專利名稱：注射用淫羊藿總黃酮的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為淫羊藿總黃酮的制備方法，尤其是注射用淫羊藿總黃酮的制備方法。
背景技術(shù)：
淫羊藿為小檗科(Berberidaceace)淫羊藿屬(Epimedium)植物，全世界約有四十余種。中國有二十三個(gè)種和四個(gè)變種。中華人民共和國2000年版藥典一部收載了淫羊藿(Epimedium brevicormum Maxim.)、箭葉淫羊藿(Epimedium sagittatum Maxim.)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanense T.S.)、朝鮮淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)五種淫羊藿，其地上部分作為藥用部位。具有補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕之功效。用于陽痿遺精，筋骨痿軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣；更年期高血壓等癥(見藥典[功能與主治])。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿具有多方面的生理活性，其對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和蛋白質(zhì)合成及核酸代謝的作用最為顯著，尤其是淫羊藿總黃酮及其有效成分淫羊藿苷的心血管方面活性，近年來得到了醫(yī)藥學(xué)的肯定和重視。劉崇銘等[劉崇銘等.淫羊藿甙對(duì)心臟的影響.中草藥，1982，11(9)30～32]的研究證明，淫羊藿苷及淫羊藿煎劑均可抑制心肌收縮力，從而降低心肌耗氧量；淫羊藿制劑能擴(kuò)張外周血管，改善微循環(huán)，增大血流量。此外，其降壓作用也與外周阻力下降有關(guān)。浙醫(yī)大生理研究室用淫羊藿提取物(乙醇粗提物)對(duì)離體兔心冠脈流量進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)小劑量(0.2g/kg)能增加冠脈流量，劑量增大作用反而減弱。汪芳裕等[汪芳裕，等.淫羊藿總黃酮的藥理作用.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1986，7(2)164～166]的研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮可提高大鼠耐缺氧能力，減慢大鼠心率，并能對(duì)抗異丙腎上腺素加快心率的作用。淫羊藿總黃酮可抑制家兔體外血栓形成，可降低全血粘度和抑制紅細(xì)胞的聚集[高其銘.西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).1992，13(3)223～226]。王敏等用麻醉家兔和狗以電磁流量計(jì)測(cè)定了淫羊藿苷對(duì)腦血流作用，結(jié)果表明動(dòng)脈和靜脈給予淫羊藿苷均能顯著增加腦血流量，降低腦血管阻力，其作用與罌粟堿相似，作用強(qiáng)度弱于罌粟堿，但作用時(shí)間較長[王敏等.淫羊藿甙擴(kuò)張腦血管作用的研究.沈陽藥學(xué)院學(xué)報(bào).1991，8(4)273～276]。
天然藥物化學(xué)和現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明淫羊藿有效成分主要為淫羊藿總黃酮苷。自1935年日本的赤井左一郎等從箭葉淫羊藿的葉中分離得到淫羊藿苷以來，已經(jīng)從淫羊藿中分離得到一百多種黃酮類化合物。劉寶慶、徐綏緒[劉寶慶，馬洪升，牟平.淫羊藿甙的分離與鑒定.中草藥，1980，11(5)201；徐綏緒，王志學(xué)，吳立軍，王乃利，陳英杰.淫羊藿甙及Epimedoside A的分離與鑒定.中草藥，1982，13(5)9～11]等較早的從朝鮮淫羊藿地上部分分離得到淫羊藿苷、淫羊藿次苷A、去氧甲基淫羊藿苷等。次后，又有人從朝鮮淫羊藿中分離得到近30個(gè)黃酮類化合物，其中包括朝藿苷甲、乙，朝藿苷A、B、C，朝藿定A、B、C，淫羊藿次苷C，寶藿苷I、II，箭葉淫羊藿苷A、B、C，淫羊藿素等[徐美珍，程志銘.淫羊藿屬植物的化學(xué)研究進(jìn)展.中國中藥雜志，1997，22(10)631～632]。