專(zhuān)利名稱(chēng)：9β－乙?；]鞘姜內(nèi)酯作為抗癌劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)，具體地說(shuō)是化合物9β-乙酰基閉鞘姜內(nèi)酯(9β-acetoxystunolide，又名9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯，自編號(hào)為CP-C)作為抗癌劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是威脅人類(lèi)生命的第二大殺手，每年奪去約700萬(wàn)人的生命，是國(guó)際上急待攻克的難題。手術(shù)、化療、放療綜合治理迄今仍是治療癌癥的主要手段。但是化療、放療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也殺死宿主的正常細(xì)胞，產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，破壞了機(jī)體的免疫功能，使免疫系統(tǒng)難以對(duì)抗入侵的細(xì)菌和病毒。現(xiàn)行的抗癌藥物缺乏對(duì)癌細(xì)胞的特異性、選擇性、不能有效對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的惡變及手術(shù)后的癌轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散。對(duì)癌細(xì)胞的多藥抗藥性也束手無(wú)策。這種現(xiàn)狀促使藥物化學(xué)家開(kāi)辟新思路，尋找、研制新結(jié)構(gòu)、新活性作用機(jī)理的抗癌活性成分。
從天然藥物中尋找抗癌劑或先導(dǎo)物是新藥研究的重要途徑，而體外活性篩選則是待研藥物必經(jīng)的第一關(guān)卡?；熕幬镏饕羌?xì)胞毒類(lèi)藥物，就是用國(guó)際通用的癌細(xì)胞系進(jìn)行體外細(xì)胞毒試驗(yàn)，藥物細(xì)胞毒活性達(dá)到國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(IC50≤4μg/ml)，則認(rèn)為具有細(xì)胞毒活性。細(xì)胞毒藥物是通過(guò)干擾與細(xì)胞的生長(zhǎng)、死亡、分化及功能相關(guān)的機(jī)制，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)甚至殺死癌細(xì)胞。細(xì)胞毒類(lèi)藥物引起細(xì)胞死亡有兩種機(jī)制，一種是細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡(凋亡)，第二種是細(xì)胞處于(藥物)劇烈損傷條件下引起細(xì)胞壞死。
本發(fā)明人的在先發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了從杯菊中提取化合物9β-乙酰基閉鞘姜內(nèi)酯及其分離提純的方法，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了該物質(zhì)具有抗癌活性。其結(jié)構(gòu)式為
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種從天然藥物杯菊中獲得天然產(chǎn)物化合物9β-乙酰基閉鞘姜內(nèi)酯作為抗癌劑的應(yīng)用。
本發(fā)明是將具有細(xì)胞毒活性的9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯作為抑制五種癌細(xì)胞的細(xì)胞毒型抗癌劑。它對(duì)五種癌細(xì)胞具有選擇性，能有效殺死L1210(小鼠白血病)、CCRF-CEM(人類(lèi)白血病)、KB(人鼻咽癌)、MCF-7(人乳腺癌)、LS174T(人結(jié)腸癌)等五種癌細(xì)胞。其中IC50(半數(shù)殺傷率濃度)分別是0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml。
9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯(CP-C)對(duì)L1210細(xì)胞毒活性，是細(xì)胞毒類(lèi)型，直接作用于細(xì)胞膜，抑制有絲分類(lèi)，限制核苷摻入細(xì)胞的DNA中，其機(jī)理與抑制微管蛋白有關(guān)，引起細(xì)胞壞死，而不是引起細(xì)胞凋亡。
9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯(CP-C)對(duì)L1210等五種癌細(xì)胞的作用規(guī)律是隨著藥物濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，L1210細(xì)胞生長(zhǎng)率越低。
