專利名稱：抗eb病毒所致腫瘤多肽及其應用與制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗EB病毒所致腫瘤多肽的基因、重組質粒、多肽及其應用與制備方法。
背景技術：
惡性腫瘤是對人類健康的巨大威脅。全世界每年死于惡性腫瘤的患者約有七百萬人，其中中國就占了六分之一，惡性腫瘤已是我國第二位的死亡原因。由于其病因、發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)尚未闡明，故防治效果也不理想?，F(xiàn)有抗腫瘤藥物在腫瘤治療中占重要地位，雖然對一些腫瘤已取得一定的療效，但仍存在著對腫瘤細胞選擇性差，免疫抑制及不良反應多而嚴重，產生耐藥性等缺陷。
近年來腫瘤基礎和臨床研究取得很大的進展，其中開發(fā)新型抗腫瘤藥物最重要的努力方向之一就是發(fā)展特異殺傷腫瘤細胞的藥物。如果能找到一種腫瘤細胞的表面特異性標志物，也就是說這樣的表面特異性標志物只有腫瘤細胞才有，而正常細胞沒有，那么就可以發(fā)展出只攻擊腫瘤細胞，不攻擊正常細胞的安全型抗腫瘤藥物。
尋找腫瘤細胞表面特異性標志物的研究已進行了數(shù)十年，然而可供使用的細胞表面特異性標志物發(fā)現(xiàn)得并不多，因此該難點已成為開發(fā)特異殺傷腫瘤藥物的學術/技術瓶頸。
Epstein-Barr病毒(EB病毒)所致的非洲兒童惡性淋巴肉瘤、Hodgkin’s淋巴肉瘤和鼻咽癌細胞表面均帶有特異的EB病毒表面抗原，因此，EB病毒表面抗原就可以認為是該類腫瘤細胞的一種特異性標志物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種新型的抗EB病毒所致腫瘤多肽的基因、重組質粒、多肽，此種多肽能特異的殺滅實體腫瘤及轉移的腫瘤細胞，且不會傷害正常的細胞。本發(fā)明的再一目的是提供上述重組抗腫瘤多肽的制備方法。
本發(fā)明的技術方案如下將編碼誘導多肽的基因與大腸菌素基因可操作地連接，從而獲得表達重組抗腫瘤多肽的核苷酸序列。編碼誘導多肽的基因為序列表中SEQ ID NO.2(編碼序列號-2)或SEQID NO.4(編碼序列號-4)所述的核苷酸序列，上述編碼誘導多肽的核苷酸序列是以ATCCHB-168雜交瘤細胞的抗EB病毒包膜糖蛋白抗體重鏈CDR1區(qū)，CDR3區(qū)，CDR1-CDR2連接段和輕鏈CDR3區(qū)的基因為藍本構建而成。大腸菌素可選自能形成離子通道的大腸菌素E1，Ia，Ib，A，B和N，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，將上述誘導多肽的基因與大腸菌素Ia(SEQ ID NO.1)的羧基端基因連接而形成如序列表中SEQ ID NO.6(編碼序列號-6)和SEQ ID NO.8(編碼序列號-8)所述的核苷酸序列。
本發(fā)明所述重組質粒，是將如上所述的編碼誘導多肽的核苷酸序列經雙鏈寡聚核苷酸點突變技術插入大腸菌素的羧基端形成本發(fā)明的重組質粒。若選用大腸菌素Ia，則將編碼誘導多肽的核苷酸序列插入Ia基因的第626位氨基酸后而形成本發(fā)明的重組質粒。構建重組質粒的原始質粒pSELECTTM-1來自于Promega公司，其中裝載了大腸菌素Ia和Immunity蛋白基因，針對誘導多肽設計了6對引物，其序列見實施例1。利用雙鏈寡聚核苷酸點突變技術，按照Strategene公司藥箱操作獲得重組質粒。
本發(fā)明的又一方面，提供本發(fā)明所述抗腫瘤多肽的制備方法，將編碼誘導多肽的基因可操作地與大腸菌素基因連接獲得編碼重組抗腫瘤多肽的基因的重組質粒，將獲得的重組質粒轉染入大腸桿菌TG1工程菌中而獲得可產生重組抗腫瘤多肽的工程菌細胞。分離純化表達的多肽即獲得本發(fā)明所述的抗腫瘤多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.7(編碼序列號-7)和SEQ ID NO.9(編碼序列號-9)所述。
本發(fā)明所述多肽可在制備治療或預防EB病毒所致腫瘤的藥中應用?？梢酝ㄟ^將本發(fā)明中的多肽添加藥學上可接受的載體或賦形劑或可選的其它成分而制成適于臨床使用的藥物組合物。其機理是多肽中可與靶腫瘤細胞表面特異性標志物(EB病毒表達在靶腫瘤細胞膜上的EB病毒表面抗原)結合的誘導多肽誘導大腸菌素通道結構域到達靶腫瘤細胞膜附近，然后大腸菌素通道結構域的疏水區(qū)段插入靶腫瘤細胞膜中，進而大腸菌素通道結構域在靶腫瘤細胞膜上形成離子通道，使靶腫瘤細胞內容物泄漏而致腫瘤細胞死亡，從而達到殺死腫瘤細胞的目的。
本發(fā)明所述的抗腫瘤多肽相較于傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的優(yōu)點在于，其具有特異的靶向性，因而在治療過程中不會攻擊正常細胞，所以其毒性和不良反應遠低于傳統(tǒng)抗腫瘤藥物。再由于它是在腫瘤細胞膜上直接形成離子通道來殺傷腫瘤細胞，因此與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相較，腫瘤細胞對其產生耐藥性的概率要低得多1.在抗腫瘤多肽—離子通道造成泄漏而致腫瘤細胞死亡的這一較短時限內，腫瘤細胞較難以利用突變基因—蛋白表達方式來修復抗腫瘤多肽—離子通道在腫瘤細胞膜上造成的幾何缺損；2.嵌合在腫瘤細胞基因中的病毒基因是寄生的基因，因而腫瘤細胞內可能缺乏有效的寄生病毒基因反饋機制來及時有效的調整表達在腫瘤細胞膜表面病毒抗原的變異性，這樣在一個相對長的時限內，構建的引導多肽總是對該抗原保持著有效的結合效率，所以腫瘤細胞對本發(fā)明的抗腫瘤多肽產生耐藥性的概率較低。再由于它可在體液和血液中游動，因此它將是對抗轉移過程中腫瘤細胞的利器。需要特別說明的是，本發(fā)明實施例試驗顯示，它的殺腫瘤細胞效率比受試傳統(tǒng)抗腫瘤藥物高出數(shù)倍之多。


