專利名稱：和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬天然化合物的用途，涉及從植物提取的和厚樸酚的新用途，尤其涉及和厚樸酚在制備抗腫瘤多個特異性靶點藥物中的用途。
背景技術：
近年來，抗腫瘤藥物的研制已從過去的傳統(tǒng)的單純的細胞毒化療藥轉向靶向藥物。靶向藥物的最大優(yōu)點是比傳統(tǒng)化療藥毒性小和療效好。
腫瘤細胞內產生的低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是近年來被明確的抗腫瘤靶點，原因如下腫瘤細胞產生的HIF-1α有多種作用，使腫瘤細胞不易發(fā)生凋亡、在腫瘤細胞的多條細胞信號通路起重要作用導致腫瘤細胞生長旺盛，促進腫瘤轉移，可導致腫瘤內血管增生、等，臨床表現(xiàn)為預后差。
腫瘤細胞產生的血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是當前公認的治療腫瘤的靶點。腫瘤細胞產生VEGF是腫瘤血管生成的關鍵因子，阻斷腫瘤細胞的VEGF表達或功能都可有效地治療腫瘤。最近，美國的Genetech公司的產品Avastin已進入臨床III期試驗。Avastin為一個抗血管內皮細胞生長因子的單克隆抗體，若通過臨床III期，也將成為第一個抗腫瘤VEGF的靶點藥。
可誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是另一治療腫瘤的靶點。細胞內的一氧化氮(NO)主要由iNOS催化產生。NO在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的功能可概括為(1)激活多條腫瘤細胞生長相關的細胞通路，使腫瘤細胞惡性生長；(2)使腫瘤細胞抗凋亡；(3)刺激低氧誘導因子-1和血管內皮細胞生長因子的合成；(4)促進腫瘤向惡性程度進化和轉移；(5)抑制機體的腫瘤免疫功能。
熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)與腫瘤細胞的生長密切相關，HSP70在腫瘤細胞中的高表達導致臨床腫瘤的治療和預后不佳。因此研發(fā)HSP70的靶向藥是當前的一個方向。
化療是治療腫瘤的一種主要手段，然而腫瘤化療往往會因腫瘤的抗藥性而失敗。腫瘤化療失敗的原因之一是腫瘤細胞產生抗細胞凋亡的特性，如在腫瘤細胞內抗凋亡因子如Bcl-xL表達增加，而促凋亡因子如Bid表達減小，使得腫瘤細胞內的凋亡調控失去平衡。因此，當前的抗腫瘤藥物的研究方向之一是通過調控腫瘤細胞內的凋亡來治療腫瘤。
和厚樸酚是從植物厚樸中提取的一種天然化合物。其化學結構如下 和厚樸酚在對其抗血栓、抗焦慮等體內實驗時，證明能被胃腸道吸收，并具有體內滯留時間較長、沒有明顯毒副作用等特點。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，該和厚樸酚英文名為honokiol，CAS number35354-74-6，分子量266.33，化學命名為3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式為C18H18O2，對人體毒性小，本發(fā)明所述的腫瘤靶點是指低氧誘導因子-1(HIF-1)，血管內皮細胞生長因子(VEGF)，一氧化氮合成酶(iNOS)，熱休克蛋白質70(HSP70)，調控細胞凋亡的因子如Bcl-2家族成員和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族成員。
本發(fā)明所述的和厚樸酚與制劑允許的藥物賦形劑或載體制成的制劑形式主要包括液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、滴丸劑或注射劑。
本發(fā)明的有益效果有(1)提出了和厚樸酚的新用途；(2)由于HIF-1，VEGF，iNOS，HSP70，Bcl-xL，Bid，caspase這些因子在腫瘤細胞生長、血管的生成、腫瘤轉移等方面起至關重要的作用，因此和厚樸酚具有腫瘤靶點藥的應用前景；(3)和厚樸酚可引起腫瘤細胞凋亡，具有制備臨床抗腫瘤藥的應用前景；(4)和厚樸酚毒性低，而目前所用的臨床抗腫瘤藥物對人體都有較大的毒性，因此可解決長期困繞抗腫瘤藥毒性大的問題；(5)本發(fā)明用體內外實驗證明和厚樸酚可有效抑制腫瘤。
圖1A為和厚樸酚對人結腸上皮癌細胞系RKO細胞內低氧誘導因子-1mRNA含量的影響。
圖1B為和厚樸酚對RKO細胞內低氧誘導因子-1mRNA含量影響的直方圖。
圖2A為和厚樸酚對RKO細胞內低氧誘導因子-1蛋白質含量的影響。
圖2B為和厚樸酚對RKO細胞內低氧誘導因子-1蛋白質含量影響的直方圖。
圖3A為和厚樸酚對RKO細胞內血管生長因子mRNA含量影響。
圖3B為和厚樸酚對RKO細胞內血管生長因子mRNA含量影響的直方圖。
圖4為和厚樸酚對RKO細胞內血管生長因子蛋白質含量的影響。
圖5A為和厚樸酚對RKO細胞內一氧化氮合成酶的蛋白質含量的影響。
圖5B為和厚樸酚對RKO細胞內一氧化氮合成酶的蛋白質含量影響的直方圖。
圖6A為和厚樸酚對RKO細胞內熱休克蛋白70的mRNA含量的影響。
圖6B為和厚樸酚對RKO細胞內熱休克蛋白70的mRNA含量影響的直方圖。
圖7A為和厚樸酚對RKO細胞內熱休克蛋白70的蛋白質含量的影響。
圖7B為和厚樸酚對RKO細胞內熱休克蛋白70的蛋白質含量影響的直方圖。
圖8為和厚樸酚對RKO細胞內Bcl-2和Bax的mRNA水平的影響。
圖9為和厚樸酚對RKO細胞內Bcl-xL和Bid的mRNA水平的影響。
圖8為和厚樸酚對RKO細胞內Bcl-2和Bax的蛋白質水平的影響。
圖9為和厚樸酚對RKO細胞內Bcl-xL和Bid的蛋白質水平的影響。
圖12為和厚樸酚對RKO細胞內caspase-3的表達的影響。
圖13為和厚樸酚對RKO細胞內caspase-7的表達的影響。
圖14為和厚樸酚對RKO細胞內caspase-9的表達的影響。
圖15為和厚樸酚作用于RKO細胞后，細胞內DNA呈梯帶的電泳圖。
圖16為和厚樸酚對荷人大腸癌RKO細胞異種移植物的Balb/C裸鼠的治療作用。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述。
