專利名稱：核苷酸類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膦酰甲氧基核苷酸類似物的前體藥物及其制備方法，本發(fā)明還涉及含有上述前體藥物的藥物組合物及其制備方法。
膦酰甲氧基核苷酸類似物是一類已知的抗病毒化合物，9-[2-(磷酰甲氧基)乙基]腺苷(簡稱PMEA)和9-[(R)-2-(磷酰甲氧基)丙基]腺苷(簡稱PMPA)是該類化合物中已經(jīng)用于臨床抗病毒治療的兩個例子。由于膦酰甲氧基核苷酸類似物中所含的膦酸根影響人體對其的吸收，一般需要將膦酰甲氧基核苷酸類似物轉(zhuǎn)化成親脂性的前體藥物來提高它的生物利用度。例如最近被FDA批準用于乙型肝炎治療的阿得福韋和用于艾滋病治療的泰諾福韋分別是膦酰甲氧基核苷酸類似物PMEA和PMPA的親脂性前藥。阿得福韋和泰諾福韋在體內(nèi)都可以被代謝成有抗病毒作用的母體藥物，但前藥的親脂性部分的代謝產(chǎn)物沒有治療作用。

齊墩果酸是從天然產(chǎn)物中提取的五環(huán)三萜類化合物，主要存在于夏枯草、懷牛膝、連翹、木犀科齊墩果、龍膽科青葉膽，女貞等植物中。它具有護肝降酶、抗炎、提高免疫功能等藥理作用，最新的研究還發(fā)現(xiàn)齊墩果酸具有很強的抗HIV活性。另外，齊墩果酸還具有促進藥物透皮吸收的作用。在臨床上，齊墩果酸主要用于治療急性黃疸型肝炎、慢性遷延型與活動型肝炎。
臨床上治療慢性乙型肝炎主要有抗病毒和保肝這兩種方法，但目前還沒有同時具備上述兩種功能的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供下式(Ia)所示的化合物及其鹽，水合物，互變異構(gòu)體和溶劑合物 其中R＝H，Me；R1＝C1-C18烷基該類化合物的合成路線如下式所示具體步驟為
1.齊墩果酸和有機醇在脫水劑的作用下可以形成齊墩果酸的酯(I)，反應(yīng)可以用相應(yīng)的有機醇作溶劑或者是有機醇和鹵代烷或DMF形成的混合溶液作為溶劑，反應(yīng)溫度一般在室溫到溶劑回流的溫度范圍內(nèi)，脫水劑為DCC。齊墩果酸的甲酯還可以通過齊墩果酸與重氮甲烷反應(yīng)來制備。
2.齊墩果酸酯(I)和氯甲酸氯甲酯在有機堿的存在下反應(yīng)得到中間體(II)，反應(yīng)溶劑選用鹵代烷，乙酸乙酯，乙腈或DMF，有機堿選用吡啶或三乙胺，反應(yīng)溫度在-20℃到室溫之間。
3.中間體(II)與膦酰甲氧基核苷酸類似物PMEA或PMPA在有機堿的作用下反應(yīng)得到化合物(Ia)。反應(yīng)的溶劑選自DMF或N-甲基吡咯烷酮，有機堿優(yōu)選三乙胺，反應(yīng)溫度在室溫到150℃之間。

齊墩果酸有很強的親脂性而膦酰甲氧基核苷酸類似物具有很強的親水性。將齊墩果酸和膦酰甲氧基核苷酸類似物通過碳酸酯鍵連接成一個分子之后，大大增加了膦酰甲氧基核苷酸類似物的親脂性并且中和了膦酸根上的負電荷，從而方便膦酰甲氧基核苷酸類似物透過生物膜，增加生物體的吸收。
體外和動物實驗顯示本發(fā)明提供的化合物(Ia)毒性很低，并具有抗艾滋病毒和乙型肝炎病毒的活性。化合物(Ia)在小鼠的腸勻漿中比較穩(wěn)定但可以被小鼠的肝臟勻漿快速地代謝為膦酰甲氧基核苷酸類似物，說明化合物(Ia)在消化道吸收的過程中是相對穩(wěn)定的而在吸收到體內(nèi)之后可以迅速地轉(zhuǎn)化為母體藥物，因此化合物(Ia)可以用作膦酰甲氧基核苷酸類似物的前體藥物。同時，本發(fā)明提供的化合物(Ia)在體內(nèi)代謝后還能產(chǎn)生齊墩果酸，具有保護肝臟的功能，從而同一種藥物具備了抗病毒和保護肝臟的多重功效。
本發(fā)明的第二個方面提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有化合物(Ia)或其鹽，水合物，互變異構(gòu)體和溶劑合物以及一種或多種藥物上可接受的載體，可選擇性地含有其他治療或預(yù)防成分。
藥物組合物可以通過任何已知的方式給藥，包括口服；肌肉，皮下和靜脈注射；通過口腔，舌下，鼻，直腸和陰道的局部給藥等方式。
