專利名稱：一種羅布麻提取物及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及涉及一種羅布麻提取物及其提取方法，特別涉及羅布麻中提取的一種黃酮類物質(zhì)及這類黃酮類物質(zhì)的提取方法。
背景技術(shù)：
羅布麻葉是一味傳統(tǒng)的平肝息風(fēng)藥，具有平肝安神，清熱利水的作用，用于肝陽(yáng)眩暈，心悸失眠，浮腫少尿；高血壓，神經(jīng)衰弱，腎炎浮腫?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其還具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗抑郁和肝保護(hù)等廣泛的藥理作用。其有效成份為黃酮類物質(zhì)。但是目前以羅布麻為原料的臨床用藥均為粗提物制品或保健產(chǎn)品如“羅布麻葉片”(衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第7冊(cè)WS3-B-1356-93)，“復(fù)方羅布麻沖劑”(衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第6冊(cè)WS3-B-1189-92)，“羅布麻茶”(為羅布麻葉和綠茶混合物)，羅布麻香煙等，普遍存在服用量過大(其日服用量在8-12g)、藥效不顯著的缺點(diǎn)；對(duì)其有效成分進(jìn)一步精制純化是這味傳統(tǒng)中藥實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化的必然趨勢(shì)，以符合現(xiàn)代制劑“劑量小、毒性小、副作用小“、“高效、速效、長(zhǎng)效”的要求；而國(guó)內(nèi)外已經(jīng)公開的文獻(xiàn)及專利如“羅布麻組合物”(CN1161844A)、“一種治療高血壓病的中藥及其制備方法”(CN1283484A)、“降血壓降血脂的中藥保健茶”(CN1309985A)、“抗抑郁”(US2002/0090403A1)均未見有高純度羅布麻提取物的報(bào)道。
一味中藥通常是由多類成份組成的，比如糖類、氨基酸類、蛋白類、香豆素類、黃酮類、鞣質(zhì)類、生物堿類、萜類和甾體類等等。常規(guī)的提取方法(如用水煎或乙醇提取)，可將其大部分提取出來(lái)，但是其真正有活性的物質(zhì)不一定是所有的成分類別，而常常僅僅是其中的一小類成分起效。因此得到一種盡可能將無(wú)效成分去除，而將有效成分盡可能保留的高純提取物，是中藥現(xiàn)代研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。
如前所述羅布麻中的有效成份為黃酮類物質(zhì)。黃酮類物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于黃酮類、黃烷醇類、黃烷類、二氫黃酮醇類、花色素類、雙苯吡酮類、異黃酮類、查爾酮類、二氫查爾酮類，橙酮類、高異黃酮類的化合物的單倍體或多聚體化合物及它們與單糖或寡糖形成的苷或其他形式的衍生物的一種或幾種的組合。目前對(duì)黃酮類物質(zhì)往往僅以“總黃酮含量”這一較上位的概念對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行表征。對(duì)深層次的，諸如黃酮類物質(zhì)中究竟是哪些有效成份起作用、這些有效份的含量等不曾認(rèn)識(shí)，不作確切表征。總黃酮含量的測(cè)定，通常是采用其中含有的一種主要成份作為代表，采用一種通用的檢測(cè)方法將提取物中某一大類成分全部按代表成分的分子量計(jì)算；因此測(cè)得的總黃酮含量是一種相對(duì)值，它受選取代表化合物的分子量、檢測(cè)方法等的影響。因此，僅以“總黃酮含量”對(duì)黃酮類物質(zhì)進(jìn)行表征，難以反映出不同黃酮類物質(zhì)(如，從不同植物中提取的黃酮類物質(zhì)或以不同方法從同一種植物中提取的黃酮類物質(zhì))的真實(shí)特點(diǎn)，不同的黃酮類物質(zhì)(即使總黃酮含量相同或相近)其包含的具體黃酮類化合物有很大不同，其所反應(yīng)的藥理、藥性有巨大的差異。提取方法不同，即使是同一種植物，所得的黃酮類物質(zhì)也不同。因此，以一種完全不同于現(xiàn)有技術(shù)的提取方法從某一植物中提取得到的黃酮類物質(zhì)，從深層次的諸如黃酮類物質(zhì)的具體構(gòu)成、含量或者其物理化學(xué)參數(shù)的角度看，就是一種新物質(zhì)，不能因?yàn)槠鋵儆凇包S酮類物質(zhì)”大類而否認(rèn)其為新物質(zhì)。
