一種特別特異的方法是利用連在生物或合成分子上的硫醇與價(jià)平臺(tái)分子上的活性“親硫”基團(tuán)產(chǎn)生親核反應(yīng)形成硫醚鍵，但也可以利用平臺(tái)分子上和生物或合成分子上反應(yīng)活性基團(tuán)的其他組合來將生物或合成分子共價(jià)連接在價(jià)平臺(tái)分子上。表1中是相互反應(yīng)性基團(tuán)的幾種組合。優(yōu)選何種給定方法要由生物或合成分子的性質(zhì)(溶解性、是否存在其他活性基團(tuán)等)來決定。
表1親核基團(tuán) 相互反應(yīng)性基團(tuán)胺，酰肼，肼 活性酯，酸酐，酰鹵，磺酰鹵，亞胺酸酯，異氰酸酯，異硫氰酸酯，氯代甲酸酯，碳化二亞胺加合物，醛，酮硫醇鹵代乙酰，烷基鹵，烷磺酸酯，馬來酰亞胺，α，β-不飽和羰基，烷基汞化合物，巰基，α，β-不飽和砜下列實(shí)施例說明如何合成各種價(jià)平臺(tái)分子以及如何與生物或合成分子偶聯(lián)。這些實(shí)施例顯示如何利用表1中的相互反應(yīng)性基團(tuán)將肽和寡核苷酸偶聯(lián)到價(jià)平臺(tái)分子上。除肽和寡核苷酸外，其他生物活性分子(蛋白，藥物等)也可以偶聯(lián)到價(jià)平臺(tái)分子上。
組合1平臺(tái)上的硫醇-配體上的親硫基團(tuán)反應(yīng)方案14
化合物A將化合物36(861mg，1.0mmol)和252mg(3.0mmol)NaHCO3溶解在20ml 1/1二噁烷/水中。冷卻混合物至0℃，攪拌下加入1.16g(5.0mmol)N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(ProchemInc.)在40ml二噁烷中的溶液。1小時(shí)后用CH2Cl2萃取混合物。合并萃取物，干燥(MgSO4)，過濾并濃縮。在硅膠上層析純化該粗品得化合物A。
化合物B具有4個(gè)巰基的平臺(tái)將732mg(0.55mmol)化合物A的DMSO(7.3ml)溶液加至55ml氦氣噴射下的pH10，100mM碳酸鈉，10mM NH4OH緩中液中?；旌衔镌贜2下保持并攪拌1小時(shí)，得到四巰基平臺(tái)B的約10mM溶液。
化合物X溴代乙酰化肽按標(biāo)準(zhǔn)的固相方法在Wang(對(duì)烷氧芐基)樹脂上用FMOC化學(xué)合成一種肽。將FMOC保護(hù)的氨基酸依次加在氨基末端。最后一步是與N-溴代乙酰氨基己酸偶聯(lián)。除去保護(hù)基并用三氟乙酸從樹脂上釋放肽得到化合物X，用制備性反相HPLC純化。
肽-平臺(tái)偶聯(lián)物，C向四巰基平臺(tái)B在pH10緩沖液中的約10mmol溶液中加入過量的溴代乙?；腦的DMSO溶液。用制備性反相HPLC純化肽偶聯(lián)物C。
組合2平臺(tái)上的胺-肽上的活化羧酸反應(yīng)方案15 化合物Y具有活化羧酸的肽按標(biāo)準(zhǔn)固相方法在Wang(對(duì)烷氧芐基)樹脂上利用TFA穩(wěn)定性保護(hù)基(羧基上的芐酯和氨基上的CBZ)合成肽。依次向氨基末端加上氨基酸殘基。用TFA從樹脂上解下肽，得到羧基末端有一游離羧基而所有其他羧基和胺均被封閉的肽。用反相HPLC純化此保護(hù)的肽Y。
肽-平臺(tái)偶聯(lián)物，D將化合物Y(0.3mmol)溶于1ml DMF中，并向此溶液中加入0.3mmol二異丙基碳化二亞胺和0.3mmol HOBT。將此溶液加至0.025mmol四氨基平臺(tái)36的DMF(1ml)溶液中。反應(yīng)完全后真空除去DMF得到全保護(hù)偶聯(lián)物粗品。將此偶聯(lián)物溶于甲醇中，并將此溶液置于含100mg 10％ Pd/C(每克偶聯(lián)物)的巴氏氫化儀中。在60psi H2下震搖混合物，并用制備性反相HPLC純化脫保護(hù)的偶聯(lián)物D。
組合3平臺(tái)上的胺-寡核苷酸上的醛反應(yīng)方案16 寡核苷酸-平臺(tái)偶聯(lián)物，E在0℃避光向1.0g(400mg全長(zhǎng)，25μmol)ACT-修飾的(CA)25在19.5ml水中的溶液加入500μl(100μmol)NaIO4的200mM溶液。將混合物保持于0℃40分鐘，加入50ml乙醇。保持混合物于-20℃計(jì)30分鐘，2000rpm離心5分鐘。棄去上清液，真空干燥沉淀。將沉淀溶于3.3ml水中，向形成的溶液中加入4.3mg(0.005mmol)化合物36在2.0ml pH8.00的100mM硼酸鈉中的溶液。向形成的溶液中加入250μl(50μmol)200mM吡啶-硼烷復(fù)合物在甲醇中的溶液，保持混合物于37℃4天。用離子交換層析純化偶聯(lián)物E。
組合4平臺(tái)上的活化羧酸-配體上的胺反應(yīng)路線17
化合物F具有4個(gè)羧基的平臺(tái)向861mg(1.0mmol)化合物36和252mg(3.0mmol)NaHCO3在20ml 1/1二噁烷/水中的溶液加入琥珀酸酐(1.0g，10mmol)，室溫下攪拌混合物16小時(shí)。用1N HCl酸化混合物并濃縮。濃縮物經(jīng)硅酸層析純化得到化合物F。
化合物G具有4個(gè)N-琥珀酰亞胺基酯的平臺(tái)制備126mg(0.1mmol)化合物F和46mg(0.4mmol)N-琥珀酰亞胺基于5ml無水THF中的溶液。冷卻該混合物至0℃，加入103mg(0.5mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺。攪拌混合物使其在數(shù)小時(shí)內(nèi)升至室溫。濾除固體，濃縮濾液得化合物G，可在硅膠上層析純化。
化合物Z帶氨基的肽按標(biāo)準(zhǔn)固相方法在Wang(對(duì)烷氧芐基)樹脂上合成肽。賴氨酸ε-氨基以CBZ基團(tuán)保護(hù)。利用FMOC化學(xué)向氨基末端依次加上氨基酸殘基。加入的最后一個(gè)殘基是N-FMOC-氨基己酸。用三氟乙酸從樹脂上解下后，用哌啶除去FMOC基團(tuán)，得到具有游離胺接頭的肽。用反相HPLC純化肽Z。
肽-平臺(tái)偶聯(lián)物H制備0.05mmol化合物Z和0.1mmol三乙胺在1ml DMF中的溶液。向此溶液中加入16.5mg(0.01mmol)化合物G在1ml DMF中的溶液。攪拌反應(yīng)混合物直到反應(yīng)完全。為了除去保護(hù)基，將偶聯(lián)物溶于甲醇中，將此濾液與100mg 10％Pd/C(每克偶聯(lián)物)一起置于一巴氏氫化儀中。在60psi H2下震搖混合物，用制備性反相HPLC純化脫保護(hù)的偶聯(lián)物H。
組合5平臺(tái)上的異硫氰酸酯-配體上的胺反應(yīng)方案18
化合物I有4個(gè)異硫氰酸酯的平臺(tái)向861mg(1.0mmol)化合物36在10ml THF中的溶液加入三光氣(381μl，575mg，5.0mmol)，室溫下攪拌直到TLC檢測(cè)反應(yīng)完全。將混合物在二氯甲烷和5％NaHCO3溶液之間分配。萃取物經(jīng)干燥(MgSO4)、過濾及濃縮。硅膠層析純化產(chǎn)物I。
肽-平臺(tái)偶聯(lián)物J制備0.05mmol化合物Z和0.1mmol三乙胺在1ml DMF中的溶液。向此溶液中加入10.3mg(0.01mmol)化合物I在1ml DMF中的溶液。攪拌混合物直到反應(yīng)完全。為了除去保護(hù)基團(tuán)，將偶聯(lián)物溶于甲醇，將此溶液與100mg 10％Pd/C(每克偶聯(lián)物)一起置于一巴氏氫化儀中。在60psi H2下振搖混合，用制備性反相HPLC純化脫保護(hù)偶聯(lián)物J。
組合6平臺(tái)上的氯甲酸酯-配體上的胺反應(yīng)方案19 化合物K有4個(gè)羥基的平臺(tái)將205μl(275mg，1mmol)三乙二醇二-氯甲酸酯在5ml CH2Cl2中的溶液加到497μl(525mg，5mmol)二乙醇胺和696μl(506mg，5mmol)三乙胺在5ml CH2Cl2中的0℃溶液中。讓混合物升溫至室溫，攪拌直到TLC顯示反應(yīng)完全。濃縮混合物，經(jīng)硅膠層析分離產(chǎn)物K。
化合物L(fēng)具有氯甲酸酯基團(tuán)的平臺(tái)向412mg(1mmol)化合物K在20ml CH2Cl2中的溶液加入吡啶(100μl)，再加入1.19g(4mmol)三光氣。室溫下攪拌混合物20小時(shí)，真空蒸發(fā)溶劑得化合物L(fēng)。
肽-平臺(tái)偶聯(lián)物M將1mmol化合物Z在10ml吡啶中的溶液加到132mg(0.2mmol)化合物L(fēng)在5ml 1/1 THF/吡啶中的溶液中。攪拌混合物直到反應(yīng)完全。真空除去溶劑。為脫去保護(hù)基團(tuán)，將偶聯(lián)物溶于甲醇中，并將此溶液與100mg 10％Pd/C(每克聯(lián)物)在巴氏氫化儀中混合。在60psi H2下?lián)u動(dòng)混合物，經(jīng)制備性反相HPLC純化脫保護(hù)偶聯(lián)物M。