孫朋悅等從朝鮮淫羊藿中分離得到了三個(gè)雙黃酮類化合物，分別是銀杏雙黃酮(Ginkgetin)，異銀杏雙黃酮(Isoginkgetin)和7-去甲銀杏雙黃酮(Biobetin)[Pengyue Sun，Yingjie Chen，Noriko Shimizu，Tadahiro Takeda.Studies on the constituents of Epimedium koreanurnIII.Chemical Pharmaceutical Bulletin，1998，46(2)355～358]。淫羊藿中除含黃酮類化合物外，還含有木脂素類、酚苷類、紫羅酮類、倍半萜類、苯乙醇苷類[徐美珍，程志銘.淫羊藿屬植物的化學(xué)研究進(jìn)展.中國中藥雜志，1997，22(10)631～632；林新，李文魁，肖培根.淫羊藿的研究新進(jìn)展.中國藥學(xué)雜志，1997，32(8)449～552；李文魁，張如意，肖培根.淫羊藿屬藥用植物研究進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)-植物藥分冊(cè)，1993，8(4)147～154；劉信順，楊濱.淫羊藿屬植物的化學(xué)成分.中草藥，1990，21(9)36～39]，以及大量多糖、葉綠素等化合物。
淫羊藿所含黃酮類化合物可以分為六大類8-異戊烯基取代的黃酮化合物、8-類異戊烯基取代的黃酮化合物、雙類異戊烯基取代的黃酮化合物、其它位置的異戊烯基取代的黃酮化合物、雙黃酮化合物和無異戊烯基取代的黃酮化合物。8-異戊烯基取代的黃酮苷類化合物是其主要藥理活性成分之一。淫羊藿屬植物所含的黃酮類化合物雖有相同的母核，但已發(fā)現(xiàn)各化學(xué)成分在種之間的分布和含量有很大差異，而不同植物所含化合物的差異往往導(dǎo)致某種藥效的差異。譬如寶藿苷-I有較好的抗腫瘤和免疫活性，而其它單體卻效果不顯。事實(shí)上，僅以淫羊藿苷作為淫羊藿屬植物唯一質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)顯然是不夠全面。
有關(guān)淫羊藿總黃酮制備方法的文獻(xiàn)很多，常見的方法有醇沉、萃取、過濾等，然而眾多文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果常有矛盾之處。陜西中醫(yī)學(xué)院王昌利等用正交實(shí)驗(yàn)法將箭葉淫羊藿的總黃酮水提取與醇提取工藝進(jìn)行比較，認(rèn)為最佳工藝是水提取(《中成藥》1996，18(5)1-3)。中國中醫(yī)研究院中藥研究所趙小妹等認(rèn)為淫羊藿水提醇沉法所得淫羊藿苷含量最高(《中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志》2000，6(6)3-5)。而四川省中藥研究所黎萬壽等認(rèn)為巫山淫羊藿中淫羊藿甙的最佳工藝是“15倍量70％乙醇溶液回流提取1h/次，共2次”(《時(shí)珍國醫(yī)國藥》2000，11(11)971)。申慶亮的正交研究結(jié)果表明箭葉淫羊藿用“乙醇回流為最佳提取方法，水提醇沉法濃縮時(shí)間過長，引起甙類成分水解”(《中成藥》2001，23(5)377)。王成軍等研究認(rèn)為提取箭葉淫羊藿中淫羊藿總黃酮最佳工藝為“80％乙醇，25倍量，回流提取1h“(《基層中藥雜志》2002，16(5)33)。蘭州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系馬慧萍等研究認(rèn)為“最佳提取工藝為10倍量70％乙醇提取3次，每次1.5h；分離工藝中酸堿沉淀法較理想；甲醇純化后總黃酮含量高達(dá)58.61％”(《華西藥學(xué)雜志》2002，17(1)1-3)。陜西韓澤民等研究認(rèn)為淫羊藿“乙醇提取效果與水提效果沒有明顯差異”，“用DM130大孔樹脂吸附，60％乙醇洗脫，乙酸乙酯溶解后，用60％乙醇反復(fù)結(jié)晶”(《中草藥》2002，33(10)906-907)。總之，雖然有關(guān)淫羊藿總黃酮制備方法的文獻(xiàn)很多，但是研究結(jié)果常有矛盾之處，這可能與藥材品種以及提取純化的目的不同有關(guān)。由于各篇文獻(xiàn)未報(bào)道總黃酮具體組成成份，更沒有將制劑與療效相結(jié)合進(jìn)行研究，所以很難評(píng)定眾多研究的優(yōu)劣，更難以選擇參考的對(duì)象，因而使后來的研究者產(chǎn)生許多疑慮。再者，現(xiàn)有工藝中也未有符合注射用淫羊藿總黃酮的制備方法，多將淫羊藿黃酮制成口服制劑，作為治療抗骨質(zhì)疏松藥物。
