專利名稱：丹酚酸b及它的鹽和其它酚酸類的醫(yī)學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從中藥提取的有效成份的醫(yī)學(xué)用途。更具體指丹參通過化學(xué)方法提取出丹酚酸B及它的鹽和其它酚酸類的醫(yī)學(xué)用途。
背景技術(shù)：
丹酚酸B及它的鎂鹽理化數(shù)據(jù)為分子式C36H28MgO16；分子量740.9154；[d]D20+126.7(C 0.73，H2O)；Uvλmax 210(ε1.92×104)，286(ε1.35×104)，306(ε1.20×104)；IR3400；1700nm；1608，1519；1363；1288cm-1均有吸收峰通過MS NMR.U.V.IR證明其結(jié)構(gòu)為 1M+＝Mg2+/22M+＝NH4++K+丹酚酸B(lithospermate B)C36H28MO16 迷迭香酸(rosmarinic acid) 紫草酸(lithospermic acid)C18H16O8C27H22O12
丹參素(Danshensu)C9H10O51、MTB在高血脂動物模型主動脈條上，通過肉眼，光鏡，電鏡觀察到有明顯的抗AS作用，肉眼可見明顯減少黃色斑塊隆起，粥樣硬化程度分級明顯降低，光鏡觀察到內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞層數(shù)較少，平滑肌細(xì)胞增殖較輕，電鏡下示內(nèi)皮細(xì)胞改變較輕，泡沫細(xì)胞較少，收縮型平滑肌細(xì)胞所占比例較大，干滑肌細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，線粒體較少，究肌絲含量較多，細(xì)胞分化程度較好；2、MTB可調(diào)節(jié)血脂，降低TC，TG，LDL，LP(a)，升高HDL；抗脂質(zhì)過氧化，提高SOD活性；3、MTB可提高NO，減低內(nèi)皮素血漿水平，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，并通過抑制動脈粥樣硬化組織Bfgf(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)在動脈壁的表達(dá)，調(diào)控平滑肌細(xì)胞的遷移與增殖，干預(yù)AS的進(jìn)程。
以上實(shí)驗(yàn)均是硝苯地平作陽性對照性，作用于優(yōu)于硝苯地平。
1、丹酚酸B對CCl4誘導(dǎo)的大鼠慢性肝損傷及肝纖維化形成有良好的抑制作用。
(1)有效抑制肝臟結(jié)締組織增生，降低肝臟膠原含量，其效果優(yōu)于秋水仙堿及原生藥丹參；(2)抗肝細(xì)胞損傷，丹酚酸乙各劑量組均能顯著降低模型大鼠較大幅度增高的血清ALT、AST活性及總膽紅素含量，高劑量組顯著提高血清Alb含量。綜合作用于對照藥物(丹參組對降總膽紅素的作用于不明顯，秋水仙堿對降A(chǔ)ST的作用不明顯)。(3)丹酚酸乙量效結(jié)果顯示以中劑量(12.5mg/Kg鼠重)為佳。
2、丹酚酸乙對已形成的DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有良好的治療效果。
(1)顯著促進(jìn)肝內(nèi)膠原的重吸收，降低肝組織Hyp含量及I型膠原的沉積；(2)促進(jìn)損傷肝細(xì)胞的修復(fù)，提高血清Alb含量，降低血清ALT、AST活性；(3)顯著降低大鼠腹水出現(xiàn)率；(4)作用優(yōu)于秋水仙堿及原生藥丹參；(5)具一定的量效關(guān)系，有效劑量區(qū)間為12.5mg/kg/d～25mg/kg/d。
3、丹酚酸乙有一定的促進(jìn)機(jī)體體液免疫功能與細(xì)胞免疫功能作用。能促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高小鼠血清中的溶血素含量，抑制小鼠的白細(xì)胞移動。增加小鼠抗體生成細(xì)胞的數(shù)量。
4、對體外肝星狀細(xì)胞功能的影響。能顯著抑制HSC的增殖，抑制活化HSC的TGFβ1自分泌及活化；降低I型前膠原mRNA表達(dá)與膠原蛋白的生成，抑制TGFβ1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中MAPK的活化。
5、一般藥理研究本品劑量為3.8、7.5和15mg/kg灌胃對麻醉Beagle犬的呼吸和循環(huán)系統(tǒng)的功能無明顯的影響；本品劑量15、30和60/kg灌胃對小鼠爬桿試驗(yàn)和Iruin行為分級試驗(yàn)均無影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類具有對肺纖維化抑制作用的藥物質(zhì)(化合物)本發(fā)明涉及的化合物為丹酚酸B及它的鹽包括鎂、銨、鉀鹽(DS-1)和丹酚酸B鹽與其它酚酸類包括迷迭香酸、紫草酸、丹參素及/或它的鹽的組合物(DS-2)的醫(yī)學(xué)用途。
