專利名稱:血小板增進(jìn)蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及血小板增進(jìn)蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
血小板是血液的重要組份之一,對(duì)受傷部位的迅速止血起關(guān)鍵的作用,并有修復(fù)受損血管的功能。血小板數(shù)量一旦低于正常水平,易引起大量失血而導(dǎo)致生命危險(xiǎn)。目前,對(duì)血小板缺乏癥病人通常施行血小板輸注治療。然而,與其它血液制品一樣,用于輸注的血小板制品的儲(chǔ)存期較短,同時(shí)置病人于感染乙肝病毒、艾滋病病毒等血原性致病源和異源免疫反應(yīng)等危險(xiǎn)之中。
血小板生成素(TPO)是刺激血小板生成的細(xì)胞因子,通過與血小板生成素受體(MPL)結(jié)合發(fā)揮作用。MPL由三部分組成胞外區(qū)域MPL-EC(26-491aa)(Extracellular domain)、跨膜區(qū)域(Transmembrane)、胞漿區(qū)域(Cytoplasmicdomain)。1994年國際上五間實(shí)驗(yàn)室同時(shí)成功克隆TPO。TPO的成功克隆給人們帶來了治療血小板減少癥的新希望和新途徑。但是,臨床結(jié)果表明TPO對(duì)治療血小板減少癥效果在不同患者中差別很大,同時(shí)TPO的副作用也開始引起人們的注意首先,TPO可活化血小板,刺激血小板聚集,從而導(dǎo)致血栓形成;其次,服用TPO后,體內(nèi)可能出現(xiàn)TPO抗體。(Archimbaud E,et al.Blood.1999;943694-3701;Schiffer CA,et al,Blood.2000;952530-2535;Nash R,et al.Blood.1997;90suppl.1262a)。因此人們希望找到可以替代血小板生成素的其他種類的蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子。
酵母雙雜交系統(tǒng)適用于研究蛋白之間的相互作用。該系統(tǒng)由兩個(gè)表達(dá)載體質(zhì)粒(A和B)和酵母宿主(C)組成。其原理是基于轉(zhuǎn)錄因子例如LexA或Gal4蛋白是由兩個(gè)分離的域(domain)組成DNA-結(jié)合域(DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄活化域(AD)。A質(zhì)粒表達(dá)釣餌蛋白和DNA-BD的融合蛋白,B質(zhì)粒表達(dá)待測蛋白和AD的融合蛋白。當(dāng)將A質(zhì)粒和B質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母宿主時(shí),在酵母中同時(shí)表達(dá)的是兩種融合蛋白如果發(fā)生相互作用,DNA-BD和AD將靠近,重新組裝成LexA或GAL4蛋白并活化報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因而,采用已知的釣餌蛋白,可以研究其配體的功能或證實(shí)某些蛋白的功能。目前,Clontech公司提供的試劑盒Matchmaker Two-Hybrid System 3,Matchmaker LexA Two-HybridSystem就是這種酵母雙雜交系統(tǒng)的商業(yè)化產(chǎn)品的例子。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于找到一種與血小板生成素具有相同功能的新的分離的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的目的還在于提供一種含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA或含有該DNA的載體或質(zhì)粒。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供本發(fā)明蛋白質(zhì)的用途,包括制藥用途和治療疾病的用途。
為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明用血小板生成素受體胞外區(qū)域(MPL-EC)為釣餌,運(yùn)用酵母雙雜交系統(tǒng),從人體胎兒肝cDNA文庫中篩選與血小板生成素受體(MPL)互相作用的蛋白,獲得了一種與MPL受體胞外區(qū)域特異性結(jié)合的新蛋白質(zhì)。該蛋白具有331個(gè)氨基酸。經(jīng)Blast分析表明,該蛋白質(zhì)與血小板生成素TPO沒有同源性。由于發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)在巨核細(xì)胞成熟和血小板生成方面具調(diào)控作用,故稱之為血小板增進(jìn)蛋白(Platelet Promoting Protein;下文有時(shí)簡稱PPP)。