目前的制備工藝所用溶劑種類較多，不利于工業(yè)化實(shí)施；所得提取物，因在產(chǎn)品純度、性狀尤其是療效方面都不符合藥典注射用藥標(biāo)準(zhǔn)，所以嚴(yán)重影響了淫羊藿總黃酮注射液的開發(fā)和在心血管疾病治療方面的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是研究可工業(yè)化實(shí)施的注射用淫羊藿總黃酮制備方法。探討如何通過對(duì)若干常規(guī)提取分離步驟的逐一改進(jìn)以及組合方式的改進(jìn)，設(shè)計(jì)具有協(xié)同作用的提取分離系統(tǒng)，僅使用乙醇這一種有機(jī)溶劑來提取分離純化淫羊藿總黃酮，使原料在純度、性狀和療效方面均符合藥典規(guī)定的注射用標(biāo)準(zhǔn)。
為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案。
一種注射用淫羊藿總黃酮苷的制備方法，包括如下步驟取淫羊藿藥材用50-70％乙醇提取2次，每次1～2小時(shí)；合并醇提液，濃縮至80℃測(cè)定密度約為1.1～1.2mg/ml的浸膏A；向浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到80％～85％，靜置分層后，留取上清液，回收上清液中的乙醇至80℃測(cè)定密度為1.05～1.15mg/ml浸膏B；向浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到20％～30％，靜置分層，留取上清液，回收上清液中的乙醇至無醇味，得水液C；取水液C上大孔樹脂柱，先用水洗滌，再用水和乙醇混合溶液梯度洗脫；留取70％乙醇洗脫液，濃縮，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿總黃酮苷粗品。
所述制備方法中取淫羊藿總黃酮苷粗品，加入95％乙醇，超聲或者回流后，過濾，收集濾液，回收乙醇，濃縮成浸膏，70℃真空干燥后粉碎，得注射用淫羊藿總黃酮苷。
所述制備方法中取朝鮮淫羊藿用60-70％乙醇加熱提取；向稠浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到80％～82％，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液含醇量達(dá)80～82％，靜置分層，將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。
所述制備方法中向稠浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到25％～30％，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到25％～30％，靜置分層，留取上清液；將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
所用大孔樹脂柱型號(hào)為D101或DM-301型樹脂，按浸膏A計(jì)算樹脂重量，浸膏A和樹脂的重量比為1∶5～1∶10，先用水洗滌，后用30％乙醇洗脫；再用70％乙醇洗脫；留取70％乙醇洗脫液?？梢詫⒁蜣娇傸S酮苷粗品，加95％乙醇，超聲20min或熱回流促溶，0～4℃冷藏后過濾，收集乙醇濾液；沉淀反復(fù)加95％乙醇2-4次，每次均用超聲或熱回流促溶、冷藏、過濾，收集乙醇濾液；合并乙醇濾液，回收乙醇，濃縮成稠浸膏，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿總黃酮苷。
本發(fā)明優(yōu)選的制備方法是向稠浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到80％～82％，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到80％～82％，靜置分層，留取上清液；沉淀反復(fù)加入乙醇2-4次，每次都使溶液的含醇量達(dá)到80％～82％，靜置分層，留取上清液；將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。向稠浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到25％～30％，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到25％～30％，靜置分層，留取上清液；沉淀反復(fù)加入乙醇1-3次，每次都使溶液的含醇量達(dá)到25％～30％，靜置分層，留取上清液；將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