丹酚酸B及鎂鹽對心血管的作用及對肝損傷，肝纖維化已作了大量試驗(yàn)，特別是對心血管的作用具有調(diào)節(jié)血脂，降低TC，TG，LDL，LP及升高HDL作用。本發(fā)明對丹酚酸B及它的鹽進(jìn)行肺纖維化抑制作用的試驗(yàn)，通過體外、體內(nèi)的試驗(yàn)，證明丹酚酸B及它的鹽具有對肺纖維化抑制作用。


圖1是DS-1對TGF-β1刺激的WI-38細(xì)胞I型膠原合成增加的影響。
圖2是DS-2對TGF-β1刺激的WI-38細(xì)胞I型膠原合成增加的影響。
圖3是DS-1對WI-38細(xì)胞增殖的影響(*p＜0.05vs.培養(yǎng)液對照(Con))。
圖4是DS-2對WI-38細(xì)胞增殖的影響(*p＜0.05vs.培養(yǎng)液對照(Con))。
圖5是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)28天時(shí)大鼠病理解剖所見，其中A.空白對照組；B.BLM模型組，肺表面出血、纖維化病灶明顯；C.DS-12.5mg/kg治療組，肺表面出血、纖維化病灶明顯減少、減輕；D.DEX組，肺表面出血、纖維化病灶減少、減輕。
圖6是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)28天時(shí)大鼠病理組織學(xué)檢查所見，其中A.空白對照組；B.BLM模型組，肺組織大面積纖維化，肺泡間隔明顯增厚，炎癥、出血病變明顯；C.DS-1 2.5mg/kg治療組，肺組織炎癥、出血明顯減輕，纖維化病變程度明顯改善；D.DEX組，肺組織炎癥、出血明顯減輕，纖維化病變程度改善。
具體實(shí)施例方式
試驗(yàn)物質(zhì)丹酚酸B及它的鹽，包括鎂、銨、鉀鹽(DS-1)，丹酚酸B鹽與其他酚酸類包括迷迭香酸、紫草酸、丹參素及/或它的鹽的組合物(DS-2)。它們的含量以重量百分比計(jì)，丹酚酸B鹽含60-75％，迷迭香酸5-20％，紫草酸為5-16％，丹參素為3-10％。
藥理試驗(yàn)分為體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)二部分一、體外試驗(yàn)DS-1和DS-2對W1-38細(xì)胞增殖及TGF-β1刺激的膠原合成的影響1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑u價(jià)DS-1和DS-2體外對WI-38細(xì)胞增殖及TGF-β1刺激的膠原合成的影響。
2.材料與方法2.1受試藥物及試劑DS-1和DS-2由中國科學(xué)院上海藥物研究所天然藥物化學(xué)研究室提供。
重組人TGF-β1購自美國R&D公司。
人I型膠原檢測ELISA試劑盒購自美國Chondrex公司。
細(xì)胞增殖檢測試劑盒，CCK-8購自日本Dojindo公司。
2.2細(xì)胞培養(yǎng)WI-38，人胚胎肺成纖維細(xì)胞系購自美國ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)條件為DMEM培養(yǎng)液(10％胎牛血清(FCS))，37℃、5％CO2空氣中貼壁孵育2h，更換培養(yǎng)液去除未貼壁之雜細(xì)胞。待細(xì)胞生長至70％融合時(shí)，用胰酶消化，按1∶4傳代。實(shí)驗(yàn)用10-15代的細(xì)胞。用胎盤蘭拒染方法判斷細(xì)胞存活率。
用DMEM培養(yǎng)液(10％FCS)制成2×105cell/ml的細(xì)胞懸液，按每孔100μl加入96孔板中，用于細(xì)胞增殖率測定。
用DMEM培養(yǎng)液(10％FCS)制成7.5×104cell/ml的細(xì)胞懸液，按每孔1ml加入24孔板中，24h后去培養(yǎng)液，加入含0.4％FCS和50μg/ml抗壞血酸鹽的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入TGF-β1(10ng/ml)和不同濃度的DS-1/DS-2，用于I型膠原合成的檢測。
2.3人I型膠原檢測人I型膠原檢測應(yīng)用ELISA方法，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。讀取490nm吸光度值。結(jié)果表示為微克I型膠原每毫克蛋白(μg/mg)。
