專利名稱：作為抑制hiv－1反式激活蛋白與反式激活應答序列rna結合用的磷脂酰乙醇胺脂質體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種作為抑制HIV-1反式激活蛋白(簡稱HIV-1 Tat)與反式激活應答序列RNA(簡稱TAR RNA)結合用的磷脂酰乙醇胺脂質體。
背景技術：
艾滋病或獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immunodeficiency Syndrome，簡稱AIDS)是1981年在美國首先發(fā)現(xiàn)的一種病毒性傳染疾病，其病原是一種能對人免疫系統(tǒng)產生破壞力的逆轉錄病毒，1983年命名為人類免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus，簡稱HIV)。HIV感染人體后，病毒特異性地侵犯并損耗T淋巴細胞造成肌體細胞免疫損傷，臨床初始表現(xiàn)為無癥狀病毒攜帶狀態(tài)，繼之發(fā)展為持續(xù)性全身淋巴結腫大綜合癥，最后并發(fā)各種嚴重機會性感染和惡性腫瘤，成為艾滋病，因無特效治療，病死率極高，已成為人類健康的大敵。至今遍布全球五大洲報告的AIDS病例數(shù)已超過二百萬，HIV感染者近五千萬，而AIDS全球死亡人數(shù)累計達2200萬。在我國，HIV感染人數(shù)已超過60萬，且仍然呈上升趨勢。艾滋病已成為全球關注的公共衛(wèi)生和社會熱點問題。
HIV屬于慢病毒屬(Lentivirus)逆轉錄病毒科，可分為HIV-1和HIV-2兩種類型，其中HIV-1是引起全球艾滋病流行的主要病因，因此，目前關于HIV的防治研究主要是針對HIV-1進行的。
人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的復制受反式激活蛋白(trans-activating protein，Tat)調節(jié)，Tat蛋白可以在轉錄起始及延伸水平反式激活HIV-1LTR的表達，使病毒mRNA水平升高上百倍。Tat蛋白的作用是通過與HIV-1病毒mRNA 5端的一段叫做反式激活反應區(qū)域(trans-activation-responsive region，TAR)的特異性結合來實現(xiàn)的。Tat蛋白是由86個氨基酸殘基組成的小型蛋白(圖1)，有兩個主要功能區(qū)富半胱氨酸區(qū)和基本區(qū)，后者是Tat與TAR的特異識別區(qū)。TAR RNA可以形成莖環(huán)結構(圖.2)，其中由三個核苷酸形成的凸出部位是與Tat蛋白親和性和特異性結合的部位，環(huán)形區(qū)是活體轉錄時所需要的，但不是Tat的結合區(qū)。
HIV Tat和TAR RNA的配合物對病毒復制起重要作用，因此抑制其相互作用成為設計和開發(fā)抗愛滋病新藥的一個重要靶點。由于AIDS是由TAR RNA病毒引起的，因此那些與TAR RNA有特異性結合的化合物將是有效的抑制劑。而且這種抑制劑應當是對人體無毒和易于被吸收的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種作為抑制HIV-1反式激活蛋白與反式激活應答序列RNA結合用的磷脂酰乙醇胺脂質體，磷脂酰乙醇胺價廉，容易獲得，抑制效果好，而且無毒。
為達到上述目的本發(fā)明采用以下技術方案一種抑制HIV-1反式激活蛋白與反式激活應答序列RNA結合用的抑制劑為磷脂酰乙醇胺脂質體。所述的抑制劑也可以為磷脂酰乙醇胺與膽固醇的混合物脂質體。
所述的磷脂酰乙醇胺也可以是DSPE或DPPE或DMPE或DHPE或它們的二種或二種以上的混合物，它們分子中烷烴碳原子數(shù)為10～18。所述的磷脂酰乙醇胺與膽固醇的摩爾比可以從0.3-0.7∶0.7-0.3。
磷脂酰乙醇胺在腦組織中含量甚多，故又稱腦磷脂。它的構造如圖3所示。