實施例1和厚樸酚對腫瘤細胞內低氧誘導因子-1(HIF-1)mRNA的抑制(1)實驗材料細胞株大腸癌細胞株RKO來源于美國American Type CultureCollection(ATCC)公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；逆轉錄試劑盒(Promage，美國)，逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒，熱穩(wěn)定DNA合成酶(Taq酶上海生工)。
儀器培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，二氧化碳培養(yǎng)箱，PCR儀，F(xiàn)CM儀。
(2)實驗方法細胞培養(yǎng)分組根據不同和厚樸酚濃度分為5組，分別以1、2、3、4、5表示。1組為對照；2組加氯化鈷(CoCl2)(150μM)；3組CoCl2(150μM)+和厚樸酚0.1μg/ml；4組CoCl2(150μM)+和厚樸酚0.5μg/ml；5組CoCl2(150μM)+和厚樸酚1μg/ml。
藥物誘導RKO細胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個復孔；用含10％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150μM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。收集細胞，提取RNA或蛋白質，做相應的RT-PCR。
RT-PCR收集細胞，棄去培養(yǎng)液，冰生理鹽水洗3次后用RNA提取試劑Trizol(每孔400ul)提取細胞RNA(按Trizol試劑說明進行)。RNA逆轉錄成cDNA按逆轉錄試劑盒方案進行，引物為寡核苷酸脫氧胸腺嘧啶(Oligo dT)。PCR的引物如下(引物由上海生工生物工程技術有限公司合成)引物 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’)PCR產物(bp)HIF-1αCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGCTTTTCCTGCTCTGTTTGGTGA 143PCR的反應體系按照PCR試劑盒方案進行。
PCR條件如下HIF-194℃5分鐘→35循環(huán){94℃30秒→54℃30秒→72℃30秒}→72℃5分鐘。
PCR產物電泳用1×TAE
三羥甲基氨基甲烷(tris)-冰醋酸-二乙胺四乙酸(EDTA)電泳緩沖液配制1.5％瓊脂糖凝膠，加0.1％溴化乙啶(EB)按說明制成水平DNA電泳膠塊。加2×上樣緩沖液，加樣于加樣孔，100V恒壓電泳約20分鐘。紫外成像儀上攝像。
(3)實驗結果參見圖1A和圖1B，圖1A用RT-PCR法檢測，細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時?？梢婋S著和厚樸酚濃度增加，HIF-1 mRNA含量減小，圖中泳道1常氧對照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道5CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚；β-actin為內對照。圖1B各組HIF-1αRT-PCR產物的條帶灰度值分別除去相應β-actin條帶的影響因子，圖中組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150μM)誘導3hrs對RKO細胞HIF-1αmRNA表達有微弱的上調。和厚樸酚濃度依賴性下調RKO細胞HIF-1αmRNA表達，0.1、0.5和1μg/ml三個濃度分別比CoCl2對照組下調7.6％、15.9％和46.7％，說明和厚樸酚0.1-1μg/ml之間濃度時抑制HIF-1α基因轉錄。
實施例2和厚樸酚對腫瘤細胞內低氧誘導因子-1(HIF-1)蛋白質的抑制實施例1表明和厚樸酚可抑制HIF-1的基因轉錄，但并沒有證明和厚樸酚可使腫瘤細胞中的HIF-1蛋白質含量也下降。該實施例證明和厚樸酚有此作用。
(1)實驗材料細胞株大腸癌細胞株RKO來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜(Bio-Rad公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠抗體(KPL，美國)，鼠抗人HIF-1α(NeoMarkers，美國)，化學發(fā)光檢測系統(tǒng)ECL反應液(SantaCruz公司)，蛋白質測定試劑盒(DC Protein Assay Kit，Bio-Rad公司)，免疫組織化學試劑盒(福州邁新公司)。
儀器培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，二氧化碳培養(yǎng)箱，電泳儀，電轉膜儀。
(2)實驗方法細胞培養(yǎng)分組根據不同和厚樸酚濃度分為5組，分別以1、2、3、4、5表示。1組為對照；2組加CoCl2(150μM)；3組CoCl2(150μM)+和厚樸酚0.1μg/ml；4組CoCl2(150μM)+和厚樸酚0.5μg/ml；5組CoCl2(150μM)+和厚樸酚1μg/ml。
藥物誘導RKO細胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個復孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150μM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。收集細胞，提取RNA或蛋白質，做西部印跡法(Western Blot)檢測細胞內的HIF-1蛋白質含量。
Western blot收集培養(yǎng)細胞，用生理鹽水洗兩次，細胞沉淀加入1×蛋白提取緩沖液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000轉速(rpm)離心20分鐘，取上清測定蛋白質濃度(按DC Protein Assay Kit說明書進行)。取蛋白提取物50μg，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍染料到達凝膠最前沿，停止電泳。
轉膜電泳結束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉膜緩沖液(Transferbuffer)中，平衡30分鐘。同時截取適當大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙-同浸于轉膜緩沖液中，平衡10～15分鐘，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉膜過夜。
