專利名稱：一種合成多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體地說涉及一種合成多肽。
背景技術(shù)：
腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性和良性腫瘤的最本質(zhì)區(qū)別，也是目前導(dǎo)致惡性腫瘤患者治療失敗的重要原因之一。腫瘤侵襲是指原發(fā)病灶的腫瘤細(xì)胞破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜形成的天然屏障，侵進(jìn)毗鄰的正常組織，使之發(fā)生壞死和病變的過程；腫瘤轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞通過血循環(huán)和淋巴循環(huán)，在遠(yuǎn)離原發(fā)部位的器官內(nèi)形成轉(zhuǎn)移灶的過程。臨床上大約30％新診斷的實(shí)體瘤患者已有可見的轉(zhuǎn)移灶，特別是一些高轉(zhuǎn)移性的腫瘤如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌及黑色素瘤等。雖然當(dāng)前以手術(shù)為主的綜合治療對(duì)初期腫瘤能取得較好的療效，但腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移使原先的局部病變轉(zhuǎn)化為全身彌散性、多灶性的疾病，最終導(dǎo)致化療與手術(shù)治療的失敗，是引起腫瘤患者死亡的主要原因。因此有效的抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移將是降低腫瘤死亡率的有效手段之一。
腫瘤的轉(zhuǎn)移規(guī)律極其復(fù)雜，涉及諸多因素，如蛋白水解酶；血管生成因子；黏附因子，如整合素(integrin)，選擇素(selectin)，鈣黏合素(E-cadherin)等；運(yùn)動(dòng)因子；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。影響腫瘤轉(zhuǎn)移任何一個(gè)因素都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抑制作用，如抑制血管生長、抑制蛋白水解酶和黏附因子的活性。報(bào)道較多的是抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，如用天然酶抑制劑TIMPs。但TIMPs在組織中含量極微且難以提取；人工重組TIMPs是大分子蛋白質(zhì)，存在生物利用度低等問題。還有研究含RGD(Arg-Gly-Asp)特異序列的肽類抗腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑，其通過結(jié)合和飽和細(xì)胞表面的整合素、纖維粘連蛋白(FN)和層粘連蛋白(LN)結(jié)合位點(diǎn)來抑制腫瘤的黏附、浸潤和轉(zhuǎn)移[賽愛榮等，HAb18G/CD147拮抗肽抗肝癌轉(zhuǎn)移作用的體外試驗(yàn)，World Chin JDigetol 2003，11(3)255-259]，?？偟膩碚f治療效果一直不盡人意，因此研制新型高效的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物顯得迫切需要。
近年來分子生物學(xué)的研究揭示腫瘤的轉(zhuǎn)移有著高度的器官選擇性。趨化因子及其受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)過程調(diào)節(jié)了腫瘤細(xì)胞的特異性器官遷移[anja Muller et al，involvement of chemokine receptors inbreast cancer metastasis，NATURE，2001，41050-56；Chris J et al，Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells inhuman ovarian cancer，CANCER RES.2001，625930-5938；Russell S，Use of the stromal cell-derived factor-1/CXCR4 pathway in prostatecancer metastasis to bone，CANCER RES.2002，621832-1837]。研究表明，高轉(zhuǎn)移的乳腺癌、前列腺癌等癌細(xì)胞表面均高表達(dá)有功能活性的趨化因子受體如CXCR4，而在淋巴結(jié)、骨髓、肝和肺等正常組織中，其基質(zhì)細(xì)胞分泌高濃度的趨化因子如CXCL12。腫瘤細(xì)胞通過血液循環(huán)到達(dá)含高濃度CXCL12的器官時(shí)，CXCR4與CXC12發(fā)生特異的受體/配體相互作用，并引起下游的信號(hào)傳導(dǎo)，使腫瘤細(xì)胞上調(diào)表達(dá)黏附分子受體，并引起癌細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞如癌周成纖維細(xì)胞分泌金屬蛋白酶，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。因此以CXCR4/CXCL12的受體/配體相互作用為新的靶點(diǎn)，有效地抑制CXCR4/CXCL12的相互作用，可從高位阻斷腫瘤細(xì)胞的遷移。