專利名稱：用精氨酸酶治療肝炎的藥物組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物組合物及其使用方法。具體地說，本發(fā)明涉及一種能夠治療肝炎的藥物組合物。
背景技術：
治療肝炎的抗病毒藥物有很多，目前多用以下幾種(1)干擾素是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝、丙肝病毒復制，同時還可以增強自然殺傷細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節(jié)作用并增強抗病毒能力。(2)白細胞介素-2即T細胞生長因子，具有調節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤作用。(3)核苷類化合物如阿昔洛韋是一種合成的無環(huán)嘌呤核苷類化合物，可抑制多種脫氧核糖核酸病毒的增殖。(4)阿糖腺苷類體內、體外均證明對乙肝病毒有潛在的作用。經觀察用藥期間部分患者的脫氧核糖核酸聚合酶陰轉，生化和肝組織異常也有好轉。(5)其他促肝細胞生長素、胸腺肽、抗乙肝核糖核酸、病毒唑、左旋咪唑、香菇多糖、強力寧及植物血凝素等。然而，以上藥物的療效仍未臻理想，且易引起不良副作用。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的一個方面提供一種更有效的肝炎治療藥物。具體地說，本發(fā)明提供一種選擇性降低患者體內精氨酸水平的藥物來治療肝炎。
本發(fā)明的另一個方面是提供一種可降解精氨酸的酶(即精氨酸降解酶)在制藥方面的應用。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的精氨酸降解酶是精氨酸酶或精氨酸脫亞胺酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的精氨酸降解酶是一種分離的且基本上純化的重組精氨酸酶。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的精氨酸酶是人精氨酸酶I。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的人精氨酸酶I基本上具有與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2基本上相同的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列編碼具有與SEQ IDNO3基本上相同的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的重組精氨酸酶的純度為80-100％。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的重組精氨酸酶的純度為90-100％。
在又一個實施方案中，本發(fā)明的精氨酸酶經修飾具有足夠高的酶活性和穩(wěn)定性以在患者體內保持3天的“足夠的精氨酸剝奪”(adequatearginine deprivation，以下簡稱AAD)。一個優(yōu)選的修飾方法是將本發(fā)明的精氨酸酶氨基末端連接6個組氨酸。另一個優(yōu)選的修飾為聚乙二醇化(pegylation)以提高所述酶的穩(wěn)定性使患者發(fā)生的免疫反應性最小。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的聚乙二醇化包括透過一個偶聯劑將精氨酸酶與至少一個聚乙二醇組份共價結合。在最優(yōu)選的實施方案中，偶聯劑是2，4，6-三氯-s-三嗪(三聚氰氯，CC)或琥珀酰亞胺丙酸(SPA)。經過修飾的精氨酸酶具有至少250I.U./mg的酶活性。更優(yōu)選的是具有至少300-350I.U./mg的酶活性，最優(yōu)選的是至少500I.U./mg的酶活性。在另一個實施方案中，所述酶被修飾成在血清或血漿中具有足夠穩(wěn)定性，并有大約至少三日的半衰期。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的制藥應用所制備的藥品可用來治療肝炎。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的制藥應用所制備的藥品可用來治療乙型肝炎。