其氨基酸序列見序列表中的SEQ ID NO.2(下文簡稱“序列2”),其核苷酸編碼序列見序列表中的SEQ ID NO.1(下文簡稱“序列1”)。本申請(qǐng)文本所用的術(shù)語“血小板增進(jìn)蛋白”或“PPP”是指一種具有序列表中序列2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供該P(yáng)PP蛋白質(zhì)的衍生物。“血小板增進(jìn)蛋白衍生物”或“PPP衍生物”或“其衍生物”包括那些具有可在體內(nèi)刺激血小板生成和加速血液凝結(jié)功能的、其氨基酸序列為序列2所示氨基酸序列的突變體、序列2的保守取代形式、增加或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的形式、氨基端截?cái)嗟男问健Ⅳ然私財(cái)嗟男问?、序?的部分或全部串聯(lián)重復(fù)形式以及與其他蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子的融合蛋白形式。例如,本發(fā)明PPP衍生物的一個(gè)具體的例子是在序列2所示的氨基酸序列的N末端還具有2-6個(gè)組氨酸。
在本申請(qǐng)文本所用的氨基酸三字母或單字母表達(dá)方式,采用IUPAC規(guī)定的氨基酸代碼(Eur.J.Biochem.,1389-37,1984)。
具體而言,首先根據(jù)人MPL-EC的DNA編碼序列設(shè)計(jì)與其兩端對(duì)應(yīng)的引物MPLEC-F和MPLEC-R,并分別在引物中加入適宜的酶切位點(diǎn)。以人體總cDNA為模板,擴(kuò)增并分離出1.3Kb的MPL-EC cDNA。然后,經(jīng)酶切后連接到pLexA質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中,得到pLexA-MPL-EC質(zhì)粒。
接下來,將得到的pLexA-MPL-EC質(zhì)粒與人胎兒肝cDNA文庫DNA共轉(zhuǎn)化酵母菌EGY48,在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選出陽性克隆。酶切該陽性克隆的質(zhì)粒DNA,分析插入基因的核苷酸序列如序列1所示,由之推測的氨基酸序列如序列2所示。
隨后,將PPP基因插入表達(dá)載體pET-28b得pET-PPP,并將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)得含有該質(zhì)粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。經(jīng)誘導(dǎo)后,表達(dá)的PPP的N端融合有6個(gè)連續(xù)的組氨酸。利用與組氨酸有親和作用的Co2+配體親和層析柱,純化PPP。
然后將純化的PPP注射正常小鼠,然后檢測外周血血小板的數(shù)量和出血時(shí)間(Bleeding Times)的變化。結(jié)果表明,純化的PPP具有明顯的促進(jìn)體內(nèi)血小板生成,和增加外周血血小板量的生物活性。
由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有促進(jìn)體內(nèi)血小板生成的作用,因而其可用于制備治療血小板減少癥的藥物的或用于制備促進(jìn)止血的藥物用途。所述藥物可為注射劑、粉劑、片劑、膠囊劑、溶液、懸浮劑、乳劑等。所述藥物的給藥途徑可為口服、經(jīng)皮、靜脈或肌肉注射給藥。
本發(fā)明還相應(yīng)地提供一種藥物組合物,其含有本發(fā)明蛋白質(zhì)PPP或其具有提升體內(nèi)血小板數(shù)量功能的衍生物;以及藥學(xué)上可以接受的載體。所述可藥用載體包括液體載體如純凈水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、白蛋白溶液等,固體載體如抗氧化劑、淀粉、糊精等。本發(fā)明的藥物組合物還可任選地含有其他造血細(xì)胞因子類生物制品如白介素、粒細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)、促紅細(xì)胞生成素等。
本發(fā)明的含有PPP的藥物組合物是可以很方便地制備的??梢圆捎弥扑庮I(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)和設(shè)備,將本發(fā)明的蛋白質(zhì)配制成藥物組合物。例如,可以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)溶解在無菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、白蛋白溶液中,配制成1μg-100μg/ml的溶液。