天然的腦磷脂是各種磷脂酰乙醇胺的混合物，經分離后得到不同R鏈長的磷脂酰乙醇胺。根據(jù)結構中R鏈長的不同，磷脂酰乙醇胺可分為1，2-二硬脂?；字Ｒ掖及穌isteroyl phosphatidylethanolamine(DSPE)，1，2-二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺dipalmitoyl phosphatidylethanolamine(DPPE)，1，2-二肉豆蔻?；字Ｒ掖及?，2-dimristoylphosphatidylethanolamine l(DMPE)，1，2二庚酰酰基磷脂酰乙醇胺1，2-diheptnoyl phosphatidylethanolamine(DHPE)等。磷脂酰乙醇胺脂質體是由磷脂酰乙醇胺形成的雙層膜球狀物，表面為氨基，帶正電荷。它是一種對人體無害的物質。
本發(fā)明中所用的脂質體可采用以下方法獲得將腦磷脂儲備液旋轉蒸發(fā)，并用高純N2將有機溶劑吹干后，可在旋轉蒸發(fā)器壁上制得腦磷脂干膜。用二次蒸餾水溶解后，得到多室脂質體。將制得的多室脂質體在80℃水浴中超聲1小時，以制備小的單室脂質體。然后再用0.1μm濾膜對其進行勻化處理。所得到的圓形脂質體可用電鏡檢驗(見圖4)。
研究蛋白質與核酸相互作用的常用方法很多，本研究中使用石英晶體微天平(QCM)。這種方法將測定物固定在QCM的鍍金面上，無需標記待測物，而且感量為納克，靈敏度極高?？稍粰z測蛋白質HIV tat與TAR RNA的識別過程中微量的質量變化。[林琳，江龍.DNA分子識別及傳感技術.化學通報，N0.5，261-267(2001).]本發(fā)明測定方法是利用生物素(biotin)與親和素(avidin)結合速度快、結合穩(wěn)定性高的特點，先用avidin或neutravidin(neutravidin是不含糖苷的親和素，其活性與母體一致，與生物素的解離常數(shù)為KD＝10-15M)將TAR RNA固定到QCM鍍金表面，再利用Tat(或腦磷脂脂質體)與TAR RNA的親和性將Tat(或腦磷脂脂質體)固定到吸附有QCM鍍金表面。其過程見圖5圖5中， 鍍金表面， 不含糖苷親和素，*生物素， TAR RNA， DPPE脂質體， HIVTat計算TAR與Tat或TAR與腦磷脂脂質體相互作用的方法是因為Tat或腦磷脂脂質體與TAR間的作用為特異性作用，所以Tat或腦磷脂脂質體在高濃度時可達到與TAR的最大結合比。因此，Tat-TAR與腦磷脂脂質體-TAR的結合常數(shù)可根據(jù)類似Langmuir吸附等溫線方程算出，即Γ-Γ∞C(KD+C)---(1)]]>Γ是Tat或腦磷脂脂質體與TAR結合的物質的量(mol)，?！奘荰at或腦磷脂脂質體與TAR的最大結合量，KD是Tat-TAR或腦磷脂脂質體-TAR的解離常數(shù)，C是溶液中Tat或腦磷脂脂質體的濃度。(根據(jù)腦磷脂脂質體的平均直徑可算出其面積。2倍的腦磷脂脂質體的面積除以單個腦磷脂的面積即為組成雙層腦磷脂脂質體所需要的單個腦磷脂的大致數(shù)量，從而可近似算出腦磷脂脂質體的分子量)。
將1/Γ與1/C作圖，則斜率為KD/?！?，截矩為1/Γ∞，從而可計算出結合常數(shù)。[H.Zhao，J.R.Li，L.Jiang，HIV-1 TAR RNA-Tat peptide complexation using poly(acrylicacid)，BBRC，Vol 320/1 pp95-99(2004)]


圖1；HIV-1Tat的初級結構.
圖2HIV-1TAR RNA的二級結構.
圖3磷脂酰乙醇胺的構造圖.
圖4DPPE脂質體電鏡5分子識別過程示意6QCM鍍金表面的質量隨分析物加入的改變7ATat與TAR RNA結合時QCM晶體表面物質的質量改變量與其濃度的關系圖.
圖7BDPPE脂質體與TAR RNA結合時QCM晶體表面物質的質量改變量其濃度的關系圖.
