專利名稱：犬白細(xì)胞干擾素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種白細(xì)胞干擾素，具體的說是一種用于緊急預(yù)防和治療犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病、犬病毒性腹瀉等病毒性疾病的犬白細(xì)胞干擾素的制備方法。
背景技術(shù)：
犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病、犬病毒性腹瀉等病毒性感染在犬群中較為常見，是當(dāng)前嚴(yán)重危害養(yǎng)犬業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病。各種年齡的犬均易感，尤其是幼犬。犬一旦感染發(fā)病，則有起病急、臨床癥狀嚴(yán)重、極易傳播擴散，以及感染率和死亡率均較高的特點，給養(yǎng)犬業(yè)者造成巨大經(jīng)濟損失。更為重要的是，寵物犬與人類接觸密切，某些人獸共患病還給人類健康帶來潛在威脅。而對于此類病毒性疾病，目前臨床上尚缺乏有效治療措施，傳統(tǒng)的犬傳染病治療方案針對病毒性疾病方法不多，有時難以奏效，尤其是有可能引起人類新型傳染病。因此，積極預(yù)防和治療犬病毒性疾病一直是共同關(guān)注的問題。
人白細(xì)胞干擾素(Interferon，IFN)自1959年Isaacs等發(fā)現(xiàn)以來，已在臨床應(yīng)用多年，是目前公認(rèn)的機體抗病毒感染防御體系中，出現(xiàn)最早且對大多數(shù)病毒均有抑制作用的一組糖蛋白，此外該組糖蛋白還具有明顯的免疫調(diào)節(jié)功能和抗腫瘤活性。但由于犬白細(xì)胞干擾素具有相對種屬特異性，及受到犬新鮮血源易受污染、生產(chǎn)工藝等問題的困擾，專供犬類預(yù)防和治療病毒性疾病的犬白細(xì)胞干擾素尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種犬白細(xì)胞干擾素的制備方法，借鑒人臍血白細(xì)胞干擾素制備工藝，使用雞新城疫病毒(NDV)作為誘生劑誘導(dǎo)健康犬白細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、滅活病毒、除菌、分裝和凍干等工藝，制成犬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑。
本發(fā)明技術(shù)方案如下犬白細(xì)胞干擾素的制備方法，依次進行以下步驟(1)、制備犬的新鮮抗凝血、分離收集白細(xì)胞懸液；
(2)、犬白細(xì)胞懸液中加入啟動用粗純?nèi)准?xì)胞干擾素進行短時培養(yǎng)；(3)、加入誘導(dǎo)劑——雞新城疫病毒NDV，誘生培養(yǎng)18-24小時；(4)、加入含有犬血清或血漿的營養(yǎng)液進行誘生，培養(yǎng)后，收集上清液，滅活雞新城疫病毒、除菌；(5)得到犬白細(xì)胞干擾素粗制品，冷凍保存。
上述的犬白細(xì)胞干擾素的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)、以800～2500rpm離心裝有新鮮抗凝血瓶30min，收集灰黃層，得到富含白細(xì)胞的懸液，用已預(yù)溫的培養(yǎng)液稀釋成1×107白細(xì)胞/ml；(2)、在前述已稀釋好的細(xì)胞懸液中加入少量粗純?nèi)准?xì)胞干擾素，使其最終濃度為100單位/ml，置于37℃水浴搖床攪拌培養(yǎng)2小時；(3)、在啟動后的犬白細(xì)胞懸液中加入雞新城疫病毒NDV，使其最終濃度為100～150血凝單位/ml，并同時在白細(xì)胞懸液中加入原全血液1～1.5倍體積量含10％犬血清或犬血漿的RPMI 1640營養(yǎng)液，加入終濃度為10μg/ml的卡那霉素，調(diào)懸液pH7.4～8，37℃搖床攪拌培養(yǎng)18～24小時；(4)、經(jīng)2000rpm～3000rpm離心30min，取上清液，加入6N HCl調(diào)至pH2.0～2.4，4℃下放置4～5天，每日振搖2～3次；再用6N NaOH調(diào)至pH7.2，即得到犬白細(xì)胞干擾素粗制品。
