專利名稱：SARS康復(fù)者血液淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)基因的cDNA文庫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及SARS康復(fù)者血液淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)基因的cDNA文庫。
背景技術(shù)：
SARS是由冠狀病毒的一個新的變種引起的嚴(yán)重傳染性疾病，其傳播快、病情嚴(yán)重、病死率高，已成為新世紀(jì)嚴(yán)重危害人類健康的瘟疫。
抑制性消減雜交技術(shù)是一種以抑制性PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)，將標(biāo)準(zhǔn)化測試cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術(shù)。通過合成兩個不同的接頭，接于經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后的測試cDNA片段的5’末端，將測試和驅(qū)動進(jìn)行兩輪雜交。標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了測試中的cDNA單鏈豐度，消減雜交步驟去除測試和驅(qū)動之間的共同序列。利用抑制性PCR選擇性擴(kuò)增目的cDNA片段，同時抑制非目的cDNA的擴(kuò)增。因此，抑制性消減雜交技術(shù)顯著增加了獲得低豐度差異表達(dá)的cDNA的概率。所謂抑制性PCR是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火，使非目的序列片段兩端的長反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生“鍋柄樣”結(jié)構(gòu)，無法與引物配對，從而選擇性抑制非目的序列片段擴(kuò)增。抑制性消減雜交技術(shù)的基本實(shí)驗過程如下首先，將要進(jìn)行比較的兩種組織或細(xì)胞來源的mRNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，把含有目的基因的cDNA稱為測試方(tester)，把參考cDNA稱為驅(qū)動方(driver)，用同一種限制性內(nèi)切酶Rsa I切割，產(chǎn)生末端平頭的片段，將測試cDNA分為兩份，每份連接不同的接頭，即接頭1(adaptor 1)和接頭2(adaptor 2)。接頭為雙鏈DNA片段，且5’-端均無磷酸基，這樣保證只有接頭中的長鏈可以與cDNA的5’-末端連接，兩個接頭含有可識別的序列。接下來進(jìn)行兩次雜交。第一次雜交在每個測試方里加入過量驅(qū)動，然后變性、退火，根據(jù)雜交動力學(xué)第二定律，即豐度越高的分子退火速度越快，因此測試方cDNA與驅(qū)動方cDNA相同片段大都形成異源雙鏈分子，使得差異表達(dá)的單鏈分子得到富集。第二次雜交，將進(jìn)行過首次雜交的兩組樣品不經(jīng)變性而直接混合，只有剩下的經(jīng)過消減并平均化了的差異表達(dá)的單鏈cDNA可以重新結(jié)合為新的雜交體分子，這種雜交體分子兩端帶有不同的接頭1和接頭2，加入新鮮變性的驅(qū)動方進(jìn)行第二輪消減雜交，進(jìn)一步富集差異表達(dá)的雜交體分子，并用DNA酶補(bǔ)平末端，這樣差異表達(dá)的測試序列-雜交體分子5’-和3’-端就有了進(jìn)行巢式PCR所需的不同的退火位點(diǎn)。最后，進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，第一次PCR只有兩端連接有不同接頭的雙鏈cDNA片段才得以指數(shù)擴(kuò)增，而其他形式如一端有接頭，而另一端無接頭的只能線性擴(kuò)增，沒有引物結(jié)合點(diǎn)的不能擴(kuò)增，還有兩端為同一接頭的形成袢狀而無法獲得指數(shù)擴(kuò)增。利用巢式引物進(jìn)行第二次PCR，富集差異表達(dá)的基因片段。PCR產(chǎn)物可以被直接插入T載體，或者利用接頭1上的NotI/SmaI/XmaI位點(diǎn)和接頭2上的EagI位點(diǎn)進(jìn)行定向克隆，或者接頭與cDNA連接處的RsaI位點(diǎn)平端克隆。然后利用測序和雜交分析來分析差異表達(dá)的序列，或者用PCR產(chǎn)物作探針來篩選DNA文庫。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供SARS康復(fù)者血液淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)基因的cDNA文庫。
本發(fā)明所提供的SARS康復(fù)者血液淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)基因的cDNA文庫，由序列表中的序列1至序列89的核苷酸序列組成。
序列表中序列1至序列89的cDNA序列對應(yīng)的克隆號為s1至s89。
