專利名稱：針對(duì)活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素IP10－DT390的質(zhì)粒及制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)以IP10為導(dǎo)向分子，白喉毒素的活性片段DT390為毒素分子，特異攻擊并殺傷活化的Th1細(xì)胞的新型重組免疫毒素質(zhì)粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
免疫毒素(Immunotoxins，ITs)是將生物毒素與抗體或細(xì)胞因子連接起來的導(dǎo)向藥物，又稱作生物導(dǎo)彈或?qū)蚨舅?。第一代免疫毒素是將載體與毒素分子通過化學(xué)偶聯(lián)而成，這類免疫毒素具有穩(wěn)定性差、分子量大、免疫原性強(qiáng)、滲透性差、療效較差等缺點(diǎn)，且難以大規(guī)模生產(chǎn)，因而限制了其應(yīng)用。隨著基因工程重組技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，將載體基因與毒素基因融合，經(jīng)表達(dá)及純化制備獲得重組免疫毒素。這種新工藝產(chǎn)生的嵌合免疫毒素穩(wěn)定性強(qiáng)，滲透性好，具有較好的導(dǎo)向特異性，且制備方法簡(jiǎn)單易行，可短期內(nèi)大量制備，在很大程度上彌補(bǔ)了第一代免疫毒素穩(wěn)定性差、半衰期短、免疫原性強(qiáng)等不足。極大地推動(dòng)了免疫毒素在相關(guān)領(lǐng)域的深入研究。免疫毒素在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，大都集中于對(duì)某些惡性腫瘤及與免疫相關(guān)的人類疾病的導(dǎo)向治療。迄今FDA批準(zhǔn)的分子靶向藥物(molecularly targeted agent)如Herceptin，Rituximab，ZD1839(Iressa)以及目前風(fēng)靡全球的STI571(Gleevec)成功地對(duì)那些常規(guī)療法無效的腫瘤患者顯現(xiàn)出驚人的療效。其中，白喉毒素與白細(xì)胞介素2重組的免疫毒素(ONTAC)業(yè)已問世，用于成人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的治療(見Foss FM.Clin Lymphoma，2000，1(2)110-116.)。以T細(xì)胞為靶細(xì)胞的免疫毒素在治療T細(xì)胞性自身免疫性疾病及移植物抗宿主疾病(GvHD)也取得了良好療效(見Hu HZ，et al.Cell Immunol.1997，17726；Brenner T，etal.Immùnol.lett.1999，68403；Kreitman RT，et al.Expert Opinion on PharmacoTherapy.1(6)1117-29，2000 Sep.)。基礎(chǔ)免疫學(xué)的研究進(jìn)展表明，自身免疫性疾病中識(shí)別自身抗原的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，主要是CD4+Th1細(xì)胞，而CD4+Th2則具有一定的調(diào)節(jié)作用(見Liblau RS，et al.Immunol.Today；1995，1634；Costa GL，et al.J.Immunol.2000，1643581)。在治療T細(xì)胞性自身免疫性疾病及移植物抗宿主疾病時(shí)，這些免疫毒素的作用靶點(diǎn)主要是選擇針對(duì)T細(xì)胞表面抗原或細(xì)胞因子受體，如CD3、CD4、CD5、IL-2等，在接受這些免疫毒素的治療后，相應(yīng)的自身免疫性疾病或GvHD病情雖有緩解，但出現(xiàn)較顯著毒副作用，有時(shí)使臨床治療被迫終止。這些毒副作用的主要原因之一是由于這類免疫毒素所選擇的導(dǎo)向分子特異性欠佳，往往導(dǎo)致無選擇性地殺死所有T細(xì)胞，可能會(huì)造成免疫應(yīng)答的普遍抑制。許多細(xì)胞因子和激素的受體在活化的自身反應(yīng)性細(xì)胞表面呈特征性分布，因此可利用其配體作為重組免疫毒素的載體。目前為止，已有許多細(xì)胞因子被利用來作免疫毒素的載體，如RFT5.dgA(CD25R)、Ki-4.dgA(CD30R)、BL22(CD22R)、IL-10等(見Kreitman RJ，et al.Bailliere′s Best Practice in ClinicalHaematology.16(1)117-33，2003 Mar；Hutchings A，et al.Transplant Immunology.11(3-4)335-44，2003 Jul-Sep.Schnell R，et al.Annals of Oncology.14(5)729-36，2003 May)，以此來構(gòu)建的重組免疫毒素均具有特異性細(xì)胞毒效應(yīng)可治療自身免疫性疾病。自身免疫性疾病(autoimmune disease)是由于各種原因?qū)е旅庖呦到y(tǒng)對(duì)自身抗原反應(yīng)，造成自身組織損傷和功能障礙的一大類疾病。