封閉將轉有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的緩沖液(TBST)中封閉1hr。雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶400-500稀釋的鼠抗人HIF-1(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5分鐘×5次。
壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5分鐘后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內，壓片，洗片。
(3)實驗結果參見圖2A和圖2B，圖2A細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時。用Western Blot方法檢測，可見隨著和厚樸酚濃度增加，HIF-1蛋白質含量A表達減小，泳道1常氧對照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道5CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。β-actin為內對照。圖2B各組HIF-1α蛋白條帶的灰度值分別去除相應β-actin條帶的影響因子。圖中組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。RKO細胞基礎水平HIF-1α蛋白表達較低，不易檢測到。CoCl2150μM誘導3小時顯著上調RKO細胞HIF-1α蛋白表達。和厚樸酚濃度依賴性下調CoCl2(150μM)所致的RKO細胞HIF-1α蛋白積聚(參見圖2A)。把western blot結果用圖像軟件(Scion Image)換算成灰度值，并作直方圖(參見圖2B)，可以看出，CoCl2(150μM)誘導的HIF-1α蛋白積聚比1組(空白對照組)增加約13倍。和厚樸酚0.1μg/ml濃度時，對CoCl2所致的HIF-1α蛋白積聚沒有明顯影響，而0.5和1μg/ml濃度時，梯度抑制CoCl2所致的HIF-1α蛋白上調，與2組(CoCl2對照組)相比分別下調28％和63.9％。和厚樸酚三個濃度對RKO細胞HIF-1mRNA及蛋白水平的影響趨勢基本一致。此結果說明和厚樸酚可使細胞內的HIF-1α蛋白質含量下降。
實施例3和厚樸酚對RKO細胞血管生長因子(VEGF)mRNA表達的影響(1)實驗材料細胞大腸癌細胞株RKO來源于美國ATCC公司。
試劑逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒為美國Promega公司產品。和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所。
儀器PCR儀。
(2)實驗方法藥物誘導RKO細胞2×105接種于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24小時，使貼壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150μM，培養(yǎng)4小時后更換培養(yǎng)液，以除去CoCl2，繼續(xù)用不同濃度的和厚樸酚作用3小時。收集細胞，提取RNA，逆轉錄成cDNA，做PCR檢測VEGF的豐度。PCR引物如下(引物由上海生工生物有限工程技術服務有限公司合成)引物 上游引物(5’-3’)下游引物(5’-3’) 產物(bp)VEGF-A GCAGAATCATCACGAAGTGG GCATGGTGATGTTGGACTCC 212反應條件如下VEGF-A95℃5分鐘→35循環(huán){95℃30秒，56℃30秒，72℃1分鐘}→72℃7分鐘。
PCR產物電泳用1×TAE電泳緩沖液配制1.5％瓊脂糖凝膠，加0.1％EB按說明制成水平DNA電泳膠塊。加2×上樣緩沖液，加樣于加樣孔，100V恒壓電泳約20分鐘。紫外成像儀上攝像。
(3)實驗結果不同濃度和厚樸酚作用于常氧或CoCl2(150μM)模擬低氧組RKO細胞4hrs，取總RNA逆轉錄為cDNA，作PCR分析。參見圖3A和圖3B，圖3A細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時，用RT-PCR方法檢測，可見隨著和厚樸酚濃度增加，VEGF的mRNA含量減小。泳道1常氧對照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道5CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚，β-actin為內對照。圖3B各組VEGFRT-PCR產物的條帶分別除去其相應β-actin條帶的影響因子，其中組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150μM)顯著上調RKO細胞VEGF mRNA表達，PCR產物條帶的灰度值是對照組的1.7倍。和厚樸酚0.1-1μg/ml濃度時，劑量依賴性下調模擬低氧引起的VEGF mRNA表達上調。1μg/ml濃度時灰度值比低氧對照組下調44％，具有顯著差異，說明和厚樸酚抑制VEGF的表達。
實施例4和厚樸酚對RKO細胞VEGF蛋白質表達的影響實施例3證明和厚樸酚處理腫瘤細胞后，細胞內VEGF mRNA水平下降，但不表明細胞內VEGF的蛋白質水平下降。檢測細胞內VEGF蛋白質的水平是必需的。
(1)實驗材料細胞大腸癌細胞株RKO來源于美國ATCC公司。
試劑鼠抗人VEGF和免疫熒光試劑盒為福州邁新公司產品。和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所。
儀器德國蔡氏熒光顯微鏡。
(2)實驗方法藥物誘導RKO細胞2×105接種于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24小時，使貼壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150μM，培養(yǎng)4小時后更換培養(yǎng)液，以除去CoCl2，繼續(xù)用不同濃度的和厚樸酚作用3小時。收集細胞，用鼠抗人VEGF與細胞溫育，再用熒光素FITC標記兔抗鼠IgG標記細胞，在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光強度。熒光越強表示VEGF含量越高。
