專利名稱：一組人工合成的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組人工合成的抗菌肽、其制備方法及在制備治療細(xì)菌、真菌、病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗菌肽是生物體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60個(gè)氨基酸組成，分子量在2000-7000D左右。隨著醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，抗菌肽的研究越來(lái)越成為生物技術(shù)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的熱門課題。至今為止，在許多動(dòng)物(尤其是昆蟲)、植物、微生物和人體上已發(fā)現(xiàn)了超過(guò)200多種抗菌肽，這類短肽不僅對(duì)細(xì)菌、真菌有廣譜的殺菌作用，而且對(duì)病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有攻擊作用。臨床試驗(yàn)也表明，在機(jī)體感染病菌或可能導(dǎo)致病菌感染的情況下，抗菌肽能快速殺滅已侵入的病菌，并且能阻止病菌的繼續(xù)侵染。
隨著對(duì)抗菌肽一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，已有許多研究者對(duì)這些抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在模擬膜的疏水環(huán)境下，分子中的α-螺旋度與其殺菌活性密切相關(guān)。另外研究結(jié)果表明抗菌肽是通過(guò)破壞膜的完整性使得細(xì)菌細(xì)胞膜滲漏而殺死細(xì)菌(Nakajima Y.etal.，J.Biol.Chem，2621665-1669；Zasloff M.Nature，2002，415389-395)。因此有人試圖通過(guò)增加分子中α-螺旋結(jié)構(gòu)或提高多肽中含正電荷氨基酸的比例來(lái)尋找更強(qiáng)抗菌活性的多肽(Broth W.B.etal.，Antimicrobial AgentsChemotherapy，2001，451894-1895；HongS.Y.etal.，Peptides，2001，221669-1674)。
美國(guó)專利6,316,594公開了天然抗菌肽parasinI，它是一種新的從鯰魚中分離出來(lái)的，是由鯰魚在表皮損傷時(shí)為防止微生物的入侵其上皮粘膜層產(chǎn)生出一種具有很強(qiáng)抗菌作用的多肽，屬于α-螺旋抗菌肽，分子量為2000.4Da，由19個(gè)氨基酸殘基組成，序列為L(zhǎng)ys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg SerSer。盡管專利文獻(xiàn)中的Parasin I對(duì)微生物表現(xiàn)出非常有效的廣譜抗菌活性，包括革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性細(xì)菌以及真菌，而且沒(méi)有任何溶血性。它合成的衍生物也具有有效的活性。但是在我們的實(shí)驗(yàn)中卻發(fā)現(xiàn)其殺菌活性較低，天然序列很難應(yīng)用于臨床，但是Parasin I基本沒(méi)有溶血性，它的一些相關(guān)的序列改造和功能應(yīng)用方面的開發(fā)還進(jìn)行的較少，所以本發(fā)明想通過(guò)對(duì)Parasin I序列的改造，得到殺菌活性更強(qiáng)的有藥用開發(fā)價(jià)值的抗菌肽，即可以形成新的專利技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一組人工合成的抗菌肽。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供一組抗菌肽的制備方法。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是公開所述抗菌肽的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的抗菌肽是在對(duì)天然抗菌肽的序列、結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成的，它們的序列如下Lys Ala Arg Gly Lys Gln Gly Asn Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Leu Ser Leu SerLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Leu Ser LeuLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu LysLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Phe Arg Ala Leu Lys Ala Leu LysLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu LysLys Gly Gln Gly Lys Gln Gly Gly Asn Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Gln Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Asn Ala Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Gln Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Asn Ala LysAsn Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Asn Ala Lys Thr Arg Ser SerAsn Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Gln Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser SerAsn Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Asn Ala LysLys Ala Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Ala Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser SerLys Ala Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala LysLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Ala Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu LysLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Ala Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu Lys本發(fā)明提供的一組抗菌肽，其制備方法可以是固相化學(xué)法，也可以將抗菌肽的編碼基因克隆到載體上，然后在宿主細(xì)胞中表達(dá)后獲得。