目前的治療措施主要是采用各種非特異的免疫抑制劑，但往往使患者免疫系統(tǒng)受到普遍性抑制而導(dǎo)致感染、腫瘤的發(fā)生及骨髓抑制等，而且不能有效地防止疾病的復(fù)發(fā)。因而促使相關(guān)領(lǐng)域的研究者從免疫治療的角度，尋求一種特異、安全、有效的治療方法如TCR阻斷法、細(xì)胞因子治療、MHC阻斷法、CD4分子阻斷法、T細(xì)胞接種以及口服抗原誘導(dǎo)耐受等等，但這些方法或因特異性不高、療效不穩(wěn)定，或因技術(shù)難度大、難以克服的毒副作用等而不能順利地過渡到臨床(見Waldor MK，et al.Science.1985，227415；Chen Y，et al.Nature.1995，376177；Weiner HL，Immunology Today.1997，18355；Hollday SD，etal.Environmental HealTh Perspectives.108 Suppl 3463-73，2000 Jun；PalmisanoGL，et al.Clinical & Experimental Immunology.135(2)259-66，2004 Feb)，因而自身免疫性疾病的治療至今仍然是困擾臨床的一大難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種新型的特異攻擊Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)粒，為臨床治療自身免疫性疾病提供一種新方案，為重組免疫毒素的應(yīng)用開辟一條新途徑。
本發(fā)明所述的針對(duì)活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)粒含有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。此種質(zhì)粒由IP10 cDNA堿基序列(來自gene bank)插入含有白喉毒素的活性片段DT390 cDNA堿基序列(來自gene bank)的SRα真核質(zhì)粒中用連接酶連接而成，可表達(dá)特異性的重組免疫毒素IP10-DT390。以IP10為導(dǎo)向分子、以白喉毒素的活性片段DT390為毒素分子，具有特異攻擊并殺傷活化的Th1細(xì)胞的特性。IP10是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答的過程中，活化的T細(xì)胞將表達(dá)多種受體，如細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的受體以及多種化學(xué)趨化因子CCR-5，CXCR-3等的受體。這些T細(xì)胞的膜受體中，現(xiàn)已證實(shí)IP10受體的表達(dá)僅限于活化的Th1細(xì)胞，而Th2細(xì)胞沒有表達(dá)，并且這種膜受體的表達(dá)穩(wěn)定和持續(xù)(見Falko R.，et al.Journal ofNeuroimmunology 2000，110195-208；Gizi W.，et al.The Journal of Immunology2002，1685885-5892)，因此，IP10受體不僅可以作為識(shí)別Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的標(biāo)志，也為相關(guān)的免疫治療提供了一個(gè)理想的靶位。本發(fā)明選用IP10為導(dǎo)向分子，白喉毒素的活性片段DT390為毒素分子，構(gòu)建IP10-DT390重組免疫毒素質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染體內(nèi)，表達(dá)重組免疫毒素，可特異攻擊并殺傷活化的Th1細(xì)胞，誘導(dǎo)自身免疫耐受，從而解決了原有免疫毒素特異性欠佳、需要提純的問題，實(shí)現(xiàn)有效治療自身免疫性疾病的目的。因此，本發(fā)明所述的針對(duì)活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)?？稍谥苽渲委熁蝾A(yù)防自身免疫性疾病的藥中應(yīng)用。
重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法依次包括以下步驟1、通過RT-PCR反應(yīng)，獲得IP10基因；2、將上述擴(kuò)增的IP10基因片段插入到含有DT390片段的SRα真核質(zhì)粒中，即構(gòu)建成重組質(zhì)粒。再轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)增，然后篩選出含有正確插入片段的克?。?、限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析，以保證重組質(zhì)粒中IP10插入片段的正確性；4、通過MTT法測(cè)定重組免疫毒素質(zhì)粒的表達(dá)活性。
上述制備方法中，構(gòu)建重組質(zhì)粒的載體除可選用SRα真核質(zhì)粒外，還可選用pSecTag2。限制性內(nèi)切酶可選用Sal I、Nco I及EcoR I。IP10基因用RT-PCR擴(kuò)增。
