專利名稱：一種治療缺血性腦中風(fēng)的中藥組合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥組合物的制備方法，具體地說是涉及一種治療缺血性腦中風(fēng)的中藥組合物的制備方法。
背景技術(shù)：
腦中風(fēng)是一種常見病和多發(fā)病，腦中風(fēng)一般又分為出血性腦中風(fēng)和缺血性腦中風(fēng)，本申請涉及后者的治療用中藥組合物。
利用中醫(yī)中藥治療缺血性腦中風(fēng)在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有很多實例，目前應(yīng)用于缺血性腦中風(fēng)的口服中成藥有通脈顆粒、腦絡(luò)通膠囊等。通塞脈片原是一種治療血栓閉塞性脈管炎的中藥處方，全方由黃芪、黨參、石斛、玄參、金銀花、牛膝、當(dāng)歸、甘草等八味中藥組成，具有培補氣血、養(yǎng)陰清熱、活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)等功效。該處方是南京中醫(yī)藥大學(xué)與江蘇省中醫(yī)研究院、江蘇省中醫(yī)院等單位于1962年開始，以中西醫(yī)結(jié)合、辨證論治的方法，先后經(jīng)過三次總結(jié)，以《四顧湯》為基礎(chǔ)，經(jīng)過二十余年臨床與基礎(chǔ)研究所取得的科研成果。1982年，“通塞脈片治療血栓閉塞性脈管炎”通過省級鑒定；同年11月8日經(jīng)江蘇省衛(wèi)生廳批準(zhǔn)由江蘇南星藥業(yè)有限責(zé)任公司正式生產(chǎn)；1994年4月被列為國家中藥二類保護品種。根據(jù)中醫(yī)異病同治的原理，通塞脈片在臨床應(yīng)用過程又進(jìn)一步拓寬了臨床應(yīng)用范圍，可用于具有氣血虛弱，陰血不足，瘀血癥的多種疾病，如冠心病、心絞痛、腦動脈硬化的失眠、健忘、癡呆等癥；也可用于慢性肝炎、肝硬化、脂肪肝的康復(fù)治療，高血壓、高血脂等癥的輔助治療；還可用于中風(fēng)及中風(fēng)后遺癥特別是腦出血半身不遂等。
通塞脈片為治療血栓病的優(yōu)良中成藥，臨床驗證對血栓閉塞性脈管炎總有效率為97.8％，顯效率為95.6％，并對腦血栓形成及其后遺癥，閉塞性動脈硬化癥，靜脈血栓形成及糖尿病壞疽均有滿意的療效。長期的臨床實踐表明，通塞脈片是治療心腦血管疾病的優(yōu)良中成藥，口服安全，方便。但該片劑主要活性部位群不明確，服用劑量偏大(一次4～5片，一日3次)，而且由于全浸膏片吸濕性較大而導(dǎo)致片劑的穩(wěn)定性較差。因此，為了進(jìn)一步闡明通塞脈片治療缺血性腦中風(fēng)的主要活性部位群，研制出有效部位群較為明確、服用劑量相對較小、制劑穩(wěn)定性較好的中藥新制劑，我們開展了以下研究。

發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供一種治療缺血性腦中風(fēng)的中藥組合物的制備方法。
2.技術(shù)方案本發(fā)明人為了進(jìn)一步探索通塞脈片處方治療缺血性腦中風(fēng)的作用機理，在分析原處方的組成及其配伍關(guān)系的基礎(chǔ)上，并結(jié)合藥物的藥理研究，提出了將缺血性腦中風(fēng)作用機理密切相關(guān)的黃芪、當(dāng)歸、玄參、金銀花為基本組成藥物，對其余的黨參、牛膝、石斛、甘草四味藥進(jìn)行正交拆方加減試驗，并以治療缺血性腦中風(fēng)作用機理相關(guān)的藥效學(xué)試驗進(jìn)行驗證，評價組方的合理性，而獲得治療缺血性腦中風(fēng)的有效處方的原料為黃芪、當(dāng)歸、玄參、金銀花、石斛和甘草六味藥。
一種治療缺血性腦中風(fēng)的中藥組合物的制備方法，以黃芪10～20g、當(dāng)歸10～18g、玄參8～10g、金銀花8～15g、石斛8～15g、甘草6～10g為原料，其制備步驟如下。
(1)取當(dāng)歸10～18g進(jìn)行二氧化碳超臨界萃取，收集提取物，備用；(2)把當(dāng)歸二氧化碳萃取后的藥渣與黃芪10～20g、玄參8～10g、金銀花8～15g、石斛8～15g、甘草6～10g合并，進(jìn)行乙醇提取，得到乙醇提取液；(3)用上述的乙醇提取液回收乙醇后的藥液，濃縮，離心，水洗沉淀，洗液與濾液合并，棄去沉淀，上清液經(jīng)大孔吸附樹脂吸附后上柱后循環(huán)上樣，用乙醇洗脫，得到乙醇洗脫液；(4)將乙醇洗脫液減壓回收乙醇，濃縮，干燥后粉碎成干浸膏粉末；(5)最后將(1)、(4)兩個步驟得到的組分合并，即得到本發(fā)明的中藥組合物。
更具體地說，制備本發(fā)明中藥組合物的方法是，以黃芪8g、玄參8g、金銀花8g、石斛8g、甘草8g為原料，其步驟如下(1)取當(dāng)歸8g進(jìn)行二氧化碳超臨界萃取收集提取物，備用；(2)把當(dāng)歸的二氧化碳超臨界萃取后的藥渣與黃芪8g、玄參8g、金銀花8g、石斛8g、甘草8g合并，用70％乙醇回流提取2次，50％乙醇回流提取1次，第1次8倍量，第2、3次6倍量，每次1h，三次醇提液合并，減壓回收乙醇并薄膜濃縮至無醇味，得醇提液；(3)用上述的醇提液，濃縮，離心，棄去沉淀，上清液經(jīng)SP-825型大孔吸附樹脂吸附12h后上柱或上柱后循環(huán)上樣4次，用60％乙醇依次洗脫；(4)將上述乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮，干燥，粉碎得干浸膏粉末；(5)將(1)、(4)兩個步驟得到的組分進(jìn)行合并，即得到本發(fā)明的中藥組合物。
上述步驟(1)當(dāng)歸的二氧化碳超臨界萃取物為揮發(fā)性成分；步驟(4)的干浸膏中主要成分為總黃酮、總皂苷、黃芪甲苷、綠原酸、阿魏酸等。
本發(fā)明的中藥組合物用常規(guī)的制劑方法，可以制成片劑、顆粒劑、微丸和膠囊劑等口服固體制劑。
3.有益效果(1)該組合物針對治療缺血性腦中風(fēng)，選取相應(yīng)的藥效學(xué)篩選模型和復(fù)方，精簡處方，并進(jìn)一步確定了組合物的主要部位為當(dāng)歸揮發(fā)性成分和全方混合提取液經(jīng)大孔吸附樹脂分離含有總皂苷、總黃酮、總酚酸等混合提取物，去除了金銀花中揮發(fā)性成分和處方藥物所含的多糖類成分以及其他水溶性雜質(zhì)，極大地減少了服用劑量。
