專利名稱：新型抗栓劑kgd－環(huán)七肽的設(shè)計、制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更確切地說基于現(xiàn)代生物化學(xué)技術(shù)與現(xiàn)代蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)制備新型抗栓劑，其設(shè)計、制備及應(yīng)用特點。
背景技術(shù)：
抗栓劑作為預(yù)防、治療心腦血管疾病要用藥的重要輔助手段，在臨床醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用。對于預(yù)防重大疾病的發(fā)生(如腦血栓的系統(tǒng)后遺癥)是主要用藥，(如廣泛使用的阿斯匹林)，同時，作為溶栓疾病(如中風(fēng)、心肌梗塞、心絞痛等)治療過程中的主要輔助用藥(如tPA-肝素配伍用藥，tPA-華法林、阿斯匹林配伍用藥等)，無論是在手術(shù)治療(如廣泛使用的微橋介入治療術(shù))，還是單純藥物性治療上，都具有舉足輕重的地位，在預(yù)防病人心腦血管循環(huán)系統(tǒng)再次出現(xiàn)栓塞，以及保證治療過程安全有效地進行方面，都發(fā)揮著重要的作用，體現(xiàn)出實際的治療與預(yù)防效果。
抗栓劑作為實際臨床醫(yī)療過程中的一種重要使用藥物，一直以來都備受重視，一直都是醫(yī)療界、醫(yī)藥界、以及科學(xué)界關(guān)注的重要領(lǐng)域。抗栓劑的研究與發(fā)展走過了一條漫長道路，根據(jù)作用機制，抗栓劑研發(fā)歷史與現(xiàn)狀可以歸納為以下幾個方面1.通過抑制血栓烷A2的合成此類抗栓劑以阿斯匹林(Aspirin)為代表。血栓烷A2是內(nèi)源性的血小板聚集刺激劑，激發(fā)體內(nèi)血栓形成，擔(dān)負一定的生理功能。在血小板中，以花生四烯酸(AA，arachidonic acid)為底物，通過一系列酶促反應(yīng)衍生血栓烷A2。阿斯匹林抑制了血栓烷A2合成代謝過程中的一個關(guān)鍵酶——環(huán)加氧酶，從而抑制了由中間代謝產(chǎn)物前列腺素最終轉(zhuǎn)變?yōu)檠ㄍ锳2。抑制效果是迅速而高效的，血栓烷A2合成抑制導(dǎo)致的血小板聚集抑制可長達血小板的整個生命周期(7至10天時間)。因為阿斯匹林優(yōu)良的用藥性能以及低廉的產(chǎn)品價格，因而是目前醫(yī)療臨床上最常用的抗栓劑，在中國也是如此，阿斯匹林廣泛應(yīng)用于對腦血管局部缺血與栓塞形成的預(yù)防性治療上，以及減少心肌梗塞再栓塞發(fā)生上。但是在長期醫(yī)療實踐的過程中，阿斯匹林的副作用也逐漸暴露出來，有些甚至是非常嚴重的副作用，如引起胃腸道出血、潰瘍發(fā)生、出血性休克發(fā)病率升高，尤其在長期、大劑量使用時更為嚴重，嚴重時常常導(dǎo)致停止用藥。這些現(xiàn)象越來越引起醫(yī)學(xué)界、科學(xué)界的關(guān)注和重視。
2.通過抑制環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶活性如Dipyridamole(迪普萊達莫)提高細胞內(nèi)cAMP水平，提高前列腺素I2的效力，抑制血栓烷A2的合成，降低血小板對血栓形成面的粘附性。在醫(yī)療上，常用作冠狀動脈擴張劑，用于對心絞痛的長期治療中。(Fitzgerald G.A，Reilly I.A，et al，Circulation，1985，72，1194-1201；Fitzgerald D.J，F(xiàn)ragetta J，et al，J.Clin.Invest，1988，82，1708-1713.)3.通過拮抗血栓烷A2受體Stegmerer在1984年就報道了合成的血栓烷受體拮抗劑對血管血栓的形成具有明顯的抑制作用(Stegmerer K，Pill J，et al，Throm Res，1984，35，379-395.)，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)對于Collagen，epinephrine，thrombin，ADP，5-HT，PAF(platelet activating factor)等物質(zhì)對血小板刺激產(chǎn)生的聚集沒有抑制效果。
4.通過單克隆抗體拮抗整合素受體在這方面，有大量的研究報告，制備特異的整合素受體單克隆抗體對整合素受體有極強的識別與結(jié)合效果，對血小板聚集表現(xiàn)出很高的抑制活性。但多項研究也表明，此種抑制是不可逆的，而且抗體與整合素受體結(jié)合持續(xù)時間很長，達血小板的整個生命周期(7-10天)，副作用顯而易見(Coller B.S，F(xiàn)olts.J.D，et al，Blood，1986，68，783-786；Coller B.S，Scadder L.E，Blood，1988，66，1456-1454；Ramadurgam K，Veerapandian B，et al，J.Biol.Chem，1995，270，2268-2273；Kunicki T.J，Ely K.R，et al，J.Biol.Chem，1995，270，16660-16665.)。