2.4細(xì)胞增殖測定融合的WI38細(xì)胞用胰酶消化，洗滌，離心后，用DMEM培養(yǎng)液(含10％FCS)制成2×105cell/ml的細(xì)胞懸液，存活率＞95％，按每孔100μl加入96孔板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)24h后，棄上清，每孔加入不同處理因素的濃度的DS-1或DS-2，繼續(xù)培養(yǎng)21h，加入WST10μl，繼續(xù)培養(yǎng)3h，讀取OD450值。結(jié)果以O(shè)D 450表示。
2.5數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)方法各檢查指標(biāo)數(shù)據(jù)錄入SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果用mean±SD表示。計(jì)量指標(biāo)，若方差齊用ANOVA過程進(jìn)行分析，最小顯著級差法(LSD)進(jìn)行各組間比較，方差不齊的用Student t test進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。顯著性水準(zhǔn)為p＜0.05。
3、結(jié)果3.1 DS-1、DS-2對I型膠原合成的影響為了檢測DS-1、DS-2對人肺成纖維細(xì)胞膠原合成的直接作用，進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖1和2。TGF-β1對WI-38細(xì)胞的I型膠原合成有明顯的促進(jìn)作用。而DS-1和DS-2對TGF-β1誘導(dǎo)的I型膠原合成增加有明顯的抑制作用，并呈依劑量關(guān)系。
3.2 DS-1、DS-2對細(xì)胞增殖的影響DS-1和DS-2對細(xì)胞增殖的影響見圖3和4。DS-1和DS-2在100μg/ml的濃度下對WI-38細(xì)胞的細(xì)胞增殖有一定的抑制作用(p＜0.05).但在10，和1μg/ml濃度下對WI-38細(xì)胞的細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用(p＜0.05)。
4、小結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DS-1、DS-2在體外可以抑制由TGF-β1刺激的WI-38細(xì)胞I型膠原合成的增加；另外在DS-1和DS-2在100μg/ml的濃度下對細(xì)胞增殖均有抑制作用。這些結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)的組織病理學(xué)檢查所觀察到的DS-1，DS-2對BLM誘導(dǎo)的SD大鼠肺纖維化的抑制作用相一致。
二、體內(nèi)試驗(yàn)DS-1和DS-2對博來霉素A5誘導(dǎo)的SD大鼠肺纖維化的作用1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察DS-1，DS-2對博來霉素A5(BLMA5)誘導(dǎo)的SD大鼠肺纖維化是否具有抑制作用。
2.受試藥物受試藥物1DS-1受試藥物2DS-2提供單位中國科學(xué)院上海藥物研究所天然藥物化學(xué)研究室含量＞99％對照樣品名稱醋酸地塞米松片提供單位上海信宜藥業(yè)有限公司批號020601含量0.75mg/片其他藥品與試劑注射用平陽霉素(BLMA5)，白色或淡黃色凍干粉，批號021002，天津太河制藥有限公司，用0.9％生理鹽水配制成注射液。
3.動物3.1來源、種屬、品系及試驗(yàn)前處理SPF級SD大鼠由由中英合資西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。許可證號SCXK(滬)2003-0002。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)中國科學(xué)院上海藥物研究所SPF級動物房1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)合格證號SYXK(滬)2003-0029。動物房條件控制溫度23±2℃，濕度60±10％，光照12h/24h，黑暗12h，動物飼料由西普爾必凱公司提供。適應(yīng)期間動物每2只1籠。
3.2動物周齡、體重、性別實(shí)驗(yàn)開始時(shí)動物10周齡左右，70只，每組10只，體重200-250g，雄性。