實(shí)施例4含兩種不同生物分子的偶聯(lián)物的合成將一種以上生物活性基團(tuán)偶聯(lián)在平臺(tái)分子上是有用的。該實(shí)施例描述含有兩個(gè)馬來酰亞胺基團(tuán)(其與含巰基肽反應(yīng))和兩個(gè)活化酯基團(tuán)(其與含游離胺的藥物反應(yīng))的平臺(tái)的制備。如方案20中所示，形成的偶聯(lián)物含有兩個(gè)肽和兩個(gè)藥物分子。
雜活化價(jià)平臺(tái)分子的制備6-氨基己酸芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽，K將32mmol 6-氨基己酸、51mmol對(duì)甲苯磺酸和40mmol苯甲醇在60ml甲苯的混合物用Dean-Stark阱回流除去水。反應(yīng)完全后冷卻混合物并沉淀產(chǎn)物。過濾收集固體，在乙醇/乙醚中重結(jié)晶得化合物K。
化合物L(fēng)向1當(dāng)量化合物5和2當(dāng)量N-羥基琥珀酰亞胺在THF中的溶液加入二環(huán)己基碳化二亞胺(2當(dāng)量)。攪拌混合物4小時(shí)并加入2.2當(dāng)量化合物K。攪拌混合物至TLC檢測(cè)反應(yīng)完全。過濾混合物并濃縮。經(jīng)硅膠層析純化產(chǎn)物。
化合物M在二氯甲烷中用三氟乙酸處理化合物L(fēng)。反應(yīng)完全后真空濃縮混合物得化合物M的三氟乙酸鹽。
化合物N
在二氯甲烷中用三氟乙酸處理化合物6(方案2)。反應(yīng)完全后真空濃縮混合物，得化合物N的三氟乙酸鹽。
化合物O在20℃水浴中，向4mmol化合物M和4mmol化合物N在162ml吡啶中的溶液加入3.2mmol三乙二醇二氯甲酸酯。攪拌混合物至TLC檢測(cè)到反應(yīng)完全，真空濃縮。將濃縮物溶于二氯甲烷，依次用1N HCl溶液、5％ NaHCO3溶液和飽和NaCl溶液洗滌。干燥(MgSO4)層，過濾并濃縮。將濃縮液溶于10ml乙醇中，加入10ml1N NaOH。攪拌混合物數(shù)小時(shí)，直到TLC檢測(cè)顯示沒有反應(yīng)繼續(xù)發(fā)生為止。用1N HCl酸化混合物，用二氯甲烷萃取。干燥(Mg-SO4)、過濾并濃縮二氯甲烷層。經(jīng)硅膠層析分離產(chǎn)物O。
化合物P將化合物O溶于乙醇，并與100mg 10％Pd/C(每克化合物O)在巴氏震搖器中氫化。用TLC監(jiān)視反應(yīng)的完成。反應(yīng)結(jié)束后，濾去催化劑，濃縮混合物得化合物P。
化合物Q向1mmol化合物P在20ml二噁烷和5ml飽和NaHCO3中的0℃溶液加入3mmol N-甲氧羰基馬來酰亞胺。攪拌此混合物1小時(shí)，用1N HCl酸化，用二氯甲烷萃取。干燥(MgSO4)、過濾并濃縮二氯甲烷層，經(jīng)硅膠層析純化得化合物Q。
化合物R向1mmol化合物Q和2mmol對(duì)硝基苯酚在二氯甲烷中的溶液加入2mmol DCC，攪拌此混合物16小時(shí)。濾去固體，濃縮濾液，經(jīng)硅膠層析純化得化合物R。
具有兩個(gè)肽和兩個(gè)藥物分子的偶聯(lián)物化合物S向1當(dāng)量雜活化平臺(tái)R在pH7.5的磷酸緩沖液中的溶液加入過量2當(dāng)量的含巰基肽。攪拌混合物1小時(shí)，加入過量2當(dāng)量的含胺藥物。經(jīng)反相HPLC或離子交換層析或兩者結(jié)合分離偶聯(lián)物3。
反應(yīng)方案20
實(shí)施例5偶聯(lián)3-II的合成和測(cè)試反應(yīng)方案21 DMTr-5’-修飾的(CA)10的制備在Milligen 8800 Prep Scale DNA合成儀上按制造商推薦的DNA氨基亞磷酸酯合成步驟制備了多核苷酸d-[DMTr-(bzCp(CE)bzA)10]。在DMTr-d-bzA-CPG載體上加樣30.0μmol/g核苷進(jìn)行合成。利用該儀器的程序除去最后的DMTr封閉基團(tuán)。向反應(yīng)中加入Milligen激活劑溶液Cat.No.MBS 5040(45ml)和0.385g化合物51(見反應(yīng)方案11)，用氬氣沸騰混合該懸液8分鐘。用一般的儀器方法氧化該混合物，過濾收集與載體結(jié)合的多核苷酸，風(fēng)干，并用100ml濃氨水在55℃處理16小時(shí)。冷卻后通過一Gel-man 10μ聚丙烯濾膜過濾。用200ml已用NaOH調(diào)至pHl2的2mMNaCl洗滌濾膜。然后將濾液加樣至一Amicon色譜柱(0.45×9.4cm，150ml)上，該柱裝有Q-Sepharose(Pharmacia)，先用3MNa-Cl再用2mM NaCl(pH12)平衡。用500ml線性梯度(2mM NaCl，pH12到1.3M NaCl，pH12)洗脫此柱，然后用1.3M NaCl，pH12沖洗，直到所有紫外吸收物質(zhì)流出。用聚丙烯酰胺電泳進(jìn)一步分析在260nm處有吸收的流份，將含純產(chǎn)物的流份合并。合并液(120ml)用240ml冷異丙醇處理，于-20℃保存30分鐘。在Sorvall RC 3B離心機(jī)中用H-6000A型轉(zhuǎn)子于3000rpm和4℃下離心15分鐘收集沉淀，得到DMTr-5’-修飾的(CA)10(14946 A260單位，498mg，62.2μM，基于300μmol CPG核苷的產(chǎn)率為20％)。
Tr-5’-修飾的(CA)10的合成反應(yīng)方案22
按為DMTr-5’-修飾的(CA)10的合成所描述的方法，用化合物53代替化合物51來合成Tr-5’-修飾的(CA)10。
DMTr-5’修飾的多核苷酸與化合物3(IA-DABA-PEG，反應(yīng)方案1)的偶聯(lián)-偶聯(lián)物3-I的制備在下述偶聯(lián)步驟中，所有緩沖液都用氦氣徹底噴射，所有反應(yīng)器在用前均用氬氣吹洗。用1ml 0.1M NaHCO3和210μl(876μmol，摩爾過量18倍)三丁基膦于室溫下處理11.568 A260單位(48.2μmol，假定在260nm處摩爾消光值＝240,000)DMTr-5’-修飾的(CA)10在7.7ml水中的溶液0.5小時(shí)。不時(shí)搖動(dòng)此懸液，用0.8ml 3MNa-Cl和16ml冷異丙醇處理。-20℃下30分鐘后，3000rpm離心20分鐘。將沉淀重溶于2ml水、0.2ml 3M NaCl中，用4ml異丙醇處理，再離心。將沉淀在真空下迅速干燥，溶于用氦氣噴射過的2.8ml水和1ml 0.1N NaHCO3中。加入6.7mg化合物3(IA-DABA-PEG)，將混合物于暗處室溫保存16小時(shí)。將終體積6ml的反應(yīng)混合物加樣于一用Sephacryl 200(Pharmacia)裝填的5×91(1800M1)Pharmacia柱上。用0.5M NaCl，0.1M硼酸鈉，pH8.3洗脫。使用蠕動(dòng)泵并設(shè)置流速為約2ml/分鐘。每15ml一份收集。在260nm處測(cè)定吸收度。還用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析這些流份，合并那些含純偶聯(lián)物的流份。
偶聯(lián)物3-I的雜交-偶聯(lián)物3-II的制備上述合并的流份含726A260單位。加入相當(dāng)量的(TG)10，于90℃加熱試管10分鐘，然后讓其在1.5小時(shí)內(nèi)冷卻至室溫。加入等量的異丙醇，于-20℃保持3小時(shí)。3000rpm離心20分鐘后，將沉淀溶于0.15M NaCl，0.01M檸檬酸鈉，pH6.8中，得到53mg雜交產(chǎn)物。將一部分此物質(zhì)用上述緩沖液稀釋，在Carey 3E分光光度計(jì)中測(cè)定雙鏈體的解鏈溫度。此物質(zhì)的Tm為73.4℃，增色率24.3％。10A260單位的產(chǎn)物如上所述與過量(TG)10退火。在Rainin HPLC儀上用Shodex Protein KW 8025柱經(jīng)凝膠滲透HPLC分析該產(chǎn)物及未退火的偶聯(lián)物及(TG)10標(biāo)準(zhǔn)品。用0.05M NaH2PO4，pH6.5，0.5MNaCl等梯度洗脫此柱。移行時(shí)間為12分鐘。產(chǎn)物的保留時(shí)間為6.9分鐘，(TG)10的保留時(shí)間為9.2分鐘。比較峰下面積顯示98.09％的產(chǎn)物為雙鏈DNA。此偶聯(lián)物用圖6A中稱為“偶聯(lián)物3-II”的結(jié)構(gòu)代表。
實(shí)施例6PN-KLH偶聯(lián)物的制備按如下方案制備PN-KLH偶聯(lián)物。