5.通過RGD多肽競爭性地抑制整合素受體目前有以下幾類RGD序列肽成為人們的研究工具人工合成及天然蛋白水解得到的RGD肽；某些天然蛇毒蛋白、神經(jīng)毒素、以及具有抗栓活性的水蛭蛋白及胞間去整合素；由整合素制備的含有功能性序列的單克隆抗體；人工改造的多功能蛋白。這類研究目前在國際上許多發(fā)達國家的實驗室都在開展這方面的研究工作，取得了大量的研究信息。在國內(nèi)，作為在該領(lǐng)域起步較早的主要研究隊伍之一，我們也在新型基因工程RGD重組多肽的制備及其功能、結(jié)構(gòu)與作用特點研究方面取得了許多有益的成果與進展，獲得了一批代表國際先進水平的成果(Jing J，Tang JG，Biotechnology Letters，2001，22，11，47-52；Yang ZH，Jing J，et al，AppliedBiochemistry and Biotechnology，U.S.A，2002，10，1，1-10.)。目前，該領(lǐng)域的研究仍在不斷地深入進行，并陸續(xù)取得了許多新的認識與突破(唐建國、井健、楊志宏，發(fā)明專利，專利號99109419)。
6.通過抑制血液中凝血酶的催化活性凝血酶在轉(zhuǎn)變纖維蛋白原為纖維蛋白，進而形成網(wǎng)狀血栓凝塊的過程中發(fā)揮重要的作用，作為整個血栓形成過程酶促化學(xué)的主要一環(huán)。目前，已發(fā)現(xiàn)直接抑制凝血酶活性的分子有水蛭素(Hirudin)，其氮端可與凝血酶分子第195位絲氨酸形成氫鍵，抑制凝血酶蛋白質(zhì)分子的催化活性(Colman R.W，Hirsh J，et al，1994，Homeostasis and Thrombosis.Basic Principles andClinical Practice(3rd Ed)，J.B.Lippincott company，Philadelphia.)。目前，國際上有德國、美國、中國等國幾家實驗室在研究基于水蛭素分子的抗栓藥物開發(fā)工作。
7.通過拮抗凝血酶受體凝血酶分子不僅具有酶促催化活性，它本身還是一個血小板激活因子。這一過程通過與凝血酶受體相互作用實現(xiàn)。凝血酶受體在41位裂解后被激活，此一過程是不可逆的，通過下游調(diào)控信號傳遞，對血小板的激活起作用。拮抗凝血酶受體能夠有效地達到抗凝效果。發(fā)現(xiàn)一種包含SFLLRN序列、水蛭素結(jié)合序列及其他抑制凝血酶受體的分子胞外結(jié)構(gòu)域，具有這種拮抗效果，但基于此的藥物尚未出現(xiàn)。
8.通過抑制凝血酶的生成凝血酶促進可溶性的纖原轉(zhuǎn)化為不溶性的纖維蛋白，在血栓的最終形成方面起到至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制凝血酶的產(chǎn)生也可以達到抗栓的效果。研究發(fā)現(xiàn)組織因子抑制劑(TFPI)可與肝素抑制因子Xa形成復(fù)合物結(jié)合到組織因子VIIa上，抑制凝血酶的產(chǎn)生。
很長一段時間里，抗血栓藥物的研究在基礎(chǔ)理論及應(yīng)用研究中都占有一席之地，但由于機體內(nèi)調(diào)控血栓溶解、血栓形成的機制非常復(fù)雜，對不同種類抗栓藥物的大量、長期的臨床醫(yī)療實踐已經(jīng)突出地表明抗栓藥物的專一性及安全性已成為新一代藥物研究開發(fā)的重要方向。
對血栓形成機制的長期研究已經(jīng)明確，在由不同刺激劑導(dǎo)致的血栓形成過程中，最后都涉及血小板與纖維蛋白原的結(jié)合與血小板的聚集。在這一過程中，作為血小板整合素受體配體的多種粘結(jié)蛋白質(zhì)(如纖維粘結(jié)蛋白(fibronectin)、纖維蛋白原(fibrinogen)、玻璃粘結(jié)蛋白(vitronectin)、馮-布勞德因子(vWF factor))中的RGD序列發(fā)揮了重大的作用，負責(zé)與多種整合素受體的識別與結(jié)合。含有RGD序列的天然蛇毒成分能競爭性地結(jié)合整合素受體，具有很高的抑制血栓形成的能力(Garsky VM，Lumma PK，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，1989，86，4022-4026；Yasuda T，Gold HK，et al，Circulation，1991，83，1038-1047；William JA，Pathol.Biol，1992，40，813-821.)。目前國際上開展較多的是利用RGD多肽的特點作用構(gòu)建一些新型基因工程抗栓分子或者基因工程雙功能分子，實驗表明，RGD多肽的引入賦予了基因工程重組產(chǎn)物較高的抗栓活性(Jing J，Tang JG，Biotechnology Letters，2001，22，11，47-52；Yang ZH，Jing J，et al，Applied Biochemistry and Biotechnology，2002，10，1，1-10；Lee G.et al，ProteinEngineering，1993，6，745-753；Church F.C.et al，J.Biol.Chem，1991，266，11975-11979；Yamada T etal，J.Biol.Chem，1995，270，5687-5690；Yamada T，Sekiya F，et al，F(xiàn)EBS Lett，1996，387，11-15；Sanchez E.F，Bush L.R，et al，Throm Res，1997，87，3，289-302.)