本發(fā)明的PPP可以參照血小板生成素的建議給藥劑量安排給藥。例如,給藥劑量范圍在1-1000μg/kg體重/日的范圍內(nèi),并由有資格的醫(yī)師根據(jù)患者的年齡、體重、疾病的嚴(yán)重程度、病因和病史等因素在該范圍內(nèi)選擇。
本發(fā)明中所述載體、宿主菌等可由商業(yè)途徑得到,如pET-28b和BL21(DE3)購自Novagen公司,酵母雙雜交篩選系統(tǒng)Matchmaker LexA Two-Hybrid System及純化His-PPP所需的Co2+配體親和層析柱TALON Metal Affinity Resin可購自美國Clontech公司。
以下通過附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本發(fā)明不受下述具體文字和圖片描述的限制,本發(fā)明可在權(quán)利要求所概括的范圍內(nèi)做各種改變,這些改變均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
圖1顯示pLexA-MPL-EC質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
圖2顯示pB42AD質(zhì)粒簡圖。
圖3顯示表達(dá)載體pET-28b簡圖。
圖4顯示表達(dá)本發(fā)明PPP的pET-PPP表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。
圖5顯示融合蛋白His-PPP SDS-PAGE電泳檢測圖。蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE電泳,凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色,箭頭所示為His-PPP,約45kDa。泳道1,蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);泳道2和3,未經(jīng)和經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌細(xì)胞裂解液;泳道4,可溶性His-PPP粗提物;泳道5,經(jīng)Co2+配體親和層析柱純化的His-PPP。
圖6表示His-PPP刺激小鼠體內(nèi)血小板增長的圖。灰色柱代表每天注射10μg His-PPP/公斤體重的實(shí)驗(yàn)組(第一組),黑色柱代表每天注射50μgHis-PPP/公斤體重的實(shí)驗(yàn)組(第二組),白色柱代表注射PBS的對(duì)照組(第三組)。第0天開始,連續(xù)腹腔注射7天。第0、4、7、10、13、16和19天時(shí)取尾靜脈外周血20μl,檢測血小板數(shù)量。血小板數(shù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差×109/L。
圖7表示本發(fā)明His-PPP縮短出血時(shí)間的柱圖。黑色柱代表每天注射10μg His-PPP/公斤體重的實(shí)驗(yàn)組(第一組),白色柱代表注射PBS的對(duì)照組(第二組)。第0天開始,連續(xù)腹腔注射7天。第0,4,7,10,13,16和19天時(shí)檢測小鼠出血時(shí)間。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例僅用于說明而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍,實(shí)施例中未注明具體條件者,按常規(guī)或制造商建議的條件進(jìn)行。
實(shí)施例1、運(yùn)用酵母雙雜交系統(tǒng)分離與血小板生成素受體胞外區(qū)域(MPL-EC26-491aa)相結(jié)合的血小板增進(jìn)蛋白1.1靶蛋白質(zhì)粒pLexA-MPL-EC的構(gòu)建根據(jù)人體血小板生成素受體胞外區(qū)域的DNA序列設(shè)計(jì)與其兩端對(duì)應(yīng)的引物MPLEC-F和MPLEC-R,并分別在引物中加入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)(下劃線)以便于克隆。
MPLEC-F5’-CCGGAATTCCAAGATGTCTCCTTGCTGGCATCAGA-3’;MPLEC-R5’-CCGCTCGAGTTATCCGACCACGAGCTCCAGGG-3’。