圖1是含有引導多肽基因和大腸菌素Ia基因的重組質粒pCHCEB1的結構示意圖。
圖2是含有引導多肽基因和大腸菌素Ia基因的重組質粒pCHCEB2的結構示意圖。
圖3為本發(fā)明所述抗腫瘤多肽對體外培養(yǎng)EB病毒所致惡性腫瘤細胞的殺傷效應圖，表明本發(fā)明所述多肽對EB病毒所致惡性腫瘤細胞表現(xiàn)出了最好的殺傷效應，圖中各組結果分別為對照組、抗腫瘤多肽1組(pCHCEB1質粒)、抗腫瘤多肽2組(pCHCEB2質粒)和抗金葡菌多肽組，各實驗組的藥物用量均為200μg/ml培養(yǎng)液；其中，a對照組，b抗腫瘤多肽1處理組，c抗腫瘤多肽2處理組，d抗金葡菌多肽處理組，e相差圖像fPI熒光染色圖像。
圖4為使用多重熒光染料觀察本發(fā)明所述抗腫瘤多肽對體外培養(yǎng)惡性腫瘤細胞(EB病毒陽性)、惡性腫瘤細胞(EB病毒陰性)和正常人體細胞的殺傷效應圖，圖中各組結果分別為對照組，抗腫瘤多肽1組(pCHCEB1質粒)和抗腫瘤多肽2組(pCHCEB2質粒)，各實驗組的藥物用量均為200μg/ml培養(yǎng)液；a Raji細胞(ATCC CCL-86)，EB病毒陽性的Burkitt’s淋巴肉瘤細胞，b ATCC CR1-2230，46歲男性愛滋病人(AIDS)惡性淋巴肉瘤細胞，EB病毒和Kaposi肉瘤病毒(HHV8)均陽性，c ATCC CRL-1648，EB病毒陰性的Burkitt’s淋巴肉瘤細胞，dATCC HepG 2，EB病毒陰性的人肝胚瘤細胞，e SMMC-7721，EB病毒陰性的人肝癌細胞，f3T3，EB病毒陰性的小鼠胚胎成纖維細胞，g ECV-304，EB病毒陰性的人靜脈內皮細胞，h對照組，i抗腫瘤多肽1處理組，j抗腫瘤多肽2處理組。
圖5為本發(fā)明抗腫瘤多肽對裸鼠體內由EB病毒所致人惡性淋巴瘤細胞長出的實體腫瘤的殺傷效應圖，圖中各組結果分別為對照組，抗腫瘤多肽1組(pCHCEB1質粒)和環(huán)磷酰胺組，給藥途徑為每日瘤旁注射，各實驗組的藥物用量抗腫瘤多肽1組為300μg/鼠/日，環(huán)磷酰胺組為100μg/鼠/日(按全國高等醫(yī)藥院校教材“藥理學”(第5版，金有豫主編，人民衛(wèi)生出版社，2002年)“抗惡性腫瘤藥”章401頁，人體治療4mg/kg/日標準劑量換算；a對照組，給藥后第1日，此時腫瘤已長到2×2mm大小，b對照組，給藥后第10日，腫瘤持續(xù)長大，c對照組，給藥后第20日，腫瘤持續(xù)長大，d抗腫瘤多肽1組，給藥后第1日，此時腫瘤已長到2×2mm大小，e抗腫瘤多肽1組，給藥后第10日，腫瘤尺寸未見增大，f抗腫瘤多肽1組，給藥后第20日，肉眼觀察已無實體腫瘤，g環(huán)磷酰胺組，給藥后第1日，此時腫瘤已長到2×2mm大小，h環(huán)磷酰胺組，給藥后第10日，腫瘤持續(xù)長大，i環(huán)磷酰胺組，給藥后第20日，腫瘤持續(xù)長大，且頂端可見紅腫，壞死。
圖6為圖5各組長腫瘤鼠藥物處理20日后取腫瘤標本的光鏡觀察圖，圖中各組結果分別為對照組，抗腫瘤多肽1組(pCHCEB1質粒)和環(huán)磷酰胺組；a對照組腫瘤標本HE染色，100x，b環(huán)磷酰胺組腫瘤標本HE染色，100x，c抗腫瘤多肽1組腫瘤標本1，HE染色，100x，d抗腫瘤多肽1組腫瘤標本2，HE染色，100x。
具體實施例方式
實施例1 表達抗腫瘤多肽的質粒的構建和重組抗腫瘤多肽的制備原始質粒為裝載了大腸菌素Ia和Immunity蛋白基因的pSELECTTM-1商用質粒(質粒大小8.3kb，UCSF Dr.P.Gosh贈予)，經雙鏈寡聚核苷酸點突變技術(QuickChangeTMKit，Strategene公司)將編碼誘導多肽的基因(序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所述核苷酸序列)插入到大腸菌素Ia基因的I626位點后，制備出了抗腫瘤多肽的兩種重組質粒pCHCEB1(如圖1所示)、pCHCEB2(如圖2所示)。重組質粒轉染入E.coli TG1工程菌(AECOM，Dr.K.Jakes贈予)里制備多肽，獲得序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所述的抗腫瘤多肽。其中，SEQ ID NO.7所述的抗腫瘤多肽由重組質粒pCHCEB1表達(在繼后的實施例中稱為“重組抗腫瘤多肽1”)，SEQ ID NO.9所述的抗腫瘤多肽由重組質粒pCHCEB2表達(在繼后的實施例中稱為“重組抗腫瘤多肽2”)。
突變程序按Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)藥箱手冊進行1、準備點突變反應物5ul 10x buffer2ul(10ng)野生型大腸菌素Ia質粒1.25ul(125ng)設計的5’-3’寡聚核苷酸引物1.25ul(125ng)設計的3’-5’寡聚核苷酸引物1ul dNTP雙蒸水50ul1ul pfu(除質粒，引物和雙蒸水外，均為藥箱所備試劑)