以下是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1.細(xì)胞毒試驗(yàn)樣品9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯的細(xì)胞毒試驗(yàn)用錐蟲(chóng)蘭染料排除法測(cè)定細(xì)胞毒活性，同時(shí)用生長(zhǎng)曲線(xiàn)法測(cè)定藥物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，并推算IC50。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)9β-乙?；?閉鞘姜內(nèi)酯對(duì)L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五種癌細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒活性，IC50分別為0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml。
對(duì)L1210細(xì)胞系活細(xì)胞生長(zhǎng)影響低濃度下(0.1，1.0μg/ml)對(duì)活細(xì)胞無(wú)抑制作用；在細(xì)胞毒濃度下(＞1.0μg/ml)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，活細(xì)胞數(shù)減少，48小時(shí)后癌細(xì)胞全部被殺死。見(jiàn)表1及圖1。
表1CP-C濃度及作用時(shí)間對(duì)體外L1210細(xì)胞生長(zhǎng)的影響表1藥物濃度24h 48h(ug/ml)細(xì)胞數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)率細(xì)胞數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)率對(duì)照組 0 7.22±0.40 14.9±0.07CP-C 0.16.80±0.2194.0 13.3±0.8089.30.36.11±0.8284.6 10.7±0 1071.81.05.00±0.1469.3 7.29±2.1048.93.01.10±0.6415.2 0.36±0.302.510.0 0.40±0.135.5 0.00±0.000.02.細(xì)胞毒類(lèi)活性作用機(jī)理試驗(yàn)1)用微量滴定克隆測(cè)定法(Microtitration clonogenic assays)和菌落形成試驗(yàn)(Colony formation assays)測(cè)定細(xì)胞毒活性是細(xì)胞毒類(lèi)活性(cytotoxic)還是生長(zhǎng)抑制活性(cytostatic)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。
表2用微量滴定克隆測(cè)定法，CP-C作用于L1210細(xì)胞2、6、24小時(shí)后，對(duì)L1210細(xì)胞菌落形成的影響。
表2不同藥物濃度相對(duì)于對(duì)照組的L1210細(xì)胞菌落形成率(％)(ug/ml)2h 6h 24h對(duì)照組0 100100 100CP-C 0.180.4±4.1 72.6±6.767.9±3.70.368.1±3.6 67.0±5.060.0±7.51.044.3±3.2 45.0±7.036.2±10.23.022.2±5.0 12.3±3.20.1±0.110.0 10.5±4.4 5.8±1.5 0.1±0.1結(jié)果表明9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯(CP-C)抑制菌落形成取決于藥物作用的時(shí)間和濃度，作用時(shí)間為2h時(shí)，隨濃度增加，菌落形成逐漸降低；作用24h時(shí)，細(xì)胞毒性明顯增加。結(jié)論細(xì)胞毒性比細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性更敏感。
2)氚代脫氧胸腺嘧啶核苷摻入試驗(yàn)([3H]-thymidine incoporation)，研究CP-C對(duì)L1210細(xì)胞核酸代謝作用的影響。結(jié)果見(jiàn)表3、圖3。
表3CP-C作用于L1210系2、6、24小時(shí)后，對(duì)氚代-胸苷摻入L1210細(xì)胞的影響。