如圖1所示,以人體總cDNA為模板,PCR合成人體血小板生成素受體胞外區(qū)域。PCR反應(yīng)液為1×PCR反應(yīng)緩沖液,0.5μM MPLEC-F,0.5μMMPLEC-R,1μg人體總cDNA,2U Taq DNA聚合酶(購自Fermentas Inc.,Maryland,USA),50μM dATP,50μM dTTP,50μM dCTP,50μM dGTP,1.5mM MgCl2,用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃,90sec循環(huán)30次94℃,5min→55℃,60sec→→→→→→→72℃,10min72℃,120sec1%瓊脂糖電泳分離和純化分子量約1.45Kb的PCR產(chǎn)物。將上述純化的擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoRI和XhoI酶切后,用T4連接酶連接到亦經(jīng)EcoRI和XhoI酶切的pLexA載體(購自美國Clontech公司)上,獲得重組DNA質(zhì)粒pLexA-MPL-EC。pLexA-MPL-EC構(gòu)建步驟見圖1。
1.2篩選與MPL-EC相互作用的蛋白篩選系統(tǒng)采用Matchmaker LexA Two-Hybrid System(購自美國Clontech公司)。該系統(tǒng)是基于LexA的酵母雙雜交系統(tǒng),用于在酵母中檢測蛋白與蛋白之間的相互作用。具體使用操作方法按生產(chǎn)廠家提供的說明書進(jìn)行。
將以pB42AD(見圖2)為載體的人體胎兒肝cDNA文庫(購自美國Clontech公司)稀釋后涂布于LB平板上,37℃過夜培養(yǎng)。用消毒的棉花棒收集細(xì)菌細(xì)胞菌落,在液體LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng),用質(zhì)粒DNA提取試劑盒E.Z.N.A.Fastfilter Plasmid Midiprep Kit(購自美國Omega Bio-Tek公司)抽提質(zhì)粒DNA。將提取得到的100μg人體胎兒肝cDNA文庫DNA和100μg按實(shí)施例1.1制備的pLexA-MPL-EC DNA共轉(zhuǎn)化含p80p-lacZ(Ura+,Lac+,Leu+)質(zhì)粒的酵母菌EGY48(購自美國Clontech公司)。將轉(zhuǎn)化的酵母菌在含X-Gal的SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(配方參照Clontech公司的產(chǎn)品說明書)上30℃培養(yǎng),選擇陽性克隆,即在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上生長并呈藍(lán)色的菌落。結(jié)果,獲得1個(gè)陽性克隆,命名為pB42AD-PPP。提取質(zhì)粒后,通過酶切分析發(fā)現(xiàn)pB42AD-PPP的插入片段約為1300bp。該克隆攜有993bp完整的編碼序列,命名為PPP,編碼331個(gè)氨基酸。將插入片段進(jìn)行核苷酸序列測定,然后氨基酸編碼分析,結(jié)果分別如序列1和2所示。經(jīng)Blast分析表明,PPP基因所編碼的氨基酸序列與血小板生成素TPO沒有同源性,但與生理功能不明的Human Nuclear Distribution Gene C(HNUDC)之cDNA序列(Matsumoto,N.and Ledbetter,D.H,Hum.Genet.104,498-504,1999;Genbankdatabase gi12052969)完全相同。由于本發(fā)明發(fā)現(xiàn)該蛋白具有提升體內(nèi)血小板數(shù)量和加速血液凝結(jié)等功能,故名命為血小板增進(jìn)蛋白(Platelet PromotingProtein;PPP)。
實(shí)施例2血小板增進(jìn)蛋白表達(dá)載體pET-28b的構(gòu)建與血小板增進(jìn)蛋白的表達(dá)純化采用如圖3所示的表達(dá)載體pET-28b(購自美國Novagen公司)克隆表達(dá)本發(fā)明的血小板增進(jìn)蛋白,此載體含有His-tag,故所表達(dá)的血小板增進(jìn)蛋白His-PPP的N端帶6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基,可經(jīng)Co2+配體親和層析一步純化。
pET-28b載體有多克隆位點(diǎn)。根據(jù)pET-28b載體的酶切位點(diǎn)和血小板增進(jìn)蛋白cDNA序列,設(shè)計(jì)兩端引物PPP-F5’-CGGGATCCGTACCCGCATGATATGCAGTAGAT-3’,含BamH I酶切位點(diǎn)(下劃線);
PPP-R5’-CCGCTCGAGTTAGCTTGGAGCTAAGGTGCAT-3’,含XhoI酶切位點(diǎn)(下劃線)。