羅布麻經(jīng)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其中至少有11個(gè)大類成分，近50個(gè)已知單一化合物包括黃酮及其取代物、三萜及甾醇、木脂素、香豆素、苷類、有機(jī)酸及酯、環(huán)醇、二萜、烷類、糖類和氨基酸類。藥理研究表明黃酮類成分是其中的主要活性成分類別之一，其中至少有25種化合物包括金絲桃苷、異槲皮苷、異槲皮苷6′-O-乙?；?、槲皮素、槲皮素3-O-槐糖苷、槲皮素3-O-(2G-葡萄糖基蕓香糖苷)、蕓香苷、新異蕓香苷、山柰酚6′-O-乙?；?、三葉豆苷、紫云英苷、異鼠李素3-O-葡糖苷等；但還不能排除其它成分有活性。因此在保證藥效的前提下，盡可能提高提取物的純度是技術(shù)難點(diǎn)。每一種新的提取方法得到的提取物(黃酮類物質(zhì))由于包含不同的黃酮類化合物、不同的含量，其藥理、藥性存在很大差異，都是一種新的物質(zhì)。
目前羅布麻總黃酮提取物制備方法主要還是水煎法、水煎后醇沉法、醇提法、醇提水沉法等，其出膏率較高(一般在20％以上，最低也在15％以上，則日服劑量也在1.6-2.4g)，特別是分離柱所用材料選用不當(dāng)，難以將羅布麻提取物中的糖類、鞣質(zhì)類、氨基酸類、及部分無(wú)效黃酮類成分除去，進(jìn)一步增加了出膏率；這些提取物常具有吸濕性大、服用量大和藥效不明顯的缺點(diǎn)，因此現(xiàn)有提取方法得到的提取物大都為粗提取物；這里出膏率是指單位干燥藥材質(zhì)量(如100g藥材)制備獲得的最終干燥提取物的質(zhì)量(如3g)。出膏率越小，表明提取物精制程度越高；但是只有出膏率還不行，因?yàn)槿绻苽涞奶崛∥锊缓钚猿煞郑瑒t出膏率越小，有可能藥理活性會(huì)越小。
中國(guó)專利“羅布麻有效部位的提取分離方法專利”(CN1385188A)，為大孔吸附樹脂分步洗脫方法。采用此方法可以獲得較高純度的羅布麻提取物，但該方法由于需要分步洗脫，成本較高，步驟復(fù)雜，出膏率仍較高(其出膏率可達(dá)到10％以下，但要達(dá)到高純度的羅布麻提取物，出膏率控制在3％以下，又不降低有效成分含量就很難了)，不易得到穩(wěn)定的高純度提取物；中藥先進(jìn)制劑之所以難以開發(fā)，難以做到服用方便、攜帶方便，其關(guān)鍵就是出膏率高、服量過大，難以制備成先進(jìn)制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)目前無(wú)法得到確切表征的高純度提取物，因而羅布麻都以生藥或粗提取物入藥的問題，提供一種確切表征的、在醫(yī)藥上有突出作用的羅布麻(高純度)提取物。
本發(fā)明還針對(duì)現(xiàn)有羅布麻提取物的提取方法出膏率高、所得提取物都為粗提物的問題，提供一種高純度羅布麻提取物的提取方法。
本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種羅布麻提取物，(1)以金絲桃苷作為代表成分對(duì)該提取物進(jìn)行測(cè)定，提取物中總黃酮含量35％-90％；(2)完全水解該提取物后，槲皮素化合物的含量30％-80％；(3)提取物中，金絲桃苷化合物的含量15％-55％。
本發(fā)明所述的羅布麻提取物是以全新的提取方法首次從羅布麻中提取出來(lái)的一種新物質(zhì)，以總黃酮含量、金絲桃苷化合物、槲皮素化合物的含量對(duì)其進(jìn)行確切的表征。目前，以上述表征方式進(jìn)行表征的黃酮類物質(zhì)未見相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。
采用羅布麻中含量較高而且分子量居中的黃酮類化合物——金絲桃苷——作為代表成分(分子量為466)，采用公知的三氯化鋁(AlCl3)和乙酸鈉作為黃酮通用顯色劑，在紫外可見分光光度儀上的400-420nm處進(jìn)行測(cè)定，這樣避免了因?yàn)楹繙y(cè)定方法不統(tǒng)一造成的對(duì)提取物定義的分歧。由于中藥材提取物受中藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)變化和提取方法的不同而有一定的變化，在對(duì)羅布麻提取物進(jìn)行多次測(cè)定后，本發(fā)明羅布麻總黃酮提取物中總黃酮含量為35％——95％。上述含量測(cè)定方法可將不同母核(苷元)的黃酮測(cè)定出來(lái)。槲皮素具有羅布麻典型的藥理特征；將提取物水解，將提取物中結(jié)合態(tài)的槲皮素解離出來(lái)進(jìn)行定義。提取物中的結(jié)合態(tài)槲皮素是指與糖或苷的化合物，包括金絲桃苷、異槲皮苷、異槲皮苷6′-O-乙?；?、槲皮素3-O-槐糖苷、槲皮素3-O-(2G-葡萄糖基蕓香糖苷)、蕓香苷、新異蕓香苷等化合物。結(jié)合態(tài)的槲皮素在體內(nèi)通常都要水解游離出槲皮素后再發(fā)揮生理活性；但作為定義提取物的指標(biāo)，卻有其優(yōu)點(diǎn)，通過該指標(biāo)可以明確定義提取物中一組藥理活性明確的化合物群。金絲桃苷是羅布麻提取物中主要的黃酮成分，也是其指標(biāo)成分，有必要對(duì)羅布麻高純提取物的該化合物含量進(jìn)行定義。