其中表達(dá)載體可以是質(zhì)?；虿《局械囊环N，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，宿主細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞、包括酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。制備的抗菌肽可通過(guò)質(zhì)譜鑒定。
為了深入研究本發(fā)明這類生物學(xué)活性抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，利用美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物公司生產(chǎn)的Pioneer多肽合成儀制備一組多肽，以進(jìn)行研究。下面以制備的具有下列氨基酸序列的GKIV-1和GKIV-2抗菌肽作為舉例來(lái)進(jìn)行敘述GKIV-1Lys Ala Arg Gly Lys Gln Gly Asn Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg SerSer利用96孔板法檢測(cè)多肽的殺菌活性(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)以預(yù)先合成的天然抗菌肽GramicidinS，nisin，magaininII為對(duì)照，進(jìn)行殺菌活性檢測(cè)。結(jié)果表明本發(fā)明抗菌肽的殺菌活性強(qiáng)于所述三種天然抗菌肽的殺菌活性。
抗菌肽在高效殺菌的同時(shí)也有可能作用于高等有機(jī)體包括人體細(xì)胞，因?yàn)榭咕牡淖饔梅绞蕉际窃诩?xì)胞膜上穿孔使得細(xì)胞發(fā)生滲漏死亡。所以把抗菌肽能否使紅細(xì)胞發(fā)生滲漏作為其是否有毒性的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，如果抗菌肽能使紅細(xì)胞中的血紅蛋白發(fā)生滲漏，就可以通過(guò)檢測(cè)OD490值確定毒性的大小。因此本發(fā)明還檢測(cè)了抗菌肽對(duì)人體紅細(xì)胞的溶血活性，實(shí)驗(yàn)表明，抗菌肽溶血率值很低，證實(shí)本發(fā)明抗菌肽的溶血毒性極小。
此外，又對(duì)本發(fā)明抗菌肽進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)急性毒性試驗(yàn)，證明抗菌肽無(wú)毒性作用。又進(jìn)行抗菌肽對(duì)小白鼠急性感染金黃色葡萄球菌的抑制作用的試驗(yàn)，表明抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌感染有顯著的抑制作用。
本發(fā)明提供一組新的人工設(shè)計(jì)合成的抗菌肽?？煞奖愕夭捎霉滔嗷瘜W(xué)法制備或?qū)⒕幋a抗菌肽的基因克隆到載體上，然后進(jìn)入宿主細(xì)胞中表達(dá)后獲得。該抗菌肽對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌、病毒具有廣譜殺傷活性，并較天然抗菌肽有更強(qiáng)的殺菌活性，但對(duì)動(dòng)、植物細(xì)胞無(wú)任何毒害作用。并通過(guò)抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌急性感染殺菌活性的小鼠試驗(yàn)顯示抗菌肽給予0.25mg/kg劑量，就能達(dá)到100％殺菌抑制率，而作為殺滅金黃色葡萄球菌特效藥的萬(wàn)古霉素要給予4.0mg/kg劑量才能達(dá)到100％的殺菌抑制率，表明本發(fā)明抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌急性感染有很顯著的殺菌效果，因此本發(fā)明抗菌肽可應(yīng)用于制備治療革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染引起的疾病的藥物。


圖1是抗菌肽GKIV-1的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 抗菌肽的制備及分離純化按上述序列制備GKIV-1和GKIV-2，同時(shí)制備GramicidinS，nisin和magaininII作為對(duì)照。
GramicidinS的序列Val Orn Leu Phe Pro Val Orn Leu Phe Pronisin的序列Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu Met GlyCys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys His Cys Ser Ile His Val Ser LysmagaininII的序列Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly GluIle Met Asn Ser本實(shí)施例采用固相化學(xué)法合成，所用儀器為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的Pioneer多肽合成儀。合成的多肽經(jīng)過(guò)高濃度的TFA剪切后，用反向柱純化，純化后的多肽通過(guò)質(zhì)譜鑒定。具體試驗(yàn)步驟如下1、抗菌肽的制備(以制備0.1mmol量的GKIV-1為例)以下所有制備抗菌肽的試劑均購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。