(2)采用CO2-SFE獲得當(dāng)歸中揮發(fā)性活性成分，由于提取分離溫度低，較好地保留了不穩(wěn)定的活性成分，提高了療效。
(3)采用大孔吸附樹脂分離富集復(fù)方藥物的有效部位群，方法簡便，工業(yè)化生產(chǎn)的可行性較好。
(4)全方混合提取液經(jīng)大孔吸附樹脂分離含有總皂苷、總黃酮、總酚酸等混合提取物中部位組成基本明確且組成比例相對固定。組合提取物溶解性好、吸濕性小，便于制劑。
具體實施例方式
實施例1治療缺血性腦中風(fēng)的中藥組合物的制備方法處方黃芪8g、當(dāng)歸8g、玄參8g、金銀花8g、石斛8g、甘草8g制備方法步驟如下(1)取當(dāng)歸干燥，粉末20目，投入萃取釜、2個解析釜及罐分別進(jìn)行加熱或冷卻，當(dāng)萃取釜溫度達(dá)到40℃，解析釜I的溫度達(dá)到50℃，解析釜II的溫度達(dá)到35℃時，打開CO2氣瓶，當(dāng)萃取釜壓力達(dá)到20MPa，解析釜II的壓力為6MPa時，開始循環(huán)萃取，CO2流量為18kg/h左右，萃取2h后從解析釜出料，收集提取物；(2)當(dāng)歸的二氧化碳萃取后的藥渣與黃芪8g、玄參8g、金銀花8g、石斛8g、甘草8g合并，用70％乙醇回流提取2次，50％乙醇回流提取1次，第1次8倍量，第2、3次6倍量，每次1h，三次醇提液合并，減壓薄膜濃縮至無醇味；(3)用上述步驟2得到的醇提液去醇，濃縮，離心，棄去沉淀，上清液經(jīng)SP-825型大孔吸附樹脂吸附12h后上柱或上柱后循環(huán)上樣4次，60％乙醇依次洗脫；
(4)將上述乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮(0.08MPa，60℃)，真空干燥(0.08MPa，70℃)，粉碎得浸膏粉末；(5)將(1)、(4)步驟得到的兩個組合進(jìn)行合并，即得到本發(fā)明的中藥組合物。
實施例2、通塞脈組合物對電凝中動脈大鼠所致缺血性中風(fēng)的治療作用1.實驗?zāi)康挠^察通塞脈組合物對電凝中動脈大鼠所致缺血性中風(fēng)的治療作用。
2.實驗材料2.1動物SD大鼠，雄性，250-300g，購自南京醫(yī)科大學(xué)動物中心。
2.2藥物藥物均密封，置陰涼干燥處保存，配制成液體后，置4℃保存。
通塞脈組合物由江蘇南中醫(yī)大藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，批號20030926，每克浸膏含生藥10.43克，人日用生藥量51.84克；通塞脈片浸膏由江蘇南中醫(yī)大藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，批號20030120，每克浸膏含生藥6.67克，人日用生藥量42.02克；陽性藥組(尼莫地平片)由山西亞寶藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)，批號030905，人日用生藥量90-360毫克；2.3藥物配制、劑量及分組通塞脈片組(1.69g浸膏量/kg·d)，通塞脈組合物高劑量組(2.66g浸膏量/kg·d)，通塞脈組合物中劑量組(1.33g浸膏量/kg·d)，通塞脈組合物低劑量組(0.44g浸膏量/kg·d)，陽性藥組(尼莫地平片)(32mg/kg·d)上述各組藥物均用蒸餾水配置成所需濃度。給藥體積為1ml/100g。
3.方法與結(jié)果3.1取體重250～300g SD雄性大鼠160只，按Tamura等的方法[1]進(jìn)行大鼠腦中動脈電凝術(shù)，各鼠以10％水合氯醛麻醉(4ml/kg，腹腔注射)，以側(cè)臥位沿右外耳道與右眼外眥連線的中點，垂直于連線切開皮膚約2cm，逐層分離肌肉，除去硬腦膜，暴露中動脈，確認(rèn)后電凝嗅束至大腦下靜脈之間的一段大腦中動脈，逐層縫合傷口，注射5000單位/ml青霉素鈉防止感染(3ml/kg，腹腔注射)，術(shù)后回籠飼養(yǎng)。觀察術(shù)后4h、8h、24h對其行為評分的影響。評分標(biāo)準(zhǔn)①提鼠尾離地面約1尺，觀察前肢情況。如兩前肢對稱地伸向地面，計為0分。如有左前肢出現(xiàn)腕屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或三者都具有，分別評為1、2、3、4分。②將動物置平滑地板上，分別推左或右)肩向?qū)?cè)移動，檢查抵抗推動的阻力。正常大鼠雙側(cè)阻力對稱。右肩向左側(cè)移動時，發(fā)現(xiàn)阻力下降者，根據(jù)下降程度的不同(輕、中、重)，評為1、2、3分；③將動物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢的肌張力。正常大鼠兩前肢肌張力對稱。發(fā)生左前肢肌張力明顯下降者，根據(jù)下降程度的輕重，評為1～3分。(4)動物無轉(zhuǎn)圈者為0分，有向一側(cè)轉(zhuǎn)圈行為的計1分，有向一側(cè)不停轉(zhuǎn)圈者計2分。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)評分，滿分12分，分?jǐn)?shù)越高，說明動物的行為障礙越嚴(yán)重，取10分以上者進(jìn)一步進(jìn)行試驗。將大鼠隨機分為7組，分別為假手術(shù)組、通塞脈片組、模型組、陽性藥組、通塞脈組合物高中低劑量組，每天給藥二次，連續(xù)七天。
3.2頸動脈取血進(jìn)行血流變學(xué)試驗和血小板聚集試驗。
取大鼠頸動脈血，置于肝素管和盛有3.8％枸櫞酸鈉的塑料試管中，進(jìn)行血流變學(xué)試驗和血小板聚集試驗。
用肝素管取全血，取1.5ml左右用毛細(xì)滴管加入紅細(xì)胞壓積管中至上部的零刻度，靜置1小時后，觀察紅細(xì)胞下降的長度(白細(xì)胞不計入)；紅細(xì)胞壓積參考文氏法，將測完血沉的紅細(xì)胞壓積管3000rpm離心30分鐘，讀取紅細(xì)胞柱的高度。
另取全血0.8mL，在血液黏度測試儀上檢測全血黏度，然后2000RPM離心10分鐘取上清所得血漿檢測血漿黏度。并用血漿在血凝測定儀上檢測凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)。
以ADP為誘導(dǎo)劑，按比濁法測定血小板聚集率。全血與抗凝劑(3.8％枸櫞酸鈉)9∶1混勻，1000rpm離心8分鐘，取得上層富血小板血漿(PRP)，余血再以3500rpm離心10分鐘，得貧血小板血漿(PPP)，取250μlPRP置于比濁管內(nèi)，37℃溫育5分鐘，隨后在PRP中加入10μl的ADP(使其終濃度為10mmol/L)，在血小板聚集儀上檢測最大聚集率。結(jié)果見表。
