專利名稱：抑制慢性粒細胞白血病中stat5活性的誘騙寡核苷酸及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及誘騙寡核苷酸及其應用，尤其是信號轉導子和轉錄激活子5(以下簡稱STAT5)誘騙寡核苷酸及其在制備治療慢性粒細胞白血病藥物中的應用。
背景技術：
慢性粒細胞白血病(以下簡稱CML)的發(fā)生是由于t(9；22)(q34；qll)所致的BCR/ABL融合基因編碼產(chǎn)生了具有強烈酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白，該蛋白導致血細胞的異常增殖和惡性轉化，但細胞惡性轉化的具體機制還不甚清楚。大量資料顯示，這與BCR/ABL酪氨酸激酶激活細胞內一些重要信號傳導分子如PI3K(Phosphatidylinositol-3kinase)、Ras(Renin-angiotensin system)、STAT(Signal transducer and activator of transcription)等有關。其中，STAT5在BCR/ABL轉化細胞過程中的作用越來越為人們所重視。
信號轉導子和轉錄激活子(簡稱STAT)蛋白家族包括七個成員STAT1-6，其中STAT5又分為STAT5a和STAT5b兩種組分(到目前為止，未發(fā)現(xiàn)兩者在DNA結合特異性上有任何區(qū)別)。它們在正常細胞內既能將胞外信號傳遞至核內，又能啟動相關基因表達，在細胞的增殖、分化和凋亡等生理過程中起重要作用。其中STAT3、STAT5的異常激活與細胞惡性轉化有密切關系，但在CML中未見有STAT3激活的報道。有資料顯示在CML細胞中，BCR/ABL融合蛋白可以直接持續(xù)(組成型)激活胞漿中的游離STAT5單體，使其磷酸化并形成二聚體，轉入核內與靶基因上相應的序列結合，從而啟動靶基因表達?，F(xiàn)在所知，抗凋亡蛋白Bcl-xL、癌蛋白c-Myc、細胞周期促進因子CyclinD1蛋白等基因的啟動子上有STAT5特異性結合序列，都可能被STAT5反式激活而異常表達。這些效應蛋白一方面促進細胞周期進展，另一方面抑制細胞凋亡，在細胞惡性轉化過程中起關鍵性作用?？梢姡M成型激活的STAT5在BCR/ABL癌蛋白與Bcl-xL、c-Myc等癌蛋白之間起著重要的中介作用。
CML的治療方法中，傳統(tǒng)的放、化療療效差且副作用大，最有效的方法是異基因造血細胞移植術，但由于供者有限及受病人年齡等條件限制，現(xiàn)在西方國家中接受該法治療者僅占初診病人的5％，我國的這一比例則更低。目前，針對BCR/ABL融合基因及其蛋白進行靶點治療是國內外CML研究的熱點，如針對BCR/ABL融合基因的反義寡核苷酸和核酶的應用以及蛋白酪氨酸激酶特異性抑制劑STI571的開發(fā)等。但這些方法都各有其不足反義寡核苷酸和核酶抑瘤效果不穩(wěn)定且難以應用于體內；而STI571的應用可使部分病人產(chǎn)生耐藥性和潛在的骨髓抑制、淋巴細胞功能損害等問題。另外，有體外實驗資料顯示隨著時間的進展和突變的積累，被抑制的BCR/ABL下游信號通路會重新激活，表現(xiàn)在細胞由BCR/ABL依賴性生長轉變?yōu)锽CR/ABL非依賴性生長。這都說明僅針對BCR/ABL進行靶點治療有其局限性。因此，為了對CML進行根治性綜合治療，從BCR/ABL致細胞轉化的機理入手，尋找新的治療靶點和治療方法有重要的現(xiàn)實意義。
轉錄因子誘騙(transcription factor decoy)策略是近年發(fā)展起來的一種阻斷基因轉錄的有效方法。其原理是體外合成一段8-30bp經(jīng)修飾的雙鏈脫氧寡核苷酸，大量轉染細胞后，競爭性抑制特定轉錄因子與基因組DNA序列上的相應順式元件結合，從而達到阻止靶基因轉錄的目的。現(xiàn)主要用于心血管疾病、病毒感染性疾病以及腫瘤等的基因治療研究。該策略有操作簡單，易于進行體內實驗和效應明顯等優(yōu)點。并且有資料顯示，該策略對癌細胞抑制作用明顯，但對正常細胞影響甚微，具有良好的應用前景。
目前，現(xiàn)有技術中尚沒有用于治療慢性粒細胞白血病的STAT5誘騙寡核苷酸藥物。