4.實(shí)驗(yàn)方法4.1 BLMA5誘導(dǎo)SD大鼠肺纖維化模型復(fù)制采用一次性氣管內(nèi)滴注BLMA5的方法復(fù)制大鼠肺纖維化動物模型。大鼠麻醉后在頸部正中切口，剝離皮下組織及肌肉，暴露氣管用1ml注射器將BLMA5/生理鹽水緩慢注入氣管，BLMA5劑量為5mg/kg。生理鹽水對照組氣管滴注等體積生理鹽水。造模后連續(xù)給藥28天后處死，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測和評價(jià)。
4.2實(shí)驗(yàn)分組與處理1)生理鹽水對照組(即空白對照)2)模型組(BLMA5組)3)DS-1 2.5mg/kg治療組(DS-1高劑量組)4)DS-1 1.25mg/kg治療組(DS-1低劑量組)5)DS-2 2.5mg/kg治療組(DS-2高劑量組)6)DS-2 1.25mg/kg治療組(DS-2低劑量組)7)地塞米松0.5mg/kg治療對照組(DEX組)空白對照組和模型組每日1次灌胃滅菌雙蒸水，DEX組給予0.5mg/kg地塞米松。
給藥體積為10ml/kg體重。
5.劑量設(shè)置及理由大鼠灌胃DS-1，DS-2 2.5，1.25mg/kg對CCl4和DMN誘導(dǎo)的大鼠慢性肝損傷和纖維化形成有良好的抑制作用。為此設(shè)DS-1，DS-2預(yù)實(shí)驗(yàn)的高劑量均為2.5mg/kg，每日1次灌胃，低劑量減半，為1.25mg/kg 2個(gè)劑量組，共4個(gè)治療組。
6.觀察指標(biāo)6.1一般臨床表現(xiàn)主要觀察造模后大鼠是否出現(xiàn)發(fā)紺，呼吸急促等呼吸困難表現(xiàn)，其它如毛松，精神萎靡等一般毒性表現(xiàn)。
6.2病理解剖觀察6.2.1肉眼觀察肺組織的顏色、病變部位和程度；6.2.2肺濕重及臟器系數(shù)大鼠麻醉后，開胸，行右心室插管，PBS灌流沖去肺組織中的血液。取左肺稱濕重，并計(jì)算臟器系數(shù)。取左肺，10％中性福爾馬林固定，做病理組織學(xué)檢查。右肺在-80℃冰箱冰存，做組織生化學(xué)檢測。
6.3肺組織生化學(xué)檢查肺組織羥脯氨酸(HP)含量采用改進(jìn)的氯胺T法。
6.4病理學(xué)組織學(xué)檢查病理組織學(xué)檢查肺組織經(jīng)固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色。顯微鏡下觀察肺組織炎癥、出血和纖維化等病變，并進(jìn)行圖像分析，對肺泡炎和纖維化程度進(jìn)行評價(jià)。
7.數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各檢查指標(biāo)數(shù)據(jù)錄入SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果用mean±SD表示。體重，肺濕重及相對重，肺組織羥脯氨酸含量，肺組織切片圖像分析結(jié)果等計(jì)量指標(biāo)，若方差齊用ANOVA過程進(jìn)行分析，最小顯著級差法(LSD)進(jìn)行各組間比較，方差不齊的用Student t test進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。
8.實(shí)驗(yàn)結(jié)果8.1死亡情況一些大鼠造模后給藥期間出現(xiàn)死亡，BLMA5組死亡3只。DS-1 1.25mg/kg組死亡1只。DS-2 2.5和1.25mg/kg組分別有3只，4只大鼠死亡。各組死亡率總結(jié)見表1。
表1各組大鼠死亡率

8.2臨床表現(xiàn)模型組大鼠氣管內(nèi)滴注BLMA5后出現(xiàn)萎靡，少動，毛松，第3天至第9天呼吸急促，發(fā)紺等呼吸道癥狀表現(xiàn)明顯，并伴有消瘦、體重減輕。第10天之后上述癥狀逐漸稍有改善，但至給藥28天時(shí)仍有以上臨床表現(xiàn)。DS-1各劑量和DS-2高劑量組治療組上述的臨床表現(xiàn)與模型組相比明顯減輕，約10天左右癥狀明顯改善，約15天左右，與空白對照相比，無明顯差別。DEX治療組大鼠也出現(xiàn)相似的臨床表現(xiàn)，但呼吸急促，發(fā)紺的程度較模型組輕。
8.3左肺濕重與相對重％DS-1，DS-2對BLMA5誘導(dǎo)肺纖維化的SD大鼠肺濕重和相對重的影響見表1。結(jié)果顯示，與模型組相比，各治療組左肺濕重和相對重量略有下降，且DS-1各治療組的下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表2各組大鼠肺濕重和相對重

*p＜0.05**p＜0.01vs.空白對照組；#p＜0.05，##p＜0.01vs.BLM組；ap＜0.05vs.DEX組；相對重％＝左肺濕重(g)/體重(g)×100％8.4肺組織生化學(xué)檢查HP含量是衡量組織膠原蛋白含量的特異性生化指標(biāo)。灌胃DS-1，DS-2對肺組織膠原蛋白含量的影響見表3。結(jié)果顯示BLM模型組及各治療組的HP含量均顯著高于空白對照組(p＜0.05)。DS-1各治療組和DS-22.5mg/kg劑量組的HP含量低于BLM組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表3各組大鼠右肺組織HP含量