具體實施例方式
實施例1Tat(GlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg)購自上海生工生物工程有限公司，TAR RNA(biotin-5’-GCCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGGC-3’)購自大連寶生物公司。
將1mM市售的DPPE儲備液(氯仿∶甲醇＝3∶1)旋轉蒸發(fā)，并用高純N2將有機溶劑吹干后，可在旋轉蒸發(fā)器壁上制得腦磷脂干膜。用二次蒸餾水溶解后，得到多室脂質體。將制得的多室脂質體在80℃水浴中超聲1小時，以制備小的單室脂質體。然后再用0.1μm濾膜對其進行勻化處理。所得到的圓形脂質體可用電鏡檢驗。
先將QCM鍍金晶片在1mg mL-1neutravidin溶液中浸泡30分鐘，以得到neutravidin修飾的QCM鍍金晶片。依次用緩沖溶液和二次蒸餾水沖洗，測量頻率。接著將neutravidin修飾的QCM鍍金晶片在1.0×10-6mol/L biotin-TAR RNA溶液中浸泡60分鐘，以得到biotin-TAR RNA修飾的QCM鍍金晶片。洗凈后，測量頻率。再在1，2-dipalmitoylphosphatidylethanolamine(DPPE)脂質體(濃度7.0×10-9mol/L)或Tat(濃度為1.0×10-6mol/L)溶液中浸泡60分鐘，再洗凈后測量頻率。然后將吸附有腦磷脂脂質體或Tat的鍍金晶片浸入Tat或DPPE脂質體溶液中浸泡60分鐘，再洗凈后測量頻率。實驗結果如圖6所示。
圖6中，橫座標為時間(分)，縱座標為質量變化值(ng)。
A曲線在QCM鍍金晶片上各種物質的吸附次序；1.neutravidin，2.biotin-TAR，3.DDPE脂質體，4.TatB曲線在QCM鍍金晶片上各種物質的吸附次序；5.neutravidin，6.biotin-TAR，7.Tat，8.DPPE脂質體。
圖6A曲線表明將吸附有TAR-DPPE配合物的QCM鍍金晶片浸入Tat溶液后，沒有明顯的質量改變，說明DPPE脂質體可抑制Tat與TAR RNA的結合，這可能是由于DPPE脂質體與TAR的相互作用改變了TAR的構型。但將吸附有TAR-Tat配合物的QCM鍍金晶片浸入DPPE脂質體溶液后，可觀察到明顯的質量改變(圖6B曲線)，這可能是由于形成了TAR-Tat-DPPE三元配合物。
Tat或DPPE脂質體在高濃度時可達到與TAR的最大結合比，我們的試驗已證明了這一點(圖7A，7B)，在圖7A中，橫坐標為濃度(μmol/L)，縱坐標為質量變化值(ng)，在圖7B中，橫座標為濃度(nmol/L)，縱座標為質量變化值(ng)。因此，Tat-TAR與DPPE脂質體-TAR的結合常數(shù)可根據(jù)公式(1)算出。根據(jù)DPPE脂質體的平均直徑可算出其中所含的DPPE分子的數(shù)量，從而可近似算出DPPE脂質體的摩爾量為9.8×106。
將1/Γ與1/C作圖，其斜率為KD/?！?，截矩為1/?！?。計算結果表明，Tat-TAR的表面結合常數(shù)(KD-1)為3.9×105M-1，與文獻[N.Tassew，M.Thompson，BiophysicalChemistry，106，(2003)241-252]報道的結合常數(shù)值基本一致。而TAR-DPPE脂質體的表面結合常數(shù)(KD-1)為7.8×106M-1，是前者表面結合常數(shù)的20倍，說明DPPE脂質體與TAR的親和性強于Tat，可以用來抑制HIV-1 Tat與TAR RNA結合。
實施例2本實施例使用市售天然腦磷脂來制備脂質體，其制備方法如實施例1。
先將QCM鍍金晶片在1mg mL-1neutravidin溶液中浸泡30分鐘，以得到neutravidin修飾的QCM鍍金晶片。依次用緩沖溶液和二次水蒸餾水沖洗，測量頻率。接著將neutravidin修飾的QCM鍍金晶片在1.0×10-6M biotin-TAR RNA溶液中浸泡60分鐘，以得到biotin-TAR RNA修飾的QCM鍍金晶片。洗凈后，測量頻率。再在天然腦磷脂脂質體溶液中浸泡60分鐘，再洗凈后測量頻率。然后將吸附有腦磷脂脂質體或Tat的鍍金晶片浸入Tat或天然腦磷脂脂質體溶液中浸泡60分鐘，再洗凈后測量頻率。實驗結果表明將吸附有TAR-天然腦磷脂配合物的QCM鍍金晶片浸入Tat溶液后，沒有明顯的質量改變，說明天然腦磷脂脂質體可抑制Tat與TAR RNA的結合，這可能是由于天然腦磷脂脂質體與TAR的相互作用改變了TAR的構型。但將吸附有TAR-Tat配合物的QCM鍍金晶片浸入天然腦磷脂脂質體溶液后，可觀察到明顯的質量改變，這可能是由于形成了TAR-Tat-天然腦磷脂三元配合物。