3.3隨即將大鼠斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干后，冷凍十分鐘，切成五片。第1刀在腦前極與視交叉連線中間；第2刀在視交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄與后葉尾極之間。然后迅速將腦片置于5ml含0.05％2，4，5-三苯基四氮唑(TTC)的PBS(10％)溶液中，37℃避光水浴溫孵10min，經(jīng)染色后，正常腦組織呈攻瑰紅色，而梗塞組織呈白色，且界限分明。梗塞指數(shù)測定取出用濾紙吸干，按順序平鋪于黑紙上，拍照，打印，按以下公式計算梗塞指數(shù)。梗塞指數(shù)＝梗塞灶紙重(g)/梗塞側(cè)腦紙重(g)，對所有數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并統(tǒng)計分析結(jié)果。
3.4病理組織切片檢查重復(fù)3.1試驗，動物處死后，取其腦組織置于10％福爾馬林內(nèi)固定，常規(guī)取材、石蠟包埋，切片厚4～5μm，HE染色，病理專業(yè)人員閱片，根據(jù)病變輕重程度，依次半定量為“+”，“++”，“+++”，“++++”，無病變正常組織標(biāo)記為“—”，又分別記分為1分，2分，3分，4分，0分，累加除血管增生、巨噬細(xì)胞增生外所有分?jǐn)?shù)，得出總分。血管增生、巨噬細(xì)胞增生為損傷修復(fù)的表現(xiàn)，故從總分中減去，根據(jù)每例修正后的總分，計算出每組每只動物的均分(X±SD)，分值越高提示損傷越嚴(yán)重，反之則說明經(jīng)藥物處理后損傷減輕，治療有效。取腦組織做病理切片后剩余部分，稱重，以pH7.OPBS緩沖液制成10％勻漿，4℃3000r/min離心30min，取上清液檢測NO、iNOS、總NOS、SOD、MDA等指標(biāo)。
表1通塞脈組合物對電凝中動脈所致缺血性中風(fēng)大鼠血液流變學(xué)的影響(X±SD)例數(shù) 全血粘度(mpa.s)組 別(只)200s-130s-15S-11S-1模型組 12 5.49±2.36 7.46±2.97 13.33±4.7831.44±10.735.38±9.24± 20.93±假手術(shù)組10 4.03±0.34*0.44**1.03**3.48**9.76±22.40±陽性藥組11 4.13±0.35*5.56±0.49*1.18**3.94**4.22± 10.02±塞脈片組11 5.71+0.50 23.40±3.34*0.470.90*通塞脈組合物低劑4.33±11 5.77±0.63 9.98±1.29*22.54±4.26*量組0.54通塞脈組合物中劑11 4.37±0.45 5.88±0.55 10.26±1.1323.34±3.33*量組通塞脈組合物高劑4.34±22.90±11 5.90±0.54 10.15±0.87量組0.53 2.34**
與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。與通塞脈片相比，#P＜0.05，##P＜0.01。下同。
表2通塞脈組合物對電凝中動脈所致缺血性中風(fēng)大鼠血液流變學(xué)的影響(X±SD)組別例數(shù) 血漿粘度(mpa·s)血沉(mm) 壓積(％)模型組121.43±0.19 0.83±0.49 41.42±5.21假手術(shù)組 101.39±0.10 1.05±0.72 37.3±3.23*陽性藥組 111.47±0.09 1.41±1.87 38.73±2.76通塞脈片111.42±0.11 0.82±0.25 38.64±2.54組低劑量組 111.40±0.06 0.95±0.72 38.27±3.50中劑量組 111.47±0.11 1.77±1.78 38.91±4.37高劑量組 111.46±0.11 1.55±1.54 39±3.32與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表3通塞脈組合物對電凝中動脈所致缺血性中風(fēng)大鼠血液流變學(xué)的影響(X±SD)組別 例數(shù)PT(s) TT(s) APTT(s)模型組 12 19.94±1.60 30.90±4.64 19.72±2.85假手術(shù)組10 22.48±6.85 35.92±8.87 21.76±13.48陽性藥組11 21.23±4.73 36.75±22.98±15.9512.56通塞脈片11 19.43±2.82 31.52±4.71 20.06±2.40組低劑量組11 17.82±1.97**30.12±3.76 18.87±2.63中劑量組11 18.53±2.07 31.92±6.53 19.26±2.90高劑量組11 23.11±12.4632.91±23.90±12.3410.22與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表4通塞脈組合物對電凝中動脈所致缺血性中風(fēng)血小板聚集試驗的影響(X±SD)血小板最大聚集率組別例數(shù) 劑量(％)模型組 12 - -47.80±2.94假手術(shù)組 10 - -43.22±5.13*陽性藥組 11 32mg/kg·d43.38±3.72*通塞脈片 11 1.69g/kg·d 46.22±6.13組低劑量組 11 0.44g/kg·d 40.66±3.93**中劑量組 11 1.33g/kg·d 38.15±3.55**高劑量組 11 2.66g/kg·d 37.56±5.39**與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