ACT-修飾的(CA)25的合成將化合物58偶聯(lián)在自動(dòng)化合成的最后一步所得的(CA)25上，引入非環(huán)三醇?xì)埢?ACT)單元。從10g DMT-d-BzA-CPG載體開始，用交替的dC和dA氨基亞磷酸酯，以30μmol/g的核苷加樣量進(jìn)行49個(gè)相繼的合成步驟。從生成的d-[DMTr-(BzCP(CE)BzA)25]中除去封閉基團(tuán)DMTr，并向反應(yīng)混合物中加入40ml激活劑溶液(Milligen，Cat，No.MBS5040)和800mg化合物58。用氬氣沸騰混合該懸液8分鐘，并進(jìn)行常規(guī)的氧化步驟。從反應(yīng)器中取出與載體結(jié)合的多核苷酸，風(fēng)干，用100ml濃氨水于55℃處理40分鐘。冷卻后，通過一Gelman 10μm聚丙烯濾膜過濾，然后用常規(guī)離子交換層析純化濾液。在260nm處有吸收的流份進(jìn)一步用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，合并含純產(chǎn)物的流份，用異丙醇沉淀得510mg(31.9μmol，10％)的ACT-修飾的(CA)25。
單鏈PN-KLH偶聯(lián)物的合成向100mg(2.5μmol)NaIO4處理的ACT修飾的(CA)25在1.33ml 50mM pH8.0硼酸鈉中的溶液加入31.3mg(0.208μmol)KLH和2.0mg(31.8μmol)吡啶-硼烷。混合物在37℃保溫72小時(shí)，在S-200上層析純化產(chǎn)物。
單鏈PN-KLH偶聯(lián)物與(TG)25的雜交向單鏈PN-KLH偶聯(lián)物中加入相當(dāng)量的(TG)25，于90℃加熱試管10分鐘，然后讓其在1.5小時(shí)內(nèi)冷卻至室溫。用異丙醇沉淀得53mg產(chǎn)物PN-KLH；Tm(0.15M NaCl，0.01M檸檬酸鈉，pH6.8)73.4℃，31.1％增色率；與用過量(TG)10退火的樣品、未退火的偶聯(lián)物和未退火的(TG)10標(biāo)準(zhǔn)品相比較，經(jīng)HPLC測(cè)得(Shodex ProteinKW 8025柱，0.05M NaH2PO4，pH6.5，0.5M NaCl)98％為雙鏈。該偶聯(lián)物可用下式代表KLH-[NH(CH2)5OPO2·O-(CA)25(TG)25]-5(假定KLH的分子量為105)并稱為“PN-KLH”。
測(cè)試偶聯(lián)物3-II這一耐受原用免疫原性多核苷酸PN-KLH免疫小鼠，測(cè)試偶聯(lián)物3-II致此小鼠耐受的能力。
材料和方法小鼠從Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)購得6周齡C57BL/6雌性小鼠。按NIH提供的方法喂養(yǎng)。
免疫按照Iverson的方法(Assay for in vivo Adoptive ImmuneResponsein Handbook of Experimental Immunology，Vol.2CellularImmuoology，Eds，D.M.Weir，L.A.Herzenberg，C.Blackwell and A.Herzenberg，4th Edition，Blackwell Scientific Publications，Oxford)，給小鼠腹膜內(nèi)注射100μg用明礬沉淀的PN-KLH和作為佐劑的2×109富爾馬林固定的百日咳菌體，將小鼠致敏。用鹽水中的50μgPN-KLH腹膜內(nèi)加強(qiáng)注射。
PN與SRBC偶聯(lián)Alsevers中的綿羊血紅細(xì)胞(SRBC)購自Colorado Serum Co.，Denver，Co.，并在2周內(nèi)使用。按Kipp和Miller的方法(“Prepara-tion of Protein-Cunjagated Red Blood Cells with ECDI(Modiflca-tion)”inSelected Methods in Cellalar Immuncology，(1980)，Eds，B.B.Mishell and S.M.Shiigi，W.H.Freemen and Co.，San Francisco，p103)，用(CA)25(TG)25(CAGT的25聚物)包被SRBC。簡(jiǎn)而言之，SRBC用冷鹽水洗4次，在含10mg碳化二亞胺的0.35M甘露糖醇，0.01M NaCl中與偶聯(lián)在D-EK上的2mg(CA)25(TG)25混合，并在4℃保溫30分鐘。用冷的平衡鹽溶液洗滌包被的SRBC并重懸至10％(V/V)。
空斑試驗(yàn)用Cunningham技術(shù)(Marbrook，J.，”Liquid Matrix(SlideMethod)”inSelected Methods in Cellular Immunology，(1980)，Eds，B.B.Mishell and S.M.Shiigi，W.H.Freemen and Co.，San Francis-co，p.86)測(cè)定抗PN空斑形成細(xì)胞(pfc)的數(shù)目。如Henry所述(“Estimation of IgG responses by Elimination of IgM Plaques’inSe-lected Methods in Cellular Immunology，(1980)，Eds，B.B.Mishelland S.M.Shiigi，W.H.Freemen and Co.，San Francisco，P91)，用兔抗鼠IgG消除IgM空斑以測(cè)定IgG pfc數(shù)目。簡(jiǎn)言之，取脾臟并制得平衡鹽溶液(BSS)中的單細(xì)胞懸液。向多核苷酸包被的SRBC中加入豚鼠血清得最終稀釋度為1∶9豚鼠血清，并加入足量的兔抗鼠IgG使最終稀釋度為1∶100兔抗鼠IgG。在微量滴定孔中混合等體積的SRBC混合物和稀釋的脾細(xì)胞，并轉(zhuǎn)至Cunningham室中。每只脾單獨(dú)測(cè)試，并測(cè)三次。將室邊緣用石蠟密封并在37℃孵育1小時(shí)。在一反式顯微鏡下觀察這些室并計(jì)空斑數(shù)。
結(jié)果用以百日咳菌體為佐劑(A&P)的明礬沉淀的PN-KLH致敏小鼠，7周后每3只鼠分為一組。給小鼠腹膜內(nèi)注射一系列成倍稀釋的PN-PABA-PEG(偶聯(lián)物3-II)，5天后所有小鼠(包括對(duì)照組)用鹽水中的PN-KLH腹膜內(nèi)加強(qiáng)注射。4天后取出脾臟并測(cè)定IgG pfc數(shù)目。如表2中所示，與對(duì)照組相比所有受試劑量的偶聯(lián)物3-II均顯示出pfc數(shù)目顯著降低。
表2偶聯(lián)物3-II(PN-DABA-PEG)的致耐受活性pfc/106劑量 脾細(xì)胞 平均降低(μg/小鼠)均值(S.D.) 百分率無12865(2846)62.5 2868(6809) 77.7125 3331(939) 74.1250 3044(1929) 76.3500 1809(759) 85.91000 2814(554) 78.1實(shí)施例7偶聯(lián)物20-II的制備和測(cè)試Tr-5’修飾的(CA)10與價(jià)平臺(tái)分子20的偶聯(lián)-單鏈偶聯(lián)物20-I的制備在氫氣氛下向918mg(0.14mmol)Tr-5’-修飾的(CA)10在30ml水中的溶液加入969μl(789mg，3.89mmol)三正丁基膦。攪拌此混合物1小時(shí)，然后加入2.4ml 3M NaCl溶液，再加入已用氦噴射除去氧的42ml異丙醇。將混合物置于-20℃冰箱中1小時(shí)，然后在3000rpm離心30分鐘。除去上清液，將油狀殘余物溶于15.5ml氦氣吹過的水中。向此混合物中加入1.24ml 3M NaCl和21.7ml氦氣吹過的異丙醇。將形成的混合物置于-20℃冰箱中1小時(shí)，于3000rpm離心20分鐘。將油狀殘余物真空干燥18小時(shí)得一固體。將此固體溶于6ml氦吹過的水中達(dá)總體積6.4ml。以260nm處紫外吸收度測(cè)得DNA量為863mg(在pH7.5磷酸鹽緩沖的鹽水中每單位吸收度為0.033mg)。在氬氣下將此溶液轉(zhuǎn)移到一50ml三頸燒瓶中。一頸為氬氣入口，塞住其他兩頸。用水和0.87ml氦吹洗的1M磷酸鈉緩沖液(pH7.8)及0.97ml甲醇調(diào)節(jié)總體積為7.7ml。向混合物中加入1.9ml(33.63mg，0.025mmol)化合物20的17.7mg/ml甲醇溶液。形成的溶液在氬氣下攪拌20小時(shí)，然后用含0.1M NaCl、0.05M磷酸鈉(pH7.5)和10％甲醇的溶液稀釋至100ml。在Frac-togel上層析進(jìn)行純化(平衡0.1M NaCl，0.05M磷酸鈉，pH7.5，10％MeOH；洗脫梯度0.5M NaCl，0.05M磷酸鈉，pH7.5，10％MeOH到0.8 NaCl，0.05M磷酸鈉，pH7.5，10％MeOH)。收集經(jīng)HPLC和聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定含純偶聯(lián)物20-I的洗脫流份232ml。加入等體積異丙醇沉淀產(chǎn)物和鹽，并置于-20℃冰箱中1小時(shí)。對(duì)水(2×100vol)透析得335mg偶聯(lián)物20-I(32ml 10.47mg/ml的溶液，假定在260nm處0.033mg/吸收度單位)。
