專利名稱：一種制備肝臟疾病的藥物組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種制備肝臟疾病藥物組合物及其用途。
背景技術(shù)：
肝炎是一種常見病、多發(fā)病，我國是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，這些患者如不能得到有效治療，就有可能發(fā)生肝纖維化，進而肝硬化?！案窝住⒏卫w維化、肝硬化”組成的“三步曲”是各種慢性肝病導致嚴重后果的共同途徑。由于肝硬化是肝臟實質(zhì)性病變，普遍認為較難逆轉(zhuǎn)，因而在治療上除對癥外，缺乏其他有效措施。而對于病毒性肝炎的治療，目前雖有少數(shù)藥物具一定療效，但治愈率不理想，且費用昂貴。因此國內(nèi)外學者不約而同把目光轉(zhuǎn)向“三步曲”的中間環(huán)節(jié)--肝纖維化。肝纖維化是指肝內(nèi)不同部位有不等量膠原纖維增生，代表了肝損傷后不完全修復過程。如果能有效地阻遏肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，甚至使其逆轉(zhuǎn)，將改善慢性肝病的預后，延長患者的生命。
近年來，國內(nèi)外學者針對膠原代謝的諸個環(huán)節(jié)，提出了一系列抗肝纖維化的藥物和療法。①抑制膠原合成a、腎上腺皮質(zhì)激素。b、干擾素。c、前列腺素類似物。d、類固醇類物質(zhì)。e、前膠原肽。②作用于前膠原的mRNA轉(zhuǎn)譯后a、秋水仙堿。b、金屬離子結(jié)合劑。c、脯氨酸一4一羥化酶抑制劑。d、脯氨酸類似物。e、前膠原向膠原后轉(zhuǎn)化的抑制劑。f、山黎豆等。③促進膠原降解的治療。以上藥物和療法有的因毒副作用較大或尚處于實驗階段，其確切療效尚待進一步觀察和探討。西藥聯(lián)苯雙酯有快速、顯著的降酶作用，但停藥后“反跳”(即肝功能異常指標加倍升高)，而且藥物對肝臟病理組織的恢復也難說有確切效果。對病毒抑制方面，比較公認有效的藥物是干擾素及其誘導劑阿糖腺苷等，但價格昂貴、副作用大，且對人體的神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及造血系統(tǒng)等均可造成不同程度的損害，還有過敏反應(yīng)。由于西藥抗肝纖維化療效的局限性，中藥抗肝纖維化研究日益受到廣泛重視，中藥復方有多途徑、多層次、多靶點的綜合藥理作用，這可能是中藥復方抗肝纖維化、調(diào)控細胞功能及有關(guān)功能性基因的優(yōu)勢所在。
目前常見的治療肝纖維化和早期肝硬化的中藥制劑多為復方制劑，中藥復方是中醫(yī)的特點及臨床療效的重要基礎(chǔ)，具有綜合的藥理學效應(yīng)，但由于生藥產(chǎn)地及成分的復雜性，在研究過程中制劑穩(wěn)定性及可控性較差，因此盡可能減少藥物組成是目前治療肝纖維化和肝硬化的趨勢，本發(fā)明正是在此基礎(chǔ)上形成的，盡量使藥物中的有效成分明確，療效確定，質(zhì)量可控，更加符合現(xiàn)代藥物的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備肝纖維化和肝硬化疾病的藥物組合物及其用途。
本發(fā)明的藥物組合物通過抑制肝纖維化的發(fā)生，進一步抑制肝硬化得發(fā)生，以達到治未病的目的。
本發(fā)明通過大量實驗、在眾多中藥中篩選出丹參、三七制成具有抗肝纖維化作用的復方制劑藥物，并通過丹參/三七不同配比的藥效實驗確立了丹參/三七的最佳配比。
以下所述的藥物組合物的組成和配比都有較好的治療和預防肝纖維化和肝硬化的療效丹參、三七；優(yōu)選的各組分為丹參提取物、三七提取物；優(yōu)選的各組分配比為丹參提取物0.5～7份、三七提取物0.1～5份；進一步優(yōu)選的各組分配比為丹參提取物1～5份、三七提取物0.5～3份；最佳的各組分配比為丹參提取物2.5～3份、三七提取物1份。
本發(fā)明藥物組成成分丹參提取物中含有丹酚酸B鎂鹽、丹參素鈉、丹酚酸類成分，三七提取物中含有三七總皂苷；優(yōu)選的本發(fā)明藥物組合物中丹參提取物中的丹酚酸的含量為丹參提取物重量的30％以上，和/或三七提取物中三七總皂苷含量為三七提取物重量的30％以上；進一步優(yōu)選的本發(fā)明藥物組合物中丹參提取物中的丹酚酸的含量為丹參提取物重量的40％以上，和/或三七提取物中三七總皂苷含量為三七提取物重量的40％以上；最佳的本發(fā)明藥物合物中丹參提取物中的丹酚酸的含量為丹參提取物重量的47～60％，和/或三七提取物中三七總皂苷含量為三七提取物重量的47～60％。
本發(fā)明藥物中的丹酚酸包括丹酚酸B鎂鹽、丹參素鈉、丹酚酸A和丹酚酸B。