適合于口服的藥物組合物可以是固體制劑如片劑，膠囊劑，粉劑，顆粒劑，也可以是液體制劑如乳液，懸浮液，溶液等?？诜钠瑒z囊劑可含有常規(guī)的賦型劑如粘合劑，潤滑劑，崩解劑，填充劑或潤濕劑?？诜墓腆w制劑還可以制成緩釋劑型。液體制劑還可以是脂質(zhì)體的懸浮液。
具體實施方法實施例1-6為化合物(1a)的合成方法實施例1
在2000ml圓底燒瓶中加入45.0g齊墩果酸，300ml乙醚，在室溫下加入重氮甲烷溶液直到固體懸浮物全部溶解并且溶液呈現(xiàn)淡黃色。加入少量乙酸至溶液黃色消失，減壓蒸餾抽干溶劑，得到白色固體。濾液過硅膠柱層析(乙酸己酯和正己烷混合溶劑為流動相)。得40.0g白色固體，即為所得化合物1。
1HNMR(CDCl3)δ0.71(s，3H)；0.77(s，3H)；0.895(s，6H)；0.92(s，3H)；0.98(s，3H)；1.12(s，3H)；2.85(d，J＝12.8Hz，1H)；3.21(d，J＝4Hz，1H)；3.625(s，3H)；5.29(t，1H)。
實施例2 將40.0g化合物1溶解于300ml CH2Cl2，加入11ml吡啶后冰浴攪拌，在氮氣保護下加入12ml氯甲酸氯甲酯。反應(yīng)液顏色變黃并不斷加深，最后成紫紅色。有白色固體生成。5小時后撤去冰浴，停止攪拌。抽濾，除去濾渣，濾液用1％HCl水溶液(350ml)洗。有機層用KHCO3溶液洗直到PH值至中性后再用水洗(3×350ml)。
有機層旋干后用硅膠柱層析分離提純(乙酸己酯和正己烷混合溶劑為流動相)。得29.6g白色固體化合物2。
1HNMR(CDCl3)δ0.72(s，3H)；0.875(s，3H)；0.90(s，3H)；0.93(s，9H)；1.13(s，3H)；2.86(d，J＝10.4Hz，1H)；3.625(s，3H)；4.423(dd，J＝5.2，10.4Hz，1H)；5.285(s，1H)；5.74(s，2H)
實施例3 在通N2氣保護下，將0.5gPMEA溶于0.5ml三己胺(TEA)和2ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的混合溶液中，70℃加熱攪拌1hr使PMEA溶解。
加入4.5g化合物2，再加2ml 1-甲基-2-吡咯烷酮。加熱攪拌，溫度控制在70℃。反應(yīng)7hr。持續(xù)通N2氣。
將反應(yīng)液溶于少量CH2Cl2后水洗，減壓蒸餾抽干溶劑，得到糖漿樣物質(zhì)。該糖漿樣物質(zhì)經(jīng)硅膠柱層析(甲醇和二氯甲烷的混合溶液為流動相，硅膠230-400目)分離得到800mg化合物3。
1HNMR(CDCl3)0.758(s，6H)；0.837(s，6H)；0.862(s，6H)；0.906(s，6H)；0.924(s，6H)；0.932(s，6H)；1.158(s，6H)；2.86(d，J＝10.4Hz，2H)；3.625(s，6H)；3.88(d，J＝7.6Hz，2H)；3.94(t，J＝4.8Hz，2H)；4.4(m，4H)；5.285(s，2H)；5.68(m，4H)；5.82(br，2H)；7.9(s，1H)；8.35(s，1H)UV(乙醇)λmax＝258.5nm(ε＝18730)
實施例4 取45.0g齊墩果酸，加入一2000ml圓底燒瓶中。用300mlCH2Cl2和600ml無水乙醇(過量)控制溫度60-70℃加熱回流溶解。待齊墩果酸全溶后加入26.7g二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)加熱回流過夜。
加入6ml己酸除去多余DCC。減壓蒸餾抽干溶劑，得到白色固體。再用少量CH2Cl2溶解，有白色不溶性固體。過濾，濾渣用少量CH2Cl2洗，濾液過硅膠柱層析(己酸己酯和正己烷混合溶劑為流動相)。得32.0g白色固體，即為所得化合物4。
1HNMR(CDCl3)；δ0.73(s，3H)；0.77(s，3H)；0.895(s，6H)；0.92(s，3H)；0.98(s，3H)；1.13(s，3H)；1.249(s，6H)；2.85(dd，J＝4，13.2Hz，1H)；3.21(d，J＝4Hz，1H)；4.08(m，2H)；5.286(s，1H)。