本發(fā)明優(yōu)選的制備方法還有向稠浸膏A中加10倍量的80％～82％乙醇，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入2倍量的80％～82％乙醇，靜置分層，留取上清液；沉淀反復(fù)加入2倍量的80％～82％乙醇1-3次，靜置分層，留取上清液；將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。向稠浸膏B中加10倍量25-30％乙醇，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入2倍量25-30％乙醇，靜置分層，留取上清液；沉淀反復(fù)加入2倍量25-30％乙醇1-3次，靜置分層，留取上清液；將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
本發(fā)明操作簡單、得率高、藥效好，且經(jīng)濟(jì)、快速、實(shí)用性較強(qiáng)。本發(fā)明用50-70％乙醇比用水的提取率高，并且可防止黃酮苷的酶解，優(yōu)選用70％乙醇；乙醇的用量根據(jù)藥材的性狀決定，如果切制后可用15倍量，不切制要用20倍量，溶劑量以淹沒藥材為宜；藥材提取兩次，每次2小時(shí)，經(jīng)分析總黃酮已經(jīng)提取比較完全。濃縮成稠浸膏，是為了節(jié)省乙醇用量和沉淀完全?！?0-85％乙醇沉淀”是為了除去提取物中大量的多糖；重復(fù)用80-85％乙醇處理沉淀，例如用2倍量的80-85％乙醇處理沉淀，可將多糖包裹的黃酮溶出；優(yōu)選用“80-82％乙醇沉淀”并重復(fù)處理?！?0-30％乙醇沉淀”可有效除去提取物中的葉綠素，反復(fù)用20-30％乙醇處理沉淀，可將葉綠素包裹的黃酮溶出，例如反復(fù)用2倍量的20-30％乙醇處理沉淀；優(yōu)選用“25-30％乙醇沉淀”并重復(fù)處理。兩次醇沉顛倒次序，效果不好，因?yàn)槎嗵橇扛?，如果先去除葉綠素，多糖包葉綠素，影響純度和色澤。上樣量和樹脂重量比應(yīng)控制在1∶5～10，上樣量如果超載，分離效果不好。大孔樹脂柱先用水洗脫的目的是除去水溶性的雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、無機(jī)鹽、鞣質(zhì)、多糖等；20-30％乙醇洗脫是除去極性較大的雜質(zhì)，如色素、8位不帶異戊烯基的黃酮等；而所需要的8-異戊烯基取代的黃酮類化合物極性適中，主要在70％乙醇洗脫部位。最后用95％乙醇超聲促溶處理的目的是為了除去原料中的部分色素和多糖，改善原料的性狀，以便達(dá)到注射用的要求。因?yàn)橹鶎游龊笏靡蜣娇傸S酮粗品色澤較深，配成注射劑后總有少許沉淀。發(fā)明人曾試用乙酸乙酯萃取處理，雖然色澤較好，但收率低；發(fā)明人也曾試用正丁醇萃取，但仍解決不了色澤問題；發(fā)明人試用75％乙醇回流處理，該方法收率雖高，但色澤和性狀最差。最后發(fā)現(xiàn)用95％乙醇超聲促溶解或95％乙醇回流促溶解處理后的色澤、產(chǎn)率均佳。本發(fā)明制備方法中80-85％乙醇沉淀與層析梯度洗脫時(shí)乙醇濃度的選擇是不但影響純度而且影響得率的關(guān)鍵步驟。除此之外，50-70％乙醇提取和最后95％乙醇處理亦為嚴(yán)重影響得率關(guān)鍵步驟。本工藝的產(chǎn)品收率約為0.9～1.1％，即100公斤藥材可得0.9～1.1公斤總黃酮，淫羊藿總黃酮苷的含量大于80％。
本制備工藝所得原料含有80％以上的淫羊藿總黃酮(淫羊藿總黃酮的測(cè)定方法為2000年版藥典一部收載的總黃酮測(cè)定方法)，符合國家新藥報(bào)批中“以有效部位為組分的注射液，其有效部位的含量應(yīng)不少于總固體量的70％(靜脈用不少于80％)”的規(guī)定。其中，主要成分淫羊藿苷的含量不少于總固體量的20％。國家新藥報(bào)批資料《中藥注射劑研究的技術(shù)要求》規(guī)定“供配制注射液用的原料或半成品，在提取、純化過程中可能引入有害有機(jī)溶劑者，應(yīng)作有害有機(jī)溶劑殘留量檢查”。因此，為了避免引入有害有機(jī)溶劑，降低提取和純化成本，本發(fā)明只使用了乙醇這種無害的有機(jī)溶劑，通過對(duì)若干常規(guī)提取分離步驟的逐一改進(jìn)以及組合方式的改進(jìn)，形成具有協(xié)同作用的提取分離系統(tǒng)。不需要作有害有機(jī)溶劑殘留量檢查，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。只使用乙醇，而使制成注射液原料在純度、性狀和療效方面符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，顯示本發(fā)明優(yōu)良效果。