本發(fā)明藥物中含有丹酚酸的丹參提取物可以將原料藥丹參采用中藥常規(guī)方法制備。例如，可將這些原料藥采用水提法、水提醇沉法、萃取法、浸漬法、滲漉法、回流提取法、連續(xù)回流提取法、大孔樹脂吸附法制備，也可以采用Takashi Tanaka等報道的丹參多酚酸鹽的提取方法(Chemical Pharmaceutical Bulletin，1989，37(2)，340～344)；Koji Hase等(Planta Medica，1997，63，22～26)、徐亞明等(中國專利CN1247855A，2000年3月公開)、劉平等(中國專利CN1270809A，2000年10月公開)、黎蓮娘等(中國專利，申請?zhí)?1142288.2，申請日2001年9月)等方法從丹參中提取酚酸類化合物；但是為了使該藥物各原料藥更好地發(fā)揮藥效，優(yōu)選對丹參原料采用下述方法制備，但是這不能限制本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明藥物組合物中丹參提取物通過下述技術(shù)方案予以實施丹參加水提??；提取液減壓濃縮，醇沉，靜置過夜；過濾，醇沉上清液，減壓濃縮至無醇味，上大孔吸附樹脂，水沖洗；乙醇洗脫；洗脫液減壓濃縮，干燥，制成丹參提取物。
優(yōu)選的丹參提取物制備方法為取丹參加水提取2次，第一次2小時，6倍量水；第二次1小時，4倍量水；提取液減壓濃縮，至密度1.05～1.10(60度)，醇沉50％，靜置過夜；過濾，醇沉上清液，減壓濃縮至無醇味，上大孔吸附樹脂(生藥∶樹脂＝1∶1)；水沖洗，3～6倍量；50％乙醇洗脫3～4倍量；洗脫液減壓濃縮，干燥，制成丹參提取物。
或者本發(fā)明藥物組合物中丹參提取物也可以通過下述技術(shù)方案予以實施(a)丹參去雜質(zhì)、切成小塊或粉碎成粗粉，用水熱提，提取液調(diào)pH至酸性后，濾過；(b)濾液上聚酰胺柱，用水沖洗至pH值為中性，再用弱堿性水溶液洗脫，收集堿洗脫液；(c)堿洗脫液調(diào)PH值到酸性后，上大孔吸附樹脂柱，先用水沖洗至pH值為中性，再用含水或無水低級醇洗脫，收集洗脫液；(d)洗脫液減壓濃縮至無醇，干燥，即得丹參提取物。
其中步驟(a)中，用水加熱提取2～4次，每次0.5小時～2小時，提取的溫度為60)～100℃(最佳為90～100℃)；提取液用酸調(diào)pH值至4以下(最佳為2以下)。
步驟(b)中，洗脫液弱堿性水溶液的濃度優(yōu)選范圍為0.01％～2％(最佳范圍為0.08％～0.5％)；聚酰胺材料為聚己內(nèi)酰胺(尼龍-6)。
步驟(c)中，大孔吸附樹脂為苯乙烯型；堿洗脫液用酸調(diào)pH值到4以下(最佳為2以下)；低級醇的碳原子范圍為C1～C5，如甲醇、乙醇等，其洗脫濃度為40％～95％(最佳為60％～95％)，從工業(yè)化生產(chǎn)的安全、低成本和工藝簡化上考慮，采用95％乙醇進行洗脫，實際效果也令人滿意。
三七提取物可以可利用現(xiàn)有技術(shù)的制備方法獲得，例如可利用中國專利ZL1095363C、中國專利申請CN1352985A、錢天香等(國外醫(yī)學·植物藥分冊，1997，12(4))、唐第光(中成藥1990，12(8)5)、中華人民共和國國家部頒標準WS3-B-3590-2001(Z)的制備方法獲取三七提取物。也可以自行摸索制備工藝提取三七提取物。還可以直接從市場上購得三七提取物，例如含量為95％(UV測定)的三七總皂苷(其中Rb1≥30％、Rg1≥20％、R1≥5％，HPLC測定)。也可以采用向三七細粉中加入藥材重量的13倍的、濃度為30％乙醇提取溶劑，提取溫度為70℃，加熱時間為40分鐘，用乙醇加熱回流提取2次，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇至一定量，加入適量水，繼續(xù)回收至無醇味，加水使成每2ml藥液相當于1g生藥，藥液通過預處理的大孔吸附樹脂校，水洗至流出液無色，改用55％乙醇洗脫，用TCL檢查洗脫終點，洗脫液加入1.1％活性炭(按投料量計)，回流脫色30min，趁熱過濾，冷卻，濾液通過鋪有少量中性氧化鋁的漏斗，減壓回收乙醇，流浸膏于水浴上蒸至枯稠狀，真空干燥，即得三七提取物。
本發(fā)優(yōu)選采用從市場購得三七總皂苷，經(jīng)進一步精制，得三七提取物。所得三七提取物中三七總皂苷的含量至少為三七提取物重量的30％以上。
本發(fā)明藥物組合物的制備方法如下取上述方法所得到的丹參提取物和三七提取物，將上述丹參提取物三七提取物按2.5～3∶1混合均勻，與適量輔料混合均勻，加熱熔融，保溫滴制，滴入常見冷凝劑中，制成滴丸即得。
本發(fā)明藥物中的輔料可以是目前常見的滴丸劑常用輔料，例如聚乙二醇-6000，聚乙二醇-4000，聚乙二醇-1500，或者是聚乙二醇-6000、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-1500的任意混合物。
本發(fā)明藥物中的輔料也可以是木糖醇和淀粉，木糖醇與淀粉的重量之比為1∶0.2～1∶0.3；或者是乳糖醇和淀粉，乳糖醇與淀粉的重量之比為1∶0.2～1∶0.3；或者是木糖醇和阿拉伯膠，木糖醇和阿拉伯膠的重量之比為1∶0.2～1∶0.4。