通塞脈組合物對全血粘度有較好的降低作用，對血小板聚集也有一定的抑制作用。說明其能使血瘀狀態(tài)明顯恢復(fù)，具有活血作用。對血漿粘度、血沉、壓積及凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間測定(APTT)、凝血酶原時間測定(PT)的影響不大，表5通塞脈組合物對電凝中動脈所致缺血性中風(fēng)梗塞指數(shù)的影響(X±SD)組別 例數(shù) 劑量 梗塞指數(shù)(％)模型組11 - 5.95±0.89假手術(shù)組 11 - 0陽性藥組 10 32mg/kg·d4.09±0.85**通塞脈片組10 1.69g/kg·d 4.96±1.25低劑量組 8 0.44g/kg·d 5.17±0.99中劑量組 11 1.33g/kg·d 4.37±1.13**高劑量組 9 2.66g/kg·d 4.56±1.83*與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
由表5結(jié)果顯示，通塞脈組合物高劑量和中劑量組與模型組相比，梗塞指數(shù)有顯著下降，與通塞脈片組比較無顯著性差異。說明通塞脈組合物對大鼠缺血性中風(fēng)有一定的治療作用。
表6通塞脈組合物對電凝中動脈所致缺血性中風(fēng)大鼠腦勻漿中遞質(zhì)的影響(X±SD)例NO(μ組別 MDA(nmol/mgprot) SOD(U/mgprot)數(shù)mol/gprot)模型組 9 3.05±1.90 3.09±1.28 21.16±2.52假手術(shù)組 111.15±1.14*1.63±1.11 24.81±3.60*陽性藥組 101.31±0.92*2.52±1.44 22.68±3.49*通塞脈片組 8 2.15±1.86 1.76±0.46*21.92±1.56低劑量組 8 0.59±0.33*1.85±2.12 23.25±1.55中劑量組 121.66±1.66 2.79±2.12 24.88±4.53*高劑量組 9 1.18±1.00*3.20±0.88 26.89±1.54**與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
一氧化氮(NO)作為一種新的神經(jīng)遞質(zhì)，由一氧化氮合酶(NOS)降解精氨酸產(chǎn)生，它具有極短的半衰期，通過彌散作用通透細(xì)胞膜，從胞內(nèi)迅速彌散到胞外，廣泛作用于神經(jīng)元胞體、末梢、膠質(zhì)細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等，但過量和失調(diào)的一氧化氮合成則導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血時，可引起神經(jīng)損傷，從而誘發(fā)一氧化氮合酶(NOS)合成過量的一氧化氮，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有直接的神經(jīng)毒性，為腦缺血遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要原因。從上表結(jié)果可以看出，通塞脈組合物能顯著降低大鼠腦組織中因缺血而升高的NO含量，從而減輕NO的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用，保持NO在腦網(wǎng)絡(luò)信息傳遞中發(fā)揮非傳統(tǒng)的中樞信使作用。另在需氧生物體內(nèi)，隨時都有大量的超氧離子生成。超氧離子具有較高的化學(xué)活性，對生物細(xì)胞具有一定的毒性。它可與過氧化氫反應(yīng)，生成毒性更強的羥基自由基(·OH)。超氧離子與羥基自由基進(jìn)攻生物膜，可改變膜的結(jié)構(gòu)和通透性；進(jìn)攻染色體，可使染色體降解、斷裂。它們還可攻擊許多細(xì)胞內(nèi)成分，使其失去生物活性和功能。氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid PUFA)引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物如醛基(MDA)、酮基、羥基以及新的氧自由基等。所以，如果生物體內(nèi)或某一組織中超氧離子含量異常高，就會引起疾病，甚至死亡。SOD是催化超氧陰離子(O2-)歧化反應(yīng)的酶類。它的存在與生物體內(nèi)的解毒作用有關(guān)，SOD活力的高低間接反應(yīng)了機體清除自由基的能力，而MDA的高低又間接反應(yīng)了機體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。從上表結(jié)果可以看出，通塞脈組合物能明顯，增加超氧化物歧化酶(SOD)活力，降低丙二醛(MDA)含量，對大鼠缺血性中風(fēng)具有明顯的治療作用。
表7通塞脈組合物對電凝中動脈所致缺血性中風(fēng)大鼠腦勻漿中遞質(zhì)的影響(X±SD)例 總組別INOS(U/mgprot)cNOS(U/mgprot)數(shù) NOS(U/mgprot)模型組11 1.50±0.21 1.29±0.340.21±0.32假手術(shù)11 0.94± 0.63±0.13**0.31±0.20組 0.23**陽性藥91.06±0.57 0.58±0.19**0.48±0.45組通塞脈11 0.92±0.58**0.48±0.16**0.44±0.52片組低劑量91.05±0.57 0.66±0.21**0.39±0.45組中劑量10 1.17±0.83 0.67±0.12**0.48±0.84組高劑量11 1.33±0.66*0.53±0.21**0.72±0.65**組與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
NOS有兩種形式結(jié)構(gòu)型NOS(constructive NOS，cNOS)和誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS，iNOS)。cNOS是NOS的生理存在形式，合成NO時間短、量少；iNOS在生理條件下水平很低，腦缺血狀態(tài)下局部炎癥細(xì)胞受各種因素刺激，iNOS大量表達(dá)、激活，可長時間大量釋放NO，故成為腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞遲發(fā)性損傷的重要原因。在缺血區(qū)域的血管和浸潤的中性粒細(xì)胞有誘生型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，另外膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在腦缺血時也產(chǎn)生iNOS，由iNOS產(chǎn)生的NO及其副產(chǎn)物過氧化氮可以通過破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。另外神經(jīng)元NOS(nNOS)產(chǎn)生的神經(jīng)元NO可以促使谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒，從而引起神經(jīng)細(xì)胞死亡。相比之下，內(nèi)皮細(xì)胞NOS(eNOS)產(chǎn)生的NO對腦缺血有保護作用。實驗發(fā)現(xiàn)，通塞脈組合物能上調(diào)鼠腦eNOS活性，下調(diào)iNOS和總NOS，改善神經(jīng)功能，提示本藥物可能通過保護腦血管病內(nèi)皮，減輕腦缺血損害。