(3)實驗結果RKO細胞經150μMCoCl2作用4小時，并用不同濃度和厚樸酚處理8小時，檢測細胞內高分子量VEGF(34-50kDa)的表達量。34-50kDa蛋白是細胞內非分泌形式的VEGF，當被剪接成189kDa、165kDa、121kDa等活性分子后，即被分泌出細胞，產生血管內皮生長因子的生理作用。我們用FITC熒光標記的二抗結合經VEGF-抗作用的細胞涂片，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)150μMCoCl2作用后的RKO細胞高分子量VEGF陽性細胞數明顯增加，熒光主要分布在細胞質，不同濃度和厚樸酚(0.1-1μg/ml)作用8小時明顯減少模擬低氧引起的陽性細胞增加。每組隨機取150個細胞進行統(tǒng)計，結果參見圖4，細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理8小時，用熒光免疫組織化學法檢測RKO細胞內的熒光強度，熒光值反映VEGF的表達量，可見隨著和厚樸酚濃度增加，高分子量VEGF的蛋白表達量減少，組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚，“**”表示與常氧對照組相比P＜0.01；“#”表示與低氧對照組相比P＜0.05；“##”表示與低氧對照組相比P＜0.01。
CoCl2(150μM)作用4小時明顯上調RKO細胞內VEGF蛋白表達，其熒光值比對照組增加5.6倍，T檢驗兩組間差異非常顯著(P＜0.01)。和厚樸酚0.1-1μg/ml均表現(xiàn)為下調CoCl2引起的VEGF表達增加，其中H0.1組比單獨低氧組減少29.5％(P＜0.01)，H0.5組和H1組分別減少76.4％和80％，與單獨低氧組相比均有顯著差異(P＜0.05)。該實驗證明，和厚樸酚處理腫瘤細胞后，細胞內VEGF蛋白質含量下降。
實施例5和厚樸酚對誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)的影響(1)實驗材料細胞細胞RKO細胞來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；鼠抗人iNOS(NeoMarkers，美國)，HRP標記的羊抗鼠抗體(Santa Cruz，美國)?；瘜W發(fā)光檢測系統(tǒng)ECL反應液(Santa Cruz，美國)儀器電泳儀，電轉膜儀(2)實驗方法藥物誘導RKO細胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個復孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150μM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。收集細胞，提取RNA或蛋白質，做Western Blot檢測細胞內的HIF-1蛋白質含量。
Western blot收集培養(yǎng)細胞，用生理鹽水洗兩次，細胞沉淀加入1×蛋白提取緩沖液，吹散，沸水中煮15分鐘，13000轉/分鐘(rpm)離心20分鐘，取上清測定蛋白質濃度(按DC Protein Assay Kit說明書進行)。取蛋白提取物50μg，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍染料到達凝膠最前沿，停止電泳。
轉膜電泳結束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉膜緩沖液中，平衡30分鐘。同時截取適當大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于轉膜緩沖液中，平衡10～15分鐘，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉膜過夜。
封閉將轉有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的TBST中封閉1小時。雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶400-500稀釋的鼠抗人iNOS(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5分鐘×5次，再浸于1∶10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5分鐘×5次。壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECLA液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5分鐘后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內，壓片，洗片。
(3)實驗結果參見圖5A和圖5B，圖5A細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時，用Western Blot法檢測，可見隨著和厚樸酚濃度增加，iNOS蛋白含量減小，β-actin為內對照。圖5B各組iNOS蛋白條帶分別除去其相應β-actin條帶的影響因子，圖中組別分別代表常氧(N)和低氧(H)時不同和厚樸酚(0-1μg/ml)作用濃度。每組取50μg蛋白進行Western blot檢測，RKO細胞基礎水平iNOS蛋白表達豐度較高。CoCl2(150μM)模擬低氧時，輕度上調RKO細胞iNOS蛋白表達，其Western blot條帶的灰度值與常氧對照組相比增強了21.4％。常氧組和厚樸酚1μg/ml濃度時顯著下調iNOS。比較常氧組與低氧組Western blot條帶的灰度值，發(fā)現(xiàn)相同劑量和厚樸酚對RKO細胞iNOS蛋白表達的影響與環(huán)境氧含量無明顯相關，說明和厚樸酚對RKO細胞iNOS蛋白的調節(jié)不受氧分壓影響。
該實驗結果說明和厚樸酚可抑制iNOS的表達。
實施例6和厚樸酚對RKO細胞HSP70mRNA的影響。
(1)實驗材料細胞RKO細胞來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒為美國Promega公司產品。