表3不同藥物濃度相對(duì)于對(duì)照組對(duì)[3H]-thymidine的摻入率(％)(ug/ml)2h 6h 24h對(duì)照組0 100 100100CP-C 0.194.1±2.6 90.9±3.8 89.8±6.50.387.9.1±3.2 82.0±2.1 79.0±11.01.079.9±4.6 65.9±4.1 53.7±5.03.048.1±17.8 33.9±8.9 2.3±1.710.0 36.9±15.6 16.1±3.1 0.1±0.1結(jié)果表明CP-C隨著時(shí)間和濃度的變化明顯抑制氚代脫氧胸苷摻入L1210細(xì)胞的DNA中。當(dāng)作用2h時(shí)，3H胸苷摻入L1210細(xì)胞的百分比開(kāi)始下降，隨著時(shí)間的增加，抑制增強(qiáng)，24h時(shí)，濃度增至10ug/mL，抑制作用最強(qiáng)。結(jié)論①隨CP-C濃度及作用時(shí)間增加，抑制氚代-胸苷摻入L1210細(xì)胞內(nèi)的作用增強(qiáng)；②CP-C細(xì)胞毒性與抑制DNA合成有關(guān)。
3)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CP-C對(duì)L1210細(xì)胞周期分布的影響。
表4、圖4是CP-C對(duì)L1210細(xì)胞系細(xì)胞周期分布的作用。圖5是CP-C處理后，L1210的流式細(xì)胞法矩形圖。
由表和圖可見(jiàn)，CP-C阻斷L1210細(xì)胞于G2/M相，推測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及菌落形成與細(xì)胞有絲分裂作用有關(guān)。
表4CP-C作用于L1210細(xì)胞系2、6、24、48小時(shí)后，對(duì)各時(shí)相細(xì)胞周期分布的影響。
表4溫育時(shí)間濃度 細(xì)胞周期分布百分率(％)(ug/mL) HD*G0/G1SG2/MPP*對(duì)照組0h00.7±0.139.1±1.330.2±1.226.0±1.54.2±1.1CP-C 2h 01.0±0.540.0±1.828.4±3.025.7±1.35.0±2.20.1 1.2±0.640.8±1.528.0±1.426.5±2.13.5±1.40.3 1.1±0.439.1±1.229.8±3.025.1±1.34.9±2.11.0 1.5±0.636.9±3.430.6±1.827.4±0.93.6±0.93.0 1.8±0.730.6±2.527.4±3.835.3±4.84.9±0.710.0 2.0±0.926.7±2.727.6±2.538.9±2.33.9±2.16h 01.9±1.439.2±1.430.0±2.226.8±1.02.1±0.50.1 1.2±0.240.6±4.729.3±4.126.5±1.43.3±1.60.3 1.1±0.442.0±1.325.7±1.828.1±1.13.1±0.91.0 1.2±0.840.9±1.418.8±2.635.8±1.53.3±1.23.0 2.1±0.525.2±4.626.1±2.945.6±3.23.0±0.510.0 2.8±2.421.9±5.826.3±4.148.3±4.14.7±1.524h 00.8±0.343.8±1.328.5±1.423.5±1.73.4±0.90.1 1.7±2.144.4±4.728.1±5.422.2±0.93.6±1.20.3 0.6±0.142.0±1.328.6±1.824.9±2.53.9±1.81.0 0.6±0.233.2±2.324.3±4.333.9±1.811.0±0.33.0 13.6±6.5 16.9±2.719.5±9.728.0±3.022.0±3.610.0 18.1±7.8 19.9±9.822.2±1.825.2±3.415.0±4.348h 05.9±0.342.3±0.328.8±0.219.4±1.40.1±0.50.1 2.3±0.442.9±0.226.3±0.824.1±0.13.2±0.90.3 2.4±1.145.2±0.425.6±0.923.1±0.93.2±1.31.0 2.2±0.130.2±1.324.4±0.221.5±0.921.1±1.93.0 19.8±4.7 22.7±7.513.7±2.425.2±0.919.1±0.710.0 66.5±0.0 10.3±4.79.6±2.3 6.1±0.5 7.6±7.24)DNA斷裂分析(DNA fragmentation assay)見(jiàn)圖6，經(jīng)48小時(shí)藥物作用后，L1210細(xì)胞系中提取DNA瓊脂糖膠電泳圖。由圖表明CP-C未出現(xiàn)DNA“梯子”型標(biāo)準(zhǔn)的斷裂現(xiàn)象。說(shuō)明CP-C是細(xì)胞毒型的抗癌劑，它引起的細(xì)胞毒是使細(xì)胞壞死，而不是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明的有益效果是1.從對(duì)9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯的系統(tǒng)的藥理研究提供充分的依據(jù)，證實(shí)9β-乙酰基-閉鞘姜內(nèi)酯的抗癌活性是屬于細(xì)胞毒類(lèi)型，其活性作用機(jī)理與抑制微管蛋白有關(guān)，引起細(xì)胞壞死。9β-乙酰基閉鞘姜內(nèi)酯細(xì)胞毒活性較強(qiáng)，具有選擇性，能有效殺死L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五種癌細(xì)胞，半數(shù)殺傷率濃度IC50分別為0.41、0.59、0.16、0.92、0.53μg/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，9β-乙酰基閉鞘姜內(nèi)酯是優(yōu)良的細(xì)胞毒類(lèi)抗癌劑。