2、進行PCR擴增，擴增條件變性95℃，35秒，退火53℃，70秒，延伸68℃，17分共20個循環(huán)；3、加入Dpn1內切酶1ul消化母體DNA鏈后(37℃，1小時)，取1ul反應物與XL1-Blue感受態(tài)細胞50ul冰孵30分鐘，行熱沖擊42℃，45秒，再置入冰中2分鐘；4、加入NZY培基0.5ml后220rpm，37℃搖菌1小時后，取50-100ul反應物鋪板(LB培基加1％瓊脂加50ug/ml氨芐青霉素，37℃過夜)；5、18小時后挑菌，循Qiagene，Gibco等公司的各種商用提取質粒藥箱提取質粒均可，測序確定突變成功；6、將質粒50ng與制備的TG1工程菌感受態(tài)細胞50ul冰孵30分，42℃，90秒熱沖擊，取50-100ul反應物加入LB培基0.5ml，220rpm，37℃搖菌1小時后鋪板(LB培基加1％瓊脂加50ug/ml氨芐青霉素)37℃孵育，18小時后挑取菌落；7、大量增菌，8-16升FB培基，250rpm，37℃，6-8小時；離心沉淀菌體，4℃，6000g，20分鐘，取4℃，50mM硼酸緩沖液(2mM EDTA+2mM DTT)50-80ml懸浮菌體，加入0.2MPMSF 250微升后行超聲破碎(4℃，400W，2分鐘)，高速離心沉淀破碎菌體(4℃，75000g，1.5小時)，取上清加入硫酸鏈霉素500萬單位沉淀DNA，高速離心后(4℃，30000g，10分鐘)取上清裝入分子量15,000的透析袋于4℃，50mM硼酸緩沖液4升透析過夜后，高速離心后(4℃，30000g，10分鐘)將上清上樣于CM離子交換柱(4℃)，經0.1-0.3M NaCl+50mM硼酸緩沖液(4℃)梯度洗脫后即可得到重組抗腫瘤多肽。
制備上述質粒中誘導多肽基因所設計的寡聚核苷酸序列pCHCEB11、5’-3’(編碼序列號-10)gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGT CAG taa ata aaatat aag aca ggc3’-5’(編碼序列號-11)gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt attcgc2、5’-3’(編碼序列號-12)ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaatat aag aca ggc
3’-5’(編碼序列號-13)gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACC TTT CTC GGG GGC ctg acg cac ccaatg cat acc3、5’-3’(編碼序列號-14)aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc GGT CAG GGT TAC TCC TAC CCC TAC ACC taa ata aaa tat aagaca ggc3’-5’(編碼序列號-15)gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT GTA GGG GTA GGA GTA ACC CTG ACC ggc cac cca ctc cagacc tttpCHCEB21、5’-3’(編碼序列號-16)gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGT CAG taa ata aaatat aag aca ggc3’-5’(編碼序列號-17)gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt attcgc2、5’-3’(編碼序列號-18)ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaatat aag aca ggc3’-5’(編碼序列號-19)gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACC TTT CTC GGG GGC ctg acg cac ccaatg cat acc3、5’-3’(編碼序列號-20)aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc TGG GGT AAT TAC CCC CAT TAC GCC ATG GAT taa ata aaatat aag aca ggc3’-5’(編碼序列號-21)gcc tgt ctt ata ttt tat tta ATC CAT GGC GTA ATG GGG GTA ATT ACC CCA ggc cac cca ctccag acc ttt
實施例2重組抗腫瘤多肽對EB病毒所致人惡性淋巴肉瘤(Burkitt’s lymphoma)外殺傷用EB病毒陽性及陰性細胞株為美國ATCC標準細胞株。