PB是指不含有鹽的緩沖溶液，預(yù)溫的培養(yǎng)液是指把溫度4℃ RPMI 1640加熱到接近37℃，過夜一般指8～24小時。
本發(fā)明制備的犬白細(xì)胞干擾素，經(jīng)分離純化后，制成凍干粉針劑，加2ml無菌雙蒸水后，能迅速溶解為均勻懸濁液，規(guī)格為干擾素含量≥2萬單位/瓶，2～8℃或室溫≤25℃保存。使用時要輕輕搖勻后方可進行肌肉注射，幼犬5000～10000單位/只/天；青年犬10000～20000單位/只/天；成年犬20000～40000單位/只/天。每日注射1次，一個療程3～5次。
本發(fā)明成功解決了犬新鮮血源來源及污染等問題，經(jīng)過嚴(yán)格田間實驗和區(qū)域?qū)嶒炞C實，無可見不良反應(yīng)。犬白細(xì)胞干擾素注入動物機體后，治療犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病、犬病毒性腹瀉等病毒性疾病，具有療效好、安全可靠、無毒副作用和不污染環(huán)境等特點。
在治療已發(fā)病犬的同時，應(yīng)及時隔離未發(fā)病犬，并給予等量藥物預(yù)防注射，使用本發(fā)明制備的犬白細(xì)胞干擾素時，應(yīng)注意環(huán)境的消毒等綜合預(yù)防措施，防治再感染或疫病的復(fù)發(fā)。
具體實施例方式犬白細(xì)胞干擾素制備工藝一、配制抗凝劑(每支12500單位的肝素鈉加Hank`s液10ml，每毫升為1250單位)及抗生素(卡那霉素，使用時終濃度為100μg/ml)。
二、犬全血采集，在動物手術(shù)間，將無菌采集犬心臟全血，收集至事先加有抗凝劑與抗生素的無菌瓶中，搖勻，在4℃冰箱放置備用。
三、制備雞新城疫病毒(F系)，并滴定其效價。
四、按產(chǎn)品說明書規(guī)定溶解RPMI 1640粉劑，經(jīng)蔡氏濾器加壓過濾，無菌檢測后在4℃冰箱放置備用。
五、粗制品干擾素制備(1)、以800～2500rpm離心裝有新鮮抗凝血瓶30min，收集灰黃層，得到富含白細(xì)胞的懸液，用已預(yù)溫的培養(yǎng)液稀釋成1×107白細(xì)胞/ml。
(2)、在已稀釋好的細(xì)胞懸液中加入少量粗純?nèi)准?xì)胞干擾素，使其最終濃度為100單位/ml，置于37℃水浴搖床攪拌培養(yǎng)2小時。
(3)、在啟動后的犬白細(xì)胞懸液中加入NDV，使其最終濃度為100～150血凝單位/ml，并同時在白細(xì)胞懸液中加入原全血液1～1.5倍體積量含10％犬血清或犬血漿的RPMI 1640營養(yǎng)液，加入終濃度為10μg/ml的卡那霉素，調(diào)懸液pH7.4，37℃搖床攪拌培養(yǎng)18～24小時；(4)、經(jīng)2000rpm～3000rpm離心30min，取上清液，加入6N HCl調(diào)至pH2.0，4放置4～5天，每日振搖2～3次。再用6N NaOH調(diào)至pH7.2，即得到犬白細(xì)胞干擾素粗制品。
PB是指不含有鹽的緩沖溶液，預(yù)溫的培養(yǎng)液是指把溫度4℃ RPMI 1640加熱到接近37℃。
上述經(jīng)檢驗合格的粗制干擾素在4℃下，2000～3000rpm/分鐘離心30分鐘，取上清液用蔡氏濾器加壓過濾，無菌收集濾液，再取樣進行無菌檢驗效價測定、安全檢驗和外源病毒檢驗合格后，加入終濃度含5％體積脫脂牛奶、5％GS和10％犬血清(或血漿)作為凍干保護劑混勻后，置入凍干機保存。