表8通塞脈組合物對缺血性中風(fēng)大鼠大腦的影響組別大腦數(shù)(n) 大腦受損傷的程度分值模型組 8 3.38±1.77假手術(shù)組 8 0.63±0.52陽性藥組 8 2.38±1.06通塞脈片組 8 2.50±1.38低劑量組 8 2.63±1.19中劑量組 8 2.50±1.07高劑量組 8 1.63±1.06病理組織學(xué)觀察，模型組大鼠腦組織有不同程度壞死，壞死處膠質(zhì)細(xì)胞有不同程度的增生，并見巨噬細(xì)胞增生、膠質(zhì)小結(jié)形成，膠質(zhì)細(xì)胞及間質(zhì)水腫。陽性藥及通塞脈組合物在不同程度上減輕腦組織損傷，其效果按遞減次序依次為大劑量組，陽性藥組，中劑量組，原劑型組、小劑量組。假手術(shù)組切片組織病理學(xué)改變不明顯，模型組腦組織損傷程度最嚴(yán)重，說明通塞脈組合物對腦組織有保護作用。
4.結(jié)論從以上結(jié)果表明，通塞脈組合物對大鼠缺血性中風(fēng)具有明顯的治療作用，能明顯減少梗塞面積，增加超氧化物歧化酶(SOD)活力，降低丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量，升高內(nèi)皮型一氧化氮合酶(NOS)含量，降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS)含量。
病理組織學(xué)觀察說明通塞脈組合物對腦組織有保護作用。
實施例3、通塞脈組合物對大腦中動脈栓塞模型大鼠的保護作用1.實驗材料1.1藥物及試劑同實施例2。
1.2實驗動物清潔級雄性SD大鼠，體重240g～310g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。
2.統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)表示成X±SD，計量資料用Student T檢驗比較統(tǒng)計學(xué)差異，行為分級組間比較用等級序值法(Ridit法)。
3.試驗方法3.1實驗方案采用頸內(nèi)動脈栓線法制備該模型。采用Longa的方法加以改進(jìn)，大鼠灌胃給藥，連續(xù)5天，第五天給藥后1h以10％水合氯醛麻醉(350mg/kg，ip)，仰位固定與手術(shù)臺上，頸部正中切口，切開皮膚后，鈍性分分離，找出頸總動脈(CCA)，繼續(xù)向下分離并結(jié)扎頸外動脈(ECA)及頸外動脈各分支(枕動脈、甲狀腺上動脈、舌動脈和面動脈)，輕輕剝離迷走神經(jīng)，分離出頸內(nèi)動脈(ICA)和翼腭動脈，ECA近心端備線，用動脈夾夾閉ICA和CCA，在ECA距ICA2mm處剪一小口，將一尼龍線(直徑0.24mm，頭端經(jīng)明火處理，使其熔成光滑的球狀)插入ECA并進(jìn)入CCA，輕扎備線，防止出血，剪斷ECA，松開ICA的動脈夾，牽引ECA，使其和ICA約成一直線，輕輕回抽尼龍線，使其順入ICA，繼續(xù)向下推進(jìn)(注意避免尼龍線進(jìn)入翼腭動脈，直至有輕微阻力。此時可見ICA伸展，尼龍線插入深度約為18mm，表明尼龍線已經(jīng)穿過大腦中動脈(MCA)起始段，到達(dá)大腦前動脈(ACA)近端，阻斷了MCA的所有血供來源，包括來自ICA和ACA及大腦后動脈的血液供應(yīng)。松開CCA動脈夾，扎緊備線，外留1cm長線頭，縫合皮膚，回籠飼養(yǎng)。
缺血3h后再灌注，再灌注時輕拉尼龍線，使尼龍線拔出顱外，血流再通，修剪尼龍線，縫合皮膚，回籠自然喂養(yǎng)。以上過程均在室溫恒定(24～25℃)情況下進(jìn)行，以利于評價腦缺血情況。觀察對大鼠局灶性腦缺血行為評分和腦梗塞面積的影響。以上過程均在室溫恒定(24～25℃)情況下進(jìn)行，以利于評價腦缺血情況。觀察對大鼠局灶性腦缺血行為評分和腦梗塞面積的影響。
3.2大鼠實驗性腦缺血行為評分法參考Bederson等的方法對術(shù)后動物的行為缺陷進(jìn)行分級評分，分級標(biāo)準(zhǔn)如下動物癥狀 等級提尾懸空時，動物的兩前肢均伸向地板方向且無其他行缺陷0級提尾懸空時，動物的手術(shù)對側(cè)前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲、肩內(nèi)旋、 1級肘外展、緊貼胸壁將動物置于光滑平面上，推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動時阻力降低2級動物自由行走時，向手術(shù)對側(cè)環(huán)轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)圈 3級等級分?jǐn)?shù)越高，表明動物的行為缺陷越嚴(yán)重。
3.3 TTC染色測量腦梗塞面積TTC染色測量腦梗塞面積[3]MCAO后24小時斷頭取腦，將腦置冰冷的生理鹽水中(2～3℃)10min，去除嗅球、小腦和低位腦干后，用生理鹽水沖洗大腦使表面不留血污，吸干周圍水分后，沿冠狀切四刀，切成五片。第一刀在腦前極與視交叉連線中間；第二刀在視交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。然后迅速將腦片置5ml含有1％TTC的磷酸緩沖溶液中，避光溫孵30分鐘，其中每隔7～8分鐘翻動一次，經(jīng)染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗塞組織呈白色，且界限分明。溫孵完畢后將腦片照相，剪下紅白顏色區(qū)稱重計算之。然后根據(jù)重量求面積法，分別計算出五個腦片共10個平面的總面積和梗塞區(qū)域的面積，求出梗塞區(qū)面積占半球總面積的百分比，即梗塞率。