。與RGD序列相比，KGD序列是近年來才發(fā)現(xiàn)了新型整合素受體識別序列(Scarborough R.M，et al，J.Biol.Chem，1991，266，9359-9362.)，KGD序列具有獨特的優(yōu)點，它不僅保留了RGD序列對整合素受體的高親和性，而且是受體專一性的。含有RGD序列的多肽常常能識別并結(jié)合多類整合素受體，不同種類的整合素受體之間的親和力差別不大，基本在一個數(shù)量級上。由于不同的整合素受體在體內(nèi)具有不同的功能，所以RGD多肽或RGD重組多肽往往除了抗栓活性以外，還能夠表現(xiàn)其他多樣的生物活性，如控制細胞的遷移、細胞程序性死亡、精卵結(jié)合等等。KGD序列由于結(jié)構(gòu)的特殊性，對血小板上含量最豐富的一類整合素受體GPIIb/IIIa是專一性識別與結(jié)合的，而對其他種類的整合素受體的親和力則很低。GPIIb/IIIa受體主要分布在血小板上，對血小板參與血栓形成過程中發(fā)揮極其重要作用，對GPIIb/IIIa受體具有專一性意味著對參與血栓形成的血小板具有了導(dǎo)向性，也即意味著對血栓具有導(dǎo)向性，KGD多肽將專一性拮抗血小板上GPIIb/IIIa受體的功能，從而高效專一性地抑制血栓形成。這一點利用在醫(yī)療上，將大大有益于血栓類疾病的預(yù)防與治療，大大有益于心腦血管疾病病人。能夠解決諸如以往常用抗栓劑(如Aspirin，Dipyradamole，整合素受體單抗)的諸多副作用和不良反應(yīng)，同時強有力地預(yù)防體內(nèi)血管血栓形成，由于其高拮抗活性，其用量很少，常常在10-6-10-8M水平左右就能表現(xiàn)出明顯的抑制血栓形成的效果。這一點在降低病人醫(yī)藥用量成本方面尤其有好處?；诖耍瑖H上已有數(shù)個實驗室在國際醫(yī)藥巨子(如SmithKline，Merck)的支持下，設(shè)計開發(fā)基于KGD多肽作用機制的新一代抗栓藥物，據(jù)統(tǒng)計，大約有6-7個產(chǎn)品目前已進入臨床實驗研究階段。目前，基于分子設(shè)計技術(shù)，我們設(shè)計的KGD-環(huán)七肽產(chǎn)品(見說明書附圖1)，已經(jīng)經(jīng)過了實驗室階段的初步基礎(chǔ)研究，研究表明，KGD-環(huán)七肽表現(xiàn)出較強的血小板聚集抑制活性(IC50為620nM)，同時，表現(xiàn)出很強血小板上纖維蛋白原受體GPIIb/IIIa受體專一性，完全具備天然KGD多肽的抗栓活性與受體專一性，同時，由于KGD-環(huán)七肽為短鏈小肽，分子量僅有826dalton，它對人體的免疫原性極低，同時又具有易于大量合成與生產(chǎn)的顯著優(yōu)點，非常適合應(yīng)用于實際臨床醫(yī)療實踐中。經(jīng)過國際權(quán)威專利文獻信息檢索以及科技文獻信息檢索，目前，有關(guān)KGD-環(huán)七肽的研制尚無任何報道，本項研究與開發(fā)填補了國內(nèi)外空白。所以，KGD-環(huán)七肽極有希望成為我國自主設(shè)計的、具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的，有極高專利保護價值的新藥。目前，KGD-環(huán)七肽的中試規(guī)模生產(chǎn)研究以及相關(guān)的動物實驗研究正在進行中，初步研究成果符合預(yù)期設(shè)計，報送國家醫(yī)藥監(jiān)督管理局準備進行實際臨床研究的工作也正在準備中。

發(fā)明內(nèi)容
為研制一種高效、安全、經(jīng)濟的新型抗栓劑，應(yīng)用于實際醫(yī)療實踐中，以解決目前在抗血栓形成臨床實踐方面存在的問題，諸如抗栓專一性差造成的內(nèi)出血現(xiàn)象，抗血栓活性/效能不高而使得用藥劑量加大，一方面加劇諸如內(nèi)出血副作用，另一方面提高藥物治療成本?；谀壳皣H上關(guān)于血栓形成與溶解機理的最新研究成果以及現(xiàn)代分子設(shè)計技術(shù)，我們優(yōu)化設(shè)計了一個環(huán)七肽結(jié)構(gòu)的具有特異功能序列的短鏈活性多肽。經(jīng)過在SGI工作站上應(yīng)用最新結(jié)構(gòu)模擬與分子設(shè)計軟件包(InsightII Ver2000)，對一系列短鏈環(huán)肽結(jié)構(gòu)進行了結(jié)構(gòu)模擬與優(yōu)化，經(jīng)過比較，環(huán)七肽(cycle-CKGDWDC)在鍵長，鍵角、環(huán)肽鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面均表現(xiàn)出較好的物理化學(xué)表征，KGD功能序列突出于此環(huán)肽鏈外側(cè)，呈活性構(gòu)象狀態(tài)，其中K(賴氨酸)和D(天冬氨酸)的側(cè)鏈構(gòu)象伸展方向以及相對位置均與天然功能性多肽Barbourin、US-2中的構(gòu)象特點一致，說明CKGDWDC環(huán)七肽中KGD序列能夠較好地表現(xiàn)出相應(yīng)的功能構(gòu)象，識別并結(jié)合血小板膜上GPIIb/IIIa受體，從而表現(xiàn)出抑制血小板聚集的活性。