發(fā)明內容
鑒于目前現(xiàn)有慢性粒細胞白血病靶點治療技術的缺陷，本發(fā)明的目的之一是提供一種以STAT5為靶點的治療慢性粒細胞白血病的誘騙寡核苷酸。
本發(fā)明的目的之二是提供上述STAT5活性誘騙寡核苷酸在制備治療慢性粒細胞白血病藥物中的應用。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，根據(jù)文獻(Ehret GB，et al.DNA BindingSpecificity of Different STAT Proteins.Comparison of in vitro specificity withnatural target sites.J.Biol.Chem，2001，2766675-6688.以及Soldaini E，et al.DNA Binding Site Selection of Dimeric and Tetrameric Stat5Proteins Revealsa Large Repertoire of Divergent Tetrameric Stat5a Binding Sites.Mol.Cell.Biol.2000，20389-401.)結合我們的前期實驗結果設計合成以STAT5為治療靶點抑制慢性粒細胞白血病的誘騙寡核苷酸，其序列為5′-AGATTTCTAGGAATTCAAATC-3′3′-TCTAAAGATCCTTAAGTTTAG-5′；所述兩條誘騙寡核苷酸鏈須等摩爾混合退火成雙鏈。
所述序列進行硫代修飾。
上述STAT5誘騙寡核苷酸用于制備治療慢性粒細胞白血病的藥物，可以將體外合成經(jīng)修飾的雙鏈脫氧寡核苷酸(Decoy ODNs)，大量轉染細胞后，競爭性抑制特定轉錄因子與基因組DNA序列上的相應順式元件結合，從而阻止靶基因轉錄，達到抑制癌細胞生長的目的。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術中反義寡核苷酸和核酶以及蛋白酪氨酸激酶特異性抑制劑STI571相比具有如下優(yōu)點和特色1、它作用的靶點不同，因此可以作為CML綜合性治療的另一個候選藥物，可以單獨應用或與其他藥物聯(lián)合應用，增強治療效果、減少毒副作用。
2、它可以同時抑制相關轉錄因子下游的所有靶蛋白的表達，特異性好、效應明顯、技術成熟，如已有NF-kappa B、E2F等多個誘騙寡核苷酸藥物被美國FDA(Food and DrugAdministration，食品與藥品管理局)批準進入III期臨床實驗。
3、根據(jù)STAT5Decoy ODN的作用原理可知，它在其他STAT5異常激活的腫瘤，如前列腺癌等也有應用前景。
發(fā)明人以慢性粒細胞白血病K562細胞作為實驗模型，應用分子生物學、細胞生物學、實驗血液學、實驗動物學等方法，進行了一系列實驗，研究了STAT5誘騙寡核苷酸對K562細胞的抑制作用。
實驗方法
1.誘騙寡核苷酸(以下簡稱Decoy ODNs)設計與合成設計與STAT5結合的序列Decoy ODNs，將一致性序列(TTC...GAA)改變了2個堿基的序列做為突變序列寡核苷酸(以下簡稱Mutant ODNs)，經(jīng)GenBank檢索，未查到與其它基因有高度同源性。
Decoy ODNs5′-AGATTTCTAGGAATTCAAATC-3′3′-TCTAAAGATCCTTAAGTTTAG-5′Mutant ODNs5′-AGATTTGTAGCAATTCAAATC-3′3′-TCTAAACATCGTTAAGTTTAG-5′序列中劃線部分為突變序列。序列全硫代修飾，由上海博亞公司合成并純化。
合成的寡核苷酸(簡稱ODNs)用乙二胺四乙酸(簡稱TE)溶液溶解，配制成260μM。等摩爾混合，在聚合酶鏈反應(以下簡稱PCR)儀上退火形成雙鏈溫度從95℃逐漸降至25℃，每15分鐘降低5℃，歷時3小時。
2.細胞培養(yǎng)K562細胞系是慢粒白血病細胞株，第三軍醫(yī)大學基礎免疫教研室饋贈。K562細胞用含10％胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于含5％CO2的37℃恒溫孵箱中，常規(guī)換液傳代，實驗前24h換液，取生長期細胞做實驗。