細胞培養(yǎng)取出0.1ml復蘇培養(yǎng)的Raji細胞懸浮液，緩緩加入含3ml 1640液體培養(yǎng)基(加10％血清)的培養(yǎng)皿中(稀釋比例為1∶30)，混合均勻，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗使用一株EB病毒陽性細胞株ATCC CCL-86(即全世界細胞培養(yǎng)室使用的標準人Burkitt’s惡性淋巴肉瘤細胞，Raji細胞，1963年分離自12歲非洲男性患兒)。受試細胞共分4組，第一組為空白組，即加入重組抗腫瘤多肽空白保存液(10mMPB+0.2M NaCI磷酸鹽緩沖液(pH7.4))。第二組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽1(質粒為pCHCEB1，保存液為10mMPB+0.2M NaCI磷酸緩沖液pH7.4)。第三組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽2(質粒為pCHCEB2，保存液為10mMPB+0.2MNaCI磷酸緩沖液pH7.4)。第四組為加入200μg/ml的抗金葡菌多肽(保存液為10mM PB+0.2M NaCI磷酸鹽緩沖液pH7.4)。
細胞在培養(yǎng)24小時后，分別加入上述各組處理物于培養(yǎng)皿中，在加入處理物后的第72小時加入100uMol碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)20ul，10分鐘后在熒光顯微鏡下觀察。受試細胞株的空白組和抗金葡菌多肽組的細胞均生長良好。惟重組抗腫瘤多肽組中絕大部分細胞被PI染成了紅色。提示這些細胞膜已被抗腫瘤多肽破壞，造成腫瘤細胞死亡。從細胞死亡數(shù)量來比較，重組抗腫瘤多肽1顯然比重組抗腫瘤多肽2更為有效，見附圖3。
實施例3重組抗腫瘤多肽對EB病毒所致Burkitt’s人惡性淋巴肉瘤細胞和其它腫瘤細胞及正常細胞的體外殺傷作用的多重熒光染色觀察細胞培養(yǎng)條件同實施例2。實驗共使用七株細胞，EB病毒陽性細胞株ATCC CCL-86(Raji細胞，Burkitt’s惡性淋巴肉瘤細胞)；ATCC CRL-2230，46歲男性愛滋病人(AIDS)惡性淋巴肉瘤細胞株，EB病毒和Kaposi肉瘤病毒(HHV8)均陽性；EB病毒陰性細胞株ATCC CRL-1648(CA-46，細胞分離自美國型Burkitt’s惡性淋巴肉瘤病人的腹水)；ATCCHepG2人肝胚瘤細胞；SMMC-7721人肝癌細胞，3T3小鼠胚胎成纖維細胞；ECV-304人臍靜脈內皮細胞(后三株細胞均源自中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心)。每株細胞分為三個實驗組，第一組為加入重組抗腫瘤多肽空白保存液(10mMPB+0.2M NaCI磷酸鹽緩沖液(pH7.4))。第二組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽1(質粒為pCHCEB1)，保存液為10mMPB+0.2M NaCI磷酸緩沖液pH7.4。第三組為加入200μg/ml的重組抗腫瘤多肽2(質粒為pCHCEB2)，保存液為10mM PB+0.2M NaCI磷酸鹽緩沖pH7.4。
細胞在培養(yǎng)24小時后，分別加入上述各組處理物于培養(yǎng)皿中，在加入處理物后的第72小時分別加入50uMol FITC 20ul及50uMol Rodamin-123 20ul兩種熒光染料。10分鐘后在Olympus IX-71熒光顯微鏡下觀察。EB病毒陰性的各腫瘤細胞株和人，鼠正常細胞株被重組抗腫瘤多肽處理后均生長良好，胞體(染為綠色)，胞核(染為淡綠色)及線粒體(染為紅色)結構清晰，無細胞腫脹。而EB病毒陽性的各腫瘤細胞株被重組抗腫瘤多肽處理后，絕大多數(shù)細胞出現(xiàn)線粒體及胞核結構消失，明顯腫脹和壞死，其中以重組抗腫瘤多肽1殺傷效果最為顯著，細胞幾乎全部死亡。顯然多重熒光染色的結果比實施例2碘化丙啶染色的結果更為精確的展示了重組抗腫瘤多肽對EB病毒陽性腫瘤細胞的強大殺傷作用，見附圖4。
EB病毒陰性的腫瘤細胞和正常細胞株生長良好表明重組抗腫瘤多肽并不攻擊細胞膜上不帶有EB病毒表面抗原的細胞。這提示本發(fā)明重組抗腫瘤多肽具有理想的靶向性和安全性。
實施例4重組抗腫瘤多肽對EB病毒所致人Burkitt’s惡性淋巴肉瘤細胞種植到裸鼠體內生長出的實體腫瘤的殺傷作用BALB/C裸體小鼠由四川大學華西動物中心提供，裸鼠喂養(yǎng) 按裸鼠飼養(yǎng)要求，水、墊草和飼料均經高溫或紫外線滅菌。在相對無菌條件下飼養(yǎng)一周，無異常后進行接種實驗。
收集指數(shù)生長期的Raji細胞懸液于50毫升離心管中，4℃離心，棄上清后，用1640液體培養(yǎng)基(加小牛血清)重懸細胞，使之達到1.0×107/ml個細胞。在裸鼠右腋處皮下注射Raji細胞懸液0.1ml。
注射細胞后3-4日腫瘤即長到約2×2mm，將荷瘤裸鼠隨機分為(A組)重組抗腫瘤多肽空白保存液(10mM PBS+0.2M NaCI磷酸鹽緩沖液(pH7.4))為對照組，(B組)重組抗腫瘤多肽1(質粒為pCHCEB1)治療組，300μg/鼠(以25克重計算)/日，(C組)環(huán)磷酰胺組，按標準教科書(Cancer，Principles & Practice of Oncology，Editor，V.T.DeVita，Jr，S.Hellman and S.A.Rosenberg，Lippincott Williams & Wilkins Publisher，2001，6thEdition，p2247-2249，Burkitt’s Lymphoma Treatment)選用環(huán)磷酰胺為現(xiàn)用抗腫瘤藥物對照組，環(huán)磷酰胺100μg/鼠/日(按全國高等醫(yī)藥院校教材“藥理學”(第5版，金有豫主編，人民衛(wèi)生出版社，2002年)“抗惡性腫瘤藥”章401頁，人體治療4mg/kg/日標準劑量換算)，間日給藥，連續(xù)20日；每組10只荷瘤裸鼠。每天觀察裸鼠活動情況，并作記錄，隔天精確測量腫瘤大小并照相。