3.4腦含水量的測定動物處死后，取出大腦稱濕重后將腦組織置于115℃電熱干燥箱中烘至恒重，稱干重，按下列公式計算腦含水量含水量(％)＝(濕重-干重)/濕重×100％
腦指數(shù)＝(腦濕重/體重)×1003.5血漿6-KPGF1α、TXB2、ET含量測定頸動脈放血，消炎痛-EDTA.Na抗凝，同時加入適量抑肽酶，3000轉(zhuǎn)/min離心分離血漿，置-20℃保存。測試時用解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供的試劑盒(生產(chǎn)日期為2004年4月23日，測試日期為04年5月9日)，由南京市第一醫(yī)院放免測試中心進(jìn)行檢測，儀器為芬蘭產(chǎn)Wizard 1470γ計數(shù)儀。
3.6動物分組及給藥大鼠隨機分為7組，即假手術(shù)組，尼莫地平組，模型組通塞脈高、中、低劑量和通塞脈片組。每組10只，灌胃給藥，連續(xù)5天，第5天進(jìn)行手術(shù)，術(shù)后30min再給藥一次。
3.7組織病理切片重復(fù)3.1試驗，動物處死后，取其腦組織置于10％福爾馬林內(nèi)固定，常規(guī)取材、石蠟包埋，切片厚4～5μm，HE染色，病理專業(yè)人員閱片，根據(jù)病變輕重程度，依次半定量為“+”，“++”，“+++”，“++++”，無病變正常組織標(biāo)記為“—”，又分別記分為1分，2分，3分，4分，0分，累加所有分?jǐn)?shù)，得出總分，計算出每組每只動物的均分(X±SD)，分值越高提示損傷越嚴(yán)重，反之則說明經(jīng)藥物處理后損傷減輕，治療有效。
4.結(jié)果4.1行為學(xué)評分4h和24h時，所有試驗動物均出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能障礙。4h時，各給藥組動物的行為學(xué)得分與模型組比較差異無顯著性(P＜0.05＝；在24h后，通塞脈組合物各劑量組動物的行為學(xué)評分均呈下降趨勢，且顯著低于模型組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01＝，見表9。提示通塞脈組合物可以改善模型動物的行為學(xué)障礙。
表9通塞脈組合物對對局灶性腦缺血再灌注大鼠的行為學(xué)評分的影響劑量 行為學(xué)評分組別 例數(shù)(g/1000g)4h 24h模型 10 - 2.6±0.522.5±0.53假手術(shù) 10 - 0 0尼莫地平102×10-32.6±0.521.8±0.79*通塞脈片10 2 2.6±0.521.9±0.88通塞脈組合物低 10 2 2.6±0.521.8±0.79*通塞脈組合物中 10 1 2.6±0.521.7±0.82*通塞脈組合物高 10 0.52.5±0.531.4±0.52**
注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
4.2對腦梗塞面積和梗塞率的影響各給藥組大鼠的腦梗塞面積和梗塞率均明顯低于模型組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，差異有顯著性(P＜0.05～P＜0.01＝，見表10。提示通塞脈組合物可以明顯縮小模型大鼠的腦梗塞面積，降低梗塞率。
4.3對腦含水量和腦指數(shù)的影響模型大鼠腦指數(shù)和含水量均明顯高于假手術(shù)組，通塞脈組合物高劑量可降低模型大鼠的腦指數(shù)，高、中劑量均可降低模型動物的腦含水量，與模型組比較，差異均有顯著性(P＜0.05 P＜0.01)，見表3。提示通塞脈組合物可以降低缺血腦組織的含水量，減輕腦水腫。
表10.對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗塞面積及梗塞率的影響(X±SD)劑量 梗塞面積 抑制率組別 例數(shù) 梗塞率(％)(g/kg) (cm2)(％)模型 10- 3.08±1.41 26.38±11.36假手術(shù) 10- 0 0尼莫地平 10 2×10-31.35± 1.52*11.87±13.08*55.00通塞脈片 102 1.36±1.61*12.03±14.33*54.38通塞脈組合物 102 1.43±1.54*12.10±12.51*54.15低通塞脈組合物 101 1.31±1.35*11.81±12.20*55.24中通塞脈組合物 100.5 0.47±0.53**4.44±4.54**83.16高注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
表11.對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦指數(shù)及腦含水量的影響(X±SD)組別 例數(shù) 劑量(g/kg) 腦指數(shù) 含水量(％)模型 10 - 0.530±0.01180.46±1.19假手術(shù) 10 - 0.470±0.037**78.38±0.90*尼莫地平 102×10-30.496±0.029*79.04±1.45*通塞脈片 10 2 0.501±0.05179.21±1.40通塞脈組合物 10 0.50.508±0.04479.28±1.63低通塞脈組合物 10 1 0.522±0.02979.16±1.52*中通塞脈組合物 10 2 0.486±0.045*79.08±1.21*高注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
4.4對血漿6-K-PGF1α、TXB2、ET含量的影響局灶性腦缺血再灌注模型大鼠血漿中TXB2、ET含量明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P＜0.05＝；除尼莫地平外，各給藥組血漿TXB2、ET含量均有下降的趨勢，其中中、高劑組可降低血漿中TXB2的含量，中劑量和原劑型組可降低血漿中ET的含量，與模型組比較差異均有顯著性(P＜0.05＝，見表12。