2.植物杯菊中珊9β-乙酰基閉鞘姜內(nèi)酯含量較高，不同季節(jié)的原料，其含量是十萬(wàn)分之一左右，該植物可以人工培植，能得到充足的原料。
3.從杯菊原料中提取9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯，分離提純簡(jiǎn)單易行。


圖1是本發(fā)明的CP-C濃度和作用時(shí)間對(duì)L1210細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
圖2是本發(fā)明的用微量滴定測(cè)定法CP-C作用于L1210細(xì)胞2、6、24小時(shí)后對(duì)L1210細(xì)胞系菌落形式的影響。
圖3是本發(fā)明的CP-C作用于L1210細(xì)胞系2、6、24小時(shí)后，對(duì)氚代一胸苷摻入L1210細(xì)胞的影響。
圖4是本發(fā)明的CP-C(3μg/ml)作用于L1210細(xì)胞2、6、24小時(shí)后，G、S、G2/M、HD、PP各時(shí)相細(xì)胞分布的百分率(％)。
圖5是本發(fā)明的L1210細(xì)胞經(jīng)CP-C處理后，CP-C對(duì)L1210細(xì)胞周期分布的流式細(xì)胞術(shù)矩形圖，濃度和作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
圖6是本發(fā)明的DNA斷裂實(shí)驗(yàn)，藥物作用48小時(shí)后，L1210的DNA提取物的瓊脂糖膠電泳譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例化合物9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯作為抗癌劑的應(yīng)用。
1.化合物9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯按以下方法分離提純1)將杯菊全株干燥粉碎后，取粉碎樣10千克，用95％乙醇浸泡30天，提取浸膏，得浸膏CP0≈800克；
2)取此浸膏800克，與硅藻土按1∶1比例混合，用95％乙醇攪拌混合均勻，在水浴上炒干，稱(chēng)重，W樣＝710克，用1L索式提取器，分別用石油醚、氯仿∶乙酸乙酯＝3∶1、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次萃取，得粗組分CP1(120克)、CP2(100克)、CP3(100克)、CP4(130克)、CP5(150克)。
3)用L1210細(xì)胞分別對(duì)CP1～CP5進(jìn)行細(xì)胞毒活性篩選，結(jié)果，抗癌活性大小依次為CP2＞CP3＞CP1＞CP4＞CP5。
4)對(duì)CP2進(jìn)行柱層析，用40～63μm硅膠作吸附劑，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇作洗脫劑，濕法裝柱，分得11個(gè)組分，經(jīng)細(xì)胞毒活性試驗(yàn)測(cè)定，得到三個(gè)活性組分(用A4、A5、A7表示)。
5)對(duì)活性組分A4用TLC級(jí)硅膠作吸附劑，用正己烷-乙酸乙酯-甲醇作洗脫劑，真空柱層析，重結(jié)晶，得純晶體CP-C。
6)用L1210癌細(xì)胞系對(duì)粗提物對(duì)組分和純晶體CP-C進(jìn)行抗癌活性篩選，得9β-乙?；?閉鞘姜內(nèi)酯抗癌活性成分。(可參考發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)02128070.3的公開(kāi)說(shuō)明書(shū))2.用染料排斥法測(cè)9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯細(xì)胞毒活性及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，來(lái)確定9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯抗癌活性與濃度(使用量)的關(guān)系①樣品處理稱(chēng)取9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯樣品1mg，溶于二甲亞砜(DMSO)中，溶解后，每個(gè)培養(yǎng)槽中加4μL，把等體積的(4μL)無(wú)藥樣的二甲亞砜單獨(dú)加在對(duì)照組槽中每個(gè)槽中，樣品濃度計(jì)算如下表