儀器PCR儀。
(2)實驗方法藥物誘導RKO細胞2×105接種于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24小時，使貼壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150μM，培養(yǎng)4小時后更換培養(yǎng)液，以除去CoCl2，繼續(xù)用不同濃度的和厚樸酚作用3小時。收集細胞，提取RNA，逆轉錄成cDNA，做PCR檢測HSP70的豐度。PCR引物如下(引物由上海生工生物工程技術有限公司合成)引物上游引物(5’-3’)下游引物(5’-3’) 產物(bp)HSP70 CAAGATCAGCGAGGCTGACAAG AACTGTACACAGGGTGGCAGTG500反應條件如下HSP7095℃5分鐘→35個循環(huán){95℃30秒，56℃30秒，72℃1分鐘}→72℃7分鐘PCR產物電泳用1×TAE電泳緩沖液配制1.5％瓊脂糖凝膠，加0.1％EB按說明制成水平DNA電泳膠塊。加2×上樣緩沖液，加樣于加樣孔，100V恒壓電泳約20分鐘。紫外成像儀上攝像。
(3)實驗結果參見圖6A和圖6B，圖6A細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時，用RT-PCR法檢測，可見隨著和厚樸酚濃度增加，HSP70 mRNA含量減小，泳道1常氧對照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道5CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。β-actin為內對照。圖6B各組HSP70RT-PCR產物條帶分別除去其相應β-actin條帶的影響因子，圖中組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚、CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150μM)上調RKO細胞HSP70mRNA表達，其PCR產物條帶的灰度值比對照組上調224％。和厚樸酚濃度依賴性下調化學低氧所致的RKO細胞HSP70mRNA上調，PCR產物條帶的灰度值與CoCl2單獨作用組相比分別減少了73.1％、76.5％和87.8％。這個結果說明和厚樸酚可抑制HSP70的表達。
實施例7和厚樸酚對RKO細胞HSP70蛋白質的影響。
(1)實驗材料細胞RKO細胞來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；鼠抗人HSP70(NeoMarkers，美國)，HRP標記的羊抗鼠抗體(Santa Cruz，美國)?；瘜W發(fā)光檢測系統(tǒng)ECL反應液(Santa Cruz，美國)儀器電泳儀，電轉膜儀。
(2)實驗方法藥物誘導RKO細胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個復孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150μM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。收集細胞，提取蛋白質，做Western Blot檢測細胞內的HSP70蛋白質含量。
Western blot收集培養(yǎng)細胞，用生理鹽水洗兩次，細胞沉淀加入1×蛋白質提取緩沖液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000rpm離心20min，取上清測定蛋白質濃度(按DC Protein Assay Kit說明書進行)。取蛋白提取物50μg，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍染料到達凝膠最前沿，停止電泳。轉膜電泳結束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉膜緩沖液中，平衡30min。同時截取適當大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于轉膜緩沖液中，平衡10～15min，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉膜過夜。封閉將轉有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的TBST中封閉1hr。雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶400-500稀釋的鼠抗人HSP70(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5min×5次。壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5min后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內，壓片，洗片。
(3)實驗結果每組取10μg蛋白進行western blot檢測。結果參見圖7A和圖7B，圖7A細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時，用Western Blot法檢測，可見隨著和厚樸酚濃度增加，HSP70蛋白含量減小，泳道1常氧對照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道5CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。β-actin為內對照。圖7B各組HSP70蛋白條帶分別除去其相應β-actin條帶的影響因子，圖中組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚、CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150μM)模擬低氧上調RKO細胞HSP70蛋白表達，western blot條帶的灰度值與對照組相比增強了195.4％，具有顯著差異。和厚樸酚0.1-1μg/ml濃度時劑量依賴性抑制CoCl2對RKO細胞HSP70蛋白表達的影響，抑制率分別為22.8％、35.8％和75.2％。這個結果與實施例5共同說明和厚樸酚可抑制細胞內HSP70的表達，使細胞內HSP70的含量降低，后者含量的降低可導致HIF-1α的降解。