本發(fā)明所涉及的新型免疫毒素質(zhì)粒及其制備方法具有以下有益效果1.IP10-DT390重組免疫毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體內(nèi)，表達(dá)重組免疫毒素，其選擇新型細(xì)胞因子IP10為導(dǎo)向分子，由于IP10受體只表達(dá)在活化的Th1細(xì)胞表面，Th2細(xì)胞表面沒有表達(dá)，因而由IP10導(dǎo)向的重組免疫毒素只針對(duì)Th1細(xì)胞，從而使導(dǎo)向攻擊更特異、更有效，減少臨床治療自身免疫性疾病時(shí)的毒副作用。
2.毒素分子選用的是白喉毒素的活性片段DT390，是細(xì)菌毒素的跨膜結(jié)構(gòu)域和酶性結(jié)構(gòu)域，去除了DT分子的細(xì)胞結(jié)合區(qū)，可進(jìn)一步減少非特異性結(jié)合和降低不良反應(yīng)。
3.通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染活體肌肉細(xì)胞的方法，將免疫毒素(IP10-DT390)質(zhì)粒直接導(dǎo)入動(dòng)物肌肉，使免疫毒素(IP10-DT390)在骨骼肌內(nèi)高效表達(dá)而起到治療作用。
4.免疫毒素質(zhì)粒是通過DNA重組技術(shù)來獲得的，它可直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞而表達(dá)重組免疫毒素，勿需進(jìn)一步提純免疫毒素蛋白質(zhì)。同時(shí)避免了原來化學(xué)偶聯(lián)免疫毒素復(fù)雜的制備工藝和難以標(biāo)化的缺點(diǎn)，使其更易產(chǎn)業(yè)化。
5.免疫毒素IP10-DT390質(zhì)粒亦可用于移植排斥反應(yīng)及某些腫瘤的防治。


圖1是本發(fā)明所述針對(duì)活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素(IP10-DT390)質(zhì)粒的一種示意圖，真核質(zhì)粒載體為SRα；圖2是流式細(xì)胞儀測(cè)定IP10-DT390活化T、Th1、Th2和B細(xì)胞的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖3是轉(zhuǎn)染SRα-IP10-DT390的NIH3T3細(xì)胞上清對(duì)活化T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(MTT法)；圖4是IP10-DT390治療組與對(duì)照組臨床評(píng)分；圖5是治療組及未治療組小鼠的病理切片。
圖中，1-1-DT390、1-2-IP10、1-3-SRα真核質(zhì)粒、3-1-轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清(48h)、3-2-轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清(24h)、3-3-非轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清、4-1-未治療組、4-2-治療組、5-1-未治療組小鼠第一室管膜周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)40×、5-2-未治療組小鼠腦膜血管周淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)40×、5-3-未治療組小鼠腦組織疏松化40×、5-4-對(duì)照組小鼠大腦組織20×、5-5-治療組小鼠腦組織疏松化減輕40×、5-6-治療組小鼠腦膜血管炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少20×具體實(shí)施方式
實(shí)施例1重組免疫毒素真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建載體選用含有DT390的SRα真核質(zhì)粒(由美國Wisconsin大學(xué)PhD.Hu Huaizhong提供，invitrogen公司)，具體步驟如下1、小鼠IP10基因的預(yù)處理(以下試劑均購于promega公司)(1)用Trizol試劑按以下步驟提取小鼠肝總RNA1)小鼠肝組織100mg。
2)加1mlTrizol。
3)勻漿。
勻漿要徹底，后轉(zhuǎn)至EP管，組織勻漿量＞100mg時(shí)分裝，1ml/每EP管。
4)顛倒混勻10下，室溫5分鐘。
5)加氯仿1/5體積(0.2ml，必須按總體積的1/5)。
6)顛倒混勻10下，室溫5分鐘。
7)離心12000g，4℃，15分鐘。
8)轉(zhuǎn)上層水相(約400μl)于另一1.5mlEP管中。
9)加等體積異丙醇(約400μl)，混勻室溫10分鐘10)離心12000g，4℃，10分鐘。
11)棄上清12)加冰預(yù)冷的75％乙醇(用DEPC水配)1ml。
13)離心7500g，4℃，5分鐘。