本發(fā)明的cDNA文庫共包括89個cDNA克隆，以文庫中的克隆序列為基礎(chǔ)，與美國國家生物技術(shù)信息中心GenBank等數(shù)據(jù)庫中人類基因進(jìn)行比較和分析，初步篩選出60個與SARS康復(fù)者SARS冠狀病毒抗體產(chǎn)生相關(guān)和可用于SARS患者治療的克隆，這些克隆為SARS康復(fù)者機(jī)體免疫機(jī)理和康復(fù)機(jī)理的研究和對SARS患者的治療研究提供了分子依據(jù)；對于保存SARS康復(fù)者與健康人淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)的基因以及篩選SARS冠狀病毒特異性抗體相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。同時對研究SARS康復(fù)者SARS冠狀病毒抗體發(fā)生機(jī)理和篩選抑制SARS冠狀病毒的藥物以及預(yù)防SARS病毒感染的疫苗具有重要意義。


圖1為部分重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增和鑒定圖譜圖2a為TMSB4基因在SARS康復(fù)者和健康者中的表達(dá)差異圖譜圖2b為HBB基因在SARS康復(fù)者和健康者中的表達(dá)差異圖譜圖3a為10例IgG抗體陽性的SARS康復(fù)者樣本中持家基因G3PDH的表達(dá)圖譜圖3b為10例IgG抗體陰性的健康者樣本中持家基因G3PDH的表達(dá)圖譜圖4為B2M基因在康復(fù)者和健康者中的表達(dá)差異圖5為HBB在SARS康復(fù)者中的多態(tài)性具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、SARS康復(fù)者與健康人血液淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)基因的cDNA文庫的建立10例SARS康復(fù)者經(jīng)SARS康復(fù)患者復(fù)診診室抽取靜脈血檢測，其SARS冠狀病毒特異性抗體IgG皆為強(qiáng)陽性；10例健康血液標(biāo)本來自北京血站的獻(xiàn)血者，經(jīng)檢測SARS冠狀病毒特異性抗體IgG為陰性。上述實(shí)驗者的靜脈血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離后提取細(xì)胞總RNA。以10例SARS康復(fù)者的RNA為實(shí)驗方(Tester)，10例健康獻(xiàn)血者的RNA為驅(qū)動方(Driver)進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選和差減文庫的構(gòu)建。具體過程如下1、細(xì)胞總RNA的提取分離實(shí)驗者血液中的淋巴細(xì)胞，采用Trizol(Gibicol)試劑分別提取各個實(shí)驗者淋巴細(xì)胞的總RNA。
2、抑制消減雜交(SSH)將10例SARS康復(fù)者淋巴細(xì)胞的RNA混合在一起為Tester，10例健康者淋巴細(xì)胞的RNA混合在一起為Driver進(jìn)行差減雜交。具體操作按SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit和Clontech PCR-SelectTMcDNA Subtractive Kit說明書進(jìn)行。
3、差減cDNA文庫的構(gòu)建(T/A克隆法)從第二次巢式PCR擴(kuò)增后的差減基因產(chǎn)物中取出3μl，與1μl pGEM-T載體連接，4℃過夜。從連接體系中取4μl轉(zhuǎn)化受體菌DH5α，接種于X-gal/IPTG Amp瓊脂平板上培養(yǎng)，挑取白色克隆在5ml LB培養(yǎng)基中37℃振搖培養(yǎng)過夜，加15％甘油，液氮速凍，-70℃保種。
4、文庫的鑒定和篩選(測序和PCR法)測序鑒定挑取消減文庫中的89個克隆，對插入的cDNA片段從質(zhì)粒載體的T7端進(jìn)行單向測序，結(jié)果得到具有序列表中序列1至序列89的核苷酸序列的s1至s89的89個cDNA序列。
PCR鑒定與篩選用與接頭有互補(bǔ)序列的內(nèi)引物巢式引物1R和2R(巢式引物序列1R5`-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3`，巢式引物序列2R5`-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3`)對質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，取5μl步驟3中的白色克隆菌液于5ml MS液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，再取1μl培養(yǎng)液直接作模板，然后依次加入10×PCR buffer 2.5μl，巢式引物1R和2R各1.0μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(2.5U)，50×dNTP 0.5μl，H2O 18.5μl，于94℃ 30s、68℃ 30s、72℃ 1.5min，30個循環(huán)擴(kuò)增，進(jìn)行PCR鑒定。