本發(fā)明的另一方面涉及一種藥物組合物，包含一種分離的且基本上純化的重組精氨酸酶。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含的重組精氨酸酶的純度為80-100％。在一個優(yōu)選的實施方案中，重組人精氨酸酶是任何一種可降解精氨酸的酶，例如精氨酸脫亞胺酶或人精氨酸酶I。在更優(yōu)選的實施方案中，所述酶是基本上具有核苷酸序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的人精氨酸酶I，其中，所述核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO3的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，所述的精氨酸酶具有足夠高的酶活性和穩(wěn)定性已在患者體內保持至少3天AAD。在最優(yōu)選的實施方案中，所述精氨酸酶還通過聚乙二醇化修飾以改良穩(wěn)定性使免疫反應最小化。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物能夠降低患者體內精氨酸水平。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的可調節(jié)肝炎。在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以治療乙型肝炎。在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物進一步被制備成固體、液體、乳狀液、懸浮液、微膠粒、或微脂體的形式。在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物的配方是適用于口服或注射的形式。


圖1A，1B和1C是人精氨酸酶I的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列。
圖1A是質粒pAB101的EcoRI/MunI至XbaI位點的核苷酸序列(SEQID NO1)。核苷酸(nt)1-6，EcoRI/MunI位點；nt481-486，啟動子1的-35區(qū)域；nt504-509，啟動子1的-10區(qū)域；nt544-549，啟動子2的-35區(qū)域；nt566-571，啟動子2的-10區(qū)域；nt600-605，核糖體結合位點；nt614-616，起始密碼子；nt632-637，NdeI位點；nt1601-1603，終止密碼子；nt1997-2002，XbaI位點。
圖1B是經修飾的人精氨酸酶的編碼核苷酸序列(SEQ ID NO2)及其相應編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。圖1A中核苷酸614-1603是修飾的精氨酸酶氨基酸序列的編碼區(qū)。N末端的6組氨酸(SEQ ID NO4)標記以下劃線標示。翻譯終止密碼子以*標示。
圖1C是正常人精氨酸酶I的編碼核苷酸序列(SEQ ID NO8)及其相應編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO9)。
具體實施方案本發(fā)明所用術語“聚乙二醇化精氨酸酶”是指通過聚乙二醇化修飾的本發(fā)明精氨酸酶I(見專利申請WO2004/001048的說明書)，以提高所述酶的穩(wěn)定性及使免疫反應性最小化。