實施例5 用250ml CH2Cl2溶解32.0g化合物4，加入9ml吡啶，在燒瓶中加一攪拌子后冰浴攪拌，待燒瓶內(nèi)外溫度平衡后加入9.2ml氯甲酸氯甲酯?？梢姺磻?yīng)液顏色由黃色不斷加深，有白色固體生成。
5小時后撤去冰浴，停止攪拌。
抽濾，得白色濾渣并伴有少量棕灰色橢圓形顆粒。除去濾渣，濾液用1％HCl水溶液(350ml)洗。有機層用KHCO3溶液調(diào)PH值至中性。分取有機層，水洗(3×350ml)。
有機層抽干后過硅膠柱層析(乙酸己酯和正己烷混合溶劑為流動相)。得25.6g白色固體，即為化合物5。
1HNMR(CDCl3)δ0.739(s，3H)；0.875(s，3H)；0.901(s，3H)；0.934(s，6H)；1.135(s，3H)；2.86(d，J＝10.4Hz，1H)；3.21(d，J＝4Hz，1H)；4.085(m，2H)；4.423(dd，J＝5.2，10.4Hz)；5.29(s，1H)；5.74(s，2H)。
實施例6 在通N2氣的環(huán)境下，將0.3gPMEA溶于0.5ml三己胺(TEA)和1.5ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的混合溶液中，70℃加熱攪拌1hr使PMEA溶解。
加入3.2g化合物2，再加2ml 1-甲基-2-吡咯烷酮。加熱攪拌，溫度控制在70℃。反應(yīng)7hr。持續(xù)通N2氣。
將反應(yīng)液溶于少量CH2Cl2后減壓蒸餾抽干溶劑，得到糖漿樣物質(zhì)。濕法裝柱，過硅膠柱層析分離反應(yīng)產(chǎn)物(甲醇和二氯甲烷的混合溶液為流動相，硅膠230-400目)得到450mg化合物6。
1HNMR(CDCl3)δ0.747(s，6H)；0.829(s，6H)；0.862(s，6H)；0.901(s，6H)；0.924(s，6H)；0.965(s，6H)；1.158(s，6H)；2.88(d，J＝10.4Hz，2H)；3.88(d，J＝7.6Hz，2H)；3.94(t，J＝4.8Hz，2H)；4.09(m，4H)；4.4(m，4H)；5.285(s，2H)；5.68(m，4H)；5.79(br，2H)；7.91(s，1H)；8.32(s，1H)UV(乙醇)λmax＝259nm(ε＝17380)實施例7動物的急性毒性試驗取7900毫克化合物3溶于50毫升含有0.5％吐溫暖80的20％乙醇水溶液中。昆明種小鼠隨即分成5組，每組10只，雌雄各半。禁食14小時后，通過1次尾靜脈注射給藥0.5毫升，給藥后的動物自由進食飲水，置于18-22℃的環(huán)境中觀察7d。每天記錄動物中毒癥狀及死亡數(shù)。用Bliss法計算LD50及95％可信限。測得化合物在小鼠中的靜注LD50為619毫克/公斤。
實施例8體外抗HBV活性實驗2.2.15細胞(自HepG2細胞轉(zhuǎn)染而來，分泌HBsAg，HBeAg)，用DMEM培養(yǎng)液(GIBCO)，培養(yǎng)液加10％胎牛血清，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，G418 380mg/L(GIBCO)，0.3g/L谷氨酰氨，用2.38g/L Hepes調(diào)pH至6.8.用0.6g/L胰蛋白酶將2.2.15細胞分散成3×107/L，每孔0.1mL/于96孔板，2天后換用含藥培養(yǎng)液，化合物3分別稀釋成11，3.7，1.2，0.4，0.137和0.045μM，每個濃度加4孔，同時設(shè)不含藥物對照組；每3天換新鮮含藥培養(yǎng)液共4次，與細胞作用12天后，換出的細胞上清液-20℃保存待檢，并收集細胞提取核心顆粒HBV DNA。應(yīng)用dot blot檢測細胞上清液及細胞中HBV DNA，結(jié)果列于表1中表1 化合物3在細胞培養(yǎng)中抑制HBV病毒復(fù)制的效果對比

實施例9體外生物穩(wěn)定性實驗新鮮小鼠肝臟用組織勻漿器勻漿后在4℃9000g離心20分鐘后取上清液備用。