同時以pGEM-T載體兩端的一對通用引物T7/SP6引物擴(kuò)增89個克隆的外源插入片段，進(jìn)行PCR篩選(除引物為T7和SP6外，PCR的反應(yīng)體系和循環(huán)程序同上)。反應(yīng)結(jié)束后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。因為只有插入片段才連有接頭，所以在電泳圖譜上可見擴(kuò)增產(chǎn)物者為陽性克隆，而無擴(kuò)增產(chǎn)物者為空載質(zhì)粒。結(jié)果表明差異表達(dá)的基因已成功的克隆到TA載體中。所有克隆都得到了特異擴(kuò)增片段，外源插入片段的大小大部分介于500-1000bp之間，平均大小在750bp左右，與SSH設(shè)計預(yù)期的插入片段大小吻合(圖1)。圖1中，1、2、3為T7/SP6引物擴(kuò)增部分質(zhì)粒，4為2000bp DNA marker，5、7、8為巢式引物1R和2R擴(kuò)增重組質(zhì)粒，6為巢式引物1R和2R擴(kuò)增空載體質(zhì)粒。
經(jīng)過上述步驟，獲得SARS康復(fù)者血液淋巴細(xì)胞差異表達(dá)的基因文庫1個，文庫中共有89個克隆。
實(shí)施例2、SARS冠狀病毒抗體相關(guān)克隆的鑒定一、生物信息學(xué)分析參考國際互聯(lián)網(wǎng)上相關(guān)的數(shù)據(jù)庫對實(shí)施例1的文庫中克隆的序列進(jìn)行相應(yīng)的比較和分析，包括同源性比較、EST拼接、功能域預(yù)測等相應(yīng)的生物信息學(xué)分析，并推測未知基因的可能功能。
利用DNA序列生物信息學(xué)分析的網(wǎng)站、數(shù)據(jù)庫和軟件進(jìn)行分析1、互聯(lián)網(wǎng)站和數(shù)據(jù)庫a.National Center for Biotechnology Information(NCBI)http//www.ncbi.nlm.nih.govb.European Bioinformatics Institute(EBI)http//www.ebi.ac.uk2、生物信息學(xué)公共數(shù)據(jù)庫a.Genebank data basehttp//www.nici.nlm.nih.gov/Web/Genebankb.表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(dbEST)http//www.nici.nlm.nih.gov/dbESTc.BodyMap(Anatcmical Expression Database of human genes)http//cookie.imcb.osaka-u.ac.jp/bodymap3、生物信息學(xué)分析軟件a.與公其數(shù)據(jù)庫作DNA序列同源性比較軟件http//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/b.與EST數(shù)據(jù)庫(dbEST)作序列同源性比較軟件Blastn2.0.124、與公共數(shù)據(jù)庫(Genebank nonredundant database)作DNA序列同源性比較對于所測定的序列與公共數(shù)據(jù)庫Genebank nonredundant database用Blastn軟件作DNA序列同源性比較。通過Internet互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)入http//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast？Jform＝1，按照說明填寫Sbmit sheet，選擇合適參數(shù)(表1)，實(shí)現(xiàn)在線DNA序列同源性比較。
表1.與Genebank作DNA序列同源性比較的參數(shù)設(shè)置

Expect值有0.0001、0.01、1、10、100、1000五種選擇，值越小，比較結(jié)果越嚴(yán)格，假陽性率越低，給出的同源基因越少。選擇1時，一般都有同源序列給出，比較也較嚴(yán)格。
同源序列配對情況圖示能十分直觀地顯示序列之間同源情況，粗線條表示同源范圍，顏色表示同源程度。
Descriptions指給出的同源序列的名稱，共有0、10、50、100、250、500六種選擇，由于最關(guān)心的是最同源的序列，所以選擇50。
Alignments指具體的序列配對情況，共有0、10、50、100、250、500六種選擇。
5、所測EST序列的分類和組成類型分析按照序列與公共數(shù)據(jù)庫同源性比較結(jié)果給出的Score值，結(jié)合EST的長度將所測定的EST序列分成3類已知序列(同源性＞90％)、同源序列(同源性40％-90％)和未知新序列(同源性＜40％)。在此基礎(chǔ)之上，對已知編碼序列依據(jù)功能和定位進(jìn)行分類。