②選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，用10％小牛血清的RPM11640培養(yǎng)基，(在24槽的培養(yǎng)基內(nèi)，對(duì)L1210細(xì)胞系)配成5×104個(gè)細(xì)胞的懸浮液，溫育24小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞不受損。然后，分裝在上述不同濃度的實(shí)驗(yàn)組的24孔槽中。在37℃溫箱中培養(yǎng)48至72小時(shí)。
③取等體積的(0.4ml)0.2％錐蟲(chóng)蘭與細(xì)胞懸浮液混合后，在室溫下作用5分鐘，在15分鐘內(nèi)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在相對(duì)比顯微鏡(Phase-contrastmicroscopy)下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，未顯色的是活細(xì)胞，呈藍(lán)色的是死細(xì)胞。
④上述細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是三次實(shí)驗(yàn)的平均值。
3.結(jié)果評(píng)定 (對(duì)照組活細(xì)胞率應(yīng)在90％以上)以L(fǎng)1210活細(xì)胞百分率為縱坐標(biāo)，以CP-C濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得細(xì)胞生長(zhǎng)率曲線(xiàn)，推算半數(shù)殺傷率濃度IC50。
由圖得出結(jié)論9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯對(duì)L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五種癌細(xì)胞的IC50分別為0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml?？梢宰鳛榭拱﹦┦褂?本抗癌劑是制備成最終抗癌藥的中間產(chǎn)品)9β-乙酰基閉鞘姜內(nèi)酯還可溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有機(jī)溶劑中。
其他癌細(xì)胞的濃度配制CCRF-CEM癌細(xì)胞配成1×105/槽；KB、MCF-7、LS174T細(xì)胞系濃度為4×104/槽；操作與L1210一樣。
4.根據(jù)上述測(cè)定的9β-乙?；]鞘姜內(nèi)酯抗癌活性與濃度(使用量)的關(guān)系，針對(duì)不同的癌細(xì)胞，不同的應(yīng)用領(lǐng)域，按本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，配制成不同溶劑、不同濃度的CP-C抗癌劑溶液。
權(quán)利要求
1.化合物9β-乙酰基閉鞘姜內(nèi)酯作為抑制五種癌細(xì)胞小鼠白血病、人類(lèi)白血病、人鼻咽癌、人乳腺癌、人結(jié)腸癌的細(xì)胞毒型抗癌劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是從天然藥物中獲取的化合物9β－乙酰基閉鞘姜內(nèi)酯(9β－acetoxystunolide)作為細(xì)胞毒型抗癌劑的應(yīng)用。它對(duì)L1210、CCRF－CEM、KB、MCF－7及LS174T等五種癌細(xì)胞具有選擇性。9β－乙?；]鞘姜內(nèi)酯對(duì)上述五種癌細(xì)胞的IC50分別為0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml，抗癌活性與藥物濃度及作用癌細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)，濃度越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞毒活性越強(qiáng)。對(duì)L1210癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，屬于細(xì)胞毒型(cytotoxic)而不是細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性(Cytostatic)，它殺死癌細(xì)胞的機(jī)理與抑制微管蛋白有關(guān)，使癌細(xì)胞壞死而不是使細(xì)胞凋亡。是一種優(yōu)良的抗癌劑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1634035SQ20041007956
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者李祖強(qiáng) 申請(qǐng)人:云南大學(xué)