本發(fā)明所用術語“基本相同”無論是針對DNA的核苷酸序列，RNA的核糖核苷酸序列，還是蛋白質的氨基酸序列，均是指與本發(fā)明所揭示的實際序列有微小的及非相因而生的序列變化的序列。具有基本相同序列的種類被認為與所揭示序列相等價并包含在所附權利要求范圍內。在此方面，“微小的及非相因而生的序列變化”是指與本文所揭示的和/或權利要求的DNA，RNA或蛋白質基本相同的序列與本文揭示的和/或權利要求的序列功能等價。功能等價序列以基本相同的方式起作用，產生與本文所揭示的和權利要求的核酸和氨基酸組合物基本相同的組合物。特別地，功能相等的DNA編碼與本文所揭示的那些蛋白質相同的蛋白質，或者編碼具有保守氨基酸變化的蛋白質，所述變化如用一個非極性殘基取代另一個非極性殘基，或者用一個帶電殘基取代另一個相似帶電的殘基。這些變化包括本領域技術人員已知的那些基本不改變蛋白質三級結構的變化。術語“足夠高的酶活性”是指重組人精氨酸酶的酶比活性為至少250I.U./mg，優(yōu)選至少300-350I.U./mg，更優(yōu)選至少500I.U./mg。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述精氨酸酶的比活性為500-600I.U./mg。術語“穩(wěn)定性”是指所述精氨酸酶在體外的穩(wěn)定性。更優(yōu)選地，所述穩(wěn)定性是指在體內的穩(wěn)定性。酶活性降低率與分離的純化的重組人精氨酸酶的血漿穩(wěn)定性成反比。這種關系可從人精氨酸酶在血漿中的半衰期反映出來。
本發(fā)明所用術語“足夠的精氨酸剝奪(AAD)”是指體內精氨酸水平為10μM或低于10μM。本發(fā)明所用術語“半衰期”是指所述精氨酸酶在體外人血漿中的濃度降至一半所需的時間。
所有其他本說明書未提及的技術手段與術語釋義等資料，皆可在專利申請WO2004/001048和WO2004/000349的說明書找到。
為研究精氨酸酶的抗乙型肝炎病毒的作用，本發(fā)明在乙型肝炎病毒基因轉染的人肝癌細胞系2.2.15細胞中，研究了精氨酸酶對細胞的毒性，對HBsAg和HBeAg分泌以及對HBV-DNA的抑制作用。并以英國葛蘭素威康公司生產的抗乙型肝炎病毒藥拉米夫定作為陽性對照進行了比較。結果顯示聚乙二醇化重組精氨酸酶的半數中毒濃度(TC50)CPE法加藥8天為40IU/ml，最大無毒濃度(TC0)為20±0IU/ml。無毒濃度20IU/ml二批實驗對細胞HBeAg的分泌抑制率為68.69±8.89，IC50為6.37±0.45IU/ml，SI為6.30±0.45。對細胞HBsAg的分泌抑制率為29.81±27.35，IC50為10.72IU/ml(一批實驗)，SI為3.73(一批實驗)。對細胞培養(yǎng)上清液內HBV-DNA斑點雜交IC50為13.18±0.45IU/ml，選擇指數為3.19±0.98。對細胞內的HBV-DNA Southern Blot Sum的IC50為19.79±7.95IU/ml，選擇指數為2.91±0.88。對細胞內的HBV-DNA SouthernBlot In Lane的IC50為20.06±1.96IU/ml，選擇指數為2.00±0.20。陽性對照拉米夫定的半數中毒濃度(TC50)和最大無毒濃度(TC0)分別為1198.97±97.50和800±0μg/ml。最大無毒濃度藥液800μg/ml加入2.2.15細胞培養(yǎng)8天，對HBeAg和HBsAg的分泌無明顯抑制作用。對細胞培養(yǎng)上清液的HBV-DNA斑點雜交的IC50為113.76μg/ml，選擇指數SI為10.54。對細胞的HBV-DNA Southern Blot Sum抑制的IC50為88.78±6.37μg/ml，選擇指數SI為13.54±0.97，與多次實驗和文獻一致，說明實驗可靠。結果提示精氨酸酶對2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg以及細胞HBV-DNA明顯抑制作用。
實施例1 試驗材料的準備1.1受試藥名稱聚乙二醇化重組人精氨酸酶(BCT-100)，以下簡稱“精氨酸酶”。所述酶具有圖1A，1B和1C所表示的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列。
制備方法請參考WO2004/001048說明書實施例1-8。在WO2004/001048的最早申請日之前，可向Ikemoto Masaki教授于日本的實驗室取得重組人精氨酸酶(京都大學；通信地址53 Kawahara-cho，Shogoin，Sakyo-ku，Kyoto-shi，Kyoto 606-8507 Japan)。待測藥物實驗時根據所設計劑量組濃度用MEM培養(yǎng)液配制。
保存條件4℃冰箱保存。