本發(fā)明藥物組合物還可以采用上述組方和常用的制劑方式制成目前其它常見的劑型，所制成的劑型可以是片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、軟膏劑、硬膏劑、噴霧劑、崩解劑、泡騰劑。
以上組成在生產(chǎn)時可按照相應(yīng)的比例增大或減少，如大規(guī)模生產(chǎn)可以以公斤或以噸為單位，小規(guī)模生產(chǎn)也可以以克為單位，重量可以增大或減小，但各組成之間的生藥材料重量配比比例不變。
以上各組成中的單味中藥，尤其是佐藥、使藥或佐藥與使藥，可以單獨或同時被適當?shù)木哂邢嗤幮?、功效的中藥替換，替換后中藥制劑及其藥物作用不變。
本發(fā)明的藥物在使用時可根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日1-3次，每日各生藥用量以國家藥典用藥量為準，不超過藥典規(guī)定量。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面通過觀察本藥物組合物在預防大鼠肝纖維化作用研究得結(jié)果，說明其在治療和預防肝纖維化和肝硬化藥物中的應(yīng)用，為方便敘述，下面將本發(fā)明稱為軟肝滴丸。
實驗例軟肝滴丸防治大鼠肝纖維化作用研究實驗目的考察軟肝滴丸對CCl4所致大鼠肝硬化模型的預防和治療作用。
實驗材料受試動物Wistar種大鼠，雌雄各半，體重180-230g。購自軍事醫(yī)學科學院9所動物實驗中心，合格證號醫(yī)動第05號。為二級清潔動物。飼養(yǎng)在天津藥物研究院動物實驗室。
受試藥物軟肝滴丸的浸膏液，樣品批號000519，由天士力研究院提供。+4℃冰箱保存。臨用前A樣品直接用蒸餾水稀釋成40mg/ml濃度給大鼠灌胃。陽性對照藥選用秋水仙堿片。昆明制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號990101。
試劑盒HA放免疫測定試劑由上海海軍醫(yī)學研究所提供，pcIII放免測定和由重慶腫瘤研究所提供。SOD、MDA、Hyp生化測定盒由南京建成生物工程研究所提供。
實驗方法一、動物及實驗分組選用180-230g健康Wistar種大鼠，雌雄各半。隨機分成正常對照組、CCl4模型組、軟肝滴丸300mg/kg組、100mg/kg組及秋水仙堿0.1mg/kg組。每一給藥組中再分成預防給藥和治療給藥。
二、模型的建立大鼠肝纖維化模型選用CCl4為誘導劑，CCl4小劑量長期注射(3個月)可造成肝纖維化模型。為加速纖維化的形成，我們選用特殊飼料，使造模周期縮短為6周[1]。除正常對照組外，其余動物均飼以單純玉米面(前兩周加20％豬油)加膽固醇0.5％、食鹽1％、飲自來水。實驗第1天背部皮下注射CCl4原液5ml/kg體重，以后每隔3天皮下注射40％CCl4-橄欖油3ml/kg體重，6周后將40％CCl4-橄欖油的用量降為1.5mg/kg體重，同時給動物恢復正常的營養(yǎng)飼料。分別于實驗的3周末、6周末和8周處死動物。取血離心，收集血清，定位取肝組織進行肝纖維化指標的測定及病理組織學檢查。
三、對大鼠肝纖維化的預防作用大鼠注射CCl4造模的同時開始給予藥物樣品灌胃給藥，劑量分別為軟肝滴丸300mg/kg和100mg/kg，秋水仙堿0.1mg/kg，每日一次，連續(xù)給藥48天。每一給藥組動物數(shù)均為16只，雌雄各半。CCl4模型組86只(包括治療給藥的48只)和正常對照組10只大鼠灌蒸餾水。除正常對照組外，其余各組動物每天給予特配飼料，飲自來水，加速肝纖維化的形成。每天觀察動物的行為狀態(tài)，記錄死亡動物。于實驗的第48天(6周末)，腹腔注射1％戊巴比妥鈉麻醉動物，斷頸取全血，離心收集血清，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。定位取肝組織，固定于20％福爾馬林液中，常規(guī)石蠟包埋切片，HE、Masson染色，顯微鏡下雙盲法觀察記錄肝纖維化的增生程度。其余的肝組織用生理鹽水洗凈血污后獨立分裝，-20℃冷凍保存，以備制成勻漿測定SOD和MDA，或脫水、脫脂、水解處理后測定Hpy。
四、對大鼠肝纖維化的治療作用用加速法成功造模31天后，將48只肝纖維化大鼠隨機分成CCl4模型組，300mg/kg，100mg/kg，和秋水仙堿0.1mg/kg組，每組12只，雌雄各半。開始進行治療給藥，每日一次，連續(xù)一個月。繼續(xù)給予CCl4刺激，6周后將40％CCl4-橄欖油的注射劑量下調(diào)為1.5ml/kg體重，同時恢復正常營養(yǎng)飼料。實驗結(jié)束時(8周)大鼠腹腔注射1％戊巴比妥鈉麻醉，斷頸取全血，離心收集血清，測定HA，pcIII含量，定位取肝組織，固定于20％福爾馬林液中，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE、Masson染色、顯微鏡下雙盲法觀察記錄肝纖維化增生程度。剩余的肝組織用生理鹽水洗凈血污后獨立分裝，-20C冷凍保存，以備SOD、MDA和Hpy的測定。