同時KGD功能序列的邊側(cè)氨基酸W(色氨酸)的結(jié)構(gòu)特點與側(cè)鏈構(gòu)象也與天然功能性蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)特點與構(gòu)象特征一致。同時，在CKGDWDC環(huán)七肽結(jié)構(gòu)中，KGDW四肽序列形成一個β-turn結(jié)構(gòu)，其中第一位的K(賴氨酸)側(cè)鏈與第四位的W(色氨酸)側(cè)鏈形成氫鍵聯(lián)系，維持β-turn結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，有利于KGD序列表現(xiàn)出特有的結(jié)構(gòu)特點，而這些對于KGD序列表現(xiàn)出高度的受體專一性是非常重要的，這些結(jié)構(gòu)特征在天然KGD功能型多肽如Barbourin、US-2中也是存在的。
天然KGD功能多肽如Barbourin、US-2長度分別為50-70個氨基酸左右，不太可能通過蛋白質(zhì)/多肽合成的方法進行大量生產(chǎn)，而只能通過基因工程的方法生產(chǎn)。同時，Barbourin、US-2都是源于蛇毒的蛋白質(zhì)分子，是Viper類蛇毒的有效成分，所以對人體有著強烈的免疫原性與潛在的致毒性，所以根本不能直接用于人體或者對病人的治療上。我們設(shè)計的KGD-環(huán)七肽結(jié)構(gòu)分子量非常小，只有約826dalton，與一般的有機合成化工類藥物差不多，而且環(huán)鏈結(jié)構(gòu)緊湊，對人體的免疫原性非常小，與一般有機合成藥物相當(dāng)。所以對人體不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
本項研究開發(fā)的目的是基于含KGD序列天然蛇毒抗栓肽蛋白質(zhì)功能與結(jié)構(gòu)特點，利用現(xiàn)代蛋白質(zhì)工程手段構(gòu)建新型的具有高效抗栓活性且具有高度受體專一性短鏈多肽分子，以用于血液生物學(xué)、藥理學(xué)和臨床醫(yī)療學(xué)的基礎(chǔ)研究和實際臨床應(yīng)用中。它的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)證明它符合我們原定研究的目的。
KGD-環(huán)七肽的構(gòu)建的方法具有創(chuàng)新性，所應(yīng)用的蛋白質(zhì)工程方法為發(fā)明人自行設(shè)計的，主要包括以下步驟1.分子設(shè)計與優(yōu)化。
KGD-環(huán)七肽的一級結(jié)構(gòu)的設(shè)計主要依據(jù)對去整合素Barbourin與US-2的研究，KGD是負責(zé)與血小板GPIIb/IIIa受體特異性識別并結(jié)合的，位于羧基端的W(色氨酸)輔助KGD功能序列發(fā)揮其生物活性。對KGD-環(huán)七肽高級結(jié)構(gòu)的評估主要是通過SGI Octane2工作站上運行InsightII(Ver2000)結(jié)構(gòu)模擬計算軟件包實現(xiàn)。在進行結(jié)構(gòu)模擬的過程中，兩個主要的結(jié)構(gòu)計算參數(shù)Iteration(循環(huán)計算次數(shù))與RMSD(結(jié)構(gòu)計算均方根偏差)分別設(shè)定為1,000與0.01，從計算次數(shù)與計算結(jié)構(gòu)精度的兩個方面對KGD-環(huán)七肽結(jié)構(gòu)預(yù)測取得一個高度精確的結(jié)果。InsightII(Ver2000)軟件包是目前在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)計算領(lǐng)域普遍采用的，具有最佳運算效率與準確度的功能軟件包，尤其在對小分子量多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測上，準確度最高，準確度達到80％以上，與實際測定結(jié)果基本一致或接近。對于KGD-環(huán)七肽這個分子量僅為826dalton的短鏈小肽而言，其預(yù)測結(jié)構(gòu)已基本上可以等同于其真實結(jié)構(gòu)，所以，從InsightII(Ver2000)軟件包中計算出來的數(shù)據(jù)已經(jīng)可以很好地指導(dǎo)我們進行功能方面的分析與預(yù)測。InsightII(Ver2000)軟件包的計算結(jié)果顯示KGDW兩端的兩個半胱氨酸形成的二硫鍵結(jié)構(gòu)大大束縛了短鏈小肽分子的構(gòu)象柔性，減少了不規(guī)則構(gòu)象產(chǎn)生的機率，整個短鏈小肽的分子結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出單一、有序的特點，其中KGD功能序列中K(賴氨酸)殘基側(cè)鏈與D(天冬氨酸)殘基側(cè)鏈分別伸向環(huán)鏈的外側(cè)，與外部溶液環(huán)境充分接觸，賴氨酸與天冬氨酸殘基側(cè)鏈的伸展方向彼此相反。分子結(jié)構(gòu)計算結(jié)果顯示，W(色氨酸)與K(賴氨酸)形成氫鍵結(jié)構(gòu)，進一步穩(wěn)定了這個環(huán)七肽的空間構(gòu)象。這些都與天然去整合素受體拮抗劑中KGD的結(jié)構(gòu)特點與作用機制相一致，所以可以較為肯定地預(yù)計，KGD-環(huán)七肽能夠較好地模擬天然去整合素多肽的功能構(gòu)象，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)活性，表現(xiàn)出較高的受體專一性與抗血小板聚集抑制活性。