1.2陽性對照藥拉米夫定英國葛蘭素威康公司生產，批號B008923，每片含量100mg，藥物經培養(yǎng)液浸泡、溶解，離心去沉淀。實驗時根據所設計劑量組濃度用MEM培養(yǎng)液配制。保存條件4℃冰箱保存。
1.3 2.2.15細胞乙型肝炎病毒(HBV)基因轉染人肝癌細胞(Hep G2)的2.2.15細胞系，美國Mount Sinai醫(yī)學中心構建，我室引進后自行傳代培養(yǎng)。
1.4試劑EaglesMEM干粉、G-418(Geneticin)、酵母t-RNA、蛋白酶K，美國GIBCO公司產品；胎牛血清，美國Hyclone Lab公司產品；L-谷氨酰胺，京科化學試劑公司進口分裝；HBsAg、HBeAg固相放免測定盒，中國同位素公司北方免疫試劑研究所；
卡那霉素，華北制藥廠產品；聚乙二醇，瑞典Fluka產品；二甲基亞砜，SIGMA公司產品d-32p-dCTP，北京亞輝生物醫(yī)學工程公司產品；1.5實驗用品及儀器培養(yǎng)瓶，丹麥Tunclon TM；培養(yǎng)板96孔板、24孔板、6孔板美國Corning公司產品；二氧化碳孵箱，美國Shel-Lab產品；γ-計數儀，德國BECKMAN產品；掃描儀MICROTEK產品；gel-pro analyzer軟件MEDIA Cybemetice產品；1.6細胞培養(yǎng)液及試劑配制MEM培養(yǎng)液100ml含胎牛血清10％，谷氨酰胺0.03％，G418380μg/ml，卡那霉素50μg/ml。
1.7 2.2.15細胞培養(yǎng)在長滿2.2.15細胞的培養(yǎng)瓶內加0.25％胰酶，37℃消化10分鐘，加培養(yǎng)液吹散，1∶3傳代，10天長滿。
實施例2精氨酸酶對細胞毒性試驗實驗分對照組和不同藥物濃度藥物組。細胞消化，配制成每毫升20萬個細胞，接種培養(yǎng)板，96孔板每孔100μl，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時，細胞長成單層后進行實驗。精氨酸酶用培養(yǎng)液配制成40IU/ml溶液，2倍稀釋20、10、5、2.5IU/ml加入96孔細胞培養(yǎng)板，共5個稀釋度，每濃度3孔，每4天換同濃度藥液，以觀察細胞病變?yōu)橹笜耍?天或4天顯微鏡下觀察細胞病變，完全破壞為4；75％為3；50％為2；25％為1；無病變?yōu)?。按Reed-Muench法計算半數有毒濃度(TC50)和最大無毒濃度(TC0)。
TC50=Antilog(B+50-BA-B×C)]]>A＝log＞50％藥物濃度B＝log＜50％藥物濃度C＝log稀釋倍數實施例3精氨酸酶對HBeAg、HBsAg抑制試驗試驗設HBsAg、HBeAg陽性對照組，陰性對照組，細胞對照組及不同藥物濃度藥物組。2.2.15細胞每毫升20萬個接種24孔細胞培養(yǎng)板，每孔1ml，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時，實驗藥液無毒濃度以下2倍稀釋，5個稀釋度分別為精氨酸酶20、10、5、2.5、1.25IU/ml，拉米夫定為800、400、200、100、50μg/ml，每濃度4孔，37℃5％CO2培養(yǎng)，每4天換原濃度藥液培養(yǎng)，第8天時收獲培養(yǎng)液，-20℃冰凍保存。試驗重復二批，分別測定HBsAg和HBeAg。用γ-計數儀測定每孔cpm值。
藥物效果計算計算細胞對照及實驗藥每濃度cpm均值及標準差，P/N值和抑制百分率(％)，半數有效濃度(IC50)及選擇指數(SI)。
②計算藥物抑制抗原半數有效濃度(IC50) A＝log＞50％藥物濃度B＝log＜50％藥物濃度C＝log稀釋倍數
③精氨酸酶在2.2.15細胞培養(yǎng)內對HBsAg和HBeAg的選擇指數(SI)，按其對細胞毒性指標細胞病變(SI)計算。
④以t檢驗法計算各稀釋度HBsAg、HBeAg和對照組間cpm差別的統(tǒng)計學意義。
實施例4精氨酸酶對2.2.15細胞DNA抑制實驗2.2.15細胞上清中HBV-DNA提取2.2.15細胞每毫升20萬個接種24孔細胞培養(yǎng)板，每孔1ml，接種后24小時加入藥物，每4天換原濃度藥液培養(yǎng)，加藥后培養(yǎng)第8天收取上清液，經聚乙二醇沉淀、蛋白酶K裂解、苯酚∶氯仿∶異戊醇抽提、無水乙醇沉淀核酸等步驟，真空抽干，重溶于TE緩沖液中作樣品。