五、檢測項目及指標1.血清III型前膠原(pcIII)的測定按照試劑盒的要求進行標準操作。由于該試劑盒適用于人的臨床檢驗，應(yīng)用到大鼠血清后反應(yīng)不佳，測定值偏低，因此將操作體系加以修正，改為200μl加樣量進行測定。
2.血清透明質(zhì)酸(HA)的測定按說明書操作。
3.肝組織勻漿中SOD、MDA的測定用生理鹽水將肝組織制成10％的勻漿，3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。取上清液進行測定，按SOD、MDA測定盒的說明書操作。
4.肝組織中羥脯氨酸(Hpy)含量的測定先將肝組織進行脫水、脫脂、水解處理。肝組織稱重，按重量體積比加入無水乙醇(1∶9w/v)進行勻漿，取勻漿旋渦混勻1分鐘，靜置2分鐘，反復2次(充分脫水)，3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。棄上層無水乙醇，留下層沉淀。在沉淀中加2ml丙酮，旋渦混勻1分鐘，靜置2分鐘，3500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上層丙酮得沉淀，重復上述步驟一次(充分脫脂)。取丙酮脫脂后的肝組織沉淀加2ml乙醚，旋渦混勻1分鐘，靜置5分鐘，吸棄上層乙醚，自然揮發(fā)待干，最后研成粉末。取20mg肝粉加6mol/L HCl 3ml，放磨口試管中加蓋，95℃或沸水中水浴5小時。冷卻后將水解液移入10ml刻度試管中，用6MNaOH調(diào)pH至6，然后稀釋至10ml，3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液2ml檢測，后面的操作按Hyp測定盒說明書。
5.病理組織學觀察HE、Masson染色的組織學切片在顯微鏡下雙盲法觀察，記錄各實驗組大鼠肝纖維化增生程度，肝纖維化和肝硬化分級標準參照Reober[2]和王寶恩[3]的方法將肝纖維化及肝硬化程度分為五級0級(-)無纖維組織增生I級(+)匯管區(qū)和肝竇隙少量纖維組織增生II級(++)匯管區(qū)和肝竇隙多量纖維組織增生伴分隔趨勢III級(H+)匯管區(qū)和肝竇隙多量纖維組織增生伴假小葉形成IV級(++++)肝硬化基礎(chǔ)上，纖維組織彌漫性增生伴淋巴細胞、單核細胞浸潤將各實驗組動物肝纖維化程度按分級打分值，(-)為0分，(+)為1分，依此類推。求分值的平均數(shù)，進行統(tǒng)計分析(t檢驗)。
實驗結(jié)果一、一般觀察及對肝纖維化大鼠存活率的影響造模大鼠注射CCl4后明顯消瘦，毛色干枯。一方面是由于CCl4的毒性所致，另一方面由于特殊配比飼料，大鼠不適應(yīng)，造成日進食量減少。各實驗組均有動物狀態(tài)不佳，甚至出現(xiàn)死亡。瀕死動物剖腹可見有肝腹水。實驗5周前預防給藥組動物的整體狀態(tài)要好于CCl4模型組。實驗期間各組動物的存活情況見表1和表2。發(fā)現(xiàn)預防給藥前3周，給藥組動物均未出現(xiàn)死亡，而CCl4模型組死亡4只；5周時，給藥組的存活率高于CCl4模型組；6周時給藥組與CCl4模型組的這種差異逐漸縮小。治療給藥1月后100mg/kg組的動物存活率明顯高于模型組及秋水仙堿0.1mg/kg組。該結(jié)果提示軟肝滴丸對CCl4造成的肝損傷有一定的保護作用，可延緩毒性出現(xiàn)的時間，預防給藥較治療給藥的效果明顯。
表1預防給藥對大鼠存活率的影響


表內(nèi)數(shù)字表示存活動物數(shù)，括號里表示存活率。
表2治療給藥1個月后各組動物的存活率

二、對肝纖維化大鼠血清HA、pcIII含量的影響軟肝滴丸預防給藥和治療給藥后對纖維化大鼠血清HA、pcIII的測定結(jié)果見表3、表4。CCl4模型組(p＜0.01，p＜0.05)預防給藥和治療給藥HA含量平均值較CCl4模型組雖有降低，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。從所測得的數(shù)據(jù)來看，似乎治療給藥的療效更好，尤其是300mg/kg組，HA含量較接近正常對照組，且軟肝滴丸的治療效果優(yōu)于秋水仙堿(三個組的p值均小于0.01)。pcIII指標的測定結(jié)果表明模型復制是成功的，但給藥組與模型組未見有何差異。
表3預防給藥48天對肝纖維化大鼠血清指標的影響

△△p＜0.01△p＜0.05(與正常對照比較)注括號內(nèi)的數(shù)字表示樣本數(shù)表4軟肝滴丸治療給藥對肝纖維化大鼠血清指標的影響