本發(fā)明的總黃酮提取物可以進(jìn)一步采用常規(guī)植物化學(xué)方法純化，例如各種色譜柱層析(減壓柱層析，葡聚糖凝膠，反相柱層析，制備性高效液相等)，這些方法對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是不言自明的。因此本發(fā)明提取物定義了三個(gè)指標(biāo)，不論其它單體化合物含量如何，只要是從植物羅布麻中提取，并且三項(xiàng)指標(biāo)在上述范圍內(nèi)，則該提取物在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
本發(fā)明所表征的羅布麻提取物是首次從羅布麻中提取出來(lái)的一種新物質(zhì)，不僅精制程度高，而且保留了大部分羅布麻的藥理活性，具有降血脂、降血壓、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、抗血栓、肝保護(hù)、抗抑郁等作用。而且服用量遠(yuǎn)小于羅布麻粗體物，其藥理、藥性與羅布麻粗提物相比有顯著區(qū)別，具有現(xiàn)代中藥“劑量小、毒性小、副作用小”、“高效、速效、長(zhǎng)效”的特點(diǎn)，滿足了醫(yī)藥領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)高效、高純度羅布麻提取物的需求。因此本發(fā)明提供的羅布麻提取物在醫(yī)藥領(lǐng)域具有極高的利用價(jià)值，能夠用于治療和預(yù)防某些心血管疾病如高血脂癥，中風(fēng)、冠心病等和肝損傷，抑郁癥以及其它相關(guān)病癥，對(duì)于上述病癥的合并癥則防治效果更佳。為進(jìn)一步開發(fā)先進(jìn)制劑提供了良好的基礎(chǔ)，如滴丸劑，注射劑，緩、控釋制劑等。
本發(fā)明所述的羅布麻提取物是一種高純度的提取物，并且具有顯著的藥理活性；采用合適指標(biāo)定義了提取物的特征。中藥先進(jìn)制劑之所以難以開發(fā)，難以做到服用方便、攜帶方便，其關(guān)鍵就是服量過大，難以制備成先進(jìn)制劑。本發(fā)明的高純度的羅布麻提取物在此方面有著廣泛的用途，具有很好的藥物開發(fā)前景，為提取物的進(jìn)一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明一方面有望給患這些疾病的患者提供一種新的治療選擇，另一方面對(duì)于更加有效的利用羅布麻植物資源，拓寬羅布麻植物的應(yīng)用也具有重要意義。
本發(fā)明羅布麻提取物的藥效學(xué)檢測(cè)(1)羅布麻高純提取物調(diào)節(jié)異常血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用試驗(yàn)及與粗體物的比較實(shí)驗(yàn)方法Wistar大鼠(280-320g)在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，眼眶采血作為正常值，低溫(-20℃)保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)于復(fù)制模型前采用尾套法測(cè)定大鼠血壓，然后正常對(duì)照組給普通飼料，高脂模型組給予高脂飼料，實(shí)驗(yàn)組給高脂飼料的同時(shí)給羅布麻粗體物(10倍重量的水提三次后，干燥使用，給藥1150mg/kg)和高純提取物(實(shí)施例1，170mg/kg)灌胃。12周后，檢測(cè)血脂指標(biāo)(包括總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL))，血壓，脂質(zhì)過氧化物(LPO)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件上完成，各組實(shí)驗(yàn)前后的數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析(ANOVA)，顯著性檢驗(yàn)取p＜0.05。