斑點雜交點樣取20ul(DNA含量25ug)，經變性、中和，并以20XSSC緩沖液對倍稀釋至1∶8倍稀釋于硝酸纖維素膜上，并經干烤、預雜交、雜交、洗膜、放射自顯影等步驟。以常規(guī)方法沖洗X光片。掃描儀掃描光片，用gel-pro軟件測定密度，計算抑制率及IC50。
2.2.15細胞培養(yǎng)液中 Southernblot2.2.15細胞內HBV-DNA提取2.2.15細胞加藥后培養(yǎng)8天，吸除培養(yǎng)液收取細胞，細胞經裂解液裂解，等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇抽提2次，加無水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于20ulTE緩沖液中，加入DNA樣品緩沖液，將樣品加于瓊脂糖膠上電泳。電泳后依次經變性、中和、轉膜后。同斑點雜交膜一同進行烤膜、雜交、暴光。掃描儀掃描光片，以gel-pro凝膠分析軟件分析相對密度，計算抑制率及IC50。
結果細胞培養(yǎng)毒性按Reed-Muench法計算半數有毒濃度(TC50)和最大無毒濃度(TC0)。對HBsAg和HBeAg抑制效果按所列公式計算，對HBV-DNA抑制效果以gel-pro凝膠分析軟件分析光片相對密度，計算抑制率及IC50。
1.精氨酸酶在2.2.15細胞培養(yǎng)中的細胞毒性為觀察精氨酸酶對乙型肝炎病毒基因轉染的人肝癌2.2.15細胞的毒性，在接種2.2.15細胞后24小時，加2倍稀釋藥液。40IU/ml開始20、10、5、2.5IU/ml，4天換一次藥液，維持8天，用顯微鏡觀察細胞病變，鏡檢CPE，結果精氨酸酶對乙型肝炎病毒基因轉染的人肝癌2.2.15細胞毒性實驗CPE法(加藥8天)二批實驗半數中毒濃度(TC50)為40IU/ml，最大無毒濃度(TC0)為20±0μg/ml。陽性對照拉米夫定半數中毒濃度(TC50)為1198.97±97.50μg/ml。最大無毒濃度(TC0)為800±0μg/ml。(見表1A.)2.精氨酸酶對HBeAg、HBsAg抑制試驗精氨酸酶和陽性對照藥拉米夫定最大無毒濃度加入2.2.15細胞培養(yǎng)中，第8天測定HBsAg和HBeAg表達的cpm值，計算藥物抑制效果。實驗結果見表2.。
2.1.精氨酸酶對HBeAg的抑制率精氨酸酶兩批實驗自最大無毒濃度20IU/ml，2倍稀釋10、5、2.5、1.25IU/ml各濃度組對2.2.15細胞培養(yǎng)第8天上清液HBeAg的平均抑制率分別為20IU/ml抑制68.69±8.89％；10IU/ml抑制60.73±17.49％；5IU/ml抑制53.96±20.36％；2.5IU/ml抑制51.83±14.16％；1.25IU/ml抑制37.34％。平均半數有效濃度(IC50)為6.37±0.45IU/ml，選擇指數(SI)為6.30±0.45。
2.2.精氨酸酶對HBsAg的抑制率精氨酸酶第1批實驗20、10、5、2.5、1.25IU/ml各濃度組對2.2.15細胞培養(yǎng)第8天上清液HBsAg的抑制率分別為49.16％，47.97％，42.29％和37.18％，半數有效劑量(IC50)為10.72IU/ml，選擇指數為3.7.3。但第2批試驗抑制率較低，最大無毒濃度20IU/ml對HBsAg抑制％未達50％，IC50＞20IU/ml。
2.3.拉米夫定對HBsAg和HBeAg的作用拉米夫定自最大無毒濃度800μg/ml開始2倍稀釋、400、200、100、50μg/ml加入2.2.15細胞培養(yǎng)體系中，第8天測定培養(yǎng)液HBsAg和HBeAg滴度，計算抑制效果(見表1B)。
2.4.拉米夫定對HBeAg的抑制率兩批試驗拉米夫定800、400、200、100、50μg/ml各濃度組對2.2.15細胞培養(yǎng)第8天上清液HBsAg的平均抑制率為8.23±3.02％、12.99±0.46％、17.83±2.09％、15.84±2.33％、14.10±1.27％。無明顯抑制作用。
2.5.拉米夫定對HBsAg的抑制率兩批試驗拉米夫定800、400、200、100、50μg/ml各濃度組對2.2.15細胞培養(yǎng)第8天上清液HBeAg的平均抑制率分別為4.65±6.58％、4.05±5.73％、5.67±4.70％、8.60±4.88％、3.45±3.95％。無明顯抑制作用。