偶聯(lián)物20-I與(TG)10退火形成雙鏈偶聯(lián)物20-II將150mg(14.33ml 10.47mg/ml，基于0.033mg/260nm吸收度單位)偶聯(lián)物20-I和157.5mg(1.50ml 104.6mg/ml，基于0.033mg/260nm吸收度單位)(TG)10置于一50ml聚丙烯離心管中。加入2.0ml pH7.2 10×PBS和2.17ml水調(diào)節(jié)濃度至15mg/ml。將此混合物置于90℃水浴中，并在1.5小時(shí)內(nèi)冷卻至室溫。用260nm處吸收度測(cè)得濃度為17.7mg/ml(0.050mg/吸收度單位)；解鏈溫度為67.5℃；增色率為27％；滲透壓346；pH7.2。為最終配制偶聯(lián)物20-II，加入7.23ml pH7.2 1/2×PBS將溶液稀釋至終濃度12.7mg/ml，滲透壓299，通過一0.22μ濾膜過濾。
Tr-5’修飾(CA)10-20的替代偶聯(lián)法單鏈偶聯(lián)物20-I的制備向Tr-5’-修飾的(CA)10在He吹洗的100mM pH5醋酸鈉中的10mg/ml溶液加入10當(dāng)量三正丁基膦。攪拌該混合物1小時(shí)，然后用1.4體積異丙醇(IPA)沉淀。將混合物置于-20℃冷箱中1小時(shí)，于3000rpm離心20分鐘。除去上清液，將沉淀溶于用He吹洗的IPA中達(dá)10mg/ml。將混合物置于-20℃冰箱中1小時(shí)，于3000rpm離心20分鐘。將沉淀在真空下干燥18小時(shí)得一固體。制備該固體在He吹洗的100mM pH10硼酸鈉緩沖液中的50mg/ml溶液。向此混合物中以9/1 MeOH/H2O中40mg/ml溶液形式加入0.25當(dāng)量化合物20。在室溫下攪拌混合物3-20小時(shí)并稀釋(0.1M NaCl，0.05磷酸鈉，pH7.5，10％MeOH)。在Factogel上層析進(jìn)行純化(平衡0.1M NaCl，0.05M磷酸鈉，pH7.5，10％MeOH；洗脫梯度0.5M NaCl，0.05M磷酸鈉，pH7.5，10％MeOH到0.8MNaCl，0.05M磷酸鈉，pH7.5，10％MeOH)。合并經(jīng)HPLC和聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示含純20-I的流份。加入等體積IPA沉淀產(chǎn)物和鹽，在-20℃冰箱中靜置1小時(shí)。對(duì)H2O(2×10vol)滲析得20-I。
20-I與(TG)10-20的替代退火法形成雙鏈偶聯(lián)物20-II按與上述基本相同的方法進(jìn)行，只是在70℃而不是90℃進(jìn)行退火。
Tr-5’修飾的(CA)10-20的第二替代偶聯(lián)法單鏈偶聯(lián)物20-I的制備N2下向7.75g Tr-5’修飾的(CA)10在104ml Ar吹洗過的100mM pH5醋酸鈉中的溶液加入4.8ml三正丁基膦。攪拌混合物1小時(shí)，用232.5ml異丙醇沉淀。將混合物置于-20℃冰箱中1.5小時(shí)，于3000rpm離心20分鐘，然后于-20℃冷凍24小時(shí)。除去上清液，將沉淀溶于170ml He吹洗的0.3M NaCl溶液中。再次用232ml Ar吹洗的異丙醇沉淀。然后將此混合物置于-20℃冰箱中，3000rpm離心20分鐘，再于-20℃放11小時(shí)。傾去上清液，沉淀在真空下干燥12小時(shí)得一固體。在110ml Ar吹洗的100mM pH10硼酸鈉緩沖液中制備該固體的溶液。向此混合物中加入4.4ml 9/1甲醇/水中406mg化合物20的溶液。室溫下攪拌混合物2小時(shí)。經(jīng)高壓離子色譜測(cè)得該產(chǎn)品混合物含60％20-I，Waters Gen PakFax柱(100×4mm)，60℃，從65％A/35％B到18％A/82％B的線性梯度，A＝0.05M NaH2PO4，pH7.5，1mM EDTA，10％ MeOH(V/V)；B＝0.05M NaHPO4，pH7.5，1M NaCl，1mM EDTA，10％MeOH(v/v)，在19.5分鐘洗出。
偶聯(lián)物20-II和未偶聯(lián)對(duì)照的測(cè)試用PN-KLH和A&P免疫C57BL/6小鼠。三周后，各組(每組5只鼠)用不同劑量20-II或4.5nM HAD-AHAB-TEG(與衍生化價(jià)平臺(tái)分子AHAB-TEG相連的接頭HAD，見圖7)，或18nM(4×4.5)(CA)10(TG)10腹膜內(nèi)注射，有一組不處理。各組進(jìn)行加強(qiáng)注射，采集血清并如實(shí)施例6中所述進(jìn)行測(cè)定?？筆N應(yīng)答的降低百分率如圖4中所示。這些小鼠抗KLH的應(yīng)答正常，與圖2中所示的那些沒有顯著差別。這些結(jié)果清楚表明抗PN應(yīng)答不受(i)僅價(jià)平臺(tái)分子，(ii)僅PN，或(iii)兩者的混合物的影響。PN必須與非免疫原性價(jià)平臺(tái)分子偶連才能誘導(dǎo)耐受性。
偶聯(lián)物20-II引起產(chǎn)生PN特異性抗體的細(xì)胞數(shù)量減少用PN-KLH和A&P免疫C57BL/6小鼠。3周后，各組動(dòng)物(每組3只小鼠)用不同劑量的20-II腹膜內(nèi)處理，有一組不處理。5天后，給所有的小鼠腹膜內(nèi)加強(qiáng)注射PN-KLH(鹽水中)，4天后取其脾臟，用溶血空斑試驗(yàn)測(cè)定產(chǎn)PN-特異性IgG的細(xì)胞數(shù)量。如表3中所示結(jié)果清楚表明該偶聯(lián)物能降低產(chǎn)PN特異性IgG的細(xì)胞數(shù)量。
表3 偶聯(lián)物20II降低pfc數(shù)量PN特異性劑量pfc/106脾細(xì)胞組別# μg/小鼠 (Mean&S.E.) 降低百分率1 None 5562(2570)2 274 982(1871) 82.33 91 1867(1335)66.44 30 2247(1606)59.65 10 6109(2545)06 34045(1411)27.37 14578(2475)17.78 0.4 5930(897) 0實(shí)施例8測(cè)試偏聯(lián)物的致耐受性測(cè)試偶聯(lián)物17-II的致耐受性用PN-KLH，A&P免疫C57BL/6小鼠。3周后各組動(dòng)物(每次5只小鼠)用不同劑量偶聯(lián)物17-II腹膜內(nèi)處理，有一組不經(jīng)處理。5天后給所有小鼠腹膜內(nèi)加強(qiáng)注射鹽水中的PN-KLH，7天后從小鼠取血。用Farr方法在PN濃度10-8M下分析血清中抗PN抗體。抗PN應(yīng)答的降低百分率如圖1所示。還用ELISA法分析血清中抗KLH抗體。結(jié)果用與標(biāo)準(zhǔn)抗KLH血清相比抗KLH的降低百分率表示并示于圖2中。圖1中數(shù)據(jù)顯示該偶聯(lián)物降低了抗PN的應(yīng)答。在所有小鼠中抗KLH(平臺(tái)分子)的應(yīng)答均正常(見圖2)。
測(cè)試不同的11-系列偶聯(lián)物的致耐受性各組C57BL/6小鼠(每次3只)用PN-KLH、A&P免設(shè)。3周后，兩組用3種不同劑量偶聯(lián)物11-IV、11-II、11-VI或11-VIII腹膜內(nèi)處理，有一組未處理。在圖6A-B中描述了這些偶聯(lián)物，按實(shí)施例7中所述方法制得。5天后給所有小鼠加強(qiáng)注射(腹膜內(nèi))鹽水中的PN-KLH，7天后從小鼠取血。用Farr法以PN濃度10-8M分析血清中抗PN抗體。表示抗PN應(yīng)答降低百分率的結(jié)果示于圖3中。這些小鼠的抗KLH應(yīng)答與圖2中所示應(yīng)答沒有顯著差異。所有四種偶聯(lián)物在所有試驗(yàn)劑量下均顯著降低抗PN應(yīng)答。偶聯(lián)物11-II降低產(chǎn)PN特異性抗體的細(xì)胞數(shù)量用PN-KLH，A&P免疫C57B1/6小鼠。3周后用三種不同劑量11-II腹膜內(nèi)處理各組小鼠(每次3只)，一組未經(jīng)處理。 5天后，所有小鼠用鹽水中PN-KLH加強(qiáng)注射；4天后取其脾臟，用溶血空斑試驗(yàn)測(cè)定產(chǎn)PN特異性IgG的細(xì)胞數(shù)量。使用不同劑量偶聯(lián)物11-II的本實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖于表4中。這些結(jié)果清楚表明該偶聯(lián)物降低了產(chǎn)PN特異性IgG的細(xì)胞數(shù)量，抗體滴度的降低并不是因?yàn)檠蹇贵w與偶聯(lián)物結(jié)合的清除作用。