14)棄上清，空氣干燥5-10分鐘(不能完全干燥)15)溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)(可在55-60℃水中，＜10分鐘，助溶)(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)依次按以下步驟進(jìn)行1)按下表配備試劑(稀釋10倍后用)。
試劑 濃度(μg/μl) 體積(μl)RNA11.5Oligo(dT)150.0522)混勻，離心，70℃，5min。
3)立即冰水浴，稍離心。
4)按下表配備試劑試劑濃度 體積(μl)終濃度M-MLV Buffer5× 4 1×dNTP10mM 1 0.5mMRNasin 40U/μl 0.5 20UM-MLV 200U/μl 1 200UddH2O 13.55)混勻，離心，42℃，60min。
6)95℃，10min(破壞MLV)。
7)4℃保存(3)cDNA的PCR反應(yīng)1)反應(yīng)體系如下表試劑 濃度 體積(μl)Taq Buffer 10×2MgCl225mM 1.2dNTP 10mM 0.2上游引物 12.5pmol/μl 0.5下游引物 12.5pmol/μl 0.5cDNA模板2ddH2O 13.3Taq酶 2.5U/μl 0.32)PCR擴(kuò)增的引物上游5′-CAT GCC ATG GAT CCC TCT CGC AAG GAC GGT C-3′下游5′-CCG GAA TTC TTA AGG AGC CCT TTT AGA CCT-3′PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性3min，94℃變性35sec、58℃復(fù)性30sec、72℃延伸55sec，34個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。
(4)擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳分析2、重組免疫毒素SRα真核表達(dá)質(zhì)粒的預(yù)處理(1)用限制性內(nèi)切Nco I及EcoRI雙酶切SRα真核質(zhì)粒，反應(yīng)體積20μl(其中含有Nco I酶1μl、EcoRI酶1μl、10×NEbuffer2 2μl、SRα真核質(zhì)粒10μl、ddH2O 6μl)，37℃過夜(內(nèi)切酶均購自New England公司)；還可選用限制性內(nèi)切酶Sal I對(duì)SRα真核質(zhì)粒進(jìn)行酶切。
(2)反應(yīng)后用1％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈照射下，按膠回收試劑盒(購自O(shè)miga公司)的方法回收大片段。
3、IP10與SRα真核表達(dá)質(zhì)粒的連接及轉(zhuǎn)化
(1)將上述步驟中所獲得的載體片段及插入片段粗略定量后，按插入片段∶載體分子摩爾數(shù)比＝3～10∶1的連接反應(yīng)原則進(jìn)行連接實(shí)驗(yàn)；(2)反應(yīng)體系如下表，整個(gè)反應(yīng)過程在PCR儀中16℃過夜。連接反應(yīng)時(shí)應(yīng)分別設(shè)立無插入片段和無載體的對(duì)照管。使上述擴(kuò)增的IP10基因片段插入到含有DT390片段的SRα真核質(zhì)粒中，IP10基因片段與DT390片段通過Nco I酶切位點(diǎn)連接，與SRα真核質(zhì)粒通過EcoR I酶切位點(diǎn)連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒(結(jié)果見圖1)。連接酶可選用T4(T4DNAligase)。
試劑 體積(μl)ddH2O 1110×buffer 2IP102SRα 4T4DNA ligase1Total Volume20(3)將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化方法按《分子克隆操作指南》進(jìn)行，主要步驟如下A、取連接產(chǎn)物4μl加入感受態(tài)細(xì)胞30μl置于1.5ml Ep管中，陰性對(duì)照為感受態(tài)細(xì)胞30μl置于1.5ml Ep管中；B、置于冰上30min，每隔幾分鐘輕彈；C、42℃水浴30Sec；D、冰上放置3min；E、加0.3ml SOC培養(yǎng)基(10ml SOC+50μl 2mol/L Mgcl2)，置于冰上；F、37℃，250rpm振搖1小時(shí)；G、取50μl轉(zhuǎn)化細(xì)胞+5μl 0.1g/ml Amp，均勻涂布于含Amp的平板，置37℃孵箱培養(yǎng)過夜。
4、限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析，以保證重組質(zhì)粒中IP10插入片段的正確性。
5、IP10-DT390真核表達(dá)質(zhì)粒在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)