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服目前腫瘤的治療難題，提供一種合成多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述合成多肽在制備用于預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種多肽化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述多肽化合物在制備用于預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的合成多肽，其氨基酸序列如(I)式所示X1X2X3-Phe-Phe-X4X5-His-Val-Ala-X6-Ala-Asn-Val-X7X8-Leu-X9-Ile-Leu-X10(I)在式(I)中X1選自Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-或Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-或Pro-X2選自-Ser-或-Cys-或-Thr-，為結(jié)構(gòu)類似的氨基酸；X3選自-Arg-或-Lys-或-His-，為堿性氨基酸；X4選自-Glu-或-Asp-，為結(jié)構(gòu)類似的酸性氨基酸；X5選自-Ser-或-Cys-或-Thr-，為結(jié)構(gòu)類似的氨基酸；X6選自-Arg-或-Lys-或-His-，為堿性氨基酸；
X7選自-Arg-或-Lys-或-His-，為堿性氨基酸；X8選自-Arg-或-Lys-或-His-，為堿性氨基酸；X9選自-Arg-或-Lys-或-His-，為堿性氨基酸；X10選自-Asn或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys-Ala；并且Ala表示英文名稱為alanine，中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Arg表示英文名稱為arginine，中文名稱為精氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Asn表示英文名稱為asparagine，中文名稱為天冬酰胺的氨基酸的相應(yīng)殘基；Asp表示英文名稱為aspartic acid，中文名稱為天冬氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Cys表示英文名稱為cysteine，中文名稱為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Glu表示英文名稱為glutamic acid，中文名稱為谷氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Gly表示英文名稱為glycine，中文名稱為甘氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；His表示英文名稱為histidine，中文名稱為組氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；
Ile表示英文名稱為isoleucine，中文名稱為異亮氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Leu表示英文名稱為leucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Lys表示英文名稱為lysine，中文名稱為賴氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Phe表示英文名稱為phenylalanine，中文名稱為苯丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Pro表示英文名稱為proline，中文名稱為脯氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Ser表示英文名稱為serine，中文名稱為絲氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Thr表示英文名稱為threonine，中文名稱為蘇氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；Val表示英文名稱為valine，中文名稱為纈氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；上述合成多肽，其中X1選自Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-或Pro-；X2選自-Ser-或-Cys-；X3為-Arg-；X4為-Glu-；X5為-Ser-；X6為-Arg-；X7為-Lys-；X8為-His-；X9為-Lys-；X10選自-Asn或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys-Ala。
上述合成多肽，其中X1為Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-，X2為-Ser-，X3為-Arg-，X4為-Glu-，X5為-Ser-，X6為-Arg-，X7為-Lys-，X8為-His-，X9為-Lys-，X10為-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys-Ala。此序列命名為BSC-1。
上述合成多肽，其中X1為Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-，X2為-Ser-，X3為-Arg-，X4為-Glu-，X5為-Ser-，X6為-Arg-，X7為-Lys-，X8為-His-，X9為-Tys-，X10為-Asn。此序列命名為BSC-2。