實施例8和厚樸酚下調Bcl-xL，上調Bid。
(1)實驗材料鼠抗人單抗P53(NeoMarkers，美國)；兔抗人多抗Bcl-2(武漢博士德公司)；兔抗人多抗Bcl-XL(武漢博士德公司)；兔抗人多抗Bid(武漢博士德公司)；兔抗人多抗Bax(武漢博士德公司)；HRP標記的羊抗鼠二抗(KPL公司，美國)；HRP標記的羊抗兔抗體(北京中山生物制品公司)；化學發(fā)光檢測系統(tǒng)ECL反應液(Santa Cruz公司，美國)；蛋白質定量試劑盒(DC proteinassay)(Bio-Rad公司，美國)；RT-PCR試劑盒(Promega公司，美國)；Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)；Protein MW marker(Fermentas公司，美國)；逆轉錄酶(Promega，美國)；RNA酶抑制劑(Promega，美國)；Taq酶(上海生工)。
(2)實驗方法細胞培養(yǎng)與藥物處理取對數生長期人結腸癌RKO細胞，用含10％滅活小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。用含10％小牛血清的新鮮RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚母液(5mg/ml)，使成所需濃度(5-15μg/ml)，作用細胞48hrs。
RT-PCR細胞總RNA提取取經不同濃度和厚樸酚作用48hrs的RKO細胞，棄去培養(yǎng)基，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，冰生理鹽水洗3次后用RNA提取試劑Trizol(每孔400ul)提取細胞RNA(按Trizol試劑說明進行)。RNA逆轉錄成cDNA按逆轉錄試劑盒方案進行，引物為寡核苷酸脫氧胸腺嘧啶(OligodT)。
引物序列如下(引物全由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’) PCR產物大小(堿基對)Bax ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGT ACAAAGATGGTCACGGTCTGC 332Bcl-xl GGAGCTGGTGGTTGACTTTCT CCGGAAGAGTTCATTCACTAC 379Bid GACCCGGTGCCTCAGGA ATGGTCACGGTCTGCCA 586Bcl-2TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG TACTGCTTTAGTGAACCTTTT 332βAGGCCAACCGCGAGAAGATGA GAAGTCCAGGGCGACGTAGCAC 350-actin CCPCR條件Bax，Bcl-xl，Bid，Bcl-294℃5分鐘→32循環(huán){92℃1分鐘→55℃30秒→72℃90秒}→72℃5分鐘→4℃保存β-actin95℃5分鐘→25-28循環(huán){95℃20秒→55℃20秒→72℃30秒→72℃7分鐘→4℃保持。
西部印跡法(Western blot)收集培養(yǎng)細胞，用生理鹽水洗兩次，細胞沉淀加入1×蛋白提取緩沖液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000轉速(rpm)離心20分鐘，取上清測定蛋白質濃度(按蛋白質定量試劑盒(DC protein assay)說明書進行)。取蛋白提取物20μg，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍染料到達凝膠最前沿，停止電泳。
轉膜電泳結束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉膜緩沖液(Transferbuffer)中，平衡30分鐘。同時截取適當大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于轉膜緩沖液中，平衡10～15分鐘，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉膜過夜。
封閉將轉有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的TBST中封閉1hr。
雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶400-500稀釋的一抗(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀釋的二抗(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5min×5次。
壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5min后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內，壓片，分別于1min、2min和5min洗片。
實驗結果p53和Bcl-2家族成員是細胞凋亡調控的關鍵因子。Bcl-2家族成員Bax和Bcl-xl是抑制凋亡的因子，在腫瘤細胞中常為高表達，Bcl-2和Bid是促進細胞凋亡的因子，在腫瘤細胞中常為低表達3。
參見圖8，和厚樸酚處理腫瘤細胞RKO后，Bax和Bcl-2在mRNA水平上與對照組相比無明顯差別，圖中M為分子量標記；1為對照，即0μg/ml的和厚樸酚處理；2為用5μg/ml和厚樸酚處理；3為用10μg/ml和厚樸酚處理；β-actin為PCR的內標。
參見圖9，和厚樸酚處理RKO細胞后，Bcl-XL的mRNA含量顯著下降，Bid的mRNA含量則顯著增加，圖中M為分子量標記；1為對照，即0μg/ml的和厚樸酚處理；2為用5μg/ml和厚樸酚處理；3為用10μg/ml和厚樸酚處理；β-actin為PCR的內標。
參見圖10，和厚樸酚處理RKO細胞后，Bax，Bcl-2和p53在蛋白質水平上與對照組相比無明顯差別，圖中honokiol為和厚樸酚的英文名，蛋白表達量用內標β-actin作為質控。
參見圖11，和厚樸酚處理RKO細胞后，Bcl-XL的蛋白質含量顯著下降，Bid的蛋白質含量則顯著增加，圖中honokiol為和厚樸酚的英文名，蛋白表達量用內標β-actin作為質控。