2.KGD-環(huán)七肽的合成與純化。
采用目前最先進的固相多肽合成技術(shù)，合成步驟分兩步進行。第一步為CKGDWDC線性七肽的固相合成與鑒定。合成后的多肽分子經(jīng)過HPLC進行純化，獲得CKGDWDC線性七肽純品多肽分子。簡要地說，多肽是在一個Milligen pepsynthesizer(肽合成儀)，通過Fmoc固相合成方法進行合成的。用90％TFA結(jié)合凈化劑進行剪切/去保護。第二步為CKGDWDC線性七肽分子的環(huán)化，主要反應(yīng)內(nèi)容為在可控氧化條件下使第一位的半胱氨酸與第七位的半胱氨酸殘基側(cè)鏈-SH進行共價偶聯(lián)形成二硫鍵橋，多肽的環(huán)化是通過剪切前用碘對三苯甲基保護的巰基進行在樹脂上的氧化，將線性七肽轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)七肽結(jié)構(gòu)，所有的多肽都通過反相HPLC進行純化，獲得具有正確二硫鍵結(jié)構(gòu)的KGD-環(huán)七肽分子，通過質(zhì)譜測定進行鑒定，用于后續(xù)的生物學(xué)活性測定。
3.KGD-環(huán)七肽的理化學(xué)性質(zhì)研究與生物學(xué)活性測定研究內(nèi)容主要包括以下方面(1)通過質(zhì)譜方法測定純化的環(huán)七肽分子量與樣品均一性；(2)自由巰基檢測實驗；
(3)SDS-PAGE與Native-PAGE電泳檢測線性肽與環(huán)性肽不同的電泳行為，對環(huán)七肽的荷質(zhì)比狀況及電泳行為、純度作出進一步評價；(4)ADP-刺激下血小板聚集抑制活性的測定，即最大半抑制濃度的測定；(5)ADP-刺激下血小板聚集抑制延遲速率的測定；經(jīng)過大量實驗研究與測定工作，表明分子設(shè)計KGD-環(huán)七肽作為新型的具有受體專一性高效抗栓劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于目前已知的所有天然抗栓劑以及國內(nèi)外迄今為止已經(jīng)研制成功及正在研究的基因工程改造或化學(xué)修飾的抗栓劑。其特點如下1.KGD-環(huán)七肽具有較強的抑制血小板聚集活性；2.KGD-環(huán)七肽具有較高度的血小板上纖維蛋白原受體專一性；3.KGD-環(huán)七肽分子量極小，對人體而言幾乎不具有免疫原性；4.綜合以上三個特點，KGD-環(huán)七肽是一類高效的抗栓劑，并且，當(dāng)應(yīng)用于臨床醫(yī)療實踐中，將具有較高的用藥安全性；5.通過固相多肽合成方法結(jié)合高效液相色譜方法制造的KGD-環(huán)七肽純度高，產(chǎn)量可以較為準確地控制，并且因為主要是采用固相多肽合成方法，所以KGD-環(huán)七肽產(chǎn)品易于大量生產(chǎn)，且產(chǎn)品的性能穩(wěn)定，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，有效規(guī)避了基因工程產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中的高風(fēng)險性及產(chǎn)品性能不穩(wěn)定缺點。因為不采用微生物發(fā)酵及基因工程路線生產(chǎn)，所以不受環(huán)境、氣候、溫度、濕度等條件影響，相對而言，生產(chǎn)成本大大降低。
6.KGD-環(huán)七肽與其它目前臨床上正在廣泛使用的抗栓劑相比，具有較低的毒副作用，對人體無免疫原性或很低，是一類高效的且具有導(dǎo)向性的新型抗栓劑，因為高度受體專一性與導(dǎo)向性，而有可能大大降低用藥劑量，進一步降低了用藥風(fēng)險與副作用，同時使治療成本大大下降，減輕病人負擔(dān)，所以，KGD-環(huán)七肽是一類非常有希望應(yīng)用于血栓類疾病治療與預(yù)防的實際臨床應(yīng)用中的。
7.整個生產(chǎn)過程不使用有毒物質(zhì)，不污染環(huán)境。
以上特點為KGD-環(huán)七肽產(chǎn)品進行后期臨床實驗研究以及將來應(yīng)用于臨床醫(yī)療實踐打下了良好的基礎(chǔ)，KGD-環(huán)七肽分子極有希望成為具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的最新一代抗栓制劑。


圖1.KGD-環(huán)七肽一級結(jié)構(gòu)示意圖及分子結(jié)構(gòu)式。
圖2.KGD-環(huán)七肽分子空間結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3.KGD-環(huán)七肽合成產(chǎn)物經(jīng)純化后的質(zhì)譜測定圖。
圖4.KGD-環(huán)七肽的SDS-PAGE電泳圖譜。1，2為非還原條件下電泳檢測；3，4為還原條件下電泳檢測。