表1A.精氨酸酶在2215細胞培養(yǎng)內對HBsAg和HBeAg的抑制作用(％)

表1B.拉米夫定在2215細胞培養(yǎng)內對HBsAg和HBeAg的抑制作用(％)

3.精氨酸酶和拉米夫定對2.2.15細胞培養(yǎng)上清液HBV-DNA的抑制作用3.1精氨酸酶在2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中HBV-DNA斑點雜交精氨酸酶在2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中對HBV-DNA的作用，加藥后培養(yǎng)8天兩批實驗原液對HBV-DNA的IC50分別為16.04、10.31IU/ml，平均IC50為13.18±4.05IU/ml，選擇指數分別為2.49、3.88，平均3.19±0.98。結果見(表2.)。
表2.精氨酸酶在2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中對HBV-DNA的作用

3.2拉米夫定在2.2.15細胞培養(yǎng)中對上清液中HBV-DNA的作用拉米夫定一批實驗對2.2.15細胞上清液內HBV-DNA的作用，IC50為113.76μg/ml，TC50為1198.97±97.50μg/ml，選擇指數為10.54。結果見表3。

表3.拉米夫定在2.2.15細胞培養(yǎng)中對上清液中HBV-DNA的作用
3.3.精氨酸酶和拉米夫定在2.2.15細胞內對HBV-DNA Southern Blot的抑制作用3.3.1精氨酸酶在2.2.15細胞內對HBV-DNA的Southern Blot抑制作用結果表明精氨酸酶加藥后培養(yǎng)8天對2.2.15細胞內總HBV-DNASouthem印跡測定的總的抑制作用二批實驗IC50分別為25.42、14.17IU/ml，平均IC50為19.79±7.95IU/mI，選擇指數分別為1.57、2.82，平均2.19±0.88。對2.2.15細胞內總HBV-DNA Southern印跡測定的InLane的抑制作用二批實驗IC50分別為21.45、18.67IU/ml，平均IC50為20.06±1.96IU/ml，選擇指數分別為1.86、2.14，平均2.00±0.20。結果見表4．表4.精氨酸酶在2.2.15細胞內HBV-DNA Southern Blot的抑制作用

3.3.2拉米夫定在2.2.15細胞內HBV-DNA的Southern Blot抑制作用結果表明拉米夫定對2.2.15細胞培養(yǎng)的細胞內總HBV-DNASouthern印跡測定總的抑制作用，兩批實驗IC50分別為84.27和93.28μg/ml，平均為88.78±6.37μg/ml，TC50為1198.97μg/ml，SI分別為14.23和12.85，平均為13.54±0.97(見表5)。
表5.拉米夫定在2.2.15細胞內HBV-DNA Southern Blot的抑制作用

討論本試驗在乙型肝炎病毒轉染人肝癌細胞2215細胞系培養(yǎng)中觀察了精氨酸酶和抗乙型肝炎病毒陽性對照藥物拉米夫定加藥后培養(yǎng)8天對細胞的毒性，對HBsAg和HBeAg分泌及細胞培養(yǎng)上清和細胞內HBV-DNA的抑制作用，總結見表6。
表6.精氨酸酶和拉米夫定在2.2.15細胞培養(yǎng)內對HBV抑制作用總結表

注①第1批實驗，②第2批實驗
1.精氨酸酶對2.2.15細胞培養(yǎng)的毒性精氨酸酶半數中毒濃度(TC50)為40IU/ml，無毒濃度(TC0)為20±0IU/ml。
陽性對照拉米夫定的半數中毒濃度(TC50)為1198.97±97.50μg/ml；無毒濃度(TC0)為800±0μg/ml。
2.精氨酸酶和拉米夫定在2.2.15細胞培養(yǎng)內對HBsAg和HBeAg的分泌的抑制作用精氨酸酶最大無毒濃度20IU/ml以下2倍稀釋4個濃度分別加入2.2.15細胞培養(yǎng)8天，兩批實驗平均對HBeAg分泌的抑制率為68.69±8.89％，對HBeAg的半數有效濃度(IC50)為6.37±0.45IU/ml，選擇指數(SI)為6.30±0.45。對HBsAg分泌的抑制率為29.81±27.35％，對HBsAg的半數有效濃度(IC50)第1批為10.72IU/ml，選擇指數(SI)為3.73，第2批20IU/ml。