制備的GKIV-1多肽序列為N-Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Lys Leu Leu Lys Lys Leu LeuLys Lys Leu Leu Arg-C制備從C端到N端逐個(gè)進(jìn)行，由合成儀自動(dòng)控制。首先稱量0.1mmol的結(jié)合了第一個(gè)氨基酸即Arg的樹脂(購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，裝柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脫保護(hù)，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)的游離氨基酸溶解于碳二亞胺(DCC)，羥基苯并三唑(HOBt)/二異丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循環(huán)偶合反應(yīng)30分鐘，二甲基甲酰胺清洗重復(fù)以上脫保護(hù)到偶合反應(yīng)步驟直到制備結(jié)束(具體操作步驟見pioneer多肽合成儀操作指南)。
制備后的多肽經(jīng)如下步驟剪切取下反應(yīng)后的樹脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三異丙基硅烷)，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過(guò)濾，濾出液中加入10倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醚，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集沉淀并室溫干燥。
2、抗菌肽純化稱量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，樣品處理后經(jīng)反向柱分離(洗脫液為含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脫峰。
3、抗菌肽的鑒定如圖1所示，制備的抗菌肽GKIV-1經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析，GKIV-1在質(zhì)譜圖中顯示的分子量計(jì)算如下 1036.3×2＝2072.6，2072.6-2＝2070.6計(jì)算出GKIV-1的分子量為2070.6。由多肽序列計(jì)算出的理論值為2071.4。證明制備的多肽即為設(shè)計(jì)的GKIV-1抗菌肽。鑒定合格的抗菌肽產(chǎn)物備用。
抗菌肽GKIV-2，天然抗菌肽GramicidinS，nisin和magaininII可以采用類似于GKIV-1抗菌肽的制備方法制備。
實(shí)施例2 抗菌肽的殺菌活性檢測(cè)以下實(shí)施例中所使用的各種菌株購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定所。
采用96孔板法對(duì)抗菌肽的殺菌活性進(jìn)行檢測(cè)，并用固相化學(xué)法合成的抗菌肽GramicidinS，nisin和magaininII作為對(duì)照，以評(píng)價(jià)本發(fā)明中作為舉例的三條抗菌肽GKIV-1和GKIV-2的殺菌活性。
按以下步驟進(jìn)行測(cè)定抗菌肽的殺菌活性菌種復(fù)蘇，接種斜面37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑菌于普通LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，稀釋菌液使菌濃度為104-105CFU/ml，按每孔100ul菌液接種于96孔板中，將多肽以一定比例稀釋后，每孔中加入10ul，將96孔板置于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD620值(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)。檢測(cè)結(jié)果見表1。
含有抗菌肽的細(xì)菌的生長(zhǎng)濃度(OD620)與不加抗菌肽的細(xì)菌的生長(zhǎng)濃度的比值大于90％時(shí)的抗菌肽濃度即為最小抑菌濃度(最小抑菌濃度(MIC)定義為顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低的濃度)。
表1 五種抗菌肽對(duì)不同細(xì)菌的抗菌活性最小抑菌濃度(MIC)的比較

上表中的的最小抑菌濃度值越小，則代表抗菌能力越強(qiáng)，從上表可以看出，本發(fā)明的抗菌肽的MIC比GramicidinS，nisin和magaininII均要小，特別是對(duì)革蘭氏陰性菌的效果，本發(fā)明的抗菌肽的抗菌能力大大強(qiáng)于對(duì)比的兩條抗菌肽。
實(shí)施例3 體外溶血活性檢測(cè)本實(shí)施例用于檢測(cè)抗菌肽對(duì)人體紅細(xì)胞是否具有溶血活性，并用固相化學(xué)法合成的抗菌肽GramicidinS，nisin和magaininII作為對(duì)照。使用的的血樣取于正常人血。
抗菌肽溶血活性的檢測(cè)步驟是4％的新鮮紅細(xì)胞懸液在414nm下血紅蛋白的釋放來(lái)檢測(cè)的。人紅細(xì)胞經(jīng)PBS(PBS35mM磷酸緩沖液/0.15M NaCl，PH7.0)洗滌，取100ul的8％人紅細(xì)胞懸液于96孔板中，每孔中加入100ul抗菌肽溶液，37℃一小時(shí)后，1500rpm離心5分鐘，轉(zhuǎn)移100ul上清于新的96孔板中，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)414nm下的吸收。陰性對(duì)照用PBS，陽(yáng)性對(duì)照用0.1％TritonX-100。檢測(cè)結(jié)果見表2表2 五種抗菌肽溶血活性檢測(cè)結(jié)果抗菌肽濃度 溶血率(％)(ug/ml) GramicidinSnisinmagaininIIGKIV-1GKIV-212.5 0.60.3 0 0 0253.21.5 0 0 05025.5 10.5 0.8 0.5 0.9100 10054.3 3.5 2.3 2.3200 10080.5 11.2 9.8 9.5500 100100 40.0 31.2 20.0表2中抗菌肽的溶血率值越小，則代表抗菌肽的溶血毒性越小。
實(shí)施例4 動(dòng)物體內(nèi)急性毒性試驗(yàn)本實(shí)施例用以檢測(cè)抗菌肽對(duì)動(dòng)物的毒性，并用固相化學(xué)法合成的抗菌肽GramicidinS，nisin和magaininII作為對(duì)照，測(cè)定本發(fā)明提供的抗菌肽GKIV-1和GKIV-2的毒性。