給藥方式為瘤旁局部注射，每天注射1次，每次0.1ml，連續(xù)給藥20天。
結果顯示重組抗腫瘤多肽組鼠腫瘤生長明顯受到抑制，其中6只裸鼠的瘤塊消失，其余4只的瘤塊明顯小于對照組和環(huán)磷酰胺組。6只環(huán)磷酰胺組鼠在20日實驗期中死亡，所有環(huán)磷酰胺組鼠的瘤塊大于重組抗腫瘤多肽組，小于對照組；詳情請見附圖5；重組抗腫瘤多肽在裸鼠體內可以遠比環(huán)磷酰胺有效地抑制Raji細胞所致的實體瘤塊生長。而并未表現(xiàn)出如環(huán)磷酰胺一樣的致死性細胞毒性。
實施例5體內實體腫瘤消除試驗的病理觀察瘤體病理組織學觀察實施例4實驗到期后處死動物，取出瘤體于10％福爾馬林中固定，石蠟切片，HE染色常規(guī)光鏡觀察。
鏡下觀對照組鼠的實體腫瘤增殖旺盛；環(huán)磷酰胺組鼠的實體腫瘤中心部分出現(xiàn)壞死，提示經環(huán)磷酰胺20日處理后，雖然肉眼觀實體腫瘤尺寸未見減小，但中心部分腫瘤細胞已被殺傷；抗腫瘤多肽組鼠的實體腫瘤顯著減小，標本1中縮小的腫瘤細胞團中幾乎均為壞死的腫瘤細胞，周邊可見大量淋巴細胞浸潤；標本2中僅見大量淋巴細胞浸潤。病理組織學結果提示抗腫瘤多肽幾乎殺滅了實體腫瘤中的所有腫瘤細胞，而環(huán)磷酰胺對實體腫瘤中的腫瘤細胞表現(xiàn)出的是部分殺滅效應；在20日處理期限中，抗腫瘤多肽的殺滅效果比環(huán)磷酰胺的殺滅效果出現(xiàn)得早而且徹底，見附圖6。
SEQUENCE LISTING<110>四川大學華西醫(yī)院<120>抗EB病毒所致腫瘤多肽及其應用與制備方法<160>9<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1878<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>misc_feature<222>(1).....(1878)<223>大腸菌素Ia基因<400>1atgtctgacc ctgtacgtat tacaaatccc ggtgcagaat cgctggggta tgattcagat 60ggccatgaaa ttatggccgt tgatatttat gtaaaccctc cacgtgtcga tgtctttcat 120ggtaccccgc ctgcatggagg ttccttcggg aacaaaacca tctggggcgg aaacgagtgg 180gttgatgatt ccccaacccg aagtgatatc gaaaaaaggg acaaggaaat cacagcgtac 240aaaaacacgc tcagcgcgca gcagaaagag aatgagaata agcgtactga agccggaaaa 300cgcctctctg cggcgattge tgcaagggaa aaagatgaaa acacactgaa aacactccgt 360gccggaaacg cagatgccgc tgatattaca cgacaggagt tcagactcct gcaggcagag 420ctgagagaat acggattccg tactgaaatc gccggatatg acgccctccg gctgcataca 480gagagccgga tgctgtttgc tgatgctgat tctcttcgta tatctccccg ggaggccagg 540tcgttaatcg aacaggctga aaaacggcag aaggatgcgc agaacgcaga caagaaggcc 600gctgatatgc ttgctgaata cgagcgcaga aaaggtattc tggacacccg gttgtcagag 660ctggaaaaaa atggcggggc agcccttgcc gttcttgatg cacaacaggc ccgtctgctc 720gggcagcaga cacggaatga cagggccatt tcagaggccc ggaataaact cagttcagtg 780acggaatcgc ttaacacggc ccgtaatgca ttaaccagag ctgaacaaca gctgacgcaa 840cagaaaaaca cgcctgacgg caaaacgata gtttcccctg aaaaattccc ggggcgttca 900tcaacaaatc attctattgt tgtgagcggt gatccgagat ttgccggtac gataaaaatc 960acaaccagcg cagtcatcga taaccgtgca aacctgaatt atcttctgag ccattccggt 1020ctggactata aacgcaatat tctgaatgac cggaatccgg tggtgacaga ggatgtggaa 1080