表1大鼠高血脂模型各組調(diào)脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝7)TC TG LDL HDL 收縮壓 舒張壓LPO組別(mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmHg) (mmHg)(nmol/l)正常對(duì)照組 2.11±0.09 0.40±0.05 1.19±0.020.79±0.12 109.6±6.2 84.4±8.0 0.34±0.68高脂模型組 2.39±0.14 0.56±0.07 0.35±0.150.71±0.05 155.4±3.3 135.0±1.32.78±1.57粗體物組2.19±0.08 0.43±0.08 0.98±0.180.83±0.11 149.3±3.9 114.8±4.40.74±0.15高純提取物組2.27±0.03*0.36±0.02 1.07±0.09* 1.03±0.02* 86±1.6* 86.7±3.9*0.34±0.09*與空白對(duì)照組比較*p＜0.05實(shí)驗(yàn)結(jié)果高純提取物給藥可以顯著降低TC，LDL，并升高HDL；對(duì)高血脂伴隨的高血壓有降壓作用，并可降低由高血脂引起的LPO的增加，表明有預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用，顯示了非常好的綜合調(diào)脂作用。從與粗體物比較來(lái)看，粗體物給藥量是高純提取物的6.7倍，但是其各項(xiàng)指標(biāo)卻均不及高純提取物，從此也可以看出高純提取物可以顯著減少服用量。
(2)羅布麻高純提取物抗血栓作用試驗(yàn)及與粗體物的比較實(shí)驗(yàn)方法Wistar大鼠(280-320g)上述模型復(fù)制好后，(粗提物810mg/Kg，實(shí)施例2170mg/Kg)，腹腔麻醉，麻醉成功后，將大鼠仰臥綁至實(shí)驗(yàn)毛頸部正中切口，縱行切開頸部皮膚、皮下、至肌然后仔細(xì)分離右側(cè)頸總動(dòng)脈約1.5mm，用小塊塑料布遮蓋傷口周圍組織防止組織溫度影響血管壁表面溫度。將實(shí)驗(yàn)性體內(nèi)血栓形成儀的刺激電極和溫度傳感器鉤于動(dòng)脈血管上，用1.5mv的直流電持續(xù)刺激血管壁，使血管內(nèi)膜造成損傷，激活血小板和凝血系統(tǒng)的活性，使其逐漸形成血栓。當(dāng)血栓形成堵塞血管時(shí)，血管遠(yuǎn)端溫度突降使儀器報(bào)警。從刺激開始到儀器報(bào)警時(shí)間是血栓形成時(shí)間，亦稱堵塞值(OT值)。實(shí)驗(yàn)中刺激7min后關(guān)閉電源，同時(shí)由溫度傳感器檢測(cè)血管表面的溫度變化，記錄OT值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白對(duì)照組相比，羅布麻高純提取物的血栓出現(xiàn)的時(shí)間顯著延長(zhǎng)，而模型組血栓出現(xiàn)的時(shí)間最短表明高純提取物有很好的抗血栓作用；此外從與粗體物的比較來(lái)看，也可看出高純提取物可以顯著減少服用量，且具有優(yōu)于粗提物的抗血栓作用。
表2抗血栓作用試驗(yàn)結(jié)果(n＝7)血栓形成時(shí)間OT值組別(Seconds)空白對(duì)照組17.5±0.5高脂模型組9.8±1.3粗提物組 20.6±1.2*高純提取物組 30.3±1.2*與空白對(duì)照組比較*p＜0.05羅布麻提取物的提取方法，包括羅布麻上柱液的制備、上柱液上分離柱分離、對(duì)分離柱的洗脫、洗脫液濃縮、干燥；分離柱采用聚酰胺樹脂，上柱液通過聚酰胺樹脂吸附后，先用水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌，洗脫液棄?。辉儆弥亓繚舛葹?0～90％的溶劑洗脫，至洗脫液與三氯化鋁無(wú)黃酮反應(yīng)，洗脫液備用，其中洗脫所用的溶劑為低級(jí)的醇、酮、酯(如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯)的一種或幾種以任意比例組合的水溶液。本發(fā)明優(yōu)選了聚酰胺樹脂作為分離柱材料，可將羅布麻上柱液中的糖類、鞣質(zhì)類、氨基酸類、及部分無(wú)效黃酮類成分等成分除去(即聚酰胺樹脂不吸附這些物質(zhì))，而保留有效成分及部分有效黃酮類物質(zhì)(保留的這部分是當(dāng)前所未充分認(rèn)識(shí)的)。因此，本發(fā)明所述的提取方法使提取物的出膏率得到降低(3％以下)(濃縮率得到提高)。洗脫液的選取及濃度，直接影響最終提取物所含組份和含量，即決定提取方法是否能得到前述表征的提取物；本發(fā)明所用的洗脫液及濃度以及聚酰胺樹脂柱的確定是在大量的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上得出的，與現(xiàn)有的提取方法相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，并帶來(lái)顯著進(jìn)步(體現(xiàn)在降低了出膏率，得到了本發(fā)明所要求保護(hù)的高純度的提取物)。