采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，體重33.5±0.25g，抗菌肽按1mg/kg劑量，每日一次連續(xù)7天經(jīng)肌注小白鼠，觀察動(dòng)物在最大劑量下毒性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，動(dòng)物經(jīng)肌注抗菌肽7天后，無(wú)異常反應(yīng)，活動(dòng)正常。經(jīng)7天觀察，60只小白鼠全部存活。證明抗菌肽無(wú)毒性作用。
實(shí)施例5 抗菌肽和萬(wàn)古霉素對(duì)小鼠金黃色葡萄球菌感染模型抑制效果的比較使用昆明小白鼠的金黃色葡萄球菌急性感染模型，實(shí)驗(yàn)步驟如下將金黃色葡萄球菌CMCC26003置于含5％豬胃粘液素的小牛肉灌輸肉湯里，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。體重大約32.6±0.25g的小鼠腹腔內(nèi)注射106-107存活細(xì)胞，每個(gè)處理組里有3個(gè)小鼠。靜脈注射抗菌肽GKIV-1(溶于0.1毫升5％右旋糖里供注射)，在10分鐘里注射。皮下注射萬(wàn)古霉素(萬(wàn)古霉素對(duì)小鼠皮下給藥是完全可生物利用的，不論皮下給予或靜脈給予有相似的活性)。
表3 抗菌肽GKIV-1和萬(wàn)古霉素對(duì)金黃色葡萄球菌急性感染小白鼠模型的抑制作用

如表3所示，靜脈注射給予0.25mg/kg，抗菌肽能100％保護(hù)感染小鼠。萬(wàn)古霉素在4.0毫克/kg劑量下才100％有效。所有的未處理小鼠在不到24小時(shí)里都死亡。
該實(shí)驗(yàn)例顯示，抗菌肽對(duì)用高致命的細(xì)菌劑量的小鼠急性感染模型殺滅金黃色葡萄球菌是十分有效的。
序列表<110>上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司<120>一組人工合成的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用<130>
<160>19<170>Patent In Version2.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>1Lys Ala Arg Gly Lys Gln Gly Asn Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys5 10 15Thr Arg Ser Ser<210>2<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
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5 10 15Leu Lys<210>19<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>19Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Ala Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala5 10 15Leu Lys
權(quán)利要求
1.一組抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽具有序列表中所列的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽還包括所述抗菌肽中個(gè)別氨基酸的取代、環(huán)化、L-型氨基酸變?yōu)镈-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物多肽。
3.一種如權(quán)利要求1或2所述抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述的制備方法為固相化學(xué)法合成。
4.一種如權(quán)利要求1或2所述抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述的制備方法為將編碼所述抗菌肽的基因克隆到載體上，然后進(jìn)入宿主細(xì)胞中表達(dá)后獲得所述抗菌肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述及的載體是質(zhì)?；虿《局械囊环N。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述及的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述及的原核細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述抗菌肽的制備方法，其特征在于所述及的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述抗菌肽的制備方法，其特征在于所述及的真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
10.一種如權(quán)利要求1或2所述抗菌肽的應(yīng)用，其特征在于所述的抗菌肽在制備治療革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌或病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
11.抗菌肽在藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物包括權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的抗菌肽中的一種或一種以上，并混合有一種或一種以上醫(yī)藥上可接受的載體和添加劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一組抗菌肽，這些抗菌肽具有比天然抗菌肽更強(qiáng)的殺菌活性，對(duì)革蘭氏陰性菌的殺滅效果特別好。本發(fā)明還公開了該組抗菌肽的制備方法，可以用固相化學(xué)法合成，也可以通過(guò)基因工程表達(dá)獲得。本發(fā)明合成抗菌肽可以用于制備治療革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌或病毒感染引起的疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61K38/10GK1616483SQ20041007881
公開日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2004年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者黃青山, 李國(guó)棟 申請(qǐng)人:上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司