ggtgacaaga aaatttataa tgctgaagtt gctgaatggg ataagttacg gcaaagattg 1140cttgatgcca gaaataaaat cacctctgct gaatctgcgg taaattcggc gagaaataac 1200ctcagtgcca gaacaaatga gcaaaagcat gcaaatgacg ctcttaatgc cctgttgaag 1260gaaaaagaga atatacgtaa ccagctttcc ggcatcaatc agaagatagc ggaagagaaa 1320agaaaacagg atgaactgaa ggcaacgaaa gacgcaatta atttcacaac agagttcctg 1380aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa gctgagcagt tagccagaga gatggccggg 1440caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac 1500cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt 1560gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct aatctgaaca gattcagtcg gggactggga 1620tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg 1680acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa acagaaacca tcatagcagg caatgccgca 1740acggctcttg tggcactggt cttcagtatt cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg 1800tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg 1860aataagttct ggggtatt1878<210>2<211>84<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(84)<223>編碼引導多肽序列1<400>2tccttcggta tgcattgggt gcgtcaggcc cccgagaaag gtctggagtg ggtggccggt60cagggttact cctaccccta cacc 84<210>3<211>28<212>PRT<213>人工序列<223>編碼引導多肽氨基酸序列1
<400>3Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val1 5 10 15Ala Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr20 25<210>4<211>87<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1).....(87)<223>編碼引導多肽序列2<400>4tccttcggta tgcattgggt gcgtcaggcc cccgagaaag gtctggagtg ggtggcctgg60ggtaattacc cccattacgc catggat87<210>5<211>29<212>PRT<213>人工序列<223>編碼引導多肽氨基酸序列2<400>5Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu1 5 10 15Glu Trp Val Ala Trp Gly Asn Tyr Pro His Tyr Ala Met Asp20 25
<210>6<211>1962<212>DNA<222>(1).....(1962)<213>人工序列<223>編碼抗EB病毒所致腫瘤多肽1基因<400>6atgtctgacc ctgtacgtat tacaaatccc ggtgcagaat cgctggggta tgattcagat 60ggccatgaaa ttatggccgt tgatatttat gtaaaccctc cacgtgtcga tgtctttcat 120ggtaccccgc ctgcatggag ttccttcggg aacaaaacca tctggggcgg aaacgagtgg 180gttgatgatt ccccaacccg aagtgatatc gaaaaaaggg acaaggaaat cacagcgtac 240aaaaacacgc tcagcgcgca gcagaaagag aatgagaata agcgtactga agccggaaaa 300cgcctctctg cggcgattgc tgcaagggaa aaagatgaaa acacactgaa aacactccgt 360gccggaaacg cagatgccgc tgatattaca cgacaggagt tcagactcct gcaggcagag 420ctgagagaat acggattccg tactgaaatc gccggatatg acgccctccg