以實(shí)施例1獲得的pB42AD-PPP質(zhì)粒DNA為模板擴(kuò)增血小板增進(jìn)蛋白cDNA。PCR反應(yīng)條件為1×PCR反應(yīng)緩沖液,0.5μM PPP-F,0.5μM PPP-R,1μg pB42AD-PPP質(zhì)粒,2U DNA聚合酶(Fermentas公司),50μM dATP,50μMdTTP,50μM dCTP,50μM dGTP,1.5mM MgCl2,用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃,60sec循環(huán)30次94℃,5min→55℃,60sec →→→→→→→→→72℃,10min72℃,90sec1%瓊脂糖電泳分離和純化分子量約1Kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將上述純化的擴(kuò)增產(chǎn)物用BamH I和Xho I雙酶切后,用T4DNA連接酶連接到亦經(jīng)BamHI和Xho I雙酶切的pET-28b載體上His-tag之下游,獲得重組DNA質(zhì)粒pET-PPP,構(gòu)建過程見圖4。
將如上獲得的重組DNA質(zhì)粒pET-PPP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(購自美國Novagen公司)。將含pET-PPP的大腸桿菌BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化子接種于含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃培養(yǎng)過夜。以1%接種量,接種至LB液體培養(yǎng)基(含有50μg/ml卡那霉素),37℃搖床培養(yǎng)至A600為0.5~0.6。在培養(yǎng)液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(簡稱IPTG)至終濃度為0.5mM,30℃誘導(dǎo)4小時(shí),離心收集菌體。用50mM磷酸鈉緩沖液(含300mM NaCl,1mM苯甲基磺酰氟(簡稱PMSF),pH7.4)重懸菌體。超聲波破碎細(xì)胞壁,10,000g離心30分鐘,棄去細(xì)胞碎片,得到His-PPP的粗提液,用TALON Metal AffinityColumn(美國Clontech公司)將His-PPP提純,操作按廠家的說明書進(jìn)行,獲得可溶His-PPP融合蛋白(45kDa)。經(jīng)10%SDS-PAGE電泳檢測,His-PPP純度達(dá)95%以上,見圖5。
實(shí)施例3His-PPP刺激BALB/c小鼠血小板的生成體內(nèi)注射藥物測外周血血小板數(shù)方法參照Kaushansky et.al.,Nature,Vol.369,1994,565-568。
用含有0.1%牛血清白蛋白(簡稱BSA)的磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS),pH8.0將如實(shí)施例2所述純化的His-PPP制配成每毫升含10μg His-PPP的溶液作為下述注射用樣品。取6~7周齡正常雄性BALB/c小鼠30只,隨機(jī)分成三組,每組10只。第一組每天注射10μg His-PPP/公斤體重,第二組每天注射50μg His-PPP/公斤體重,第三組作為對(duì)照組每天注射含有0.1%BSA的PBS。連續(xù)腹腔注射7天。第0,4,7,10,13,16和19天時(shí)取尾靜脈外周血20μl,用F-820Sysmex半自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(Sysmex Corp.Ltd,Japan)測血小板數(shù)量。
結(jié)果如圖6所示。開始注射后4~7天時(shí),在所述兩種劑量His-PPP刺激下,小鼠體內(nèi)血小板數(shù)均有顯著增加(n=10,p<0.05)。第4天時(shí),10μg劑量組血小板數(shù)(1346±54)比對(duì)照組(1162±72)增長15.8%,50μg 劑量組血小板數(shù)(1506±70)比對(duì)照組增長29.6%。第7天時(shí),10μg 劑量組血小板數(shù)(1418±80)比對(duì)照組(1169±78)增長21.3%,50μg劑量組血小板數(shù)(1489±57)比對(duì)照組增長27.4%。停止藥物注射后,血小板數(shù)量逐漸緩慢回落,至第19天即注射停止后12天時(shí)方下降到注射前水平。
實(shí)施例4.His-PPP縮短小鼠出血時(shí)間出血時(shí)間指皮膚刺破后出血到出血自然停止所需要的時(shí)間,是評(píng)價(jià)血小板功能的試驗(yàn)。測出血時(shí)間的方法參考Alves-Rosa et.al.,Blood,Vol.96,2000,2834-2840。
用含有0.1%BSA的PBS,pH8.0將如實(shí)施例2所述純化的His-PPP制備成每毫升含10μg His-PPP的溶液作為下述注射用樣品。取20只BALB/c小鼠隨機(jī)分成二組,每組10只。第一組每天注射10μg His-PPP/公斤體重;第二組為對(duì)照組,每天注射含有0.1%BSA的PBS。第0天開始,連續(xù)腹腔注射7天。在第0,4,7,10,13,16和19天時(shí)檢測小鼠出血時(shí)間。出血時(shí)間由下列方法測定在小鼠尾巴末端剪20mm口子,每隔30秒用濾紙輕輕觸及傷口取血印跡,直至濾紙上無血跡為止,計(jì)算其間所需時(shí)間。