羅布麻上柱液在靜置后通常含有大量的膠體物質(zhì)、懸浮的小顆粒不溶物等，這些物質(zhì)會(huì)嚴(yán)重堵塞樹脂柱，影響樹脂柱的壽命；其次羅布麻上柱液中含有大量強(qiáng)吸附性物質(zhì)，聚酰胺對(duì)此類物質(zhì)的吸附力較大，應(yīng)提前除去，否則也會(huì)影響樹脂柱的壽命。為此，本發(fā)明在上柱液上柱前，在上柱液中加入澄清劑來(lái)進(jìn)行澄清、純化處理，澄清劑是甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑的其中一種溶液或甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑中的任兩種以1-2∶1-2比例制成的溶液，甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑單獨(dú)或兩種組合的用量占羅布麻用量的0.2％-2％(g/g)。澄清劑用量少達(dá)不到澄清、純化的目的，澄清劑用量過多會(huì)造成所需有效成份的損失。
由于上柱液的復(fù)雜性，一種澄清劑常常不能達(dá)到較好的澄清效果，多需要聯(lián)合使用；但采用其中任何一種也可將上柱液澄清，只是效果稍有不同，影響不大。因此本發(fā)明在于可采用澄清劑對(duì)羅布麻上柱液進(jìn)行上柱前處理。本發(fā)明中的蛋白類澄清劑是指明膠。本發(fā)明中的甲殼素類澄清劑是指甲殼素，或以甲殼素為原料的各種衍生物(如脫乙酰甲殼素，也稱殼聚糖)制成的澄清劑。ZTC澄清劑是市場(chǎng)上公開出售的現(xiàn)有產(chǎn)品，其包括A組份和B組份。
本發(fā)明采用的聚酰胺樹脂可以是各種粒度范圍的樹脂，也可以是各種顆粒形狀的樹脂如粉末狀、顆粒狀和球狀樹脂。
用水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌，主要是除去過量的樣品溶液、不吸附的糖類、氨基酸類、吸附力較弱的苷類和一些小分子酚性物質(zhì)等，將洗脫液棄?。蝗缓罂芍苯邮褂弥亓繚舛葹?0～90％的溶劑洗脫，直至洗脫液與三氯化鋁無(wú)黃酮反應(yīng)；洗脫液濃縮，并將濃縮液進(jìn)行干燥，可得總黃酮提取物；用水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌過度會(huì)將所需的有效成份洗掉，洗滌不足不能將不吸附的糖類、氨基酸類、吸附力較弱的苷類和一些小分子酚性物質(zhì)等充分洗掉，將會(huì)影響出膏率。本發(fā)明為進(jìn)一步優(yōu)化提取方法，用1-5倍樹脂柱體積的水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌。
本發(fā)明中的水可以是不加任何物質(zhì)的純水，也可以是加入適當(dāng)?shù)母男詣┤纾倭康乃?、堿或鹽這些都是本領(lǐng)域內(nèi)的公知共用的方法；本發(fā)明中重量濃度為5％-25％的溶劑是指，以水為溶劑的低級(jí)的醇、酮、酯等的一種或幾種的組合，如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯；也可以加入適當(dāng)?shù)母男詣┤?，少量的酸、堿或鹽；本發(fā)明中重量濃度為40％-90％的溶劑是指，以水為溶劑的低級(jí)的醇、酮、酯等的一種或幾種的組合，如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯；也可以加入適當(dāng)?shù)母男詣┤纾倭康乃?、堿或鹽。本發(fā)明優(yōu)選水為除雜溶劑，50％-85％的乙醇為洗脫劑。
本發(fā)明中經(jīng)純化后的洗脫液采用濃縮、干燥技術(shù)后，即可得到高純度的提取物。其中濃縮可采用減壓濃縮、薄膜濃縮等方法；干燥可采用常壓烘干、減壓干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等技術(shù)。這些方法均是本領(lǐng)域內(nèi)的公知公用的方法。
本發(fā)明的上柱液制備，采用本領(lǐng)域內(nèi)公知公用的方法，可用含水或不含水甲醇、乙醇、丙酮，乙酸乙酯、正丁醇、正己烷或類似物之一種或幾種任意比例的混合物作溶劑，或由這些溶劑與酸、堿配成的酸性或堿性溶劑進(jìn)行提取，可以經(jīng)過加熱回流、滲漉、超聲提取、微波提取或高壓提取等方法提取。本發(fā)明優(yōu)選25-85％乙醇回流提取。