本發(fā)明通過藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)淫羊藿總黃酮苷具有良好的心腦血管活性，可治療卒中易感型自發(fā)性高血壓病、冠心病和心絞痛，同時(shí)又改善腦缺血和腦缺氧，所以注射劑型較為合適。
黃酮類化合物作為淫羊藿屬植物的主要化學(xué)成分，迄今已經(jīng)分離得到上百個(gè)黃酮化合物。在研究中發(fā)現(xiàn)各化學(xué)成分在種之間的分布和含量有很大差異，如果以淫羊藿苷作為淫羊藿屬植物或者淫羊藿總黃酮苷有效部位的唯一質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)顯然是不全面的。為了全面控制淫羊藿屬植物及其有效部位淫羊藿總黃酮苷的內(nèi)在質(zhì)量，篩選部分有代表性的化合物作為指示標(biāo)準(zhǔn)，通過各化合物的含量和相對(duì)比較，能夠了解淫羊藿屬植物及其有效部位的質(zhì)量。
具體實(shí)施例方式
原料朝鮮淫羊藿于2000年夏季采收于遼寧本溪，陰干粉碎。生藥材由沈陽藥科大學(xué)生藥學(xué)教研室鑒定。陽性對(duì)照品維拉帕米為SIGMA公司的產(chǎn)品，NE(重酒石酸去甲腎上腺素)上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品，動(dòng)物采用Sprague-Dawley大鼠(本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。
新樹脂的預(yù)處理D101或DM-301型樹脂(天津農(nóng)藥股份有限公司樹脂分公司生產(chǎn))用適量的丙酮，在60℃左右溫浸三次，直至浸液在試管中用水稀釋不產(chǎn)生渾濁為止。樹脂用水漂洗至無丙酮味后上柱備用。樹脂的再生樹脂使用3～5次后，可用5％的HCl溶液處理幾次，直至溶液無色為止，用水漂洗至中性。再用5％的NaOH溶液處理，直至溶液無色為止，最后用水漂洗至中性。
實(shí)施例1朝鮮淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)藥材9.74Kg，用20倍量(重量體積比g/ml，即1g藥材加20ml的乙醇。下同)的70％乙醇煎煮兩次，每次2小時(shí)。提取液回收乙醇，濃縮成密度約為1.2g/ml(80℃測(cè)定)的浸膏，共得1.68Kg。取浸膏500g，加入95％乙醇使含醇量達(dá)到80％，充分?jǐn)嚢韬箪o置24小時(shí)，留取上清夜。沉淀再用2倍量(重量體積比g/ml，即浸膏500g需加入1000m1)的80％乙醇同法處理兩次。合并上清夜，回收乙醇濃縮成密度約為1.05g/ml(80℃測(cè)定)的浸膏。向浸膏中加入乙醇使含醇量達(dá)到30％，充分?jǐn)嚢韬箪o置24小時(shí)后，留取上清夜。沉淀再用2倍量(重量體積比g/ml，即浸膏500g需加入1000m1)的30％乙醇同法處理兩次。合并上清夜，回收乙醇至無醇味的水液，取該水液上處理好的D101大孔樹脂柱吸附。樹脂柱用去離子水充分洗滌后，先用30％乙醇再用70％乙醇梯度洗脫。將70％乙醇洗脫部位濃縮，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿總黃酮苷36.5克(收率7.3％)。
淫羊藿總黃酮苷粉末用20倍量(重量體積比g/ml，即1g粉末加20ml的乙醇)的95％藥用乙醇，40KHz超聲20min促溶，冷藏(0～4℃)，過濾，收集濾液。濾渣用10倍量的95％藥用乙醇，同法再處理四次。合并五次濾液，回收乙醇，70℃真空干燥后粉碎，可得淫羊藿總黃酮苷注射用原料22.1克，收率60.5％(總收率約為0.7％，即100公斤藥材得0.7公斤總黃酮)。其中總黃酮含量(以淫羊藿苷計(jì))為89.6％，淫羊藿苷含量為26.3％。
經(jīng)檢測(cè)本發(fā)明注射液原料符合國家新藥報(bào)批資料《中藥注射劑研究的技術(shù)要求》規(guī)定，在純度、性狀和療效方面符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例2取實(shí)施例1中浸膏500g，加入10倍量(重量體積比g/ml。下同)的80％乙醇(經(jīng)測(cè)試含醇量為80％)，充分?jǐn)嚢韬箪o置24小時(shí)，留取上清夜。沉淀再用2倍量的80％乙醇同法處理兩次。合并上清夜，回收乙醇濃縮成密度約為1.15g/ml(80℃測(cè)定)的浸膏。向浸膏中加入10倍量的30％乙醇(此時(shí)含醇量為30％)，充分?jǐn)嚢韬箪o置24小時(shí)后，留取上清夜。沉淀再用2倍量的30％乙醇同法處理兩次。合并上清夜，回收乙醇至無醇味的水液，取該水液上處理好的D101大孔樹脂柱吸附。樹脂柱用去離子水充分洗滌后，先用30％乙醇再用70％乙醇梯度洗脫。將70％乙醇洗脫部位濃縮，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿總黃酮苷35.2克(收率7.0％)。