結(jié)果如圖7所示。第0天時(shí)兩組小鼠出血時(shí)間基本相同,為5.5分鐘左右。第4天His-PPP組出血時(shí)間為4.2分鐘,比對(duì)照組的6.3分鐘下降33.5%(n=10,p<0.05);第7天時(shí)His-PPP組為2.9分鐘,比對(duì)照組的5.9分鐘下降50.8%(n=10,p<0.05);第10天時(shí)出血時(shí)間達(dá)最低值2.4分鐘,比對(duì)照組的6.3分鐘下降了61.9%(n=10,p<0.05)。停止注射后,His-PPP組出血時(shí)間逐漸緩慢回升,到第19天即注射停止后12天時(shí)出血時(shí)間方回復(fù)到注射前水平。
本發(fā)明不受上述具體文字描述的限制,本發(fā)明可在權(quán)利要求書所概括的范圍內(nèi)做各種改變。這些改變均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>百瑞全球有限公司(BioRight Worldwide Company Ltd.)<120>血小板增進(jìn)蛋白及其應(yīng)用<130>002FPI0003C1<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>993<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1atgggcggag agcaggagga ggagcggttc gacggcatgt tgctggccat ggctcagcag 60cacgagggcg gcgtgcagga gcttgtgaac accttcttca gcttccttcg acgcaaaaca120gactttttca ttggaggaga agaagggatg gcagagaagc ttatcacaca gactttcagc180caccacaatc agctggcaca gaagacccgg cgggagaaga gagcccggca ggaggccgag240cggcgggaga aggcggagcg ggcggccaga ctggccaagg aagccaagtc agagacctca300gggccccaga tcaaggagct aactgatgaa gaggcagaga ggctgcagct agagattgac360cagaaaaagg atgcagagaa tcatgaggcc cagctcaaga acggcagcct tgactcccca420gggaagcagg atactgagga agatgaggag gaagatgaga aggacaaagg aaaactgaag480cccaacctag gcaacggggc agacctgccc aattaccgct ggacccagac cctgtcggag540ctggacctgg cggtcccttt ctgtgtgaac ttccggctga aagggaagga catggtggtg600gacatccagc ggcggcacct ccgggtgggg ctcaaggggc agccagcgat cattgatggg660gagctctaca atgaagtgaa ggtggaggag agctcgtggc tcattgagga cggcaaggtg720gtgactgtgc atctggagaa gatcaataag atggagtggt ggagccgctt ggtgtccagt780
gaccctgaga tcaacaccaa gaagattaac cctgagaatt ccaagctgtc agacctggac840agtgagactc gcagcatggt ggaaaagatg atgtatgacc agcgacagaa gtccatgggg900ctgccaactt cagacgaaca gaagaaacag gagattctga agaagttcat ggatcaacat960ccggagatgg atttttccaa ggctaaattc aac 993<210>2<211>331<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Gly Gly Glu Gln Glu Glu Glu Arg Phe Asp Gly Met Leu Leu Ala1 5 10 15Met Ala Gln Gln His Glu Gly Gly Val Gln Glu Leu Val Asn Thr Phe20 25 30Phe Ser Phe Leu Arg Arg Lys Thr Asp Phe Phe Ile Gly Gly Glu Glu35 40 45Gly Met Ala Glu Lys Leu Ile Thr Gln Thr Phe Ser His His Asn Gln50 55 60Leu Ala Gln Lys Thr Arg Arg Glu Lys Arg Ala Arg Gln Glu Ala Glu65 70 75 80Arg Arg Glu Lys Ala Glu Arg Ala Ala Arg Leu Ala Lys Glu Ala Lys85 90 95Ser Glu Thr Ser Gly Pro Gln Ile Lys Glu Leu Thr Asp Glu Glu Ala100105 110