表12對局灶性腦缺血再灌注大鼠血漿6-K-PGF1α、TXB2、ET含量的影響(X±S)例 劑量組別 6-K-PGF1α、TXB2、 ET數(shù) (g/kg)模型10- 800.38±462.47 821.58±453.83 46.25±11.43317.29±假手術(shù) 10- 611.59±416.13 33.19±12.73*260.24**尼莫地平 10 2×10-3668.84±393.36 749.62±698.24 44.02±16.22通塞脈102 1008.88±369.61 716.74±450.90 34.09±13.09*片通塞脈低 10 0.5 780.03±426.85 484.79±531.58 35.80±18.48通塞脈中 101 900.48±411.69 362.64±220.31*28.99±15.95*通塞脈高 102 660.06±333.02 370.52±315.76*35.64±17.76PGI1、TXA2對血小板及血管功能的調(diào)節(jié)具有重要的意義，TXA2主要在血小板微粒體內(nèi)合成，具有很強的血管收縮及促進(jìn)血小板聚集作用。PGI1由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，可舒張血管，抑制血小板聚集。正常情況下，兩者保持動態(tài)平衡對維持血管的正常功能、調(diào)節(jié)血流量具有重要的意義，病理狀態(tài)下兩者平衡失調(diào)是造成血小板聚集、血栓形成及血管痙攣的重要原因。TXA2生物半衰期約30秒，迅速代謝成無活性的TXB2；PGI1生物半衰期約3分鐘，代謝成6-K-PGF1α。由于PGI1和TXA2性質(zhì)不穩(wěn)定，難以直接測定，故國內(nèi)外均測定6-K-PGF1α和TXB2作為判斷PGI1和TXA2濃度的指標(biāo)。ET是廣泛分布于心血管系統(tǒng)的一種調(diào)節(jié)肽和生長因子，是目前已知引起血管收縮的最強及最持久的體液因子，由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，參與血流的調(diào)節(jié)。臨床及實驗研究表明，腦缺血時ET分泌增加。本實驗顯示各給藥組血漿TXB2、ET含量均有下降的趨勢，其中中、高劑組可降低血漿中TXB2的含量，中劑量和原劑型組可降低血漿中ET的含量，與模型組比較差異均有顯著性。
表13通塞脈組合物對缺血性中風(fēng)大鼠大腦的影響組別 大腦數(shù)(n)大腦受損傷的程度分值模型組 6 5.8±0.4假手術(shù)組 6 0.4±0.54陽性藥組 5 2.6±1.82通塞脈片組 5 3.8±2.17低劑量組 6 3.17±2.04中劑量組 5 2.2±1.64高劑量組 6 2.33±2.9病理組織學(xué)觀察，線栓法缺血性中風(fēng)大鼠模型，表現(xiàn)為腦組織不同程度壞死，膠質(zhì)細(xì)胞及間質(zhì)水腫。陽性藥及通塞脈組合物對腦中風(fēng)模型在不同程度上有減輕腦組織損傷作用，其效果按遞減次序依次為通塞脈組合物大劑量組，中劑量組，陽性藥組，小劑量組。假手術(shù)組組織病理學(xué)改變不明顯，原劑型組腦組織損傷程度比模型組輕，但較其他組別為重。
5.結(jié)論從以上結(jié)果表明，通塞脈組合物可以改善模型動物的行為學(xué)障礙，可以明顯縮小模型大鼠的腦梗塞面積，降低梗塞率；降低缺血腦組織的含水量，減輕腦水腫。各給藥組血漿TXB2、ET含量均有下降的趨勢，其中中、高劑組可降低血漿中TXB2的含量，中劑量和原劑型組可降低血漿中ET的含量，與模型組比較差異均有顯著性。病理組織學(xué)觀察，線栓法缺血性中風(fēng)大鼠模型，表現(xiàn)為腦組織不同程度壞死，膠質(zhì)細(xì)胞及間質(zhì)水腫。陽性藥及通塞脈組合物對腦中風(fēng)模型在不同程度上有減輕腦組織損傷作用，其效果按遞減次序依次為通塞脈組合物大劑量組，中劑量組，陽性藥組，小劑量組。假手術(shù)組組織病理學(xué)改變不明顯，原劑型組腦組織損傷程度比模型組輕，但較其他組別為重。
實施例4、通塞脈組合物浸膏對大鼠體內(nèi)血栓的影響[實驗?zāi)康腯結(jié)扎下腔靜脈后，造成血管壁損傷，血流阻斷，形成下腔靜脈血栓，觀察通塞脈組合物浸膏對血栓長度、重量的影響。
1.動物健康SD大鼠，300g左右，雌雄各半，購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。生產(chǎn)許可證號(SCXK)2002-0031。
2.藥物通塞脈組合物浸膏，南京中醫(yī)藥大學(xué)新藥及海洋藥物研究中心制劑研究室提供，臨床人用量51.84g/日，每克浸膏相當(dāng)于生藥量7.92g。南中醫(yī)大藥業(yè)股份有限公司提供。
通塞脈原劑型，臨床人用量6.3g浸膏/日，每克浸膏相當(dāng)于生藥量6.67g。南中醫(yī)大藥業(yè)股份有限公司提供。
戊巴比妥鈉中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司進(jìn)分，批號F20020405。
3.器材手術(shù)器械若干套。
取健康SD大鼠72只，隨機分成6組，每組12只。模型組(等量蒸餾水)，陽性藥組(尼莫地平g/kg·d)，通塞脈組合物浸膏大、中、小三個劑量組(2.679g/kg·d、1.3395g/kg·d、0.4465g/kg·d)。
給藥方式為灌胃給藥，每日一次，共給藥10天。末次給藥前一天禁食。末次給藥后1小時，大鼠以戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定后腹部消毒，從腹中線打開腹腔，暴露并分離下腔靜脈，在左腎靜脈下方水平處結(jié)扎，并縫合腹腔。結(jié)扎2小時后，重新打開腹腔，在結(jié)扎下方2cm處用止血鉗夾住下腔靜脈，取出此段血管，迅速縱行剖開官腔，在濾紙上取出血栓，蘸干多余血跡，稱量濕重。然后放入37℃烘箱干燥24小時。稱量干重。
獲得的數(shù)據(jù)采用EXCEL軟件進(jìn)行F檢驗和T檢驗。
通塞脈組合物浸膏對結(jié)扎損傷管壁造成的下腔靜脈血栓形成有一定的抑制作用，見表14。
表14.通塞脈組合物浸膏對大鼠下腔靜脈血栓的影響(X±SD)組別 劑量(g/kg.d)例數(shù) 血栓長度(mm) 血栓濕重(mg) 血栓干重(mg)模型組-11 10.89±3.9734.45±13.73 9.55±2.54陽性藥 0.032 12 6.12±4.61*14.58±13.03**4.67±4.66**原劑型 11 8.60±2.84 24.18±8.33*7.36±2.25*小劑量 27.77 12 8.56±3.50 19.33±11.22**6.58±3.94*中劑量 13.89 11 7.27±2.62*19.27±7.50**6.73±2.69*大劑量 4.63 12 7.12±3.74*17.08±7.13**#6.00±3.36**與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。與原劑型相比，#P＜0.05。