根據(jù)近似Langmuir吸附等溫線方程可算出Tat-TAR的表面結合常數(shù)Ka為3.9×105M-1。而TAR-天然腦磷脂脂質體的表面結合常數(shù)Ka為9.6×106M-1，是前者表面結合常數(shù)的24倍，說明天然腦磷脂脂質體與TAR的親和性強于Tat?？梢杂脕硪种艸IV-1 Tat與TAR RNA結合。
實施例3本實施例使用市售膽固醇和1，2-二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)來制備混合脂質體，其制備方法如實施例1先將QCM鍍金晶片在1mg mL-1avidin溶液中浸泡30分鐘，以得到avidin修飾的0CM鍍金晶片。依次用緩沖溶液和二次水沖洗，測量頻率。接著將avidin修飾的QCM鍍金晶片在1.0×10-6M biotin-TAR RNA溶液中浸泡60分鐘，以得到biotin-TAR RNA修飾的QCM鍍金晶片。洗凈后，測量頻率。再在DMPE和膽固醇的混合脂質體溶液中浸泡60分鐘，DMPE和膽固醇的摩爾分數(shù)為0.5∶0.5。再洗凈后測量頻率。然后將吸附有混合脂質體或Tat的鍍金晶片浸入Tat或DMPE脂質體溶液中浸泡60分鐘，再洗凈后測量頻率。將吸附有TAR-混合脂質體配合物的QCM鍍金晶片浸入Tat溶液后，沒有明顯的質量改變，說明混合脂質體可抑制Tat與TARRNA的結合。但將吸附有TAR-Tat配合物的QCM鍍金晶片浸入混合脂質體溶液后，可觀察到明顯的質量改變，這可能是由于形成了TAR-Tat-混合脂質體三元配合物。
根據(jù)Langmuir吸附等溫線方程可計算出Tat-TAR的表面結合常數(shù)Ka為3.9×105M-1。而TAR-混合脂質體的表面結合常數(shù)Ka為5.7×106M-1，是前者表面結合常數(shù)的15倍，說明含有膽固醇的混合脂質體與TAR的親和性強于Tat，可以用來抑制HIV-1 Tat與TAR RNA結合。
序列表<110>中國科學院化學研究所<120>作為抑制HIV-1反式激活蛋白與反式激活應答序列RNA結合用的磷酸酰乙醇胺脂質體<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>人工合成<400>1Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5 10<210>2<211>29<212>RNA<213>人工合成<400>2gccagaucug agccugggag cucucuggc
權利要求
1.一種抑制HIV-1反式激活蛋白與反式激活應答序列RNA結合用的抑制劑，其特征在于所述的抑制劑為磷脂酰乙醇胺脂質體。
2.如權利要求1所述的抑制HIV-1反式激活蛋白與反式激活應答序列RNA結合用的抑制劑，其特征在于所述的抑制劑為磷脂酰乙醇胺與膽固醇的混合物脂質體。
3如權利要求1或2所述的抑制HIV-1反式激活蛋白與反式激活應答序列RNA結合用的抑制劑，其特征在于所述的磷脂酰乙醇胺為DSPE或DPPE或DMPE或DHPE或它們的二種或二種以上的混合物，它們分子中烷烴碳原子數(shù)為10～18。
4.如權利要求2所述的抑制HIV-1反式激活蛋白與反式激活應答序列RNA結合用的抑制劑，其特征在于其中磷脂酰乙醇胺與膽固醇的摩爾分數(shù)從0.3-0.7∶0.7-0.3。
5如權利要求1或2所述的抑制HIV-1反式激活蛋白與反式激活應答序列RNA結合用的抑制劑，其特征在于它是通過以下方法獲得的脂質體，將腦磷脂儲備液(氯仿∶甲醇＝3∶1)旋轉蒸發(fā)，并用高純N2將有機溶劑吹干后，可在旋轉蒸發(fā)器壁上制得腦磷脂干膜，用二次蒸餾水溶解后，得到多室脂質體，將制得的多室脂質體在80℃水浴中超聲1小時，以制備小的單室脂質體，然后再用0.1μm濾膜對其進行勻化處理，其腦磷脂儲備液的濃度從0.5-2.0mM/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種磷脂酰乙醇胺脂質體，它是作為抑制HIV－1反式激活蛋白與反式激活應答序列RNA結合用的抑制劑，該抑制劑也可以是磷脂酰乙醇胺與膽固醇的混合物脂質體，該磷脂酰乙醇胺脂質體是通過以下方法獲得的將腦磷脂儲備液旋轉蒸發(fā)，并用高純N
文檔編號A61P31/00GK1732960SQ200410074010
公開日2006年2月15日 申請日期2004年8月31日 優(yōu)先權日2004年8月10日
發(fā)明者江龍, 趙紅, 李津如 申請人:中國科學院化學研究所