3.誘騙核苷酸轉染試驗寡核苷酸和脂質體分別按照1∶4比例在兩管中以無血清1640中稀釋，靜置30min后將兩者輕輕混勻，靜置15min。加入以無血清1640洗滌并調整好細胞數(shù)的K562細胞懸液，輕輕混勻置37℃孵育4～6h，加入含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
4.生長曲線實驗取生長期細胞，洗滌后重懸于無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，調整細胞數(shù)為1×105/孔，使用5μM、15μM、25μM三種Decoy ODNs處理濃度，用脂質體轉染K562細胞，連續(xù)5天每天以臺盼藍染色后計數(shù)活細胞數(shù)目，每次計數(shù)重復3次，以平均值繪制生長曲線。
5.噻唑藍(簡稱MTT)實驗收集對數(shù)生長期的K562細胞，利用脂質體轉染，接種于96孔培養(yǎng)板，細胞終密度為2×104/孔，分別加入Decoy ODNs和Mutant ODNs序列，終濃度為5μM、15μM、25μM，每個濃度做3個平行孔，每孔總體系200μl，以脂質體處理而不加寡核苷酸的細胞孔做對照組，試劑空白以無血清RPMI-1640培養(yǎng)液補足。置37℃，含5％CO2孵箱中培養(yǎng)72小時，在每組的3個平行孔中加入四甲基偶氮唑藍(MTT，濃度為0.5mg/ml)，置37℃、含5％CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時，1000g離心10分鐘，小心棄去上清，加入二甲基亞砜200μl，振蕩5分鐘，用酶標儀在570nm處讀取吸光度值(A值)。細胞增殖抑制率＝(1-實驗組平均A值/對照組平均A值)×100％。
6.細胞周期測定以15μM Decoy ODNs處理1×106個K562細胞，24h后收集細胞，PBS洗兩次后，70％乙醇中固定過夜，上機前洗去乙醇，加入PCB溶液低滲處理室溫30分鐘，離心去上清，加入50μg/ml RNAseA消化30分鐘，再加入終濃度為50μg/ml的PI染液室溫避光孵育25分鐘，用流式細胞儀FCM檢測。結果見表1。
表1 DecoyODNs對K562細胞周期各期比例的影響(％)

*表示與未處理組比較P＜0.05**表示與其它兩組比較P＜0.05K562細胞的細胞周期分析結果表明Decoy ODNs處理細胞24h后，與未處理細胞和Mutant ODNs處理組的細胞相比，G0/G1期細胞比例增高，S期細胞比例下降，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示Decoy ODNs處理后阻滯了細胞周期由G0/G1期向S期推進。Mutant ODNs未明顯影響細胞周期進程。
7.Annexin-V/PI雙染法檢測凋亡調整K562細胞數(shù)為5×105/ml，加入15μM Decoy ODNs處理24小時后收集細胞，經(jīng)PBS洗兩次后，重懸于100μl反應緩沖液中，加入5μl Annexin V-FITC及10μl的PI，輕輕混勻，避光保存20min，加入200μl PI緩沖液，立即上FCM檢測。
8.反轉錄-聚合酶鏈反應(簡稱RT-PCR)
用Trizol試劑提取K562細胞的總RNA。定量后進行逆轉錄反應，PCR反應條件為c-myc94℃45秒，58.1℃1分鐘，30個循環(huán)，72℃10分鐘。
bcl-xL94℃45秒，67℃1分鐘，30個循環(huán)，72℃10分鐘。
cyclin D194℃45秒，58.1℃1分鐘，30個循環(huán)，72℃10分鐘。
GAPDH94℃45秒，58.1℃1分鐘，27個循環(huán)，72℃10分鐘。
反應結束后PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像儀上觀察結果并照相。