本發(fā)明的原料為羅布麻的葉，提取前可經(jīng)干燥或烘干處理。其中羅布麻是指夾竹桃科(Apocynaceae)植物，其來(lái)源有羅布麻屬羅布麻，學(xué)名Apocynum venetum L.又稱紅麻(Apocynum Lancifolium Rus)；白麻屬白麻(別名紫斑羅布麻Poacynum pictum[Sohnenk]Baill)和大葉白麻(別名大花羅布麻Poacynum hendersonni[Hook.f]Woodson)。(中國(guó)植物志(第六十三卷).科學(xué)出版社北京.1977157-163)以本發(fā)明所述的提取方法可得到本發(fā)明所述的羅布麻提取物。采用聚酰胺樹脂作為分離手段，可除去大量雜質(zhì)，因而使有效成分富集、出膏率低(3％以下)，同時(shí)完成了除雜和濃縮兩道工序，與傳統(tǒng)方法相比，這種方法的生產(chǎn)周期縮短，產(chǎn)品穩(wěn)定性增強(qiáng)，而且可除去藥材中的有毒成份和污染的有害金屬或重金屬元素。本發(fā)明所述的提取方法優(yōu)選澄清劑進(jìn)行上柱液前處理，可明顯延長(zhǎng)分離柱的壽命。


圖1為實(shí)施例1金絲桃苷HPLC圖譜；圖2為實(shí)施例1水解槲皮素HPLC圖譜；圖3為實(shí)施例2金絲桃苷HPLC圖譜；圖4為實(shí)施例2水解槲皮素HPLC圖譜；圖5為實(shí)施例3金絲桃苷HPLC圖譜；圖6為實(shí)施例3水解槲皮素HPLC圖譜；
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
1.羅布麻高純提取物的制備取羅布麻葉(200℃烘烤1小時(shí))300g，在85℃-100℃的溫度下，以3000mL的40％乙醇水回流提取3次(3000mL×3)，每次0.5hr，合并提取液，室溫下靜置過夜、過濾，去沉淀，濾液減壓濃縮(60℃，0.08-0.1MPa)，至總體積900mL，濃縮液加1％殼聚糖的乙酸溶液180mL(相當(dāng)于1.8克殼聚糖，可制成其它濃度的殼聚糖溶液，只要使殼聚糖充分溶解即可)，攪拌2min，室溫靜置2-4hr，抽濾，棄去殘?jiān)?，上清夜過處理好的聚酰胺樹脂柱(柱體積約300mL，流速300mL/hr)，以FeCl3反應(yīng)檢測(cè)流出液，以確證樹脂是否吸附飽和；隨后以600mL水，用鹽酸調(diào)pH為3后，進(jìn)行洗脫除雜，然后用70％乙醇水溶液洗脫至無(wú)AlCl3反應(yīng)，洗脫流速約300mL/hr收集70％乙醇水溶液并減壓濃縮(60℃，0.08-0.1MPa)至近干；水浴蒸干后，80℃烤箱干燥12-72hr，得黃棕色至黃色粉末，為羅布麻高純提取物，總量為5.42g(含水量≤5％)。出膏率為1.8％。
2、含量測(cè)定(1)金絲桃苷的測(cè)定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流動(dòng)相乙腈∶四氫呋喃∶1.1％乙酸(15.5∶5.5∶79)；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm；進(jìn)樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖1示，其中保留時(shí)間(min)為9的為金絲桃苷。羅布麻高純提取物(實(shí)例1)的金絲桃苷含量為17.8％。
(2)總槲皮素的測(cè)定樣品水解條件取10mg樣品至50ml量瓶中，加80％的甲醇溶解定容，取10ml續(xù)濾液加1ml鹽酸回流水解1小時(shí)后，定容至25ml得供試液。
色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流動(dòng)相甲醇∶0.4％磷酸(50∶50)；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm；進(jìn)樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖2示，其中保留時(shí)間(min)為10的為槲皮素。羅布麻高純提取物(實(shí)例1)水解后的槲皮素含量為36.7％。
(3)總黃酮的含量測(cè)定對(duì)照品溶液制備精密稱取金絲桃苷對(duì)照品(120℃下減壓干燥至恒重)適量，用甲醇配置成1ml含0.06mg的溶液。
供試品溶液制備精密稱取干燥本品(實(shí)施例1)20mg，置于100mL量瓶中，加入甲醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻，備用。
測(cè)定方法取對(duì)照品溶液及供試品溶液，置10mL容量瓶中，用甲醇加至5mL，經(jīng)AlCl3和乙酸鈉顯色后，按分光光度法(中國(guó)藥典2000版附錄IVA)，在400nm處測(cè)定吸光度，實(shí)例1總黃酮物質(zhì)含量為42.8％。
實(shí)施例2.