gctgcataca 480gagagccgga tgctgtttgc tgatgctgat tctcttcgta tatctccccg ggaggccagg 540tcgttaatcg aacaggctga aaaacggcag aaggatgcgc agaacgcaga caagaaggcc 600gctgatatgc ttgctgaata cgagcgcaga aaaggtattc tggacacccg gttgtcagag 660ctggaaaaaa atggcggggc agcccttgcc gttcttgatg cacaacaggc ccgtctgctc 720gggcagcaga cacggaatga cagggccatt tcagaggccc ggaataaact cagttcagtg 780acggaatcgc ttaacacggc ccgtaatgca ttaaccagag ctgaacaaca gctgacgcaa 840cagaaaaaca cgcctgacgg caaaacgata gtttcccctg aaaaattccc ggggcgttca 900tcaacaaatc attctattgt tgtgagcggt gatccgagat ttgccggtac gataaaaatc 960acaaccagcg cagtcatcga taaccgtgca aacctgaatt atcttctgag ccattccggt 1020ctggactata aacgcaatat tctgaatgac cggaatccgg tggtgacaga ggatgtggaa 1080ggtgacaaga aaatttataa tgctgaagtt gctgaatggg ataagttacg gcaaagattg 1140cttgatgcca gaaataaaat cacctctgct gaatctgcgg taaattcggc gagaaataac 1200ctcagtgcca gaacaaatga gcaaaagcat gcaaatgacg ctcttaatgc cctgttgaag 1260gaaaaagaga atatacgtaa ccagctttcc ggcatcaatc agaagatagc ggaagagaaa 1320agaaaacagg atgaactgaa ggcaacgaaa gacgcaatta atttcacaac agagttcctg 1380aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa gctgagcagt tagccagaga gatggccggg 1440caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac 1500cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt 1560gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct aatctgaaca gattcagtcg gggactggga 1620tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg 1680acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa acagaaacca tcatagcagg caatgccgca 1740acggctcttg tggcactggt cttcagtatt cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg 1800tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg 1860aataagttct ggggtatttc cttcggtatg cattgggtgc gtcaggcccc cgagaaaggt 1920ctggagtggg tggccggtca gggttactcc tacccctaca cc 1962
<210>7<211>653<212>PRT<213>人工序列<223>抗EB病毒所致腫瘤多肽1氨基酸序列<400>7Ser Asp Pro Val Arg Ile Thr Asn Pro Gly Ala Glu Ser Leu Gly Tyr5 10 15Asp Ser Asp Gly His Glu Ile Met Ala Val Asp Ile Tyr Val Asn Pro20 25 30Pro Arg Val Asp Val Phe His Gly Thr Pro Pro Ala Trp Ser Ser Phe35 40 45Gly Asn Lys Thr Ile Trp Gly Gly Asn Glu Trp Val Asp Asp Ser Pro50 55 60Thr Arg Ser Asp Ile Glu Lys Arg Asp Lys Glu Ile Thr Ala Tyr Lys65 70 75 80Asn Thr Leu Ser Ala Gln Gln Lys Glu Asn Glu Asn Lys Arg Thr Glu85 90 95Ala Gly Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Ala