核酸序列的檢索聯(lián)網(wǎng)至http//www.ncbi.nlm.nih.gov80/entrez/query.fcgi？db＝Nucleotide進(jìn)行檢索，輸入需要檢索的內(nèi)容，點(diǎn)擊Search鍵開始查詢。
核酸序列同源性分析查詢該序列是否是已知序列及與已知序列同源性的高低。采用NCBI的Blast軟件對GenBank中的非冗余數(shù)據(jù)庫(non-redundant database，nr)(網(wǎng)址為httn.//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)進(jìn)行查詢。該數(shù)據(jù)庫是對Genbank、EMBL和DDBJ中去除所有相同核酸序列進(jìn)行后整合所得到的最為全面的已知基因的數(shù)據(jù)庫，其中還包括了部分基因組的序列。
按照上述方法將89個克隆的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行了比較，79個克隆的測序結(jié)果成功的進(jìn)行了比對4個cDNA克隆未查到同源序列，占已測序克隆的5.06％；其它75個克隆共代表了11個不同的已知基因，其中52個克隆代表同一個基因。表明SARS康復(fù)者體內(nèi)的確存在豐度較高的差異表達(dá)基因。75個克隆對應(yīng)的已知序列的名稱如下(1)克隆s1編碼胸腺素3(thymosin-like 3，TMSB4X)(2)克隆s2，s3，s5，s8，s9，s10，s11，s13，s14，s15，s16，s17，s18，s20，s22，s26，s27，s28，s29，s39，s40，s42，s44，s45，s46，s47，s51，s52，s54，s55，s57，s58，s59，s60，s62，s64，s68，s69，s70，s73，s74，s76，s77，s78，s81，s82，s83，s84，s85，s86，s87，s88，s89編碼β-球蛋白鏈(beta globin chain，HBB)(3)Clone s21，s35，s36編碼人β-2-微球蛋白(Homo sapiensbeta-2-microglobulin，B2M)(4)Clone s6，s72編碼核糖體蛋白L7a((ribosomal protein L7a)(5)Clone s7編碼人CUB和Sushi多功能區(qū)3(Homo sapiens CUB and Sushi multipledomains 3，CSMD3)(6)Clone s12，s23，s49，s53，s66編碼183線粒體基因組(183 mitochondrion)
(7)Clone s19編碼單模AslA線粒體全基因組(haplotype AslA mitochondrion，complete genome)(8)Clone s24，s25，s30，s33編碼人α基因序列(Homo sapiens alpha gene sequence)(9)clone s38編碼核糖體蛋白S4(ribosomal protein S4，X-linked)(10)clone s65，s67，s71編碼人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Homo sapiensglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPD)(11)clone s79編碼人236線粒體基因(Homo sapiens isolate 236 mitochondrion)經(jīng)過對上述75個克隆對應(yīng)的已知基因的pubmed的檢索分析，初步篩選出與SARS冠狀病毒抗體相關(guān)的克隆s1，s2，s3，s5，s8，s9，s10，s11，s13，s14，s15，s16，s17，s18，s20，s22，s26，s27，s28，s29，s39，s40，s42，s44，s45，s46，s47，s51，s52，s54，s55，s57，s58，s59，s60，s62，s64，s68，s69，s70，s73，s74，s76，s77，s78，s81，s82，s83，s84，s85，s86，s87，s88，s89，s22，s41，s43，s21，s35，s36。
二、利用RT-PCR對測序后的差異表達(dá)的基因序列進(jìn)行鑒定，具體過程如下1、設(shè)計并合成差異表達(dá)蛋白TMSB4X(克隆s1)、HBB(克隆s2，s3，s5，s8，s9，s10，s11，s13，s14，s15，s16，s17，s18，s20，s22，s26，s27，s28，s29，s39，s40，s42，s44，s45，s46，s47，s51，s52，s54，s55，s57，s58，s59，s60，s62，s64，s68，s69，s70，s73，s74，s76，s77，s78，s81，s82，s83，s84，s85，s86，s87，s88，s89)、B2M(克隆s21，s35，s36)基因的引物；TMSB4X基因的引物序列為5’GAG AAG CAA GCA GGC GAA TC 3’，5’CCC CAC TTC TTCCTT CAC CA 3’Tm＝56℃PCR擴(kuò)增13個循環(huán)。
HBB基因的引物序列為5’GCA GGC TGC TGG TGG TCT AC 3’，5’GCA CAC AGA CCA GCACGT TG 3’Tm＝57℃ PCR擴(kuò)增13個循環(huán)。