淫羊藿總黃酮苷粉末用20倍量的95％藥用乙醇，加熱回流20分鐘，冷藏(0～4℃)，過濾，收集濾液。濾渣用10倍量的95％藥用乙醇，同法再處理四次。合并五次濾液，回收乙醇，70℃真空干燥后粉碎，可得淫羊藿總黃酮苷注射用原料23.6克，收率67％。其中總黃酮含量(以淫羊藿苷計(jì))為87.5％，淫羊藿苷含量為25.4％。經(jīng)檢測(cè)本發(fā)明注射液原料符合國家新藥報(bào)批資料《中藥注射劑研究的技術(shù)要求》規(guī)定，在純度、性狀和療效方面符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例3淫羊藿藥材1.02Kg，用20倍量的50％乙醇煎煮兩次，每次1.5小時(shí)。提取液回收乙醇，濃縮成密度約為1.15g/ml(80℃測(cè)定)的稠浸膏，共得176g。向浸膏中加入95％乙醇使含醇量達(dá)到85％，充分?jǐn)嚢韬箪o置24小時(shí)，留取上清夜。沉淀再用2倍量的85％乙醇同法處理兩次。合并上清夜，回收乙醇濃縮成密度約為1.15g/ml(80℃測(cè)定)的浸膏。向浸膏中加入乙醇使含醇量達(dá)到20％，充分?jǐn)嚢韬箪o置24小時(shí)后，留取上清夜。沉淀再用2倍量的20％乙醇同法處理兩次。合并上清夜，回收乙醇至無醇味的水液，取該水液上處理好的DM-301大孔樹脂柱吸附。樹脂柱用去離子水充分洗滌后，先用30％乙醇再用70％乙醇梯度洗脫。將70％乙醇洗脫部位濃縮，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿總黃酮苷12.0克(收率6.8％)。
淫羊藿總黃酮苷粉末用20倍量的95％藥用乙醇，40KHz超聲20min促溶，冷藏(0～4℃)，過濾，收集濾液。濾渣用10倍量的95％藥用乙醇，同法再處理四次。合并五次濾液，回收乙醇，70℃真空干燥后粉碎，可得淫羊藿總黃酮苷注射用原料8.7克，收率72.5％。其中總黃酮含量(以淫羊藿苷計(jì))為89.8％，淫羊藿苷含量為27.9％。檢測(cè)結(jié)果同上。
實(shí)施例4朝鮮淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)藥材3.05Kg，用20倍量的60％乙醇煎煮兩次，每次2小時(shí)。提取液回收乙醇，濃縮成密度約為1.1g/ml(80℃測(cè)定)的稠浸膏，共得488g。向浸膏中加入95％乙醇使含醇量達(dá)到82％，充分?jǐn)嚢韬箪o置24小時(shí)，留取上清夜。沉淀再用2倍量的82％乙醇同法處理兩次。合并上清夜，回收乙醇濃縮成密度約為1.15g/ml(80℃測(cè)定)的浸膏。向浸膏中加入乙醇使含醇量達(dá)到25％，充分?jǐn)嚢韬箪o置24小時(shí)后，留取上清夜。沉淀再用2倍量的25％乙醇同法處理兩次。合并上清夜，回收乙醇至無醇味的水液，取該水液上處理好的D101大孔樹脂柱吸附。樹脂柱用去離子水充分洗滌后，先用30％乙醇再用70％乙醇梯度洗脫。將70％乙醇洗脫部位濃縮，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿總黃酮苷29.8克(收率6.1％)。
淫羊藿總黃酮苷粉末用20倍量的95％藥用乙醇，40KHz超聲20min促溶，冷藏(0～4℃)，過濾，收集濾液。濾渣用10倍量的95％藥用乙醇，同法再處理四次。合并五次濾液，回收乙醇，70℃真空干燥后粉碎，可得淫羊藿總黃酮苷注射用原料20.5克，收率68.8％。其中總黃酮含量(以淫羊藿苷計(jì))為86.7％，淫羊藿苷含量為26.8％。檢測(cè)結(jié)果同上。
實(shí)施例5本發(fā)明對(duì)淫羊藿總黃酮中分離得到的寶藿苷-I、淫羊藿次苷-I、朝藿苷C、淫羊藿苷、脫水淫羊藿素、去甲基脫水淫羊藿素六種黃酮類化合物(前四種為黃酮苷，后兩種為苷元)，進(jìn)行了擴(kuò)張血管方面的活性測(cè)試。
大鼠斷頭處死后開胸，取出胸主動(dòng)脈，置于含95％O2和5％CO2飽和營養(yǎng)液中。去除血管周圍的結(jié)締組織，剪成6～8毫米的動(dòng)脈環(huán)。放于37.2攝氏度的營養(yǎng)液的浴槽中，通95％O2和5％CO2，前負(fù)荷1.0g。