△p＜0.05(與正常對照比較)**p＜0.01(與秋水仙堿比較)三、對肝組織中SOD、MDA和Hpy含量的測定軟肝滴丸預防給藥和治療給藥對肝臟組織SOD、MDA和Hpy的含量測定結(jié)果見表5、表6?？梢奀Cl4模型組動物肝組織中SOD活性及Hpy的含量與正常對照比較明顯降低(p＜0.001)。同時MDA含量升高，表明模型動物的肝臟細胞已受到有害自由基的嚴重損傷，繼而造成纖維增生，反映膠原蛋白的Hpy含量升高。從測得的數(shù)據(jù)來看，軟肝滴丸和秋水仙堿，無論是預防給藥還是治療給藥均在一定程度上有逆轉(zhuǎn)上述異常指標的趨勢，與CCl4模型組比較，無統(tǒng)計學意義，這可能與肝硬化模型過重有關(guān)。軟肝滴丸與陽性藥秋水仙堿之間也無明顯差異。
表5軟肝滴丸預防給藥對肝纖維化大鼠肝組織中SOD、MDA、Hpy的影響

△△△p＜0.001(與正常對照比較)*p＜0.05(與CCl4模型比較)表6軟肝滴丸治療給藥1個月對肝纖維大鼠肝組織中SOD、MDA、Hpy的影響

△△p＜0.01△p＜0.05(與正常對照比較)四、病理組織中檢查肝組織切片經(jīng)HE及Masson染色，顯微鏡下雙盲法觀察其病理改變，發(fā)現(xiàn)除肝纖維化和肝硬化病變外，各組均呈現(xiàn)肝細胞脂肪變性，且尤以預防給藥階段為著，而隨著肝硬化的形成，脂肪變性程度減輕。肝纖維化形成以肝竇隙和匯管區(qū)纖維組織增生為主要表現(xiàn)，肝竇隙纖維化呈現(xiàn)肝細胞周圍，尤以中央靜脈周圍肝竇隙纖維化為著，逐漸融合成分隔帶，加之匯管區(qū)纖維組織增生向小葉內(nèi)穿插，逐漸將原正常肝組織分隔、包繞、形成假小葉。各實驗組的典型病理照片見附件，按照肝纖維化分級評分制，將各實驗組動物的分級結(jié)果列于表7、表8。發(fā)現(xiàn)軟肝滴丸預防給藥300mg/kg，與CCl4模型組比較，肝纖維化程度明顯減輕(p＜0.05)。CCl4模型動物的病理損傷程度處于(++)級以上，而給藥組還有部分動物為(+)級，占15.4-25％。治療給藥與模型組比較，雖無統(tǒng)計學的明顯差異，但從評分的平均值來看，軟肝滴丸兩個組均低于模型組，尤以300mg/kg更為明顯。從表7中可以看出CCl4造模6周的纖維化程度分值為2.64，我們在CCl4造模31天(5周)開始治療給藥1個月后，軟肝滴丸得分值為2.28-2.67，與造模6周時(2.64，見表7)基本一致，而模型組動物的肝纖維化程度進一步加重，分值達3.0。說明經(jīng)軟肝滴丸治療后能在一定程度上阻止肝纖維化向肝硬化的進一步發(fā)展，該藥的治療效果不亞于秋水仙堿。
表7軟肝滴丸預防給藥48天對大鼠肝纖維化程度的影響

*p＜0.05(與CCl4模型比較)表8軟肝滴丸治療給藥1個月對大鼠肝纖維化程度的影響

本實驗結(jié)果表明軟肝滴丸預防給藥和治療給藥300mg/kg組HA水平接近正常值，且療效優(yōu)于秋水仙堿組。該藥顯示出了一定的抗肝纖維化的作用。pcIII的測定結(jié)果給藥組與模型組比較未見差異，分析原因有1.pcIII測試盒是用于人臨床實驗，造成結(jié)果偏差。2.pcIII指標適用于肝纖維化的形成時期，對于肝硬化或陳舊纖維化不一定升高。本實驗在CCl4造模6周末和8周時取血測定pcIII，此時經(jīng)病理檢查已處于纖維化中期，因此各組間的pcIII含量相差不多，CCl4模型組不會再升高，今后在觀察pcIII指標時可適當提前取血的時間，血清學的變化是先于病理改變的。
大鼠注射CCl4造成的肝損傷直至演變?yōu)楦卫w維化或肝硬變，主要是由自由基損傷引起的，若藥物具有直接或間接的抗氧化、抗自由基功效(降低MDA含量，增加SOD活性)，即能保護組織，減輕這種損傷，阻止或延緩肝纖維化的形成。肝組織中SOD活性，降低MDA和Hpy含量的作用趨勢，與CCl4模型比較無統(tǒng)計學意義，可能與模型過重有關(guān)，掩蓋了部分藥效，但該藥對大鼠肝纖維化的防治作用是不容忽視的。
病理組織學檢查結(jié)果表明，CCl4注射3周即可造成大鼠肝脂肪病變，形成了空泡，約1/4動物已出現(xiàn)早期肝纖維組織增生，6周末大部分動物已處于肝纖維化(++)級，為重度纖維化或硬化。軟肝滴丸預防給藥48天可使大鼠肝纖維化程度明顯減輕。當大鼠已形成中度纖維化時，開始治療給藥，1個月后軟肝滴丸治療組基本阻止了肝纖維化的進一步發(fā)展。若將治療給藥的開始時間提前(造模3周)，即在肝纖維化初期應(yīng)用此藥，相信其治療效果會更加明顯。
結(jié)論軟肝滴丸能提高CCl4造模大鼠的存活率，對肝損傷有一定的保護作用；該藥可改善肝病變大鼠血清及肝組織中異常的生理及生化指標，具有一定的抗纖維化作用；軟肝滴丸預防給藥48天，大鼠肝臟的病理組織學改變程度比CCl4模型組顯著減輕，對于中度肝纖維化大鼠，軟肝滴丸治療1個月有阻止肝纖維化進一步發(fā)展的趨勢；軟肝滴丸(100-300mg/kg)對大鼠肝纖維化的防治作用不亞于秋水仙堿，甚至在某些測定指標還優(yōu)于秋水仙堿，尤其是治療給藥，軟肝滴丸的效果要好于秋水仙堿。
本發(fā)明藥物是通過以下實施例制備而成，以下具體實施例是對本發(fā)明的解釋，并不能限制本發(fā)明。
具體實施例方式