9.蛋白印跡提取K562細胞總蛋白并以Bradford法定量后進行SDS-PAGE電泳，積層膠濃度5％，分離膠濃度10％，以80V電泳，直至溴酚藍進入分離膠后以100V電壓繼續(xù)電泳約2小時。電泳結束后半干轉移15V轉移2小時。最后DAB試劑顯色。結果用掃描儀進行掃描，軟件分析灰度值，結果以目的條帶的灰度與內參條帶的灰度之比表示。
10.動物實驗五周齡的雌性Balb/c-nude裸小鼠(購于上海斯萊克實驗動物有限公司)，體重16-18g，在SPF(specific pathogen free)級層流飼養(yǎng)間以高壓滅菌食物和水飼養(yǎng)。為了增加K562細胞致瘤率，裸鼠先用Sli Precise直線加速器(Elekta公司，瑞典)行全身照射，每只裸鼠總劑量300cGy。取對數(shù)生長期的K562細胞用PBS洗滌2次，離心濃縮，調整密度為5×107/ml，在每只裸鼠的右腋下皮下注射0.2ml，繼續(xù)飼養(yǎng)。5天后，共有11只裸鼠右腋下長出水皰樣腫瘤，將其中10只隨機分為兩組Mutant ODN組5只，Decoy ODN組5只。隔天以游標卡尺測量瘤體的長徑與寬徑，并以公式V＝1/2×(a2×b)計算瘤體體積，其中V為體積(mm3)，a為寬徑(mm)，b為長徑(mm)。從第10天起每3天向瘤體內注射1次脂質體-ODN混合物(濃度同細胞周期實驗)，每次每只瘤體內注射0.1ml，共注射4次，22天時斷頸快速處死裸鼠，鈍性分離取出瘤體，稱重、照相后置液氮中保存。
11.統(tǒng)計學處理實驗獨立重復三次，結果用平均值±標準差表示，以SPSS10.0軟件分析，多組數(shù)據(jù)間用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗。


下面結合附圖對本發(fā)明及實驗結果進一步說明圖1顯示了Decoy ODNs對K562細胞生長曲線的影響；圖2顯示了Decoy ODNs和Mutant ODNs對K562細胞的抑制率；圖3顯示Annexin-V實驗檢測Decoy ODNs處理K562后細胞的凋亡。
圖4顯示Decoy ODNs處理對K562細胞bcl-xL、cyclin D1、c-myc mRNA的影響。
圖5顯示Decoy ODNs處理對K562細胞bcl-xL、cyclin D1、c-myc蛋白的影響。
圖6顯示了K562荷瘤裸鼠的腫瘤生長曲線。
圖7顯示了Decoy ODN對K562瘤體的抑制作用。
各圖中Decoy表示誘騙寡核苷酸處理組；Mutant表示突變寡核苷酸處理組；Control表示對照組；Cell number表示細胞數(shù)；Inhibition rate表示抑制率；目的基因/GAPDH表示不同的目的基因條帶與內參基因GAPDH條帶的灰度比值；目的蛋白/actin表示不同的目的蛋白條帶與內參蛋白actin條帶的灰度比值；bcl-xL表示抗凋亡蛋白Bcl-xL；c-myc表示癌蛋白c-myc；CyclinD1表示細胞周期素D1；Concentration表示寡核苷酸濃度；Tumor size表示腫瘤體積。
請看圖1，Decoy ODNs對K562細胞生長的抑制隨Decoy ODNs濃度的增大而增大。由生長曲線看出，5μM濃度對K562細胞的生長抑制不明顯；而15μM DecoyODNs對K562細胞有明顯抑制生長作用，處理后K562細胞數(shù)僅有緩慢的增長；25μM處理濃度明顯抑制了K562細胞生長。
請看圖2，5μM Decoy ODNs處理3d后對K562細胞的抑制率為15％，15μM處理濃度抑制率達到51％，25μM處理濃度抑制率達82％。說明了Decoy ODNs對K562細胞的增殖抑制呈劑量依賴性，濃度越高，抑制作用也越明顯。Mutant ODNs也隨著濃度的增大對K562細胞的抑制增強，但在與相同濃度Decoy ODNs比較，抑制率明顯低下，5μM為6％，15μM為10％，25μM為18％。
請看圖3橫坐標FL1代表FITC標記的Annexin-V熒光強度，縱坐標代表PI強度。依據(jù)FL1及FL2將FCM分成4各區(qū)，LL代表活細胞，LR代表早期凋亡細胞，UR、UL代表晚期凋亡和死細胞。圖3a，未處理組大部分細胞都是活細胞，早期凋亡細胞只有1.32±0.53％。圖3b，Decoy ODNs轉染K562細胞24h后即有14.57±1.08％早期凋亡細胞。圖3c，Mutant ODNs基本上不影響K562細胞的凋亡，早期凋亡細胞只有4±2.02％。