通塞脈組合物浸膏對結(jié)扎損傷管壁造成的下腔靜脈血栓形成有一定的抑制作用。
實施例5、通塞脈組合物對膠原蛋白-腎上腺素誘發(fā)的小鼠體內(nèi)血栓形成的影響[實驗?zāi)康腯膠原蛋白和腎上腺素都是血小板聚集誘導(dǎo)劑，小鼠靜脈注射等誘發(fā)體內(nèi)肺拴塞，血栓形成，導(dǎo)致偏癱和死亡，觀察通塞脈組合物浸膏對其影響。
1.動物ICR小鼠，18-22g，雌雄各半，購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。生產(chǎn)許可證號(SCXK)2002-0031。
2.藥物和試劑通塞脈組合物，南京中醫(yī)藥大學(xué)新藥及海洋藥物研究中心制劑研究室提供，臨床人用量51.84g生藥/日，每克浸膏相當(dāng)于生藥量10.43g。
通塞脈原劑型，臨床人用量6.3g浸膏/日，每克浸膏相當(dāng)于生藥量6.67g。南中醫(yī)大藥業(yè)股份有限公司提供。批號阿斯匹林，湖南制藥廠，批號990402。
腎上腺素注射液，1mg/ml，天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，批號0306031。
II型膠原蛋白，Sigma公司生產(chǎn)，北京邦定泰克生物技術(shù)公司分裝。
3.器材小鼠固定器，1ml注射器。

取小鼠144只，隨機分為6組，每組24只，雌雄各半模型組(蒸餾水10ml/kg·d)，通塞脈原劑型組(16.39g生藥/kg·d)，陽性藥組(阿斯匹林50mg/kg·d)，通塞脈組合物大、中、小三個劑量組(40.08、20.04、6.68g生藥/kg·d)。連續(xù)灌胃7天，灌胃體積為10ml/kg。末次給藥后1h，尾靜脈注射腎上腺素-膠原蛋白混和液0.1ml/10g體重。觀察小鼠5分鐘內(nèi)死亡率。結(jié)果采用卡方檢驗，比較組間差異。
附膠原蛋白-腎上腺素混合誘導(dǎo)劑的配制稱取膠原蛋白30mg，浸泡于3-4ml生理鹽水中2小時以上，勻漿，加生理鹽水40ml，3000rpm離心10分鐘，取上清，另加入腎上腺素1ml，加入生理鹽水至50ml即成。
通塞脈組合物浸膏對結(jié)扎損傷管壁造成的下腔靜脈血栓的抑制作用，見表15；表15通塞脈對膠原蛋白-腎上腺素所致小鼠體內(nèi)血栓的影響(X±SD)組別 劑量(g/kg.d)例數(shù) 5’內(nèi)小鼠死亡數(shù) 5’內(nèi)小鼠死亡率(％)模型組 - 24 16 66.67陽性藥0.05 21 2 9.52**原劑型16.3922 7 39.13*大劑量40.0823 11 47.83中劑量20.0423 7 30.43**小劑量6.68 21 11 47.62與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
通塞脈組合物對膠原蛋白-腎上腺素所引起的小鼠體內(nèi)血小板聚集有抑制作用，從而抑制其體內(nèi)血栓的形成。
權(quán)利要求
1.一種治療缺血性腦中風(fēng)的中藥組合物的制備方法，以黃芪10～20g、當(dāng)歸10～18g、玄參8～10g、金銀花8～15g、石斛8～15g、甘草6～10g為原料，其制備步驟如下(1)取當(dāng)歸10～18g進(jìn)行二氧化碳超臨界流體萃取，收集萃取物；(2)當(dāng)歸二氧化碳萃取后的藥渣與黃芪10～20g、玄參8～10g、金銀花8～10g、石斛8～15g、甘草6～10g合并，進(jìn)行乙醇提取，得到乙醇提取液；(3)用上述乙醇提取液減壓回收乙醇后的藥液、濃縮離心、水洗沉淀、洗液與濾液合并，棄去沉淀，上清液經(jīng)大孔吸附樹脂吸附后，用乙醇洗脫得到乙醇洗脫液；(4)將乙醇洗脫液減壓回收乙醇，濃縮，干燥后粉碎得干浸膏粉末；(5)將上述步驟(1)、(4)得到的組分合并，即得到本發(fā)明的中藥組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于步驟(2)中先用70％乙醇回流提取2次，后用50％乙醇回流提取1次，第1次8倍量，第2、3次6倍量，每次提取1h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于步驟(3)中清液經(jīng)SP-825型大孔吸附樹脂吸附12h后上柱或上柱后循環(huán)上樣4次，用60％乙醇依次洗脫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于步驟(4)中的干燥方法為噴霧干燥或真空干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的中藥組合物可制成片劑、顆粒劑、微丸、膠囊劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療缺血性腦中風(fēng)的中藥組合物的制備方法，其步驟為(1)取當(dāng)歸二氧化碳超臨界流水萃取物；(2)把當(dāng)歸藥渣與黃芪、玄參、金銀花、石斛、甘草合并進(jìn)行乙醇提取得醇提液；(3)將醇提液減壓回收乙醇、濃縮、離心、水洗沉淀，棄去沉淀，上清液經(jīng)大孔吸附樹脂吸附后上柱或循環(huán)上樣，用乙醇洗脫得洗脫液；(4)將洗脫液減壓回收乙醇、濃縮、干燥后粉碎成干浸膏粉末；(5)再將(1)、(4)兩個組分合并，即得中藥組合物。該制法的優(yōu)點是克服了原工藝水提醇沉難以保留當(dāng)歸揮發(fā)性成分的缺陷；采用大孔樹脂分離較好地富集了主要活性成分，提高了療效，減少了服用量，中間提取物的溶解性好，吸濕性小，便于制劑。
文檔編號A61K9/48GK1615994SQ20041006478
公開日2005年5月18日 申請日期2004年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月28日
發(fā)明者蔡寶昌, 狄留慶, 陳滌平, 陸茵, 吳皓, 李偉, 李偉東, 李吉峰 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)