結論和厚樸酚可下調腫瘤細胞內抑細胞凋亡因子Bcl-xL，上調促細胞凋亡因子Bid。
實施例9 和厚樸酚上調并激活腫瘤細胞內Caspase成員實驗材料鼠抗人單抗caspase-3(NeoMarkers，美國)；鼠抗人單抗Caspase-7(NeoMarkers，美國)；鼠抗人單抗Caspase-9(NeoMarkers，美國)；HRP標記的羊抗鼠二抗(KPL公司，美國)。
實驗方法細胞培養(yǎng)和藥物處理取對數生長期人結腸癌RKO細胞，用含10％滅活小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。用含10％小牛血清的新鮮RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚母液(5mg/ml)，使成所需濃度(5-15μg/ml)，作用細胞48hrs。
西部印跡法(Western blot)收集培養(yǎng)細胞，用生理鹽水洗兩次，細胞沉淀加入1×蛋白提取緩沖液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000轉速(rpm)離心20分鐘，取上清測定蛋白質濃度(按蛋白質定量試劑盒(DC protein assay)說明書進行)。取蛋白提取物20μg，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍染料到達凝膠最前沿，停止電泳。
轉膜電泳結束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉膜緩沖液(Transferbuffer)中，平衡30分鐘。同時截取適當大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于轉膜緩沖液中，平衡10～15分鐘，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉膜過夜。
封閉將轉有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的TBST中封閉1hr。
雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶400-500稀釋的一抗(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀釋的二抗(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5min×5次。
壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECLA液0.7ml+ECLB液0.7ml)，加在膜上，5min后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內，壓片，分別于1min、2min和5min洗片。
實驗結果天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族是細胞凋亡的執(zhí)行者。Caspase在細胞中有兩種形式，無活性的酶元(procaspase)和有活性的酶。和厚樸酚處理RKO腫瘤細胞后，細胞內的酶元procaspase-3，-7，和-9含量顯著增加(圖12，13，14)，而且細胞內被激活的caspase-3的含量也顯著增加(圖13)。激活的caspase-3是細胞發(fā)生凋亡的關鍵點(Wang KW.Trends in<p>表CLi3-xMIIMIV(PO4)3MIV＝Zr、TiMII＝能夠具有+2氧化態(tài)的任何過渡金屬
(1)取自R.D.Shannon，Acta Cryst.A32，751(1976)。
(2)在每種情形下，MII與脫出的鋰離子數目成比例地氧化成更高的氧化態(tài)，因為ZrIV和TiIV不會氧化。
(3)RMM是相對分子質量。
(4)“脫出的鋰離子數目”一詞是基于一個化學式。
表2.和厚樸酚對人結腸癌細胞RKO細胞凋亡的誘導作用
和厚樸酚可誘導RKO腫瘤細胞內DNA呈特異性梯帶，參見圖15，其中條帶1對照；條帶25μg/ml和厚樸酚；條帶310μg/ml和厚樸酚條帶415μg/ml和厚樸酚。DNA特異性梯帶是確定細胞凋亡的標志。
實施例11和厚樸酚在體對人結腸癌細胞系RKO細胞所致實體瘤及腹水瘤的抑制作用(1)實驗材料細胞系人結腸癌細胞系RKO來源于美國ATCC公司；和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所。
動物Babl/c小鼠(上海動物中心)無菌飼養(yǎng)室及飼料(浙江省中醫(yī)學院提供)(2)實驗方法腹水瘤模型取對數生長期RKO細胞→0.25％胰酶消化片刻→離心、生理鹽水洗3次，徹底去除胰酶→細胞沉淀溶于無血清RPIM1640培養(yǎng)基，使成2×106/ml→每鼠腹腔接種100μl(含2×105細胞)→觀察腹部膨隆情況。
實體瘤模型取腹水瘤鼠一只→引頸處死→碘酊消毒皮膚，75％乙醇浸泡片刻→剪開腹壁皮膚，無菌生理鹽水1000μl沖淋腹腔→收集沖洗液→每鼠50μl(約含2×105細胞)接種于腋部皮下→隔天稱量體重，卡尺測量瘤體體積。
分組及用藥腹水瘤及實體瘤各分為3組空白對照組、溶劑組、用藥組。和厚樸酚溶于PEG400/蔗糖(體積比7∶3)溶液，使成25mg/ml，放置37℃搖床振蕩2小時，分裝備用。用藥組隔天每鼠灌胃5mg(100μl)和厚樸酚溶液，溶劑組給予等體積PEG400/蔗糖溶液，對照組給予等體積生理鹽水，隔天一次，連續(xù)用藥至對照組死亡。隔天稱量體重及測量瘤體大小或腹部膨隆情況。
(3)實驗結果<1>和厚樸酚對RKO細胞成腹水瘤的抑制作用腹水瘤組在腹腔接種當天開始用藥，每天觀測腹部膨隆，隔天記錄體重。比較各組平均生存時間。結果如表4所示，溶劑組和對照組的平均壽命分別是28.8天和29.7天，兩組之間無顯著差異。和厚樸酚用藥組平均壽命50.9天，比對照組延長22.18天，平均生存時間是對照組的176.7％，兩組之間有顯著差異(P＜0.05)，說明和厚樸酚能有效抑制RKO細胞形成腹水瘤，并延長荷瘤鼠的生存時間。
表3和厚樸酚對荷人RKO腹水瘤Balb/C裸鼠的平均生存時間和生存延長時間的影響實驗分組動物數 MST(天) T/C(％)對照組 7 28.8 100溶劑組 6 29.7 104.5和厚樸酚7 50.9 176.7*平均生存時間(mean survival time，MST)。生存時間延長率(The survivalrate，T/C％)，T/C(％)＝[試驗組的平均生存時間/對照組的平均生存時間]×100％.*P＜0.01，與溶劑組相比。