(1)在轉(zhuǎn)染前24h，將NIH3T3細(xì)胞(購自TaKaRa公司)接種于六孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞約1×106，置于37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)；(2)待細(xì)胞長(zhǎng)滿至約80-90％融合后，分別以SRα空質(zhì)粒及IP10-DT390 SRα質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞NIH-3T3，具體操作按Qiagen公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒中的說明書進(jìn)行；(3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后72h，收集細(xì)胞。將變性后的蛋白質(zhì)marker和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞裂解上清液在5％的濃縮膠和10％的分離膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳；(4)電泳完備后，將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，電轉(zhuǎn)移后的膜用封閉液(約10％的PBS脫脂奶粉)封閉處理2h，再加入IP10多克隆抗體應(yīng)用液作用1h，充分洗滌后再加入酶標(biāo)二抗兔抗羊IgG，作用1h。最后加底物顯色。
實(shí)施例2體外重組免疫毒素IP10-DT390的生物活性測(cè)定1、流式細(xì)胞儀測(cè)定其細(xì)胞毒性(1)在無菌操作臺(tái)上取小鼠脾臟，用RPMI1640培養(yǎng)基制成脾細(xì)胞懸液，與conA(10ug/ml)混合培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)3天后，加入上述轉(zhuǎn)染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/20、1/50稀釋的濃度，50μl/孔，各濃度設(shè)立三復(fù)孔；(3)繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定免疫毒素IP10-DT390分別對(duì)活化T、Th1、Th2細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞毒性(CD4+T細(xì)胞膜表面標(biāo)記；IFN-γTh1細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記；IL-4Th2細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記；CD19+B細(xì)胞膜表面標(biāo)記)；(4)流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示，T細(xì)胞及Th1細(xì)胞數(shù)目下降40％-60％，而對(duì)Th2及B細(xì)胞無此影響(如圖2所示)。由此表明重組免疫毒素IP10-DT390具有較好的靶向特異性。
2、轉(zhuǎn)染上清中IP10-DT390對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(MTT法)(1)效應(yīng)細(xì)胞的準(zhǔn)備6-8周齡，20g左右雌性C57BL/6小鼠眼球放血后處死，無菌解剖剝離脾臟，用注射器針芯輕壓脾組織，加入RPMI1640培養(yǎng)基，收集離心，獲得脾細(xì)胞的懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，常規(guī)接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含ConA的RPMI1640培養(yǎng)基(ConA終濃度為5μg/ml)，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時(shí)后，收集懸浮生長(zhǎng)被ConA激活的淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞(2)將收集的效應(yīng)細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μl/孔，再分別將收集的上述轉(zhuǎn)染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/20、1/50稀釋的濃度加入，50μl/孔，各濃度設(shè)立三復(fù)孔。
(3)于37℃，5％CO2孵箱中共同培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)后，分別取出培養(yǎng)板，每孔加20μl MTT(5μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，將培養(yǎng)板以1000轉(zhuǎn)/分離心5min，小心去除上清，每孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO)，充分混勻，37℃放置20min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值(波長(zhǎng)570nm)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞活性 (4)結(jié)果顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清對(duì)小鼠活化T細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞抑制效應(yīng)，共育48小時(shí)的抑制效應(yīng)高于24小時(shí)，且該抑制效應(yīng)具有劑量依賴關(guān)系，即隨著上清稀釋度的增加而抑制效應(yīng)隨之降低(結(jié)果見圖3)。