實施例1丹參提取物的制備方法取丹參加水提取2次，第一次2小時，6倍量水；第二次1小時，4倍量水；提取液減壓濃縮，至密度1.05～1.10(60度)，醇沉50％，靜置過夜；過濾，醇沉上清液，減壓濃縮至無醇味，上大孔吸附樹脂(生藥∶樹脂＝1∶1)；水沖洗，3～6倍量；50％乙醇洗脫3～4倍量；洗脫液減壓濃縮，干燥，制成丹參提取物。
實施例2丹參提取物的制備方法(a)丹參去雜質(zhì)、切成小塊或粉碎成粗粉，用水熱提，提取液調(diào)pH至酸性后，濾過；(b)濾液上聚酰胺柱，用水沖洗至pH值為中性，再用弱堿性水溶液洗脫，收集堿洗脫液；(c)堿洗脫液調(diào)PH值到酸性后，上大孔吸附樹脂柱，先用水沖洗至pH值為中性，再用含水或無水低級醇洗脫，收集洗脫液；(d)洗脫液減壓濃縮至無醇，干燥，即得丹參提取物。
其中步驟(a)中，用水加熱提取2～4次，每次0.5小時～2小時，提取的溫度為6(0～100℃(最佳為90～100℃)；提取液用酸調(diào)pH值至4以下(最佳為2以下)。
步驟(b)中，洗脫液弱堿性水溶液的濃度優(yōu)選范圍為0.01％～2％(最佳范圍為0.08％～0.5％)；聚酰胺材料為聚己內(nèi)酰胺(尼龍-6)。
步驟(c)中，大孔吸附樹脂為苯乙烯型；堿洗脫液用酸調(diào)pH值到4以下(最佳為2以下)；低級醇的碳原子范圍為C1～C5，如甲醇、乙醇等，其洗脫濃度為40％～95％(最佳為60％～95％)，從工業(yè)化生產(chǎn)的安全、低成本和工藝簡化上考慮，可采用95％乙醇進行洗脫。
實施例3三七提取物的制備方法取三七細粉中加入藥材重量的13倍的、濃度為30％乙醇提取溶劑，提取溫度為70℃，加熱時間為40分鐘，用乙醇加熱回流提取2次，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇至一定量，加入適量水，繼續(xù)回收至無醇味，加水使成每2ml藥液相當于1g生藥，藥液通過預處理的大孔吸附樹脂校，水洗至流出液無色，改用55％乙醇洗脫，用TCL檢查洗脫終點，洗脫液加入1.1％活性炭(按投料量計)，回流脫色30min，趁熱過濾，冷卻，濾液通過鋪有少量中性氧化鋁的漏斗，減壓回收乙醇，流浸膏于水浴上蒸至枯稠狀，真空干燥，即得三七提取物。
實施例4從市場購得三七總皂苷，經(jīng)進一步精制，得三七提取物。所得三七提取物中三七總皂苷的含量至少為三七提取物重量的30％以上。
實施例5丹參5kg粉碎成粗粉，加去離子水在100℃微沸狀態(tài)下加熱提取3次。第一次5.5倍水，加熱1小時；第二、三次各加3倍量水分別加熱0.5小時。提取液用10％鹽酸調(diào)PH值為2后，濾過，濾液上聚酰胺柱(干樹脂量為生藥量2/3)。用5倍量去離子水洗，繼續(xù)用0.1％碳酸氫鈉水溶液洗脫，用量為柱體積的5倍。收集洗脫液，用10％鹽酸調(diào)PH到2后上D101大孔吸附樹脂，用去離子水沖洗至中性，繼續(xù)用95％乙醇洗脫，待色帶下來即收集此色帶。減壓濃縮收集液至盡干，用適量水溶解后冰箱冷藏過夜，通過0.3μm混合纖維素微孔濾膜過濾即得丹參總酚酸提取液，以2％氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到6.0后立即冷凍干燥，得丹參總酚酸原料凍干粉221g，成品收率為生藥量的4.4％。.按專利申請文獻(中國專利，申請?zhí)?1142288.2，申請日2001年9月)的方法進行測定，成品含總酚酸83.94％，丹酚酸B為53.73％。
實施例2丹參5kg粉碎成粗粉，加去離子水在80℃加熱提取3次。第一次5.5倍水，加熱2小時；第二、三次各加3倍量水分別加熱1小時。提取液用5％硫酸調(diào)PH值為1后，濾過，濾液上聚酰胺柱(干樹脂量為生藥量2/3)。用5倍量去離子水洗，繼續(xù)用0.2％碳酸氫鈉水溶液洗脫，用量為柱體積的4倍。收集洗脫液，用5％硫酸調(diào)PH到1后上AB-8大孔吸附樹脂，用去離子水沖洗至中性，繼續(xù)用60％乙醇洗脫，待色帶下來即收集此色帶。減壓濃縮收集液至無醇味，冰箱冷藏過夜，通過0.3μm混合纖維素微孔濾膜過濾即得丹參總酚酸提取液，以2％氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到6.0后立即冷凍干燥，得丹參總酚酸原料凍干粉227g，成品收率為生藥量的4.5％。按專利申請文獻(中國專利，申請?zhí)?1142288.2，申請日2001年9月)的方法進行測定，成品含總酚酸83.15％，丹酚酸B為54.03％。