表4偶聯(lián)物11-II降低pfc數(shù)量PN特異性pfc/106脾細(xì)胞 降低百分率組別#μg/小鼠 (圴值&S.E.) (SD)1None 10845(1308)2263 3613(547) 66.23(8.6)3873462(1041)64.98(17)4297354(1504)29.5(23.8)59 6845(2031)30.9(32.2)63 7982(223) 26.8(3.52)71 6043(545) 44.5(7)80.4 9343(1251)13(19.8)實(shí)施例9HADpS-(CA)10-偶聯(lián)物20-IV的制備制備5′末端用磷代磷酸酯加接頭修飾的多核苷酸。除下列不同點(diǎn)外，按實(shí)施例5的方法合成20聚體(CA)10并向此多核苷酸加上HAD接頭。在最后的氧化步驟中，用3H-1，2-苯并二硫雜環(huán)戊二烯-3酮1，1-二氧化物(Glen Rosearch，Sterling，VA)的0.05M乙腈溶液代替碘溶液。按制造商的說明進(jìn)行硫化。按實(shí)施例5中所述方法進(jìn)行氨處理和純化。該多聚核苷酸與AHAB-TEG價(jià)平臺(tái)的偶聯(lián)按實(shí)施例5的方法進(jìn)行。
測(cè)試偶聯(lián)物20-IV的致耐受性因?yàn)镻N的5′-磷酸酯易于酶降解，末端磷酸酯上一個(gè)氧原子用硫取代，這樣得HADpS。用PN-KLH，A&P免疫C57BL/6小鼠。三周后各組小鼠(每組5只)用不同劑量的偶聯(lián)物20-IV腹膜內(nèi)處理；有一組未經(jīng)處理。給各組加強(qiáng)注射，采集血清并按上文所述方法檢測(cè)。顯示抗PN應(yīng)答降低百分率的結(jié)果示于圖5中。這些鼠的抗KLH應(yīng)答正常，與圖2中所示的那些沒有顯著差別。這些結(jié)果表明該偶聯(lián)物顯著降低抗PN的應(yīng)答。
偶聯(lián)物20-IV引起產(chǎn)生PN特異性抗體的細(xì)胞數(shù)降低用PN-KLH，A&P免疫C57BL/6小鼠。三周后各組動(dòng)物(每組3只)腹膜內(nèi)注射不同劑量的偶聯(lián)物20-IV，有一經(jīng)未經(jīng)處理。5天后給所有小鼠腹膜內(nèi)加強(qiáng)注射鹽水中的PN-KLH，4天后取其脾臟，用溶血空斑試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)PN特異性IgG的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果如表5中所示，它表明該偶聯(lián)物降低了產(chǎn)生PN特異性IgG的細(xì)胞數(shù)量。
表5偶聯(lián)物20-IV降低pfc數(shù)量
PN特異性劑量pfc/106脾細(xì)胞組別# μg/小鼠 (均值&S.E.)降低百分率1 None 5889.4(3444)2 274 3413(1604) 423 91222(752) 96.24 301492(2269) 74.75 105421(832) 86 3 5077(1946) 13.97 1 7023(679) 08 0.4 4159(2688) 29實(shí)施例10用LJP 394-偶聯(lián)物20-II處理BXSB小鼠小鼠處理方案在La Jolla Pharmaceutical喂養(yǎng)6-9周齡雄性BXSB小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，Me)。隨意攝取食物和水。使用前一周限制動(dòng)物。在第一次偶聯(lián)物處理前獲取原始血樣及體重。在7-9周齡開始偶聯(lián)物處理，從第59到150天每周靜脈內(nèi)注射兩次。周期性采血并測(cè)定其抗DNA抗體滴度。
檢測(cè)抗DNA IgG抗體的產(chǎn)生從每只鼠采取血清樣品并用ELISA確定是否存在抗DNA抗體。用100μl/孔(PN)50-D-EK(D-谷氨酸與D-賴氨酸的一共聚物)以50μg/ml濃度于4℃下包被Falcon Probind 96孔微滴定檢測(cè)板(Becton Dickerson，Oxnard，cA)過夜。用無鈣和鎂和0.05％Tween20的PBS(洗滌緩沖液)用一M 96V洗板器(ICN Biomedical，Inc，.Irvine，cA)洗板兩次。在含1％明膠(Norland Products，Inc.，New Brunswick，NJ)和0.05％Tween 20的PBS在室溫下封閉1小時(shí)。加入血清樣品或標(biāo)準(zhǔn)品以前，用洗滌緩沖液洗板兩次。在含1％明膠、0.05％Tween 20和10％綿羊血清的PBS稀釋液中制備血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。培養(yǎng)板與血清樣品在37℃孵育60-90分鐘，然后用洗滌緩沖液洗孔四次。生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG(SigmaChemical Co.，St，Louis，MO)用含10％羊血清的封閉液稀釋至1/1000。 37℃孵育1小時(shí)，洗4次。加入底物OPD(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)。將培養(yǎng)板在黑暗中保溫直到用ELISA讀板器在OD 450nn(Bio-TeK Instruments，Winooski，VT)測(cè)得最大標(biāo)準(zhǔn)品的最大讀數(shù)為約1OD單位為止。用50μl 3M HCl終止反應(yīng)，在490hm處讀板。在每個(gè)微滴定板中都有參照陽性血清，每次實(shí)驗(yàn)的陽性孔均在參照時(shí)間曲線95％靈敏度范圍內(nèi)。在隨后的血樣中，一些陽性樣品超出了參照曲線。但大部分稀釋度的鼠血清樣品在參照曲線范圍內(nèi)。正常的陰性對(duì)照血清中未觀察到顯著的結(jié)合。結(jié)果示于圖15中。
實(shí)施例11蜂毒肽和其偶聯(lián)物的制備蜂毒蛋白分子由26個(gè)氨基酸組成，是蜂毒的主要成分。三分之一的蜂毒敏感性個(gè)體具有蜂毒蛋白特異性抗體。蜂毒蛋白在一些小鼠品系中(Bal b/c，CAF1)是高免疫原性的。在應(yīng)答性小鼠品系中大部分(＞80％)蜂毒蛋白特異性抗體與B細(xì)胞表位結(jié)合，該表位是蜂毒蛋白的C末端七肽。
蜂毒蛋白H2N-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-CONH2(SEQ.ID.1).
刺激T細(xì)胞的蜂毒肽cell Stimulation蜂毒肽#1.
Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly(″7 mer″)(SEQ.ID NO.2).
蜂毒肽#2.
Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly(″8 mer″)(SEQ.IDNO.3).
蜂毒肽#3.
Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly(″9 mer″)(SEQ IDNO.4).
蜂毒肽#4.
Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly(″10 mer″)(SEQ.ID NO.5).
蜂毒肽#5.
Cys-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly(″11mer″)(SEQ.ID NO.6).
肽合成按標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc化學(xué)技術(shù)，在甘氨酸樹脂(Advanced Chem Tech#SG5130或等同物(Advanced ChemTech，2500 Seventh StreetRoad，Louisville，KY)上，每個(gè)偶連步驟用2.3M過量氨基酸衍生物合成蜂毒蛋白。用溴酚藍(lán)監(jiān)視偶連的完成，用茚三酮證實(shí)。
偶聯(lián)中使用的蜂毒蛋白肽蜂毒肽#6.
H2N-Cys-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly-CO2H(SEQ.IDNO.7).
蜂毒肽#7.
H2N-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Lys-Cys-Gly-CO2H(SEQ.ID NO.8).
蜂毒肽#8.
(H2N-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln)2-Lys-Cys-Gly-CO2H(SEQ.ID NO.9).