實(shí)施例3重組質(zhì)粒對(duì)自身免疫性疾病動(dòng)物模型EAE(experimental allergicencephalomyelitis)的初步治療效果1、EAE(Experimental Allergic Encephalomyelitis)動(dòng)物模型的建立根據(jù)常規(guī)方法用MBP免疫C57BL/6小鼠，建立EAE模型。
(1)用C57BL/6小鼠建立EAE動(dòng)物模型，將自提的MBP粗提液與FCA(內(nèi)含結(jié)核分枝桿菌5mg/ml)等體積混和，使用3ml注射器反復(fù)推拉成為油包水的乳劑，采用腹腔注射的方法。
(2)免疫劑量每只小鼠注射MBP∶FCA(1∶1)混和液0.4ml，百日咳桿菌菌液PBS(1∶50)混和液0.2ml(內(nèi)含百日咳桿菌0.6-1.8×106個(gè))。
(3)對(duì)照組每只小鼠腹腔注射百日咳桿菌菌液與PBS混和液0.2ml(內(nèi)含百日咳桿菌0.6-1.8×106個(gè))。
(4)免疫時(shí)間第1天、第7天免疫兩次。
2、重組質(zhì)粒對(duì)EAE模型的初步治療(1)用IP10-DT390重組質(zhì)粒對(duì)EAE動(dòng)物模型進(jìn)行治療試驗(yàn)治療時(shí)間在MBP免疫小鼠后第1天、第3天分別治療2次；治療方法使用陽離子脂質(zhì)體包被的IP10-DT390重組質(zhì)粒，采用試驗(yàn)小鼠大腿肌肉注射的方式；治療劑量50μg/只。
(2)觀察治療后治療組及未治療組的癥狀表現(xiàn)，根據(jù)臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分(Kono分級(jí)法)，具體為0分沒有任何臨床癥狀；1分動(dòng)物尾部無力；2分動(dòng)物尾部無力+前肢或后肢中等無力；3分前肢或后肢嚴(yán)重?zé)o力，人為翻身后不能恢復(fù)；4分肢體麻痹，人為翻身后不能恢復(fù)；5分瀕死狀態(tài)(有關(guān)結(jié)果如圖4所示)。
(3)處死動(dòng)物并取腦組織及骨髓做病理切片，經(jīng)HE染色后鏡下觀察病理改變(如圖5所示)。
結(jié)果顯示，動(dòng)物模型臨床評(píng)分顯示，其治療組與未治療組均有明顯差異(p＜0.05)。病理切片顯示，治療組與未治療組比較，小腦及脊髓脫髓鞘病變減輕；腦膜下及血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少?？傊瑒?dòng)物試驗(yàn)初步結(jié)果表明經(jīng)重組免疫毒素IP10-DT390質(zhì)粒治療后，EAE動(dòng)物模型的臨床癥狀有明顯緩解作用。
SEQUENCE LISTING<110>四川大學(xué)<120>針對(duì)活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素IP10-DT390的質(zhì)粒及制備方法與應(yīng)用<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1410<212>DNA<213>小鼠<400>1ggcgctgatg atgttgttga ttcttctaaa tcttttgtga tggaaaactt tgctagctac60cacgggacta aacctggtta tgtagattcc attcaaaaag gtatacaaaa gccaaaatct120ggtacacaag gaaattatga cgatgattgg aaagggtttt atagtaccga caataaatac180gacgctgcgg gatactctgt agataatgaa aacccgctct ctggaaaagc tggaggcgtg240gtcaaagtga cgtatccagg actgacgaag gttctcgcac taaaagtgga taatgccgaa300actattaaga aagagttagg tttaagtctc actgaaccgt tgatggagca agtcggaacg360gaagagttta tcaaaaggtt cggtgatggt gcttcgcgtg tagtgctcag ccttcccttc420gctgagggga gttctagcgt tgaatatatt aataactggg aacaggcgaa agcgttaagc480gtagaacttg agattaattt tgaaacccgt ggaaaacgtg gccaagatgc gatgtatgag540tatatggctc aagcctgtgc