干擾素粗制品可依下列步驟精制(硫氰酸鉀鹽析純化)(1)、在粗制干擾素中加1/10倍體積量4℃預(yù)冷的5M硫氰酸鉀(KCNS)，慢加攪拌，加完后，用4℃預(yù)冷2N HCl調(diào)pH至3.5，慢加約3ml/min，4℃靜置8～12小時，(2)、4℃下，2000rpm(轉(zhuǎn)/分，下同)離心20min(分鐘，下同)，棄去上清液，取沉淀；(3)、沉淀中加1/15倍體積量的-20℃預(yù)冷95％酒精；先加少量酒精，組織勻漿器快檔研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl調(diào)至pH4.0，(4)、4℃下2500rpm離心20min，棄沉淀；(5)、上清液用1N NaoH調(diào)至pH5.0～5.5，(6)、4℃下2000rpm離心20min，棄沉淀；(7)、上清液用0.1N NaoH調(diào)至PH5.6～6.0；(8)、4℃下2000rpm離心20min，棄沉淀；(9)、上清液用1N NaoH調(diào)至pH8.0，(10)、4℃下2000rpm離心20min，棄上清液；(11)、沉淀物中加入原1/10～1/15倍體積量pH8.0的0.1M PB(含0.5M KCNS)溶液；(12)、4℃攪拌過夜(8～24小時)，使之充分溶解；(13)、4℃下2000rpm離心20min，棄沉淀；(14)、上清液用2N HCl調(diào)至pH3.0；(15)、4℃下2000rpm離心20min，棄上清液；(16)、沉淀物中加入1/100倍體積量pH8.0的0.1M PB溶液溶解，然后用pH7.6 PB溶液透析，除去CNS-；(17)、用HNO3、0.1N AgNO3檢測CNS-，直至透析除盡為止；(18)、3萬g離心1小時，棄沉淀；(19)、測定干擾素效價及比活性，比活性≥1×105國際單位/mg蛋白為合格；(20)、無菌分裝，-70℃保存。
權(quán)利要求
1.犬白細(xì)胞干擾素的制備方法，依次進行以下步驟(1)、制備犬的新鮮抗凝血、分離收集白細(xì)胞懸液；(2)、犬白細(xì)胞懸液中加入啟動用粗純?nèi)准?xì)胞干擾素進行短時培養(yǎng)；(3)、加入誘導(dǎo)劑——雞新城疫病毒NDV，誘生培養(yǎng)18-24小時；(4)、加入含有犬血清或血漿的營養(yǎng)液進行誘生，培養(yǎng)后，收集上清液，滅活雞新城疫病毒、除菌；(5)得到犬白細(xì)胞干擾素粗制品，冷凍保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬白細(xì)胞干擾素的制備方法，其特征在于(1)、以800～2500rpm離心裝有新鮮抗凝血瓶30min，收集灰黃層，得到富含白細(xì)胞的懸液，用已預(yù)溫的培養(yǎng)液稀釋成1×107白細(xì)胞/ml；(2)、在前述已稀釋好的細(xì)胞懸液中加入少量粗純?nèi)准?xì)胞干擾素，使其最終濃度為100單位/ml，置于37℃水浴搖床攪拌培養(yǎng)2小時；(3)、在啟動后的犬白細(xì)胞懸液中加入雞新城疫病毒NDV，使其最終濃度為100～150血凝單位/ml，并同時在白細(xì)胞懸液中加入原全血液1～1.5倍體積量含10％犬血清或犬血漿的RPMI1640營養(yǎng)液，加入終濃度為10μg/ml的卡那霉素，調(diào)懸液pH7.4～8，37℃搖床攪拌培養(yǎng)18～24小時；(4)、經(jīng)2000rpm～3000rpm離心30min，取上清液，加入6N HCl調(diào)至pH2.0～2.4，4℃下放置4～5天，每日振搖2～3次；再用6N NaOH調(diào)至pH7.2，即得到犬白細(xì)胞干擾素粗制品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬白細(xì)胞干擾素的制備方法，其特征在于(1)、以2000rpm離心裝有新鮮抗凝血瓶30min，收集灰黃層，得到富含白細(xì)胞的懸液，用已預(yù)溫的培養(yǎng)液稀釋成1×107白細(xì)胞/ml。