加入一個(gè)半脫氨酸，因?yàn)槟承╇耐ㄟ^硫醚鍵與價(jià)平臺(tái)分子連結(jié)。合成后用反相HPLC純化肽，冷凍干燥至干。然后稱出適量的肽用于每次偶聯(lián)。
還原預(yù)形成的二硫鍵(三丁基膦法)所有緩沖液用He噴洗。將肽溶于最小體積(約10-20mg/ml)的0.05M NaHCO3(pH8.25)中。通過向825.6μl異丙醇(iPrOH)中加入174.4μl三丁基膦制備1ml 0.7M三丁基膦溶液(TBP；MW＝202.32g/mol；d＝0.812g/ml)。然后向如上制備的肽溶液中加入1∶1當(dāng)量的TBP，充分混合，反應(yīng)30分鐘到1小時(shí)，不時(shí)混合以保持TBP溶解或/和分散在溶液中。經(jīng)HPLC證實(shí)還原完全。
肽與價(jià)平臺(tái)分子#3或#60的偶聯(lián)所有緩沖液用He噴洗。將聚乙二醇(PEG)衍生物#3或#60溶于最小體積(約20mg/ml)的0.05M NaHCO3(pH8.25)中。PEG衍生物上每個(gè)碘代乙?；褂眉s3當(dāng)量的肽。對(duì)氨基苯甲酸(PA-BA)-PEG；有2個(gè)碘代乙?；籑W＝約4100g/mol；每當(dāng)量PA-BA-PEG使用6當(dāng)量肽。二氨基苯甲酸(PABA)-PEG有4個(gè)碘代乙?；?；MW＝約4300g/mol；每當(dāng)量PABA-PEG使用12當(dāng)量肽。將PEG溶液加到還原的肽溶液中，在黑暗中反應(yīng)至少1小時(shí)。用制備性HPLC純化肽偶聯(lián)物。經(jīng)用15％tricine[N-三(羥甲基)甲基甘氨酸]凝膠電泳檢查各流份，然后合并及冷干。
表6蜂毒肽與PEG的偶聯(lián)物肽或偶聯(lián)物對(duì)偶聯(lián)物號(hào)價(jià)平臺(tái)所偶聯(lián)的肽#B細(xì)胞 偶聯(lián)末端表位/分子T細(xì)胞的激活1 6062N no(pep)2 3 64N no(pep/conj)3 3 74C nd4 3 54N yes(pep)5 3 882C nd
1.刺激來自蜂毒蛋白免疫小鼠的培養(yǎng)T細(xì)胞吸收[3H]胸苷；nd＝未測(cè)定；pep＝受試肽，conj＝受試的肽-PEG偶聯(lián)物。
2.4份分支肽，每肽含兩相同分支；每個(gè)分支含一個(gè)B細(xì)胞表位。鼠淋巴結(jié)增殖試驗(yàn)在La Jolla Pharmaceutical動(dòng)物中心獲得雌性Balb/c小鼠(6-8周齡；Jackaon Laboratory，Bar Harbor，Maine)并按國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)的指南喂養(yǎng)。自由攝取食物和水。用在福氏完全佐劑(CFA)(Sigma Chemical Co.，St.Lonis，MO)中的50μg蜂毒蛋白分子在每只后肢腳墊上免疫Balb/c小鼠。7天后無菌取下腘淋巴結(jié)。通過將細(xì)胞壓過一50目篩將淋巴結(jié)輕輕分解。在含谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的RPMI-1640(Irvine Scientific，Irvine CA)中洗滌此單細(xì)胞懸液。5×105個(gè)細(xì)胞在圓底96孔Corning微滴定板的4個(gè)孔中，在補(bǔ)有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培養(yǎng)液中，與10、1.0或0.1μg/ml蜂毒蛋白一起培養(yǎng)。陽性對(duì)照孔中細(xì)胞與100或50U/ml鼠白細(xì)胞介素2(IL-2)、1μg/ml pHA(植物血細(xì)胞凝集素)一起培養(yǎng)。陰性對(duì)照孔含有RPM-1640和10％FCS中的淋巴結(jié)細(xì)胞。在有5％CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞4天。每孔中加入1μCi[3H]胸苷(ICNBiochemicals，Costa Mesa，CA)再培養(yǎng)18小時(shí)。用一半自動(dòng)細(xì)胞收集器(Scatron，Sterling，VA)將細(xì)胞收集在一玻璃纖維濾墊上。用液閃測(cè)定[3H]胸苷的摻入。結(jié)果用每分鐘平均計(jì)數(shù)表示。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用4μg CFA中蜂毒蛋白腹膜內(nèi)(i，p.)致敏Balb/c小鼠。一日后腹膜內(nèi)注入潛在耐受原或配制用緩沖液。三天后所有小鼠接受不完全福氏佐劑(ICF)(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)中的4μg蜂毒蛋白腹膜內(nèi)注射。10天后從眶后靜脈叢采取100-200μl血液。檢測(cè)血清樣品中的抗肽或抗蜂毒蛋白IgG抗體。
檢測(cè)抗蜂毒蛋白IgG或抗蜂毒蛋白全抗體用ELISA依次確定每個(gè)鼠血清樣品中抗蜂毒蛋白抗體的存在與否。Falcon Probind 96孔微滴定板在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)(pH7.2)中于4℃用10μg 1ml蜂毒蛋白預(yù)包被過夜。用含PBS、0.02％Tween 20和1％明膠(Norland Products Inc.，NewBrunswick，NJ)的洗滌溶液洗板2次。用含5％明膠的200μl PBS于37℃封板1小時(shí)。在含5％明膠的PBS稀釋液中制備血清樣品。在1∶100到1∶1000的稀釋度測(cè)試樣品。37℃孵育1小時(shí)后洗板4次。用含5％明膠的PBS稀釋ExtraAvidin過氧化物酶(SigmaChemical Co.，St，Louis，MO)稀釋至1∶1000。37℃保溫30分鐘，然后洗滌5次。每孔中加入鄰苯二胺(OPD)(Sigma Chemical Co.，StLouis，MO)在黑暗中反應(yīng)15-30分鐘，用3M HCl終止反應(yīng)。用一微板讀數(shù)器(Bio-tek Instruments，Winooski，VT)在450nm處測(cè)定光密度(OD)。
抗體形成細(xì)胞的檢測(cè)按如上IgG抗體測(cè)檢(ELISA)中所述方法準(zhǔn)備纖維素微滴定板(Millipore Co.，Bedford，MA)。但在上述實(shí)驗(yàn)中向孔中加入血清樣品的地方，用脾細(xì)胞(5×105/孔)代替血清，并孵育過夜。ELISA實(shí)驗(yàn)的其余部按如上所述方法進(jìn)行。
T細(xì)胞表位來自用蜂毒蛋白致敏的小鼠的T細(xì)胞表明，與蜂毒蛋白全分子和與C-末端蜂毒蛋白3、4和5應(yīng)答，T細(xì)胞增殖(圖8)。但C末端肽1和2不誘導(dǎo)顯著的T細(xì)胞增殖。將蜂毒肽2和5與PEG偶聯(lián)。象蜂毒肽2一樣，蜂毒肽2的PEG偶聯(lián)物也不誘導(dǎo)顯著的T細(xì)胞增殖。
為了使用蜂毒蛋白致敏并加強(qiáng)的小鼠耐受，用蜂毒蛋白偶聯(lián)的肽進(jìn)行研究用上述制備的偶聯(lián)物處理(10mg/kg，200μg/鼠)的小鼠，與用配制用緩沖液處理的對(duì)照Balb/c小鼠相比，抗蜂毒肽2抗體水平顯著降低(圖9)，抗蜂毒蛋白抗體水平也降低(圖10)。檢測(cè)用緩沖對(duì)照或偶聯(lián)物處理的小鼠脾細(xì)胞，測(cè)定抗體形成細(xì)胞產(chǎn)生抗蜂毒蛋白或抗蜂毒肽2抗體的能力，用可溶性ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗體。如圖11中所示，偶聯(lián)物2處理組中抗蜂毒肽2抗體形成細(xì)胞的水平顯著低于用緩沖液處理的對(duì)照組。用偶聯(lián)物4(含T細(xì)胞表位的肽5的偶聯(lián)物)處理小鼠，沒能降低所處理鼠中抗肽5抗體的滴度。因此，含T細(xì)胞表位的偶聯(lián)物不是耐受原(圖12)。實(shí)際上，非但沒有降低應(yīng)答，抗肽抗體水平還稍有升高。
實(shí)施例12為致用蜂毒蛋白致敏并加強(qiáng)的小鼠耐受，用蜂毒肽偶聯(lián)物進(jìn)行的另一些研究5-8周齡雌性C57 BL/6小鼠購自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。按國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)的指南喂養(yǎng)動(dòng)物。
免疫方案腹膜內(nèi)注射5μg明礬沉淀的蜂毒蛋白和作為佐劑的2×109百日咳菌體(Michigan Department of Public Health，Lansing，MI)致敏小鼠。腹膜內(nèi)加強(qiáng)注射PBS中的5μg蜂毒蛋白。
pfc試驗(yàn)用碳化二亞胺將綿羊血紅細(xì)胞(SRBC)(Colorado Serum Co.，Denver，Colorado)與蜂毒肽2偶聯(lián)。新鮮SRBC(2周內(nèi))用冷鹽水洗4次，用甘露糖醇(0.35M甘露糖醇，0.01M NaCl)洗1次。將SRBC懸浮在甘露糖醇中達(dá)濃度10％(v/v)。向1ml 10％SRBC中加入含30μg蜂毒肽#3的100μl甘露糖醇，然后在冰中孵10分鐘。然后加入100μl 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亞胺HCl(EDCI)的100mg/ml溶液，并在冰中孵育30分鐘。用平衡鹽溶液(BSS)(Irvine Scientific Co.，Irvine，CA)洗滌SRBC兩次，并重新懸浮為10％(v/v)。用BSS重配冷干的豚鼠補(bǔ)體(GIBCO，NewYork，NY)，然后用BSS稀釋1∶3。將1ml稀釋的豚鼠補(bǔ)體加至3ml偶聯(lián)SRBC中。加入兔抗鼠IgG達(dá)最終稀釋度1∶100兔抗血清。這一濃度是預(yù)先確定的，以抑制所有IgM pfc，而提高IgG pfc的最大數(shù)目。將等體積的這種補(bǔ)體/抗鼠IgG/SRBC懸液與來自單一鼠的脾細(xì)胞懸液混合。將每種混合物50μl轉(zhuǎn)移到Cunningham載片的室中(每個(gè)載片有3個(gè)室)。邊緣用石蠟密封，于37℃孵育1小時(shí)。借助于解剖顯微鏡對(duì)每個(gè)室中空斑計(jì)數(shù)。每個(gè)脾懸液還用非偶聯(lián)SR-BC作為對(duì)照進(jìn)行分析。測(cè)定每個(gè)脾細(xì)胞懸液中存活細(xì)胞的數(shù)目。測(cè)定每個(gè)室中每106脾細(xì)胞中pfc的數(shù)目，計(jì)數(shù)三份的平均值。從偶聯(lián)SRBC的pfc數(shù)中減去非偶聯(lián)SRBC的pfc數(shù)以確定肽特異性pfc的數(shù)目。