<2>和厚樸酚對RKO細胞成實體瘤的抑制作用取Babl/c小鼠10只，待瘤體增長至約5×5mm時，隨機分為對照組(3只)、溶劑組(3只)與用藥組(4只)。用藥組每次灌胃5mg和厚樸酚，隔天一次，持續(xù)21天。溶劑組給予等體積溶劑(PEG400/蔗糖)，對照組給予等體積生理鹽水。隔天稱重及測量瘤體大小，以每周最后一次的數據作圖，結果參見圖16，Y軸代表腫瘤體積，X-軸代表藥物治療天數，可見和厚樸酚可顯著遏制腫瘤的生長，“*”表示與對照組相比P＜0.05。
結果為對照組和用藥組開始時的平均瘤體體積分別為0.185cm3和0.171cm3，一周后兩組的增長率分別是361％和198％，相差1.8倍，但統(tǒng)計表明無組間差異(P＝0.055＞0.05)。第2周時對照組14天平均增長1182％，而用藥組只增長710％，前者與后者的比值為1.66，但統(tǒng)計表明有組間差異(P＝0.011＜0.05)。第3周時用藥組的增長明顯減慢，21天平均增長率是901％，而對照組達到1626％，兩組間差異顯著(P＜0.05)。第4周時對照組動物陸續(xù)死亡，而用藥組也停止給藥，但瘤體增長未見明顯增快，反而其中一只出現(xiàn)瘤體脫落現(xiàn)象。溶劑組與對照組無組間差異。以上結果表明，和厚樸酚對RKO細胞所致實體瘤具有顯著的抑瘤效果。
實施例1-9證明和厚樸酚的作用靶點為低氧誘導因子(HIF-1)，血管生長因子(VEGF)、一氧化氮合成酶、HSP70、Bcl-xL、Bid、和caspase；而實施例10和11用體外和體內實驗充分證明和厚樸酚通過作用于這些靶點可有效抑制腫瘤。研發(fā)抗腫瘤的靶點藥是當前的趨勢。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發(fā)明。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的部分參考文獻1.Ross JS，Schenkein DP，Peitrusko R，et al.Am J Clin Pathol.122598-609，2004.
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權利要求
1.和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，和厚樸酚，英文名為honokiol，CAS number35354-74-6，分子量266.33，化學命名為3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式為C18H18O2，腫瘤靶點是指低氧誘導因子-1、血管內皮細胞生長因子、氧化氮合成酶、熱休克蛋白質-70、細胞凋亡的相關蛋白。
2.根據權利要求1所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是在制備針對腫瘤細胞內低氧誘導因子-1來治療腫瘤的藥物中的應用。
3.根據權利要求2所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是在制備抑制腫瘤細胞內低氧誘導因子-1α的合成及其積聚的抗腫瘤藥物中的用途。
4.根據權利要求1所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是在制備針對腫瘤細胞的血管內皮細胞生長因子來治療腫瘤的藥物中的用途。
5.根據權利要求4所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是在制備抑制腫瘤細胞內的血管內皮細胞生長因子的合成的抗腫瘤藥物中的用途。
6.根據權利要求1所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是在制備針對腫瘤細胞的一氧化氮合成酶來治療腫瘤的藥物中的應用。
7.根據權利要求6所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是在制備調控腫瘤細胞內的一氧化氮合成酶的合成的藥物中的用途。
8.根據權利要求1所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是在制備針對腫瘤細胞的熱休克蛋白質-70來治療腫瘤的藥物中的應用。
9.根據權利要求8所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是在制備調控腫瘤細胞內的熱休克蛋白質-70的合成的抗腫瘤藥物中的用途。
10.根據權利要求1所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是在制備針對腫瘤細胞的調控細胞凋亡的因子來治療腫瘤的藥物中的應用。
11.根據權利要求10所述根據權利要求8所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是在制備抑制腫瘤細胞內抗凋亡因子Bcl-XL，增強促凋亡因子Bid的抗腫瘤藥物中的用途。
12.根據權利要求10所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是在制備誘導腫瘤細胞凋亡的抗腫瘤藥物中的應用。
13.根據權利要求1-10所述的任一和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，其特征是制備的藥物是由和厚樸酚與制劑允許的藥物賦形劑或載體組合，其制劑形式為液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、緩釋劑、滴丸劑或口崩制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點藥物中的用途，該和厚樸酚英文名為honokiol，CAS number35354－74－6，分子量266.33，化學命名為3，5’－diallyl－4，2’－dihydroxybiphenyl，分子式為C
文檔編號A61K31/05GK1633997SQ200410067749
公開日2005年7月6日 申請日期2004年10月29日 優(yōu)先權日2004年10月29日
發(fā)明者胡汛, 陳菲, 徐棟, 潘鏘榮, 顧影, 王弢 申請人:浙江大學