B2M基因的引物序列為5’GAG TAT GCC TGC CGT GTG AA 3’，5’TGC CAG CCC TCC TAGAGC TA 3’Tm＝56℃ PCR擴(kuò)增13個循環(huán)。
實(shí)施例1提取的10例SARS冠狀病毒IgG抗體陽性的SARS康復(fù)者和10例IgG抗體陰性的健康者的血液淋巴細(xì)胞RNA，經(jīng)SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit將上述兩組RNA合成的cDNA作為模板，擴(kuò)增鑒定TMSB4X、HBB、B2M基因在上述SARS康復(fù)者和健康人血液淋巴細(xì)胞中的表達(dá)差異，用持家基因G3PDH作為對照；PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃ 2分，94℃ 30秒、退火溫度30秒、65℃ 60秒，13個循環(huán)。擴(kuò)增完畢，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，分析基因表達(dá)的差異性。結(jié)果如圖2a、圖2b、圖3a、圖3b、圖4和圖5所示，圖2a和圖2b表明TMSB4X、HBB基因在康復(fù)者和健康人淋巴細(xì)胞中都檢測到表達(dá)，但在SARS康復(fù)者淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量更高；圖4表明B2M基因在SARS康復(fù)者淋巴細(xì)胞中有表達(dá)，但表達(dá)的豐度不是太高，在凝膠電泳圖上看不出B2M基因在健康人淋巴細(xì)胞中有表達(dá)；圖5表明HBB基因在SARS康復(fù)者淋巴細(xì)胞中有3個大小不同的轉(zhuǎn)錄本，而在健康者中只有其中的一個轉(zhuǎn)錄本。圖2a和圖2b中，1，3，5，7為SARS康復(fù)者；2，4，6，8為健康者。圖4中，1，3，5為SARS康復(fù)者；2，4，6為健康者。圖5中，1，2，3為SARS康復(fù)者；4，5，6為健康者。
序列表<160>89<210>1<211>442<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttataaactt tttatttgca tattaaaaaa60attgtgcatt ccaataatta aaatcatttg aacaaaaaaa aaaatggcac tctgattaaa120ctgcattaca gcctgcagga caccttgggc cagcttggtt ttactctaaa tttcactgtc180gtcccacccc acttcttcca ccccacttct tccttcacca acgtgcaagt tctttccttc240cctgccagcc agatagatag acagatggga aaggcaggcg cggccttcgt tgtcagtagt300tctttgatgt gaaaggggca gcacagtcat ttaaacttga tccaacctct ttgcatctta360caaagttaaa cagctaaaag aagtaaaata agaaggcaat gcttgtggaa tgtacctgcc420cgggcgggcg ctcgaatcac ta 442<210>2<211>423<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2cgccatcgca tgctcccggc cgccatggcc gcgggatttc gagcggccgc ccgggcaggt 60acgcggggac atttgcttct gacacaactg tgttcactag caacctcaaa cagacaccat 120ggtgcacctg actcctgagg agaagtctgc cgttactgcc ctgtggggca aggtgaacgt 180ggatgaagtt ggtggtgagg ccctgggcag gctgctggtg gtctaccctt ggacccagag 240gttctttgag tcctttgggg atctgtccac tcctgatgct gttatgggca accctaaggt 300gaaggctcat ggcaagaaag tgctcggtgc ctttagtgat ggcctggctc acctggacaa 360cctcaagggc acctttgcca cactgagtga gctgcactgt gacaagctgc acgtggatcc 420tga 423<210>3<211>424<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)