確定測(cè)pfc的最佳時(shí)間用蜂毒蛋白將小鼠致敏。各組(每織3只)致敏小鼠在第2，4，6和8天用蜂毒蛋白加強(qiáng)免疫。在第10天處死小鼠并取其脾臟。制備細(xì)胞懸液并測(cè)定肽特異性pfc數(shù)目。用蜂毒蛋白加強(qiáng)免疫后第6天獲得最佳數(shù)量的pfc。
肽在PEG偶聯(lián)物上的方向并不影響偶聯(lián)物誘導(dǎo)耐受性的能力為了確定PEG偶聯(lián)物上肽的方法是否影響其誘導(dǎo)耐受性的能力，構(gòu)建了兩種不同的耐受原。將肽通過C-末端與價(jià)平臺(tái)分子3共價(jià)相連得蜂毒肽偶聯(lián)物3。各組(3/組)用蜂毒蛋白致敏的小鼠腹膜內(nèi)注射偶聯(lián)物或鹽水。 5天后，包括未處理對(duì)照組的所有小鼠加強(qiáng)注射5μg蜂毒蛋白。6天后處死小鼠，取其脾并測(cè)定肽特異性pfc數(shù)目。如表8所示，兩個(gè)方向都對(duì)降低用蜂毒蛋白母蛋白致敏和加強(qiáng)的小鼠中肽特異性pfc/106脾細(xì)胞數(shù)目上有效。
表7PEG偶聯(lián)物上肽的方向不影響偶聯(lián)物誘導(dǎo)耐受性的能力蜂毒肽 肽特異性pfc/106偶聯(lián)物#μg/小鼠 脾細(xì)胞(均值和S.D.) 降低百分率3 1000μg 386(85)86.8％″ 500μg489(一只小鼠) 83.3％″ 250μg957(298) 67.3％2 1000μg 546(160) 81.3％″ 500μg866.6(235) 70.4％″ 250μg1280(一只小鼠) 56.2％無 無2924(164) --每個(gè)PEG偶聯(lián)物上肽的數(shù)目影響偶聯(lián)物誘導(dǎo)耐受性的能力為了確定肽與PEG分子的比率是否重要，構(gòu)建了三種不同的偶聯(lián)物，每種PEG偶聯(lián)物上肽的數(shù)目不同。偶聯(lián)物1中每個(gè)PEG偶聯(lián)物僅有兩個(gè)肽。另一種偶聯(lián)物中每個(gè)PEG偶聯(lián)物有四個(gè)肽(偶聯(lián)物2)。第三種每PEG偶聯(lián)物有八個(gè)肽(偶聯(lián)物5)。各組(3/組)用蜂毒蛋白致敏的小鼠腹膜內(nèi)注射不同的偶聯(lián)物或鹽水。5天后，包括未處理對(duì)照組的所有小鼠加強(qiáng)注射5μg蜂毒蛋白。6天后，處死小鼠，取其脾并測(cè)定肽特異性pfc的數(shù)目，如表8所示，每PEG分子含兩肽的偶聯(lián)物1不能降低用蜂毒蛋白母蛋白致敏和加強(qiáng)的小鼠中肽特異性pfc/106脾細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果表明蜂毒肽偶聯(lián)物2和5都可有效地作為耐受原；但含8個(gè)肽的偶聯(lián)物5在低于偶聯(lián)物2的劑量下有效，偶聯(lián)物2中每個(gè)價(jià)平臺(tái)分子含4個(gè)肽。
表8每PEG偶聯(lián)物上肽的數(shù)目影響偶聯(lián)物誘導(dǎo)耐受性的能力肽特異性間接處理所劑量IgG用分子μg/小鼠(nMoles) pfc(SD) 降低百分率未處理 1159(280) std偶聯(lián)物1 1000(217)1290(98) -11％250(54) 1350(206) -16％偶聯(lián)物2 500(80) 585(125) 49.5％250(40) 1001(176) 14％偶聯(lián)物5 500(53) 630(325) 45.6％250(26.5)443(105) 61.8％125(13.25) 583(69) 49.7％
對(duì)多核苷酸化學(xué)、偶聯(lián)物化學(xué)、免疫學(xué)領(lǐng)域和相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的，對(duì)實(shí)施本發(fā)明的上述方案的修正應(yīng)包括在下述權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.包含分支基團(tuán)的價(jià)平臺(tái)分子，其中所述平臺(tái)分子的化合價(jià)是二或更高，并且其中所述分支基團(tuán)的數(shù)目預(yù)先確定了所述平臺(tái)的化合價(jià)和生物活性分子附著位點(diǎn)的位置。
2.權(quán)利要求1的分子，其中所述分支基團(tuán)來源于選自二氨基酸、三胺和氨基二酸基團(tuán)的功能性部分。
3.權(quán)利要求1或2的分子，其具有實(shí)質(zhì)上均一的分子量。
4.權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的分子，其包含至少一個(gè)末端分支基團(tuán)，其中所述末端分支基團(tuán)是二分叉的，從而為生物活性分子提供兩個(gè)附著位點(diǎn)。
5. 權(quán)利要求1的分子，由下式表示G[2]{L[2]-J[2]-Z[2](T[2])p[2]}n[2]其中G[2]選自-(CH2)q--CH2-(CH2OCH2)r-CH2-(HO)4-sC(CH2OCH2CH2-)s其中n[2]個(gè)L[2]的每一個(gè)所述殘基存在時(shí)獨(dú)立地選自O(shè)，NRSUB和S；其中n[2]個(gè)J[2]的每一個(gè)所述殘基存在時(shí)獨(dú)立地選自C(＝O)和C(＝S)；其中n[2]個(gè)Z[2]的每一個(gè)獨(dú)立地選自下式所表示的基團(tuán) 或W[4]-N{Y[4]}2或W[5]-CH{Y[5]}2其中各W[3]，W[4]或W[5]存在時(shí)獨(dú)立地為包含1-100個(gè)選自C，H，N，O，Si，P和S的原子的基團(tuán)；2×n[2]個(gè)Y[4]的每一個(gè)以及2×n[2]個(gè)Y[5]的每一個(gè)獨(dú)立地為包含1-100個(gè)選自C，H，N，O，Si，P和S的原子的基團(tuán)，其含有至少p[2]/2(其中p[2]/2是整數(shù))個(gè)功能性基團(tuán)在烷基、鏈烯基和芳族碳原子上的附著位點(diǎn)；其中p[2]×n[2]個(gè)T[2]的每一個(gè)獨(dú)立地選自 其中q是0-20的整數(shù)；r是0-300的整數(shù)；而s是1-4的整數(shù)；每個(gè)X獨(dú)立地是F，Cl，Br，I，或允許親核加成至所述價(jià)平臺(tái)分子的其它功能性基團(tuán)；每個(gè)RALK獨(dú)立地為直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-20烷基；每個(gè)RSUB獨(dú)立地是H；直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-20烷基；C6-20芳基；或C7-30烷芳基；并且每個(gè)RB獨(dú)立地是包含1-50個(gè)選自C，H，N，O，Si，P和S的原子的化學(xué)基團(tuán)；每個(gè)RESTER獨(dú)立地是N-琥珀酰亞氨基、對(duì)硝基苯基、五氟苯基、四氟苯基、五氯苯基、2，4，5-三氯苯基、2，4-二硝基苯基或氰甲基；p[2]是1-8的整數(shù)；n[2]是1-32的整數(shù)；并且條件是p[2]×n[2]大于1而小于33。
6.權(quán)利要求5的分子，其中結(jié)構(gòu)L[2]-J[2]-Z[2]選自 和
7.權(quán)利要求6的分子，其中p[2]×n[2]個(gè)T[2]的每一個(gè)獨(dú)立地選自-SH -NH2 -NCS-RALKX
8.權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的分子，其中s是3或4。
9.權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)的分子，其中所有p[2]×n[2]個(gè)T[2]是相同的。
10.權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)的分子，其中n[2]是1-16。
11.權(quán)利要求10的分子，其中n[2]是1-8。
12.權(quán)利要求10的分子，其中n[2]是1-4。
13.權(quán)利要求10的分子，其中n[2]是1-2。
14.權(quán)利要求5-13任一項(xiàng)的分子，其中p[2]是1-4。
15.權(quán)利要求14的分子，其中p[2]是1-2。
16.權(quán)利要求5-15任一項(xiàng)的分子，其中所有n[2]個(gè)Z[2]是相同的。
17.偶聯(lián)物，其包含(a)生物活性分子，和(b)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的價(jià)平臺(tái)分子。
18.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中所述價(jià)平臺(tái)分子結(jié)合至多核苷酸。
19.權(quán)利要求18的偶聯(lián)物，其中所述多核苷酸是長(zhǎng)度為至少約20bp的雙鏈體。
20.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中所述生物活性分子是特異性結(jié)合抗體并且缺乏T細(xì)胞表位的免疫原的類似物，所述抗體與所述免疫原特異性結(jié)合。
21.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中所述生物活性分子選自糖類、脂類、脂多糖、蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、藥物、單鏈或雙鏈寡核苷酸、半抗原、擬表位、適體、或其類似物。
22.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中所述生物活性分子是多肽。
23.權(quán)利要求17-22任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中生物活性分子位于平臺(tái)分子的末端。
24.權(quán)利要求17-23任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述價(jià)平臺(tái)分子包含至少一個(gè)末端分支基團(tuán)，其中所述末端分支基團(tuán)是二分叉的，從而為所述生物活性分子提供兩個(gè)附著位點(diǎn)。
25.權(quán)利要求17-24任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述生物活性分子是相同的。
26.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中所述價(jià)平臺(tái)分子具有實(shí)質(zhì)上均一的分子量。
27.權(quán)利要求17-26任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物包含分別結(jié)合至分支基團(tuán)末端和生物活性分子的連接部分。