圖5.KGD-環(huán)七肽對ADP刺激下血小板聚集抑制的光透射圖。A為0.9％NaCl溶液作為對照。B、C、D為不同濃度KGD-環(huán)七肽(0.25，0.5，0.75uM)。
圖6.ADP刺激下KGD-環(huán)七肽對血小板聚集抑制程度曲線圖。
圖7.ADP刺激下KGD-環(huán)七肽對血小板聚集半抑制圖譜。A圖表示以0.9％NaCl生理鹽水作為陰性對照；B圖表示KGD-環(huán)七肽IC50值(620nM)。
圖8.ADP刺激下KGD-環(huán)七肽對血小板聚集抑制速率變化圖。
具體實施例方式
實施例1.KGD-環(huán)七肽的分子設(shè)計與多肽合成實驗材料與試劑多肽合成中所需各種氨基酸為Sigma公司產(chǎn)品；各種層析介質(zhì)均為瑞典Phamacia公司產(chǎn)品，其他所需分析純級試劑為北京化工廠產(chǎn)品；部分色譜純級試劑為美國Sigma公司產(chǎn)品；實驗設(shè)備SGI工作站、InsightII(Ver2000)軟件包為美國SGI公司產(chǎn)品；電泳儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；FPLC(AKTA系列)快速蛋白液相層析系統(tǒng)、反相層析柱、蛋白質(zhì)固相合成儀為瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品；質(zhì)譜儀為美國HP公司產(chǎn)品；大型蛋白質(zhì)凍干機為美國Labconco公司產(chǎn)品；恒溫水浴設(shè)備為美國Colora公司產(chǎn)品。
實驗方法與結(jié)果1.KGD-環(huán)七肽分子結(jié)構(gòu)設(shè)計與結(jié)構(gòu)優(yōu)化(計算機分子結(jié)構(gòu)模建程序參考相應(yīng)軟件包及SGI工作站使用手冊進行)。最終設(shè)計的KGD-環(huán)七肽短鏈環(huán)型多肽分子的一級結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)示意圖如附圖1與附圖2所示。
2.KGD-環(huán)七肽分子的合成對KGD-環(huán)七肽分子的合成分兩步進行。首先在Milligen Pepsynthesizer 9050蛋白質(zhì)固相合成儀上合成線性結(jié)構(gòu)的CKGDWDC-短鏈多肽分子，第二步為線性CKGDWDC-多肽分子的環(huán)化，即在位于氮端第一位的半胱氨酸與位于羧端第一位的半胱氨酸之間形成二硫橋連接，從而形成CKGDWDC-七肽分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
采用蛋白質(zhì)固相合成技術(shù)合成KGD-環(huán)七肽的一級結(jié)構(gòu)，即線性KGD短鏈多肽分子。這一步在Pharmacia公司生產(chǎn)的Milligen Pepsynthesizer 9050蛋白質(zhì)固相合成儀上進行，具體合成步驟參考固相合成儀產(chǎn)品使用手冊。第一次合成產(chǎn)物大約為40mg，經(jīng)過脫鹽與HPLC等必要的純化步驟后，除去合成過程中雜質(zhì)與反應(yīng)副產(chǎn)物，獲得具有較高純度的KGD-線性七肽分子，用于后面的環(huán)化實驗，從初次合成的40mg產(chǎn)物中獲得純化的線性多肽分子約15毫克。多肽的環(huán)化是通過剪切前用碘對三苯甲基保護的巰基進行在樹脂上的氧化，在可控氧化條件下使第一位的半胱氨酸與第七位的半胱氨酸殘基側(cè)鏈-SH進行共價偶聯(lián)形成二硫鍵橋，將線性七肽轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)七肽結(jié)構(gòu)。具體反應(yīng)步驟參考Milligen Pepsynthesizer 9050蛋白質(zhì)固相合成儀產(chǎn)品使用手冊。對反應(yīng)體系進行濃縮后，進行HPLC-反相層析操作，除去線性多肽分子及其他反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，獲得KGD-環(huán)七肽純品多肽，真空冷凍干燥，獲得KGD-環(huán)七肽干粉。對KGD-環(huán)七肽進行飛行質(zhì)譜檢測，檢測圖譜如圖3所示。測定的KGD-環(huán)七肽分子量為819.3dalton，與KGD-環(huán)七肽理論分子量(826dalton)基本一致，并且圖譜顯示多肽均一性較好，無其他雜峰出現(xiàn)，無其他雜蛋白。
實施例2.KGD-環(huán)七肽分子的理化性質(zhì)鑒定1.首先對獲得的KGD-環(huán)七肽多肽分子進行自由巰基數(shù)目鑒定實驗材料與試劑DTNB試劑；實驗設(shè)備紫外分光光度計為島津公司產(chǎn)品；恒溫水浴設(shè)備為美國Colorea公司產(chǎn)品。
實驗方法與結(jié)果調(diào)節(jié)多肽濃度，使之達到適當(dāng)濃度范圍，取15-30ul待測樣品，加入1ml DTNB溶液中，25℃保溫，反應(yīng)0.5小時，然后測定412nm吸光值，根據(jù)吸光值大小判斷多肽中二硫鍵含量，并對照標準曲線計算巰基數(shù)量。若待檢分子中含有自由巰基(-SH)，則會出現(xiàn)顯色反應(yīng)，反應(yīng)溶液體系呈現(xiàn)橙黃色；若待檢分子中無自由巰基，則反應(yīng)溶液體系不呈現(xiàn)任何顏色。對獲得的KGD-環(huán)七肽多肽干粉中的實驗結(jié)果表明，無任何顯色現(xiàn)象出現(xiàn)，表明，該物質(zhì)中無自由巰基存在，所有的半胱氨酸都形成了二硫鍵連接，以-S-S-鍵形式存在。