上述合成多肽，其中X1為Pro-，X2為-Cys-，X3為-Arg-，X4為-Glu-，X5為-Ser-，X6為-Arg-，X7為-Lys-，X8為-His-，X9為-Lys-，X10為-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys。此序列命名為BSC-3。
本發(fā)明所指多肽序列，包括式(I)所表示的片段、類似物和同族物以及它們的衍生序列，如反向序列，反手鏈，及Cys殘基間在自然或?qū)嶒?yàn)室條件下形成二硫鍵所形成的新序列等。
本發(fā)明涉及的多肽序列，源于以CXCR4為靶標(biāo)的系統(tǒng)研究，實(shí)驗(yàn)顯示它們可有效抑制CXCR4/CXCL12的相互作用，阻斷癌細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制相關(guān)蛋白的高表達(dá)，從高位阻斷腫瘤細(xì)胞的遷移。但這些多肽的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性并不限于抑制CXCR4/CXCL12的相互作用。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的合成多肽可用于預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移，在制備用于預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中有著重要的應(yīng)用。其治療效果好，應(yīng)用前景廣闊。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 BSC-1、BSC-2及BSC-3的合成，分離純化及二硫鍵構(gòu)建由Fmoc/tBu固相多肽合成方法合成(SPPS)。合成的固相支持物為2-chlorotrityl resin，每步耦合反應(yīng)均為一次，Kaiser test檢測(cè)反應(yīng)過程。合成所需肽鏈后用Reagent B(TFA 88％，phenol 5％，H2O 5％，TIS2％)從2-chlorotrityl resin切除多肽，冷乙醚沉淀得多肽粗品。粗品用巰基乙醇還原二硫鍵，再溶于DMSO中配成稀溶液，空氣鼓動(dòng)過夜形成分子內(nèi)二硫鍵。
RT-HPLC純化多肽，C18柱(10mm×200mm，300 particle size)，線性梯度洗脫H2O/acetonitrile 0.1％TFA.冷凍干燥，得SN-1 12mg，SN-2 13mg，SN-3 10mg.每個(gè)樣品均配置濃度為5mg/300ul DMSO.MALDI-TOF MS分析分子量為BSC-13571.7(calculated 3571.1)；BSC-23086.9(calculated 3086.5)；BSC-32893.1(calculated 2893.4)。
實(shí)施例2 底物與受體CXCR4親和性實(shí)驗(yàn)將待測(cè)底物SN-1，2，3與CXCR4+的U373-MAGI-CXCR4 CEM細(xì)胞培養(yǎng)，加入熒光素標(biāo)記的CXCR4單抗12G5，保溫一定時(shí)間，測(cè)細(xì)胞之熒光強(qiáng)度。顯示多肽底物與受體CXCR4有很強(qiáng)的親和性。其中序列BSC-1、BSC-2及BSC-3的IC50見表(1)表(1)

實(shí)施例3 底物抑制SDF-1α與CXCR4的相互作用實(shí)驗(yàn)將熒光標(biāo)記的SDF-1α與CXCR4+的U373-MAGI-CXCR4 CEM細(xì)胞培養(yǎng)，加入待測(cè)底物，保溫一定時(shí)間，測(cè)細(xì)胞之熒光強(qiáng)度。顯示多肽底物與受體CXCR4的強(qiáng)親和性抑制了天然配體SDF-1α與CXCR4的相互作用，其中序列BSC-1、BSC-2及BSC-3的IC50見表(1)。
結(jié)果說明多肽底物可能以SDF-1α/CXCR4的相互作用為靶點(diǎn)。
實(shí)施例4 重組基底膜侵襲抑制試驗(yàn)將底部鋪有8μm孔徑PVP-聚碳酸膜的transwell小室放入24孔滅菌培養(yǎng)板中，小室內(nèi)膜上加入Maruigel膠(40ul/膜)，37℃，1h，超凈工作臺(tái)吹干。在小室外24孔板中加入含有SDF-1a的趨化劑200ul，小室內(nèi)加入預(yù)先與SN-1，2，3(1mg/ml)共孵育2h的U373-MAGI-CXCR4 CEM細(xì)胞，于37℃含5％CO2孵箱中孵育20h。棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室中的細(xì)胞，95％酒精固定15min后，取下濾膜，HE染色，中性樹膠封片，在40X光鏡下計(jì)數(shù)膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù)，記數(shù)至少5個(gè)視野。同時(shí)，以無多肽底物作對(duì)照，計(jì)算趨化指數(shù)。結(jié)果含有多肽底物的實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組(P＜0.05)，顯示多肽底物對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有顯著的抑制作用。其中序列BSC-1、BSC-2及BSC-3的IC50見表(2)表(2)

實(shí)施例6 序列BSC-1、BSC-2及BSC-3的急性毒理試驗(yàn)小鼠急性毒理試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物為健康雄性小鼠。采用灌胃方法試驗(yàn)。給藥量至1.2g/kg時(shí)仍未發(fā)現(xiàn)供試小鼠有中毒癥狀和死亡。試驗(yàn)表明，BSC-1、BSC-2及BSC-3的LD50遠(yuǎn)大于1.2g/kg。