<400>3acaagccatc catgctcccg gccgccatgg ccgcgggatt cgagcggccg cccgggcagg 60tacgcgggga catttgcttc tgacacaact gtgttcacta gcaacctcaa acagacacca 120tggtgcatct gactcctgag gagaagtctg ccgttactgc cctgtggggc aaggtgaacg 180tggatgaagt tggtggtgag gccctgggca ggctgctggt ggtctaccct tggacccaga 240ggttctttga gtcctttggg gatctctcca ctcctgatgc tgttatgggc aaccctaagg 300tgaaggctca tggcaagaaa gtgctcggtg cctttaatga tggcctggct cacctggaca 360acctcaaggg cacctttgcc acactgagtg agctgcactg tgacaagctg cacgtggatc 420ctga 424<210>4<211>484<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>4gccgagtcgc atgctcccgg ccgccatggc cgcgggattt cgagcggccg cccgggcagg 60tacgcgggca cacgattaac ccaagtcaat agaagccggc gtaaagagtg ttttagatca 120ccccctcccc aataaagcta aaactcacct gagttgtaaa aaactccagt tgacacaaaa 180tagactacga aagtggcttt aacatatctg aacacacaat agctaagacc caaactggga 240ttagataccc cactatgctt agccctaaac ctcaacagtt aaatcaacaa aactgctcgc 300cagaacacta cgagccacag cttaaaactc aaaggacctg gctgatgctt catatccctc 360tagaggagcc tgttctgtaa tcgataaacc ccgatcaacc tcaccacctc ttgctcagcc 420tatataccgc catcttcagc aaaccctgat gaaggctaca aagtaagcgc aagtacctcg 480gccg 484<210>5<211>402<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>5tttttttttt tttttttttt ttttgaaaat aaatgttttt tattaggcag aatccagatg 60ctcaaggccc ttcataatat cccccagttt agtagttgga cttagggaac aaaggaacct 120ttaatagaaa ttggacagca agaaagcgag cttagtgata cttgtgggcc agggcattag 180ccacaccagc caccactttc tgataggcag cctgcactgg tggggtgaat tctttgccaa 240agtgatgggc cagcacacag accagcacgt tgcccaggag cctgaagttc tcaggatcca 300
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權(quán)利要求
1.SARS康復(fù)者血液淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)基因的cDNA文庫，由序列表中的序列1至序列89的核苷酸序列組成。
2.權(quán)利要求1所述的cDNA文庫在篩選SARS冠狀病毒特異性抗體相關(guān)基因中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的cDNA文庫在篩選治療SARS藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的cDNA文庫在篩選預(yù)防SARS病毒感染的疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了SARS康復(fù)者血液淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)基因的cDNA文庫。本發(fā)明所提供的SARS康復(fù)者血液淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)基因的cDNA文庫，由序列表中的序列1至序列89的核苷酸序列組成。本發(fā)明的cDNA文庫可用于研究SARS康復(fù)者機(jī)體免疫機(jī)理和康復(fù)機(jī)理以及SARS康復(fù)者SARS冠狀病毒抗體發(fā)生機(jī)理，也可用于篩選抑制SARS冠狀病毒的藥物以及預(yù)防SARS病毒感染的疫苗。
文檔編號A61K39/215GK1727486SQ20041007106
公開日2006年2月1日 申請日期2004年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月28日
發(fā)明者范保星, 劉又寧, 朱茂祥, 解立新, 孫敬芬, 陳良安, 佘丹陽, 田慶 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院