1.羅布麻高純提取物的制備取干燥大葉白麻葉300g，在85℃-100℃的溫度下，以60％乙醇水回流提取3次(3750，2700mL，2400)，每次1hr，合并提取液，室溫下靜置過夜、過濾，去沉淀，濾液減壓濃縮(60℃，0.08-0.1MPa)，至總體積900mL，濃縮液加1％殼聚糖的乙酸溶液180mL后，再加1％的明膠溶液180mL攪拌2min，室溫靜置2-4hr，抽濾，棄去殘?jiān)锨逡惯^處理好的聚酰胺樹脂柱(柱體積約300mL，流速300mL/hr)，以FeCl3反應(yīng)檢測(cè)流出液，以確證樹脂是否吸附飽和；隨后以600mL10％的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液棄去，再用60％乙醇和丙酮水溶液洗脫，洗脫至無(wú)AlCl3反應(yīng)，洗脫流速約300mL/hr，收集60％乙醇和甲醇水溶液并減壓濃縮(60℃，0.08-0.1MPa)至近干；水浴蒸干后，80℃烤箱干燥12-72hr，得黃棕色至黃色粉末，為羅布麻高純提取物，總量為3.66g(含水量≤5％)。出膏率為1.22％。
含量測(cè)定(1)金絲桃苷的測(cè)定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流動(dòng)相乙腈∶四氫呋喃∶1.1％乙酸(15.5∶5.5∶79)；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm；進(jìn)樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖3示，其中保留時(shí)間(min)為9的為金絲桃苷。羅布麻高純提取物(實(shí)例2)的金絲桃苷含量為50.3％。
(2)總槲皮素的測(cè)定樣品水解條件取10mg樣品至50ml量瓶中，加80％的甲醇溶解定容，取10ml續(xù)濾液加1ml鹽酸回流水解1小時(shí)后，定容至25ml得供試液。
色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流動(dòng)相甲醇∶0.4％磷酸(50∶50)；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm；進(jìn)樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖4示，其中保留時(shí)間(min)為10的為槲皮素。羅布麻高純提取物(實(shí)例2)水解后的槲皮素含量為66.0％。
(3)總黃酮的含量測(cè)定對(duì)照品溶液制備精密稱取金絲桃苷對(duì)照品(120℃下減壓干燥至恒重)適量，用甲醇配置成1ml含0.06mg的溶液。
供試品溶液制備精密稱取干燥本品(實(shí)施例2)20mg，置于100mL量瓶中，加入甲醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻，備用。
測(cè)定方法取對(duì)照品溶液及供試品溶液，置10mL容量瓶中，用甲醇加至5mL，經(jīng)AlCl3和乙酸鈉顯色后，按分光光度法(中國(guó)藥典2000版附錄IVA)，在400nm處測(cè)定吸光度，實(shí)例2總黃酮物質(zhì)含量為82.5％。
實(shí)施例3.