抑制率未達50％，IC50＞20IU/ml，SI≤1。兩批試驗未作平均。
拉米夫定最大無毒濃度藥液800μg/ml加入2.2.15細胞培養(yǎng)8天，對HBeAg和HBsAg的分泌無明顯抑制作用。不能計算半數有效濃度和選擇指數。
3.精氨酸酶和拉米夫定在2.2.15細胞培養(yǎng)內對HBV-DNA抑制作用結果表明精氨酸酶對細胞培養(yǎng)上清內HBV-DNA斑點雜交加藥8天IC50為13.18±4.05IU/ml，選擇指數為3.19±0.98。對細胞內的HBV-DNASouthern Blot加藥8天Sum的IC50為19.79±7.95IU/ml，選擇指數為2.19±0.88。對細胞內的HBV-DNASouthern Blot加藥8天In Lane的IC50為20.06±1.96μg/ml，選擇指數為2.00±0.20。
拉米夫定對細胞培養(yǎng)上清的HBV-DNA斑點雜交的IC50為113.76μg/ml，SI為10.54。Southern印跡測定總的抑制作用，兩批實驗IC50分別為84.27和93.28μg/ml，平均為88.78±6.37μg/ml，TC50為1198.97μg/ml，SI分別為14.23和12.85，平均為13.54±0.97。
必需注意本文所用的及在權利要求中所用的單數形式術語“一個”“這個”除非特別指出，還包括復數形式。因此，例如“一種藥物制品”包括不同制品的混合物，“治療方法”包括本領域技術人員已知的等價的步驟和方法等等。
除非另外指出，本文所用所有技術和科學術語具有與本領域技術人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所述的那些相似或相同的任何方法和材料可以用于本發(fā)明的實踐和測試中，但本文描述了優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物在此并入參考，以闡述和揭示與所引用的內容相關聯的特殊內容。本發(fā)明已經充分地進行了描述，本領域技術人員可以在本發(fā)明范圍內對其加以修改。所有這種修改包含在本發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明的藥物組合物的配方可以是固體，溶液，乳液，分散液，膠囊，脂質體等形式使用，其中在本發(fā)明的實際應用中所得配方含有一或多種修飾的人精氨酸酶作為活性成分，與適于腸道或非腸道施用的有機或無機載體或賦形劑混合。所述活性成分可以是精氨酸酶，例如伴有用于片劑、小丸、膠囊、栓劑、溶液、乳液、懸浮液和適于生產固體、半固體或液體形式制劑的任何其它形式的常規(guī)非毒性的藥物可接受的載體。除了輔助劑之外，還可以使用穩(wěn)定劑，增稠劑和色素及香味劑。所述藥物配方中包含的一或多種精氨酸酶活性成分的量足以對靶過程、癥狀或疾病產生所需作用。
含有本發(fā)明活性成分的藥物配方可以是適于口服形式的，例如片劑，口含片(troches)，錠劑，水性或油性懸浮液，分散粉末或顆粒，乳液，硬或軟膠囊，或糖漿或酏劑。口服配方可以根據本領域己知生產藥物配方的任何方法制備。片劑可以無包衣，或者可以通過已知技術包衣，以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而在更長的時間內提供持續(xù)作用。它們也可以包衣形成滲透性治療片劑以控制釋放。
在一些情況中，口服配方可以是硬明膠膠囊，其中活性成分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣，磷酸鈣，高嶺土等混合。它們也可以是軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油介質例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