aggaaatcgt gtcaggcgat cagtaggtag ctcattgtca600tgcataaatc ttgattggga tgtcataagg gataaaacta agacaaagat agagtctttg660aaagagcatg gccctatcaa aaataaaatg agcgaaagtc cggccaaaac agtatctgag720gaaaaagcta aacaatacct agaagaattt catcaaacgg cattagagca tcctgaattg780tcagaactta aaaccgttac tgggaccaat cctgtattcg ctggggctaa ctatgcggcg840tgggcagtaa acgttgcgca agttatcgat agcgaaacag ctgataattt ggaaaagaca900
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權(quán)利要求
1.一種針對(duì)活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)粒，其特征在于將IP10 cDNA堿基序列片段插入含有白喉毒素DT390 cDNA堿基序列活性片段的SRa真核質(zhì)粒中用連接酶連接而成。
2.如權(quán)利要求1所述的針對(duì)活化Th1細(xì)胞的重組免疫毒素質(zhì)粒質(zhì)，其特征在于所說的連接酶選用T4連接酶。
3.一種權(quán)利要求1至2所述重組組免疫毒素質(zhì)粒的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟(1)將動(dòng)物的IP10基因進(jìn)行擴(kuò)增；(2)將上述擴(kuò)增的IP10基因片段插入到含有DT390片段的真核質(zhì)粒中構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)增，然后篩選出含有正確插入片段的克隆；(3)利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析，以保證重組質(zhì)粒中IP10插入片段的正確性。
4.如權(quán)利要求3所述的重組免疫毒素質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建重組質(zhì)粒選用的質(zhì)粒載體有SRα、pSecTag2。
5.如權(quán)利要求3或4所述的重組免疫毒素質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于限制性內(nèi)切酶選用SalI、NcoI及EcoRI。
6.如權(quán)利要求3或4所述的重組免疫毒素質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于IP10基因用RT-PCR擴(kuò)增。
7.權(quán)利要求1至2所述重組組免疫毒素質(zhì)粒在制備治療自身免疫系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1至2所述重組組免疫毒素質(zhì)粒在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1至2所述重組組免疫毒素質(zhì)粒在制備治療移植排斥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
通過基因工程技術(shù)構(gòu)建重組免疫毒素IP10－DT390的高效表達(dá)質(zhì)粒。它是一種特異針對(duì)活化Th1細(xì)胞的新型重組免疫毒素質(zhì)粒(IP10－DT390)，轉(zhuǎn)染入體內(nèi)后表達(dá)高度特異性的重組免疫毒素，以IP10為導(dǎo)向分子，白喉毒素的活性片段DT390為毒素分子，選擇了活化Th1細(xì)胞的特異性膜受體CXCR3(IP10受體)為靶點(diǎn)。該免疫毒素質(zhì)粒的制備方法包括重組質(zhì)粒的構(gòu)建、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的工程菌的制備等步驟。該質(zhì)粒表達(dá)的重組免疫毒素具有嚴(yán)格的靶向性，即通過IP10的導(dǎo)向作用特異攻擊活化的Th1細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性免疫耐受，從而避免了無選擇性地殺傷所有T細(xì)胞，特別適合于自身免疫性疾病和器官移植排斥反應(yīng)的防治，亦可應(yīng)用于某些腫瘤的治療。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1641035SQ20041008139
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2004年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月3日
發(fā)明者張 林, 陳文捷, 李虹, 賈怡, 李明遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:四川大學(xué)