請看圖4Decoy ODNs轉染K562細胞24h，收集細胞做RT-PCR，bcl-xL、cyclinD1、c-myc mRNA在Decoy ODNs處理后表達下調，經(jīng)密度分析后，以各目的條帶和內參GAPDH的密度相比，bcl-xL下降了54.04％，cyclin D1下降了45.30％，c-myc下降了53.60％。
請看圖5Decoy ODNs處理48h后，bcl-xL、cyclin D1、c-myc蛋白表達水平都不同程度下調。將各目的條帶與內參actin的灰度相比，Decoy ODNs作用48h后，bcl-xL下降36.58％、cyclinD1下降了31.04％、c-myc下降了49.70％。
圖6中，圖中數(shù)值為代表性腫瘤三次體積測定值±SD，可見與Mutant ODN組相比，Decoy ODN組腫瘤體積明顯受到抑制(P＜0.05)。
圖7中上行為Mutant ODN組瘤體，下行為Decoy ODN組，稱重后發(fā)現(xiàn)，Decoy ODN組腫瘤重量明顯低于Mutant ODN組(P＜0.05)。
實驗結果表明1、STAT5誘騙寡核苷酸可以有效抑制體外培養(yǎng)的K562細胞生長增殖。
2、STAT5誘騙寡核苷酸對K562細胞的抑制作用主要是通過抑制細胞周期進展和促進細胞凋亡而發(fā)揮作用的。
3、STAT5誘騙寡核苷酸對K562細胞的抑制作用在一定濃度范圍內呈濃度依賴性。
4、STAT5誘騙寡核苷酸可以有效抑制實驗動物模型中K562細胞所致實體瘤的生長。
5、STAT5誘騙寡核苷酸在體內體外均能抑制慢性粒細胞白血病K562細胞的生長增殖，為STAT5誘騙寡核苷酸在制備臨床治療慢性粒細胞白血病藥物中的應用提供了充分的實驗依據(jù)。
具體實施例方式
分別合成5′-AGATTTCTAGGAATTCAAATC-3′3′-TCTAAAGATCCTTAAGTTTAG-5′兩條鏈，均經(jīng)過全硫代修飾，等摩爾混合，在PCR儀上從95℃緩慢降至25℃退火形成雙鏈的STAT5誘騙寡核苷酸。上述STAT5誘騙寡核苷酸用于制備治療慢性粒細胞白血病的藥物，誘騙寡核苷酸的濃度為5～25μmol/L。
權利要求
1.一種抑制慢性粒細胞白血病中STAT5活性的誘騙寡核苷酸，其序列為5′-AGATTTCTAGGAATTCAAATC-3′3′-TCTAAAGATCCTTAAGTTTAG-5′；所述兩條誘騙寡核苷酸鏈須等摩爾混合退火成雙鏈。
2.根據(jù)權利要求1所述的抑制慢性粒細胞白血病中STAT5活性的誘騙寡核苷酸，其特征在于所述序列進行硫代修飾。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的抑制慢性粒細胞白血病中STAT5活性的誘騙寡核苷酸，其特征在于所述STAT5誘騙寡核苷酸在制備治療慢性粒細胞白血病藥物中的應用。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述STAT5誘騙寡核苷酸的終濃度為5～25μmol/L。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種抑制慢性粒細胞白血病中STAT5活性的誘騙寡核苷酸及其應用，該誘騙寡核苷酸的序列為5′－AGATTTCTAGGAATTCAAATC－3′3′－TCTAA AGATCCTTAAGTTTAG－5′；所述兩條誘騙寡核苷酸鏈須等摩爾混合退火成雙鏈，并進行硫代修飾。將該STAT5誘騙寡核苷酸用于制備治療慢性粒細胞白血病的藥物，可以把體外合成經(jīng)修飾的雙鏈脫氧寡核苷酸(Decoy ODNs)，大量轉染細胞后，競爭性抑制特定轉錄因子與基因組DNA序列上的相應順式元件結合，從而阻止靶基因轉錄，達到抑制癌細胞生長的目的。
文檔編號A61P35/02GK1769447SQ20041008122
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月5日 優(yōu)先權日2004年11月5日
發(fā)明者王小中, 馮文莉, 史梅, 曾建明 申請人:重慶醫(yī)科大學