2.SDS-PAGE電泳檢測KGD-環(huán)七肽實驗材料與試劑丙烯酰胺(Arc)，甲叉雙丙烯酰胺Bis為Boehringer Manngeim公司產(chǎn)品，TEMED、DTT為Promega公司產(chǎn)品。
實驗設(shè)備微量蛋白質(zhì)電泳儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品。
實驗方法與結(jié)果對純化的KGD-環(huán)七肽多肽進行SDS-PAGE電泳，分別進行還原狀態(tài)(加DTT)與非還原狀態(tài)(不加DTT)情況下蛋白質(zhì)的電泳檢測，實驗結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，加入DTT情況下，蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的位置要相對滯后，比在非還原狀態(tài)下(不加DTT)，多肽分子的泳動速度要稍微慢一些。顯示二硫鍵形成對整個多肽分子構(gòu)象具有一定的影響，說明KGD-環(huán)七肽的線性結(jié)構(gòu)與環(huán)形結(jié)構(gòu)，其分子構(gòu)象是不同的。
3.通過質(zhì)譜方法檢測KGD-環(huán)七肽的分子量及分子均一性。
實驗設(shè)備質(zhì)譜儀為美國Hewlett Packard公司產(chǎn)品。
實驗方法與結(jié)果質(zhì)譜檢測在中國科學(xué)院化學(xué)所進行，具體步驟參考美國HP質(zhì)譜測定儀的產(chǎn)品使用說明書及檢測軟件包使用說明。結(jié)果如圖3所示，檢測表明，KGD-環(huán)七肽純品多肽的分子量為819.3dalton，因為在檢測過程中，因為W(色氨酸)及二硫鍵的存在，會對檢測結(jié)果產(chǎn)生一定誤差，導(dǎo)致質(zhì)譜測定的數(shù)據(jù)與理論計算的數(shù)據(jù)有一定誤差，與分子量理論值826dalton在允許誤差范圍內(nèi)，與理論值較為接近。同時，實驗結(jié)果表明，所獲得的多肽純度較高，樣品均一性良好。
實施例3.ADP刺激下的血小板聚集抑制實驗研究KGD-環(huán)七肽的抗栓活性實驗材料與試劑Wistar小鼠與兔，3.8％枸櫞酸鈉，PRP(富含血小板血漿)；PPP(貧含血小板血漿)；0.9％NaCl生理鹽水。
實驗設(shè)備Chron-LG雙道血小板聚集檢測儀為美國Cole-Parmer公司產(chǎn)品。
實驗方法與結(jié)果富含血小板血漿(PRP，platelet-rich plasma)取自Wistar小鼠與兔。測定由北京醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)研究室進行，該方法為測定藥物抗栓活性的常規(guī)方法，為國家衛(wèi)生部規(guī)定和國際通用，用光濁度計監(jiān)測反應(yīng)過程中溶液體系中血小板聚集情況，透射光強度將隨著血小板聚集率的下降而降低，用生理鹽水溶解KGD-環(huán)七肽分子，并配制不同濃度，用于監(jiān)測對ADP刺激下血小板聚集的抑制情況。
首先抽取5ml 3.8％枸櫞酸鈉，然后取新鮮血液45ml混勻，注入到硅化的無菌離心管中，1000rpm離心15min，小心吸去上層血漿(PRP)，計數(shù)血小板并調(diào)至3×106個/ml。將剩余的血液以3000rpm離心20min，上層較為透明的即為PPP，將PRP300ul于緩沖液(對照)或待測樣品加入到測試管中，混勻，在37℃保溫3min，加入攪拌磁棒，首先用PPP調(diào)零點，之后將對照管(含PPP)和測試管放入測試孔中，在測試管中加入誘導(dǎo)劑ADP至終濃度為10uM，開始攪拌，隨時間坐標記錄血小板聚集光透射圖譜，3min后結(jié)束記錄，血小板聚集儀自動給出樣品的最大聚集率。光透射圖譜如圖5所示。樣品對血小板聚集的抑制率＝(對照的最大聚集率-樣品的最大聚集率)/對照的最大聚集率×100％。最大半抑制值IC50的測定是將不同濃度的樣品與PRP 37℃保溫3min，加入誘導(dǎo)劑ADP(終濃度為10uM)，測定樣品的最大聚集率。以抑制率對樣品濃度作曲線，當(dāng)抑制率達到50％時待測樣品的濃度為其IC50值。
KGD-環(huán)七肽與富含血小板血漿PRP混合，ADP是一種血小板刺激劑，能激活血小板上纖維蛋白原受體GPIIb/IIIa的活性構(gòu)象，與細胞外基質(zhì)中的受體配體結(jié)合，促使血小板與血小板之間，血小板與細胞外基質(zhì)之間發(fā)生相互作用與聚集。而拮抗整合素受體的行為會阻止血小板聚集現(xiàn)象的發(fā)生，因此表現(xiàn)出明顯ADP刺激下的血小板聚集抑制效果。本文將其作為評價抗栓活性的一個重要參數(shù)。在富含血小板溶液體系中，當(dāng)加入KGD-環(huán)七肽時，ADP刺激下的血小板聚集程度明顯下降，實驗結(jié)果如附圖5所示。其中，以陰性對照(0.9％NaCl溶液)透射光強為100％，根據(jù)不同濃度下KGD-環(huán)七肽產(chǎn)生的血小板聚集程度，估算其達到最大半抑制時的濃度，如附圖6所示，KGD-環(huán)七肽對血小板聚集抑制的IC50值約為620nM，如附圖7所示。