1.羅布麻高純提取物的制備取干燥紫斑羅布麻葉300g，在85℃-100℃的溫度下，以45％乙醇水回流提取3次(3000mL，2700mL，2400mL)，每次1hr，合并提取液，室溫下靜置過夜、過濾，去沉淀，濾液減壓濃縮(60℃，0.08-0.1MPa)，至總體積900mL，濃縮液加1％ZTC溶液A組分160mL，再加加1％ZTC溶液B組分160mL攪拌2min，室溫靜置2-4hr，抽濾，棄去殘?jiān)?，上清夜過處理好的聚酰胺樹脂柱(柱體積約300mL，流速300mL/hr)，以FeCl3反應(yīng)檢測(cè)流出液，以確證樹脂是否吸附飽和；隨后以900mL水洗脫，棄去洗脫液，然后用85％甲醇水溶液洗脫，洗脫至無(wú)AlCl3反應(yīng)，洗脫流速約300mL/hr收集85％甲醇水溶液并減壓濃縮(60℃，0.08-0.1MPa)至近干；水浴蒸干后，80℃烤箱干燥12-72hr，得黃棕色至黃色粉末，為羅布麻高純提取物，總量為3.39g(含水量≤5％)。出膏率為1.13％。
含量測(cè)定(1)金絲桃苷的測(cè)定色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流動(dòng)相乙腈∶四氫呋喃∶1.1％乙酸(15.5∶5.5∶79)；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm；進(jìn)樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖5示，其中保留時(shí)間(min)為9的為金絲桃苷。羅布麻高純提取物(實(shí)例3)的金絲桃苷含量為26.8％。
(2)總槲皮素的測(cè)定樣品水解條件取10mg樣品至50ml量瓶中，加80％的甲醇溶解定容，取10ml續(xù)濾液加1ml鹽酸回流水解1小時(shí)后，定容至25ml得供試液。
色譜條件固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流動(dòng)相甲醇∶0.4％磷酸(50∶50)；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm；進(jìn)樣量10-20μl，所得HPLC圖譜如圖6示，其中保留時(shí)間(min)為10的為槲皮素。羅布麻高純提取物(實(shí)例3)水解后的槲皮素含量為47.8％。
(3)總黃酮的含量測(cè)定對(duì)照品溶液制備精密稱取金絲桃苷對(duì)照品(120℃下減壓干燥至恒重)適量，用甲醇配置成1ml含0.06mg的溶液。
供試品溶液制備精密稱取干燥本品(實(shí)施例3)20mg，置于100mL量瓶中，加入甲醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻，備用。
測(cè)定方法取對(duì)照品溶液及供試品溶液，置10mL容量瓶中，用甲醇加至5mL，經(jīng)AlCl3和乙酸鈉顯色后，按分光光度法(中國(guó)藥典2000版附錄IVA)，在400nm處測(cè)定吸光度，實(shí)例3總黃酮物質(zhì)含量為59.8％。
權(quán)利要求
1.一種羅布麻提取物，其特征為(1)以金絲桃苷作為代表成分對(duì)該提取物進(jìn)行測(cè)定，提取物中總黃酮含量35％-90％；(2)完全水解該提取物后，槲皮素化合物的含量30％-80％；(3)提取物中，金絲桃苷化合物的含量15％-55％。
2.一種如權(quán)利要求1所述的羅布麻提取物的提取方法，包括羅布麻上柱液的制備、上柱液上分離柱分離、對(duì)分離柱的洗脫、洗脫液濃縮、干燥；其特征為分離柱采用聚酰胺樹脂，上柱液通過聚酰胺樹脂吸附后，先用水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌，洗脫液棄??；再用重量濃度為40～90％的溶劑洗脫，至洗脫液與三氯化鋁無(wú)黃酮反應(yīng)，洗脫液備用，其中洗脫所用的溶劑為低級(jí)的醇、酮、酯的一種或幾種以任意比例組合的水溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征為用1-5倍樹脂柱體積的水或重量濃度為5％-25％的溶劑洗滌。
4.如權(quán)利要求2或3所述的提取方法，其特征為優(yōu)選水為除雜溶劑，50％-85％的乙醇為洗脫劑。
5.如權(quán)利要求2或3所述的提取方法，其特征為在上柱液上柱前，在上柱液中加入澄清劑來(lái)進(jìn)行澄清、純化處理，澄清劑是甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑的其中一種溶液或甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑中的任兩種以1-2∶1-2比例制成的溶液，甲殼素類、蛋白類、ZTC澄清劑單獨(dú)或兩種組合的用量占羅布麻用量的0.2％-2％。
全文摘要
本發(fā)明為一種羅布麻提取物及其提取方法。羅布麻提取物，(1)以金絲桃苷作為代表成分對(duì)該提取物進(jìn)行測(cè)定，提取物中總黃酮含量35％－90％；(2)完全水解該提取物后，槲皮素化合物的含量30％－80％；(3)提取物中，金絲桃苷化合物的含量15％－55％。提取方法與采用聚酰胺樹脂分離柱，并用澄清劑對(duì)上柱液進(jìn)行澄清、純化，可明顯延長(zhǎng)分離柱的壽命。本發(fā)明所表征的羅布麻提取物是首次從羅布麻中提取出來(lái)的一種新物質(zhì)，不僅精制程度高，而且保留了大部分羅布麻的藥理活性，而且服用量遠(yuǎn)小于羅布麻粗體物，其藥理、藥性與羅布麻粗提物相比有顯著區(qū)別。提取方法采用聚酰胺樹脂作為分離手段，可除去大量雜質(zhì)，因而使有效成分富集、出膏率低(3％以下)。
文檔編號(hào)A61P3/00GK1634325SQ20041006455
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月18日
發(fā)明者李青山, 侯晉軍, 韓利文, 韓玲革 申請(qǐng)人:李青山