*p＜0.05**p＜0.01vs.空白對照組；#p＜0.05，##p＜0.01vs.BLM組；ap＜0.05vs，DEX組8.5病理解剖和病理組織學(xué)檢查實(shí)驗(yàn)第28天，各組動物解剖時(shí)可見，DS-1各治療組和DS-22.5mg/kg組與模型組相比，肺組織表面出血點(diǎn)和纖維化病灶有不同程度減少(5)。病理組織學(xué)檢查顯示，模型組大鼠肺組織可見出血，較多淋巴細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞浸潤，肺泡壁明顯增厚并可見較多成纖維細(xì)胞，部分肺泡腔消失，或被淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞團(tuán)和膠原纖維填塞。與模型組相比，DS-12.5mg/kg組動物肺組織出血、炎細(xì)胞浸潤明顯減少，肺纖維化病變程度明顯減輕(圖6)。DS-11.25mg/kg治療組和DS-22.5mg/kg組劑量組肺組織出血、炎癥和纖維化程度減輕不如DS-12.5mg/kg組明顯，并與地塞米松組的結(jié)果相似。
對各組大鼠肺組織切片進(jìn)行圖像分析，結(jié)果顯示，DS-1各治療組、DS-22.5mg/kg組和DEX治療對照組淺染區(qū)面積百分比明顯較模型組減少，說明在該劑量下對BLM引起的肺纖維化有一定的抑制作用；各治療組肺泡炎病變程度(見深染區(qū)面積百分比)與模型組相比有不同程度的減輕。
表4各組大鼠肺組織切片圖像分析結(jié)果

*p＜0.05**p＜0.01vs.空白對照組；#p＜0.05，##p＜0.01vs.BLM組；ap＜0.05vs.DEX組淺染區(qū)代表肺間質(zhì)纖維化程度，深染區(qū)代表炎癥區(qū)域，代表炎癥反應(yīng)程度，無染區(qū)為肺泡腔。
9.小結(jié)SD大鼠灌胃DS-1對BLMA5誘導(dǎo)的肺纖維化的作用為●DS-1可以明顯減少BLMA5引起的大鼠死亡●對存活大鼠的一般臨床表現(xiàn)有改善作用；●降低BLMA5引起的肺濕重增加；●對BLMA5誘導(dǎo)的肺組織HP含量增加有一定的抑制作用，病理組織學(xué)檢查顯示與模型組相比，DS-1各治療組對肺纖維化病變有不同程度的改善，呈依劑量關(guān)系DS-1高劑量組的抑制作用優(yōu)于地塞米松治療對照組。
SD大鼠灌胃DS-2對BLMA5誘導(dǎo)的肺纖維化的作用為●對存活大鼠的一般臨床表現(xiàn)有改善作用，但沒有DS-1明顯；●降低BLMA5引起的肺濕重增加；●對BLMA5誘導(dǎo)的肺組織HP含量增加有一定的抑制作用。病理組織學(xué)檢查顯示，與模型組相比，肺纖維化病變有所改善。高劑量組于地塞米松治療對照組相當(dāng)，而低劑量組的抑制作用不明顯。
權(quán)利要求
1.丹酚酸B及它的鹽或丹酚酸B鹽和丹參酸類化合物組成的組合物的醫(yī)學(xué)用途，作為在制備預(yù)防、治療人的肺纖維化藥物中應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹酚酸B及它的鹽或丹酚酸B鹽和丹參酸類化合物組成的組合物的醫(yī)學(xué)用途，其特征在于丹酚酸B及它的鹽、迷迭香酸、紫草酸、丹參素鈉鹽組成的組合物作為制備預(yù)防、治療人的肺纖維化藥物中應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹酚酸B及它的鹽或丹酚酸B鹽和丹參酸類化合物組成的組合物，其特征在于該組合物為(以重量百分比計(jì))丹酚酸B鹽 60-75％迷迭香酸5-20％紫草酸為3-16％丹參酸為3-10％。
全文摘要
本發(fā)明公開了丹酚酸B及它的鹽和由丹酚酸B及它的鹽、迷迭香酸、紫草酸、丹參素鈉鹽組成的組合物的醫(yī)學(xué)用途。通過動物體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明丹酚酸B及它的鹽具有對肺纖維化抑制作用，該作用與地塞米松治療對照組相當(dāng)。
文檔編號A61P11/00GK1768738SQ20041006790
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者朱大元, 任進(jìn), 蔣山好, 宮麗昆 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所