小鼠30天毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物為健康雄性小鼠。采用灌胃方法試驗(yàn)。給藥量為150mg/kg day，連續(xù)30天。試驗(yàn)表明，受試小鼠無死亡，生長發(fā)育、造血功能等系列生化指標(biāo)均無明顯異常變化。
由以上實(shí)例可知，BSC-1，BSC-2，BSC-3表現(xiàn)出很好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞活性，且無明顯毒性。由于序列中的X3X5X6X7X8X9均為堿性胺基酸，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易就能推出這些位置的胺基酸殘基用-Arg-或-Lys-或-His-相互替代不會(huì)顯著改變序列的性質(zhì)，因而推測(cè)其相互替換產(chǎn)生的新序列同樣具有原序列類似的生物活性。
X2位置的-Ser-或-Cys-和-Thr-，為結(jié)構(gòu)類似的氨基酸；本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易就能推出這些位置的胺基酸殘基相互替代不會(huì)顯著改變序列的性質(zhì)，因而推測(cè)其相互替換產(chǎn)生的新序列同樣具有原序列類似的生物活性。
X4位置的-Glu-與-Asp-，為結(jié)構(gòu)類似的酸性氨基酸；本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易就能推出這些位置的胺基酸殘基相互替代不會(huì)顯著改變序列的性質(zhì)，因而推測(cè)其相互替換產(chǎn)生的新序列同樣具有原序列類似的生物活性。
權(quán)利要求
1.一種合成多肽，其氨基酸序列如(I)式所示X1X2X3-Phe-Phe-X4X5-His-Val-Ala-X6-Ala-Asn-Val-X7X8-Leu-X9-Ile-Leu-X10(I)在式(I)中X1為Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-或Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-或Pro-；X2為-Ser-或-Cys-或-Thr-；X3為-Arg-或-Lys-或-His-；X4為-Glu-或-Asp-；X5為-Ser-或-Cys-或-Thr-；X6為-Arg-或-Lys-或-His-；X7為-Arg-或-Lys-或-His-；X8為-Arg-或-Lys-或-His-；X9為-Arg-或-Lys-或-His-；X10為-Asn或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys-Ala。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成多肽，其特征在于其中X1為Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-或Pro-；X2為-Ser-或-Cys-；X3為-Arg-；X4為-Glu-；X5為-Ser-；X6為-Arg-；X7為-Lys-；X8為-His-；X9為-Lys-；X10為-Asn或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys-Ala。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成多肽，其特征在于X1為Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-，X2為-Ser-，X3為-Arg-，X4為-Glu-，X5為-Ser-，X6為-Arg-，X7為-Lys-，X8為-His-，X9為-Lys-，X10為-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys-Ala。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成多肽，其特征在于X1為Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-，X2為-Ser-，X3為-Arg-，X4為-Glu-，X5為-Ser-，X6為-Arg-，X7為-Lys-，X8為-His-，X9為-Lys-，X10為-Asn。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成多肽，其特征在于X1為Pro-，X2為-Cys-，X3為-Arg-，X4為-Glu-，X5為-Ser-，X6為-Arg-，X7為-Lys-，X8為-His-，X9為-Lys-，X10為-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys。
6.一種多肽化合物，包括式(I)所示結(jié)構(gòu)所表示的多肽片段、類似物以及它們的衍生序列。
7.權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的合成多肽在制備用于預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求6所述的多肽化合物在制備用于預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種合成多肽及其應(yīng)用。其氨基酸序列如下所示X
文檔編號(hào)A61K38/16GK1660895SQ20041007777
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者卜憲章, 邵偉艷, 古練權(quán), 曹穎男, 于志文 申請(qǐng)人:中山大學(xué)