Glu Arg Leu Gln Leu Glu Ile Asp Gln Lys Lys Asp Ala Glu Asn His115 120 125Glu Ala Gln Leu Lys Asn Gly Ser Leu Asp Ser Pro Gly Lys Gln Asp130 135 140Thr Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Glu Lys Asp Lys Gly Lys Leu Lys145 150 155 160Pro Asn Leu Gly Asn Gly Ala Asp Leu Pro Asn Tyr Arg Trp Thr Gln165 170 175Thr Leu Ser Glu Leu Asp Leu Ala Val Pro Phe Cys Val Asn Phe Arg180 185 190Leu Lys Gly Lys Asp Met Val Val Asp Ile Gln Arg Arg His Leu Arg195 200 205Val Gly Leu Lys Gly Gln Pro Ala Ile Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Asn210 215 220Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Ser Trp Leu Ile Glu Asp Gly Lys Val225 230 235 240Val Thr Val His Leu Glu Lys Ile Asn Lys Met Glu Trp Trp Ser Arg245 250 255Leu Val Ser Ser Asp Pro Glu Ile Asn Thr Lys Lys Ile Asn Pro Glu260 265 270Asn Ser Lys Leu Ser Asp Leu Asp Ser Glu Thr Arg Ser Met Val Glu275 280 285
Lys Met Met Tyr Asp Gln Arg Gln Lys Ser Met Gly Leu Pro Thr Ser290295 300Asp Glu Gln Lys Lys Gln Glu Ile Leu Lys Lys Phe Met Asp Gln His305 310 315 320Pro Glu Met Asp Phe Ser Lys Ala Lys Phe Asn325 330<210>3<211>35<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer<400>3ccggaattcc aagatgtctc cttgctggca tcaga35<210>4<211>32<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>4ccgctcgagt tatccgacca cgagctccag gg 32<210>5<211>32<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer
<400>5cgggatccgt acccgcatga tatgcagtag at 32<210>6<211>31<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>6ccgctcgagt tagcttggag ctaaggtgca t 3權(quán)利要求
1.一種分離的人源蛋白質(zhì),其特征在于,具有如下氨基酸序列MGGEQEEERF DGMLLAMAQQ HEGGVQELVN TFFSFLRRKT DFFIGGEEGMAEKLITQTFS HHNQLAQKTR REKRARQEAE RREKAERAAR LAKEAKSETSGPQIKELTDE EAERLQLEID QKKDAENHEA QLKNGSLDSP GKQDTEEDEEEDEKDKGKLK PNLGNGADLP NYRWTQTLSE LDLAVPFCVN FRLKGKDMVVDIQRRHLRVG LKGQPAIIDG ELYNEVKVEE SSWLIEDGKV VTVHLEKINKMEWWSRLVSS DPEINTKKIN PENSKLSDLD SETRSMVEKM MYDQRQKSMGLPTSDEQKKQ EILKKFMDQH