(2)、在前述已稀釋好的細(xì)胞懸液中加入少量粗純?nèi)准?xì)胞干擾素，使其最終濃度為100單位/ml，置于37℃水浴搖床攪拌培養(yǎng)2小時。(3)、在啟動后的犬白細(xì)胞懸液中加入NDV，使其最終濃度為150血凝單位/ml，并同時在白細(xì)胞懸液中加入原全血液1.5倍體積量含10％犬血清或犬血漿的RPMI 1640營養(yǎng)液，加入終濃度為10μg/ml的卡那霉素，調(diào)懸液pH7.4，37℃搖床攪拌培養(yǎng)18～24小時；(4)、經(jīng)2000rpm離心30min，取上清液，加入6N HCl調(diào)至pH2.0，4℃放置4～5天，每日振搖2～3次。再用6N NaOH調(diào)至pH7.2，即得到犬白細(xì)胞干擾素粗制品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬白細(xì)胞干擾素的制備方法，其特征在于對犬白細(xì)胞干擾素粗制品依下列步驟精制(1)、在粗制干擾素中加1/10倍體積量4℃預(yù)冷的5M硫氰酸鉀(KCNS)，慢加攪拌，加完后，用4℃預(yù)冷2N HCl調(diào)pH至3.5，慢加約3ml/min，4℃靜置8～12小時，(2)、4℃下，2000rpm(轉(zhuǎn)/分，下同)離心20min(分鐘，下同)，棄去上清液，取沉淀；(3)、沉淀中加1/15倍體積量的-20℃預(yù)冷95％酒精；先加少量酒精，組織勻漿器快檔研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl調(diào)至pH4.0～4.5，(4)、4℃下2500rpm離心20min，棄沉淀；(5)、上清液用1N NaoH調(diào)至pH5.0～5.5，(6)、4℃下2000rpm離心20min，棄沉淀，(7)、上清液用0.1N NaoH調(diào)至PH5.6～6.0，(8)、4℃下2000rpm離心20min，棄沉淀，(9)、上清液用1N NaoH調(diào)至pH8.0，(10)、4℃下2000rpm離心20min，棄上清液，(11)、沉淀物中加入原1/10～1/15倍體積量pH8.0的0.1M PB(含0.5M KCNS)溶液，(12)、4℃攪拌過夜，使之充分溶解，(13)、4℃下2000rpm離心20min，棄沉淀，(14)、上清液用2N HCl調(diào)至pH3.0，(15)、4℃下2000rpm離心20min，棄上清液，(16)、沉淀物中加入1/100倍體積量pH8.0的0.1M PB溶液溶解，然后用pH7.6 PB溶液透析，除去CNS-，(17)、用HNO3、0.1N AgNO3檢測CNS-，直至透析除盡為止，(18)、3萬g離心1小時，棄沉淀，(19)、測定干擾素效價及比活性，比活性≥1×105國際單位/mg蛋白為合格，(20)、無菌分裝，-70℃保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種犬白細(xì)胞干擾素的制備方法，使用雞新城疫病毒(NDV)作為誘生劑誘導(dǎo)健康犬白細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、滅活病毒、除菌、分離、純化等工藝，制成犬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑。本發(fā)明成功利用了犬新鮮全血作為原料，制備工藝簡便及經(jīng)凍干后易運送和保藏，產(chǎn)品質(zhì)量可靠。犬白細(xì)胞干擾素注射犬機體后，具有療效好、安全可靠和無毒副作用等特點?？捎糜谥委熑翢?、犬細(xì)小病毒病、犬病毒性腹瀉等病毒性疾病。
文檔編號A61P31/12GK1661036SQ200410065929
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月25日
發(fā)明者王明麗 申請人:王明麗