實施例3丹參5kg粉碎成粗粉，加去離子水在100℃微沸狀態(tài)下加熱提取3次。第次5.5倍水，加熱1小時；第二、三次各加3倍量水分別加熱0.5小時。提取液用10％鹽酸調(diào)PH值為2后，濾過，濾液上聚酰胺柱(干樹脂量為生藥量2/3)。用5倍量去離子水洗，繼續(xù)用0.1％碳酸氫鈉水溶液洗脫，用量為柱體積的5倍。收集洗脫液，用10％鹽酸調(diào)PH到2后上RA大孔吸附樹脂，用去離子水沖洗至中性，繼續(xù)用60％甲醇洗脫，待色帶下來即收集此色帶。減壓濃縮收集液至無醇味，冰箱冷藏過夜，通過0.3μm混合纖維素微孔濾膜過濾即得丹參總酚酸提取液，以2％氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到6.0后立即冷凍干燥，得丹參總酚酸原料凍干粉224g，成品收率為生藥量的4.5％。按專利申請文獻(中國專利，申請?zhí)?1142288.2，申請日2001年9月)的方法進行測定，成品含總酚酸84.02％，丹酚酸B為54.17％。
實施例4取丹參5kg加水提取2次，第一次2小時，6倍量水；第二次1小時，4倍量水；提取液減壓濃縮，至密度1.05～1.10(60度)，醇沉50％，靜置過夜；過濾，醇沉上清液，減壓濃縮至無醇味，上大孔吸附樹脂(生藥∶樹脂＝1∶1)；水沖洗，3～6倍量；50％乙醇洗脫3～4倍量；洗脫液減壓濃縮，干燥，制成丹參提取物。
實施例5取三七細粉5kg，向三七細粉中加入藥材重量的13倍的、濃度為30％乙醇提取溶劑，提取溫度為70℃，加熱時間為40分鐘，用乙醇加熱回流提取2次，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇至一定量，加入適量水，繼續(xù)回收至無醇味，加水使成每2ml藥液相當于1g生藥，藥液通過預處理的大孔吸附樹脂校，水洗至流出液無色，改用55％乙醇洗脫，用TCL檢查洗脫終點，洗脫液加入1.1％活性炭(按投料量計)，回流脫色30min，趁熱過濾，冷卻，濾液通過鋪有少量中性氧化鋁的漏斗，減壓回收乙醇，流浸膏于水浴上蒸至枯稠狀，真空干燥，即得三七總皂苷。
實施例6取按照實施例1方法獲得的丹參提取物2.5g，實施例3方法獲得的三七提取物1g，混合均勻，與15g聚乙二醇6000混合均勻，加熱至溫度85～90℃，化料40～80分鐘后，移至罐溫保持在85～90℃的滴丸機滴罐中。藥液滴至7～8℃甲基硅油中，取出滴丸，除油，篩網(wǎng)選丸，即得。
實施例7取按照實施例2方法獲得的丹參提取物3g，實施例3方法獲得的三七提取物1g，混合均勻，與聚乙二醇-600018g混和均勻，加熱至溫度85～90℃，化料20～120分鐘后，移至罐溫保持在85～90℃的滴丸機滴罐中。藥液滴至7～8℃液體石蠟中，取出滴丸，除油，篩網(wǎng)選丸，即得。
實施例8取按照實施例4方法獲得的丹參提取物1g，實施例3方法獲得的三七提取物9g，混合均勻，與15g聚乙二醇4000混合均勻，加熱熔融，保溫滴制，滴入常見冷凝劑中，制成1000粒滴丸即得。
實施例9取按照實施例3方法獲得的丹參提取物7g，實施例3方法獲得的三七提取物3g，混合均勻，與15g聚乙二醇6000和聚乙二醇4000混合物混合均勻，加熱熔融，保溫滴制，滴入常見冷凝劑中，制成1000粒滴丸即得。
實施例10取按照實施例1方法獲得的丹參提取物3g，實施例3方法獲得的三七提取物7g，混合均勻，與15g聚乙二醇6000和聚乙二醇1500混合物混合均勻，加熱熔融，保溫滴制，滴入常見冷凝劑中，制成1000粒滴丸即得。
實施例11
取按照實施例4方法獲得的丹參提取物9.9g，實施例3方法獲得的三七提取物0.1g，混合均勻，與15g聚乙二醇4000和聚乙二醇1500混合物混合均勻，加熱熔融，保溫滴制，滴入常見冷凝劑中，制成1000粒滴丸即得。
實施例12取按照實施例1方法獲得的丹參提取物5g，實施例3方法獲得的三七提取物5g，混合均勻，與15g聚乙二醇6000和聚乙二醇1500混合物混合均勻，加熱熔融，保溫滴制，滴入5～10℃液體石蠟中，制成1000粒滴丸即得。
實施例13取按照實施例1方法獲得的丹參提取物5.5g，實施例3方法獲得的三七提取物4.5g，混合均勻，與20g聚乙二醇6000混合均勻，加熱至溫度85～90℃，化料80～100分鐘后，移至罐溫保持在85～90℃的滴丸機滴罐中。藥液滴至0～5℃液體石蠟中，取出滴丸，除油，篩網(wǎng)選丸，即得。
實施例14取按照實施例4方法獲得的丹參提取物7.5g，實施例3方法獲得的三七提取物2.5g，與16.5g聚乙二醇4000混合均勻，加熱熔融，保溫滴制，滴入常見冷凝劑中，制成1500粒滴丸即得。
實施例15取按照實施例3方法獲得的丹參提取物5g、實施例3方法獲得的三七提取物0.1g、木糖醇15g、淀粉4g，備用；將丹參提取物和三七提取物加入木糖醇和淀粉混合物中，攪拌均勻，保溫，在55～75℃溫度下滴制、滴管口徑為1.30～4.0毫米，以每分鐘30～60滴的速度滴制，滴入甲基硅油中，制成1000粒滴丸，成形后，將丸取出，用吸水紙拭干滴丸表面，即得。
實施例16取按照實施例2方法獲得的丹參提取物7g、實施例3方法獲得的三七提取物5g、木糖醇25g、淀粉6g備用；將丹參提取物和三七提取物加入水浴融化的木糖醇和淀粉混合物中，保溫，在65～95℃溫度下滴制、滴管口徑為1.10～3.0毫米，以每分鐘20～50滴的速度滴制，滴入植物油中，制成1000粒滴丸，成形后，將丸取出，用吸水紙拭干滴丸表面，即得。