小鼠的腸勻漿可用類似的方法制備。
2毫克化合物3溶于5毫升的DMSO中配成溶液備用。
500微升小鼠肝臟勻漿和腸勻漿在37℃培養(yǎng)5分鐘后加入化合物3的DMSO溶液12.5微升，混勻后放置在37℃每分鐘振蕩100次進行培養(yǎng)，第1，30和60分鐘分別取50微升樣品，用含0.1％的三氟醋酸的乙腈中止反應(yīng)，離心分離后取上清液直接用HPLC分析化合物3的含量，根據(jù)濃度變化曲線計算化合物3在肝臟勻漿和腸勻漿中的半衰期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物3在腸勻漿中的半衰期是32.5小時，在肝臟勻漿中的半衰期是3.5小時，說明化合物3在小鼠腸中足夠穩(wěn)定，在消化道吸收的過程中主要以前體藥物的形式存在，而小鼠肝臟可以很快地將化合物3代謝成母體藥物。
實施例10對小鼠CCl4急性肝損傷的作用SR小鼠50只，18-22克，雌性，隨機分為5組，每組10只，除正常對照組，各組腹腔注射CCl4 140mg/kg，隨后實驗組經(jīng)口灌胃給予化合物346mg/kg.d、140mg/kg.d、460mg/kg.d，模型對照組和正常對照均給予同體積蒸餾水，連續(xù)灌胃給藥5天，于最末一次給藥后15小時，斷頭處死動物，取血測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)，檢測結(jié)果列于表2中，同時取肝臟進行病理組織檢查。
表2

病理切片觀察表明，與模型對照組比較，各給藥組肝小葉水樣變性和濁腫現(xiàn)象均明顯較輕，肝細胞亦未出現(xiàn)點狀壞死和肝硬化現(xiàn)象；中央靜脈邊緣較為緊密，肝細胞多呈放射狀排列，肝細胞索基本上較清楚，細胞分界較清楚，表明化合物3對CCl4引起的肝損傷有一定的保護作用。
實施例11片劑的制備制劑配方1毫克/片化合物3 250毫克微晶纖維素 25毫克濕玉米淀粉 35毫克聚維酮 15毫克硬脂酸鎂5毫克330毫克制劑配方2毫克/片化合物3 250毫克淀粉甘醇酸鈉30毫克聚維酮 15毫克硬脂酸鎂5毫克300毫克以上制劑通過用聚維酮溶液濕法造粒后加入硬脂酸鎂壓片得到。
權(quán)利要求
1.下式(Ia)所示的化合物及其鹽，水合物，互變異構(gòu)體和溶劑合物 其中R＝H，Me；R1＝C1-C18烷基
2.式(Ia)所示的化合物或其鹽，水合物，互變異構(gòu)體和溶劑合物在制備藥物組合物中的應(yīng)用。
3.一種藥物組合物，它包括治療人類HIV感染或HBV感染有效量的式(Ia)所示的化合物或其鹽，水合物，互變異構(gòu)體和溶劑合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，所述的藥物組合物是適合于口服的。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，所述的藥物組合物是片劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，所述的藥物組合物是膠囊劑。
7.一種制備以式(Ia)所示的化合物或其鹽，水合物，互變異構(gòu)體和溶劑合物為有效成分的藥物組合物的方法，該方法包括將所說的有效成分與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體混合。
8.一種制備式(Ia)所示的化合物的方法，包括使膦酰甲氧基核苷酸類似物與式(II)所示的中間體反應(yīng)，其中L為離去基團。
全文摘要
本發(fā)明提供了一些含有五環(huán)三萜類化合物的膦酰甲氧基核苷酸類似物的前體藥物及其制備方法。這些前體藥物具有抗艾滋病毒和乙型肝炎病毒的活性和保護肝臟的功能，可以用于制備藥物組合物。
文檔編號A61P1/00GK1796393SQ20041006588
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日
發(fā)明者袁建棟 申請人:博瑞生物醫(yī)藥技術(shù)(蘇州)有限公司