PEMDFSKAKF N;或其具有提升體內(nèi)血小板數(shù)量功能的衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的蛋白質(zhì),其特征在于,在所述的氨基末端還具有2-6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的蛋白質(zhì),其特征在于,所述的氨基酸序列由如下核苷酸序列編碼atgggcggagagcaggaggaggagcggttcgacggcatgttgctggccatggctcagcagcacgagggcggcgtgcaggagcttgtgaacaccttcttcagcttccttcgacgcaaaacagactttttcattggaggagaagaagggatggcagagaagcttatcacacagactttcagccaccacaatcagctggcacagaagacccggcgggagaagagagcccggcaggaggccgagcggcgggagaaggcggagcgggcggccagactggccaaggaagccaagtcagagacctcagggccccagatcaaggagctaactgatgaagaggcagagaggctgcagctagagattgaccagaaaaaggatgcagagaatcatgaggcccagctcaagaacggcagccttgactccccagggaagcaggatactgaggaagatgaggaggaagatgagaaggacaaaggaaaactgaagcccaacctaggcaacggggcagacctgcccaattaccgctggacccagaccctgtcggagctggacctggcggtccctttctgtgtgaacttccggctgaaagggaaggacatggtggtggacatccagcggcggcacctccgggtggggctcaaggggcagccagcgatcattgatggggagctctacaatgaagtgaaggtggaggagagctcgtggctcattgaggacggcaaggtggtgactgtgcatctggagaagatcaataagatggagtggtggagccgcttggtgtccagtgaccctgagatcaacaccaagaagattaaccctgagaattccaagctgtcagacctggacagtgagactcgcagcatggtggaaaagatgatgtatgaccagcgacagaagtccatggggctgccaacttcagacgaacagaagaaacaggagattctgaagaagttcatggatcaacatccggagatggatttttccaaggctaaattcaac。
4.一種質(zhì)粒,其特征在于,包含編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述蛋白質(zhì)氨基酸序列的核苷酸序列的DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒,其為表達(dá)載體pET-PPP。
6.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述蛋白質(zhì)用于制備治療血小板減少癥的藥物或用于制備促進(jìn)止血的藥物的用途。
7.權(quán)利要求6所述的用途,其特征是所述藥物為注射劑、粉劑、片劑、膠囊劑、溶液、懸浮劑、乳劑。
8.權(quán)利要求6所述的用途,其特征是所述藥物的給藥途徑可為口服、經(jīng)皮、靜脈或肌肉注射。
9.一種藥物組合物,其含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其具有提升體內(nèi)血小板數(shù)量功能的衍生物;以及藥學(xué)上可以接受的載體。
10.一種治療血小板減少癥的方法,其特征在于包括給予患有血小板減少癥的患者有效量的權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或在患者體內(nèi)表達(dá)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明披露一種與血小板生成素受體(MPL)有強(qiáng)親和性的蛋白及其核苷酸編碼序列。該蛋白具有提升體內(nèi)血小板數(shù)量和加速血液凝結(jié)等功能,因而將本發(fā)明的蛋白稱為血小板增進(jìn)蛋白(Platelet Promoting Protein,簡稱PPP)。本發(fā)明的蛋白或核苷酸序列可以用于治療人體血小板減少癥等疾病。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1754886SQ20041008029
公開日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者徐培林, 葛怡琛, 楊燕 申請(qǐng)人:百瑞全球有限公司