對(duì)高鉀預(yù)收縮的大鼠胸主動(dòng)脈的舒張作用在K-H液中標(biāo)本平衡1小時(shí)，標(biāo)本預(yù)先用80mmol/L的KCl敏化，加入終濃度為80mmol/LKCL使主動(dòng)脈環(huán)收縮，收縮達(dá)最大時(shí)加入本發(fā)明淫羊藿總黃酮苷，觀察其對(duì)主動(dòng)脈條收縮的舒張作用。(結(jié)果見表)對(duì)高鈣預(yù)收縮的大鼠胸主動(dòng)脈的舒張作用在無鈣K-H液標(biāo)本平衡1小時(shí)，標(biāo)本預(yù)先敏化，加入80mmol/L的KCl，收縮達(dá)最大時(shí)加入2.5mmol/LCaCl2再次刺激主動(dòng)脈環(huán)收縮，收縮達(dá)最大時(shí)加入本發(fā)明淫羊藿總黃酮苷，觀察其隊(duì)主動(dòng)脈條收縮的舒張作用。(結(jié)果見表)對(duì)NE預(yù)收縮的大鼠胸主動(dòng)脈的舒張作用使用K-H液標(biāo)本平衡1小時(shí)，標(biāo)本預(yù)先敏化。預(yù)先加入本發(fā)明淫羊藿總黃酮苷15～20分鐘后，加入1.18×10-7mol/L NE使主動(dòng)脈環(huán)收縮，觀察其對(duì)主動(dòng)脈條收縮的舒張作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算本發(fā)明淫羊藿總黃酮苷對(duì)血管收縮的抑制率。(結(jié)果見表)表樣品對(duì)由KCl，CaCl2和NE誘導(dǎo)主動(dòng)脈收縮的影響樣品 終濃度 樣品抑制百分率mean±sd(n)(mol/L)高鉀模型 高鈣模型 NE模型寶藿苷-I 10-552.5±22.6(3) 5.6±9.6(3)23.8±9.8(3)淫羊藿次苷-I 10-60±0(3) 0±0(3)0±0(3)朝藿苷C 10-549.2±7.9(3) 18.0±1.7(3) 17.7±11.0(4)淫羊藿苷 10-538.1±8.8(3) 0.6±1.2(3)4.2±7.2(3)脫水淫羊藿素 10-50±0(3) 0.5±1.1(4)2.8±4.8(3)去甲基脫水淫羊藿素10-530.4±9.0(3) 27.2±7.4(3) 33.6±5.2(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明寶藿苷-I、朝藿苷C、淫羊藿苷、去甲基脫水淫羊藿素對(duì)主動(dòng)脈條收縮有抑制作用。寶藿苷-I、淫羊藿苷和去甲基脫水淫羊藿素在10-5mol/L的濃度水平上，對(duì)80mmol/L KCl所致的主動(dòng)脈條收縮均有一定的抑制作用。朝藿苷C、去甲基脫水淫羊藿素在10-5mol/L的濃度水平上對(duì)2.5mmol/L CaCl2所致主動(dòng)脈條收縮有一定的抑制作用。對(duì)于1.18×10-7mol/L的NE引起的主動(dòng)脈環(huán)收縮，寶藿苷-I、淫羊藿苷和去甲基脫水淫羊藿素在該濃度時(shí)表現(xiàn)出較明顯的抑制作用。這可能與抑制細(xì)胞外鈣內(nèi)流作用有關(guān)。
權(quán)利要求
1.注射用淫羊藿總黃酮苷的制備方法，包括如下步驟取淫羊藿藥材用50-70％乙醇提??；合并醇提液，濃縮至密度約為1.1～1.2mg/ml的浸膏A；向浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到80％～85％，靜置分層后，留取上清液，回收上清液中的乙醇至80℃測(cè)定密度為1.05～1.15mg/ml浸膏B；向浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到20％～30％，靜置分層，留取上清液，回收上清液中的乙醇至無醇味，得水液C；取水液C上大孔樹脂柱，先用水洗滌，再用水和乙醇混合溶液梯度洗脫；留取70％乙醇洗脫液，濃縮干燥后，得淫羊藿總黃酮苷粗品。
2.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于取淫羊藿總黃酮苷粗品，加入95％乙醇，超聲或者回流后，過濾，收集濾液，回收乙醇，濃縮成浸膏，70℃真空干燥后粉碎，得注射用淫羊藿總黃酮苷。
3.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于取朝鮮淫羊藿用60-70％乙醇加熱提取；向稠浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到80％～82％，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液含醇量達(dá)80～82％，靜置分層，將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。