實施例17取按照實施例2方法獲得的丹參提取物5g、實施例3方法獲得的三七提取物5g、乳糖醇17.5g、阿拉伯膠5.5g備用；將丹參提取物和三七提取物加入乳糖醇和阿拉伯膠混合物中，混合物在50～95℃加熱熔融，攪拌均勻，攪拌時間為10～30分鐘，保溫，在60～85℃溫度下滴制、滴管口徑為1.1～3.5毫米，以每分鐘50～60滴的速度滴制，滴入甲基硅油中，制成1000粒滴丸，成形后，將丸取出，用吸水紙拭干滴丸表面，即得。
實施例18取按照實施例2方法獲得的丹參提取物1g、實施例3方法獲得的三七提取物10g、木糖醇20.7、阿拉伯膠8.3g備用；將丹參提取物和三七提取物加入木糖醇和阿拉伯膠的混合物中，充分混合，混合物在50～115℃加熱熔融，攪拌均勻，攪拌時間為10～30分鐘，保溫，在60～85℃溫度下滴制、滴管口徑為1.1～3.5毫米，以每分鐘20～60滴的速度滴制，滴入0～18℃的液體石蠟中，待干燥后分裝，制成1000粒滴丸，成形后，將丸取出，用吸水紙吸去丸表面的液狀石蠟，即得。
實施例19取按照實施例1方法獲得的丹參提取物7g、實施例3方法獲得的三七提取物2g、乳糖醇16g、阿拉伯膠4g備用；將丹參提取物和三七提取物加入乳糖醇與阿拉伯膠的混合物中，混合物在64℃加熱熔融，攪拌均勻，攪拌時間為10～30分鐘，保溫，在64℃溫度下滴制、滴管口徑為1.2～2.5毫米，以每分鐘20～60滴的速度滴制，滴入0℃的甲基硅油中，制成1000粒滴丸，將形成的滴丸瀝盡并擦去冷卻液，待干燥后分裝，制成1000粒滴丸，即得實施例20取按照實施例2方法獲得的丹參提取物6g、實施例3方法獲得的三七提取物4g、木糖醇14g、阿拉伯膠6g備用；將丹參提取物和三七提取物加入木糖醇和阿拉伯膠的混合物中，混合物在64℃加熱熔融，攪拌均勻，攪拌時間為10～30分鐘，保溫，在64℃溫度下滴制，滴管口徑為1.2～2.5毫米，以每分鐘20～40滴的速度滴制，滴入10℃的甲基硅油中，將形成的滴丸瀝盡并擦去冷卻液，待干燥后分裝，制成1000粒滴丸，即得。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于該藥物組合物組成包括丹參提取物、三七提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該組合物的組成包括丹參提取物0.5～7份、三七提取物0.1～5份。
3.如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于該組合物的組成包括丹參提取物1～5份、三七提取物0.5～3份。
4.如權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于該組合物的組成包括丹參提取物2.5～3份、三七提取物1份。
5.如權(quán)利要求1、2或3所述的藥物組合物，其特征在于丹參提取物中含有丹酚酸、丹酚酸B鎂鹽、丹參素鈉，三七提取物中含有三七總皂甙。
6.如權(quán)利要求5所述的物組合物，其特征在于丹參提取物中的丹酚酸的含量為丹參提取物重量的30％以上，和/或三七提取物中三七總皂苷含量為三七提取物重量的30％以上。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于丹參提取物中的丹酚酸的含量為丹參提取物重量的40％以上，和/或三七提取物中三七總皂苷含量為三七提取物重量的40％以上。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于丹參提取物中的丹酚酸的含量為丹參提取物重量的47～60％，和/或三七提取物中三七總皂苷含量為三七提取物重量的47～60％。
9.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物在制備治療肝纖維化和早期肝硬化藥物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物在制備治療乙肝、慢性乙肝和脂肪肝所導致的肝纖維化和早期肝硬化藥物中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物在制備治療慢性肝損傷，抑制肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種由丹參、三七制成的藥物組合物及其用途。本發(fā)明藥物組合物可以減輕慢性肝損傷，抑制肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，本發(fā)明藥物組合物可用于治療肝纖維化和肝硬化的藥物，通過動物實驗證明，該藥物具有明顯的抗肝纖維化和肝硬化的作用。
文檔編號A61P1/16GK1778332SQ200410072858
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月24日
發(fā)明者葉正良, 張文生 申請人:天津天士力現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司