所述藥物配方也可以是無菌注射溶液或懸浮液。這種懸浮液可以根據已知方法配制，使用適當的分散或增濕劑或懸浮劑。所述無菌注射制品也可以是在無毒腸道外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸浮液，例如于1，4-丁二醇中的溶液。無菌的不易發(fā)揮的油常規(guī)用作溶劑或懸浮介質。為此目的可以應用任何柔和的不易揮發(fā)油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯，脂肪酸(包括油酸)，天然植物油如芝麻油，椰子油，花生油，棉花子油，或者合成的脂肪酸載體，如油酸乙酯等。如果需要，可以摻入緩沖劑，葡萄糖溶液防腐劑，抗氧化劑等或者它們可以用作溶質以溶解可溶的酶。
所述藥物配方也可以作為輔助治療劑，與其它化療劑一起使用。
權利要求
1.一種精氨酸降解酶在制備治療肝炎藥品中的應用。
2.如權利要求1的應用，其中，所述酶是一種分離的且基本上純化的重組精氨酸酶。
3.如權利要求1的應用，其中，所述重組精氨酸酶的純度為80-100％。
4.如權利要求3的應用，其中，所述重組精氨酸酶是人精氨酸酶I。
5.如權利要求3的應用，其中，所述重組精氨酸酶是精氨酸脫亞胺酶。
6.如權利要求4的應用，其中，所述酶具有與SEQ ID NO1或SEQID NO2基本上相同的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列編碼具有與SEQ ID NO3基本上相同的氨基酸序列。
7.如權利要求4的應用，其中，所述酶具有至少250I.U/mg的酶活性。
8.如權利要求4的應用，其中，所述酶被修飾成在血清或血漿中具有足夠穩(wěn)定性，并有大約至少三日的半衰期。
9.如權利要求8的應用，其中，所述修飾為聚乙二醇化。
10.如權利要求9的應用，其中，所述聚乙二醇化包括透過一個偶聯劑將所述酶與至少一個聚乙二醇組份共價結合。
11.如權利要求9的基本上純化的重組人精氨酸酶，其中，所述偶聯劑是2，4，6-三氯-s-三嗪(三聚氰氯，CC)或琥珀酰亞胺丙酸(SPA)。
12.如權利要求4的應用，其中所述人精氨酸酶I的氨基末端連接6個組氨酸。
13.如權利要求1的應用，其中，所述肝炎為乙型肝炎。
14.一種藥物組合物，其包含一種精氨酸降解酶。
15.如權利要求14的藥物組合物，其中，所述精氨酸降解酶是一種分離的且基本上純化的重組精氨酸酶。
16.如權利要求15的藥物組合物，其中，所述酶的純度為80-100％。
17.如權利要求15的藥物組合物，其中，所述重組精氨酸酶是人精氨酸酶I。
18.如權利要求15的藥物組合物，其中，所述重組精氨酸酶是精氨酸脫亞胺酶。
19.如權利要求17的藥物組合物，其中，所述酶基本上具有基本上與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2相同的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列編碼具有基本上與SEQ ID NO3相同的氨基酸序列。
20.如權利要求17的藥物組合物，其中，所述酶具有至少250I.U./mg的酶活性。
21.如權利要求17的藥物組合物，其中，所述酶在患者血漿中的半衰期至少為3天。
22.如權利要求17的藥物組合物，其中，所述酶在患者血漿中的半衰期至少為1天。
23.如權利要求17的藥物組合物，其中，所述酶經聚乙二醇化的方法修飾。
24.如權利要求17的應用，其中所述酶的氨基末端連接6個組氨酸。
25.如權利要求14的藥物組合物，其中所述酶能夠降低患者體內精氨酸水平。
26.如權利要求14的藥物組合物，其中所述酶可調節(jié)肝炎。
27.如權利要求24的藥物組合物，其中所述肝炎為乙型肝炎。
28.如權利要求14的藥物組合物，其中所述組合物進一步被制備成固體、液體、乳狀液、懸浮液、微膠粒，或微脂體的形式。
29.如權利要求14的藥物組合物，其中所述組合物的配方是適用于口服或注射的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及用聚乙二醇修飾的人精氨酸I酶治療肝炎的方法及其制藥方面的應用。
文檔編號A61P31/00GK1745847SQ20041007685
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月8日 優(yōu)先權日2004年9月8日
發(fā)明者鄭寧民 申請人:康達醫(yī)藥科技有限公司