28.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中所述生物活性分子包含至少約20個(gè)堿基對(duì)的多核苷酸雙鏈體，各自結(jié)合至價(jià)平臺(tái)分子，所述多核苷酸雙鏈體各具有對(duì)人系統(tǒng)性紅斑狼瘡抗dsDNA自身抗體的顯著結(jié)合活性。
29.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中所述生物活性分子選自糖類、脂類、脂多糖、肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、單鏈寡核苷酸、雙鏈寡核苷酸、半抗原、及其類似物包括擬表位和適體、及其混合物。
30.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中所述價(jià)平臺(tái)分子通過選自DABA，BAHA，BAHAOX和ARAB的試劑衍生化。
31.權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，其中一個(gè)接頭分子將雙鏈體偶聯(lián)至價(jià)平臺(tái)分子。
32.權(quán)利要求31的偶聯(lián)物，其中所述接頭分子選自HAD和HADPS。
33.權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，其中所述多核苷酸雙鏈體的長(zhǎng)度是實(shí)質(zhì)上均一的。
34.權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，其中所述多核苷酸雙鏈體在核苷酸組成方面是實(shí)質(zhì)上均一的。
35.權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，其中所述多核苷酸雙鏈體的長(zhǎng)度為約20-約50bp。
36.權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，其中所述多核苷酸雙鏈體在其一個(gè)末端或接近一個(gè)末端處結(jié)合至價(jià)平臺(tái)分子。
37.權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，其中所述多核苷酸雙鏈體是(CA)10(TG)10，并且所述價(jià)平臺(tái)分子是衍生化的三甘醇。
38.權(quán)利要求37的偶聯(lián)物，其中多核苷酸雙鏈體與價(jià)平臺(tái)分子的摩爾比為2∶1到8∶1。
39.權(quán)利要求37的偶聯(lián)物，其中多核苷酸雙鏈體與價(jià)平臺(tái)分子的摩爾比為4∶1。
40.權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，其中所述多核苷酸雙鏈體是(CA)10(TG)10，并且所述價(jià)平臺(tái)分子是衍生化的2，2’-亞乙二氧基二乙胺。
41.權(quán)利要求40的偶聯(lián)物，其中多核苷酸雙鏈體與價(jià)平臺(tái)分子的摩爾比為2∶1到8∶1。
42.權(quán)利要求40的偶聯(lián)物，其中多核苷酸雙鏈體與價(jià)平臺(tái)分子的摩爾比為4∶1。
43.權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物是人系統(tǒng)性紅斑狼瘡的耐受原。
44.權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，其中所述多核苷酸雙鏈體具有B-DNA型螺旋結(jié)構(gòu)和對(duì)人系統(tǒng)性紅斑狼瘡抗dsDNA自身抗體的顯著結(jié)合活性。
45.權(quán)利要求20的偶聯(lián)物，其中所述免疫原是外免疫原。
46.權(quán)利要求45的偶聯(lián)物，其中所述外免疫原是生物藥物、過敏原、與Rh溶血疾病相關(guān)的Rh/D免疫原、與男性不育相關(guān)的α-精子或與風(fēng)濕熱相關(guān)的糖復(fù)合物。
47.權(quán)利要求20的偶聯(lián)物，其中所述免疫原是自身免疫原。
48.權(quán)利要求47的偶聯(lián)物，其中所述自身免疫原與甲狀腺炎、糖尿病、中風(fēng)或重癥肌無力相關(guān)。
49.權(quán)利要求20的偶聯(lián)物，其中所述免疫原與類似物屬于相同的化學(xué)類別。
50.權(quán)利要求49的偶聯(lián)物，其中所述免疫原和類似物是多肽。
51.權(quán)利要求20的偶聯(lián)物，其中所述免疫原與類似物屬于不同的化學(xué)類別。
52.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，由下式表示 其中r＝0-300；而每個(gè)U是 其中X＝O或S；而PN是單鏈或雙鏈多核苷酸。
53.權(quán)利要求52的偶聯(lián)物，其中將多核苷酸連接至磷原子的氧是單鏈多核苷酸5’羥基的氧或雙鏈多核苷酸的一條鏈5’羥基的氧。
54.權(quán)利要求53的偶聯(lián)物，其中PN是雙鏈多核苷酸。
55.權(quán)利要求54的偶聯(lián)物，其中r＝2；X＝O，并且其中PN是20個(gè)堿基對(duì)的多核苷酸。
56.權(quán)利要求55的偶聯(lián)物，其中所述多核苷酸是(CA)10(TG)10。
57.權(quán)利要求56的偶聯(lián)物，其中將多核苷酸連接至磷原子的氧是(CA)10的5’羥基的氧。
58.權(quán)利要求52的偶聯(lián)物，其中PN是單鏈多核苷酸。
59.權(quán)利要求58的偶聯(lián)物，其中r＝2；X＝O，并且其中PN是20個(gè)堿基的多核苷酸。
60.權(quán)利要求59的偶聯(lián)物，其中所述多核苷酸是(CA)10。
61.權(quán)利要求60的偶聯(lián)物，其中將多核苷酸連接至磷原子的氧是(CA)10的5’羥基的氧。
62.制備權(quán)利要求17-61任一項(xiàng)的偶聯(lián)物的方法，包括將生物活性分子結(jié)合至平臺(tái)分子，從而形成偶聯(lián)物。
63.制備權(quán)利要求28的偶聯(lián)物的方法，包括(a)將多條至少20個(gè)堿基對(duì)的單鏈多核苷酸各結(jié)合至價(jià)平臺(tái)分子上；和(b)將互補(bǔ)的單鏈多核苷酸退火至與價(jià)平臺(tái)分子結(jié)合的單鏈多核苷酸，以形成所述多核苷酸雙鏈體。
64.權(quán)利要求63的制備偶聯(lián)物的方法，進(jìn)一步包括以下步驟首先將單鏈多核苷酸結(jié)合至接頭分子，然后將接頭分子結(jié)合至價(jià)平臺(tái)分子。
65.制備權(quán)利要求20的偶聯(lián)物的方法，包括(a)將缺乏T細(xì)胞表位的免疫原的類似物共價(jià)結(jié)合至價(jià)平臺(tái)分子以形成偶聯(lián)物；和(b)從反應(yīng)混合物中回收該偶聯(lián)物。
66.用于形成與生物活性分子的偶聯(lián)物的組合物，其包含價(jià)平臺(tái)分子，其中所述平臺(tái)分子包含分支基團(tuán)，其中所述平臺(tái)分子的化合價(jià)是由分支基團(tuán)的數(shù)目預(yù)先確定的，其中所述平臺(tái)分子的化合價(jià)是二或更高，并且其中分支基團(tuán)的數(shù)目預(yù)先確定了所述平臺(tái)的化合價(jià)和生物活性分子附著位點(diǎn)的位置。
67.權(quán)利要求66的組合物，其中所述分支基團(tuán)來源于選自二氨基酸、三胺和氨基二酸基團(tuán)的基團(tuán)。
68.權(quán)利要求66或67的組合物，其中所述價(jià)平臺(tái)分子具有實(shí)質(zhì)上均一的分子量。
69.權(quán)利要求66-68任一項(xiàng)的組合物，其中所述價(jià)平臺(tái)分子包含至少一個(gè)末端分支基團(tuán)，其中所述末端分支基團(tuán)是二分叉的，從而為所述生物活性分子提供兩個(gè)附著位點(diǎn)。
70.權(quán)利要求66-69任一項(xiàng)的組合物，其中所述生物活性分子結(jié)合至價(jià)平臺(tái)分子，從而產(chǎn)生包含偶聯(lián)物的組合物；并且其中所述生物活性分子是相同的。
71.權(quán)利要求70的組合物，其中所述生物活性分子包含多核苷酸。
72.權(quán)利要求71的組合物，其中所述偶聯(lián)物包含分別結(jié)合至分支基團(tuán)的末端和生物活性分子的連接部分。
73.用于治療抗體介導(dǎo)病變的組合物，其包含權(quán)利要求17-61任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述組合物配制成注射施用。
74.權(quán)利要求73的組合物，其中所述組合物適于降低抗體水平。
75.權(quán)利要求73的組合物，其中所述組合物適于抑制抗體產(chǎn)生。
76.用于治療人系統(tǒng)性紅斑狼瘡的組合物，其包含權(quán)利要求19或20的偶聯(lián)物，其中所述組合物配制成注射施用。
77.藥物組合物，其包含權(quán)利要求17-61任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，還包含可藥用賦形劑。
78.用于治療抗體介導(dǎo)病變的藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，與可藥用載體。
79.用于治療狼瘡的藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，與可藥用載體。
80.權(quán)利要求79的組合物，用于在個(gè)體中誘導(dǎo)對(duì)免疫原的特異性細(xì)胞無反應(yīng)性。
81.權(quán)利要求79的組合物，用于治療個(gè)體的抗體介導(dǎo)病變，其中在所述抗體介導(dǎo)病變中，作為對(duì)免疫原的應(yīng)答產(chǎn)生了不希望的抗體。
82.權(quán)利要求78-81任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物配制成通過注射給藥。
全文摘要
公開了化學(xué)上定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子和含有化學(xué)上定義的價(jià)平臺(tái)分子和生物或合成分子的偶聯(lián)物，生物或合成分子包括具有至少20個(gè)堿基對(duì)、對(duì)人狼瘡病抗dsDNA自身抗體有顯著結(jié)合活性的多核苷酸雙鏈體。
文檔編號(hào)A61K38/11GK1572797SQ20041006212
公開日2005年2月2日 申請(qǐng)日期1994年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月8日
發(fā)明者S·M·庫茈, D·S·瓊斯, D·A·利文斯通, 余林 申請(qǐng)人:拉卓拉藥物公司