4.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于向稠浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到25％～30％，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到25％～30％，靜置分層，留取上清液；將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
5.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于大孔樹脂柱型號(hào)為D101或DM-301型樹脂，按浸膏A計(jì)算樹脂重量，浸膏A和樹脂的重量比為1∶5～1∶10，先用水洗滌，后用30％乙醇洗脫；再用70％乙醇洗脫；留取70％乙醇洗脫液。
6.權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于將淫羊藿總黃酮苷粗品，加95％乙醇，超聲20min或熱回流促溶，0～4℃冷藏后過濾，收集乙醇濾液；沉淀反復(fù)加95％乙醇2-4次，每次均用超聲或熱回流促溶、冷藏、過濾，收集乙醇濾液；合并乙醇濾液，回收乙醇，濃縮成稠浸膏，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿總黃酮苷。
7.權(quán)利要求3的制備方法，其特征在于向稠浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到80％～82％，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到80％～82％，靜置分層，留取上清液；沉淀反復(fù)加入乙醇2-4次，每次都使溶液的含醇量達(dá)到80％～82％，靜置分層，留取上清液；將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。
8.權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于向稠浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到25％～30％，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量達(dá)到25％～30％，靜置分層，留取上清液；沉淀反復(fù)加入乙醇1-3次，每次都使溶液的含醇量達(dá)到25％～30％，靜置分層，留取上清液；將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
9.權(quán)利要求7的制備方法，其特征在于向稠浸膏A中加10倍量的80％～82％乙醇，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入2倍量的80％～82％乙醇，靜置分層，留取上清液；沉淀反復(fù)加入2倍量的80％～82％乙醇1-3次，靜置分層，留取上清液；將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。
10.權(quán)利要求8的制備方法，其特征在于向稠浸膏B中加10倍量25-30％乙醇，靜置分層，留取上清液；沉淀再加入2倍量25-30％乙醇，靜置分層，留取上清液；沉淀反復(fù)加入2倍量25-30％乙醇1-3次，靜置分層，留取上清液；將留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
全文摘要
一種防治心血管疾病的注射用淫羊藿總黃酮苷的制備方法。將淫羊藿藥材用乙醇回流提取，提取液回收乙醇濃縮后，上大孔樹脂柱吸附，用水洗滌后，再用不同濃度的乙醇梯度洗脫，濃縮干燥后可得含量大于80％的淫羊藿總黃酮苷。本發(fā)明操作簡單、得率高、藥效好，且經(jīng)濟(jì)、快速、實(shí)用性較強(qiáng)。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1634910SQ200410065668
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月11日
發(fā)明者孔令義, 童玉璽, 袁杰 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)