以光透射圖譜實驗中光透射記錄起始階段圖譜變化斜率進行計算，可以測出KGD-環(huán)七肽對血小板聚集抑制速率的影響。KGD-環(huán)七肽對ADP刺激下血小板聚集速率變化影響曲線如附圖7所示。顯示隨著溶液體系中KGD環(huán)七肽濃度的增加，血小板聚集的速率逐漸降低，這表明隨著KGD-環(huán)七肽的增加，血小板上GPIIb/IIIa受體對ADP刺激性的應(yīng)激性下降，顯示KGD-環(huán)七肽對血小板的抑制不僅體現(xiàn)在聚集程度上的抑制，對聚集速率也有一定的抑制效果。KGD-環(huán)七肽不同濃度對聚集速率的影響見附圖8。進一步說明了KGD-環(huán)七肽是通過血小板GPIIb/IIIa受體的相互作用達到抑制效果的。
血小板聚集主要是通過血小板上纖維蛋白原受體GPIIb/IIIa與細胞外基質(zhì)的相互作用發(fā)生的，GPIIb/IIIa受體被強烈拮抗時，血小板與血小板之間、以及血小板與細胞外基質(zhì)之間的相互作用被抑制。血小板聚集抑制實驗清晰地表明KGD-環(huán)七肽具有與受體GPIIb/IIIa相互作用的能力。應(yīng)當(dāng)說，這一能力的表現(xiàn)是KGD-環(huán)七肽分子上的KGD功能序列表現(xiàn)出來的。說明KGD-環(huán)七肽中的KGD序列展示出相應(yīng)的功能活性構(gòu)象，能夠與GPIIb/IIIa受體識別并結(jié)合，發(fā)揮其受體識別與結(jié)合特點，表現(xiàn)其相應(yīng)的生物活性。研究符合預(yù)期主要目的。
權(quán)利要求
1.一種新型抗栓劑，其特征在于它是一類含有功能型KGD(賴氨酰-甘氨酰-天冬氨酰)特異三肽序列的短鏈環(huán)形多肽分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型抗栓劑，其特征在于所說的含KGD的功能序列為KGDWD(賴氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-色氨酰-天冬氨酰)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型抗栓劑，其特征在于所說的抗栓劑分子結(jié)構(gòu)為環(huán)形短鏈多肽結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)由位于KGD功能序列的N端的半胱氨酸殘基與位于KGD功能序列C端的半胱氨酸殘基以二硫鍵形式連接，形成-S-S-二硫鍵共價結(jié)構(gòu)，從而使多肽分子形成共價閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)形式。
4.制備權(quán)利要求1或3所述新型抗栓劑的方法，包括以下步驟(1)KGD-環(huán)七肽的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計；(2)KGD-環(huán)七肽的化學(xué)合成與環(huán)化；(3)KGD-環(huán)七肽的理化性質(zhì)測定；(4)KGD-環(huán)七肽的抗栓活性測定。
5.權(quán)利要求1或3所述的新型抗栓劑，在預(yù)防和治療心腦血管疾病中的應(yīng)用以及進行有關(guān)血液學(xué)、細胞生物學(xué)、及臨床基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用；
6.權(quán)利要求5的用途，其特征在于所說的心腦血管疾病為血栓性疾病；
7.權(quán)利要求1或3所述的新型抗栓劑，在進行有關(guān)血栓形成機理研究中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以含Lys－Gly－Asp(簡稱KGD)功能序列的短鏈多肽為特征的新型抗栓劑的制備方法與應(yīng)用。該抗栓劑是一種環(huán)七肽分子，通過化學(xué)合成方法合成線性長度七肽分子，進而通過二硫鍵的形成構(gòu)成(1，7)位共價閉合環(huán)化結(jié)構(gòu)的環(huán)七肽分子(簡稱KGD－環(huán)七肽)。該環(huán)七肽的序列為Cys－Lys－Gly－Asp－Trp－Asp－Cys，KGD序列是環(huán)七肽的功能序列，通過環(huán)化結(jié)構(gòu)使KGD序列表現(xiàn)出功能構(gòu)象，發(fā)揮與血小板膜上纖維蛋白原受體GPIIb/IIIa受體專一性識別與結(jié)合的能力，表現(xiàn)出較強的抗血小板聚集活性，具有較強的抗血栓形成能力，具有較高的臨床應(yīng)用價值，是一類很有希望的抗血栓形成新藥，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K38/12GK1746182SQ200410074320
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月9日
發(fā)明者井健 申請人:井健