Ala Arg Glu Lys Asp Glu100 105 110Asn Thr Leu Lys Thr Leu Arg Ala Gly Asn Ala Asp Ala Ala Asp Ile115 120 125Thr Arg Gln Glu Phe Arg Leu Leu Gln Ala Glu Leu Arg Glu Tyr Gly130 135 140Phe Arg Thr Glu Ile Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Arg Leu His Thr Glu145 150 155 160Ser Arg Met Leu Phe Ala Asp Ala Asp Ser Leu Arg Ile Ser Pro Arg165 170 175Glu Ala Arg Ser Leu Ile Glu Gln Ala Glu Lys Arg Gln Lys Asp Ala180 185 190Gln Asn Ala Asp Lys Lys Ala Ala Asp Met Leu Ala Glu Tyr Glu Arg195 200 205Arg Lys Gly Ile Leu Asp Thr Arg Leu Ser Glu Leu Glu Lys Asn Gly210 215 220Gly Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ala Gln Gln Ala Arg Leu Leu Gly225 230 235 240Gln Gln Thr Arg Asn Asp Arg Ala Ile Ser Glu Ala Arg Asn Lys Leu245 250 255Ser Ser Val Thr Glu Ser Leu Asn Thr Ala Arg Asn Ala Leu Thr Arg260 265 270
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Ile Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu625 630 635 640Glu Trp Val Ala Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr645 650<210>8<211>1965<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1).....(1965)<223>編碼抗EB病毒所致腫瘤多肽2基因<400>8<400>1atgtctgacc ctgtacgtat tacaaatccc ggtgcagaat cgctggggta tgattcagat 60ggccatgaaa ttatggccgt tgatatttat gtaaaccctc cacgtgtcga tgtctttcat 120ggtaccccgc ctgcatggag ttccttcggg aacaaaacca tctggggcgg aaacgagtgg 180gttgatgatt ccccaacccg aagtgatatc gaaaaaaggg acaaggaaat cacagcgtac 240aaaaacacgc tcagcgcgca gcagaaagag aatgagaata agcgtactga agccggaaaa 300cgcctctctg cggcgattgc tgcaagggaa aaagatgaaa acacactgaa aacactccgt 360gccggaaacg cagatgccgc tgatattaca cgacaggagt tcagactcct gcaggcagag 420ctgagagaat acggattccg tactgaaatc gccggatatg acgccctccg gctgcataca 480gagagccgga tgctgtttgc tgatgctgat tctcttcgta tatctccccg ggaggccagg 540tcgttaatcg aacaggctga aaaacggcag aaggatgcgc agaacgcaga caagaaggcc 600gctgatatgc ttgctgaata cgagcgcaga aaaggtattc tggacacccg gttgtcagag 660ctggaaaaaa atggcggggc agcccttgcc gttcttgatg cacaacaggc ccgtctgctc 720gggcagcaga cacggaatga cagggccatt tcagaggccc ggaataaact cagttcagtg 780acggaatcgc ttaacacggc ccgtaatgca ttaaccagag ctgaacaaca gctgacgcaa 840cagaaaaaca cgcctgacgg caaaacgata gtttcccctg aaaaattccc ggggcgttca 900tcaacaaatc attctattgt tgtgagcggt gatccgagat ttgccggtac gataaaaatc 960acaaccagcg cagtcatcga taaccgtgca aacctgaatt atcttctgag ccattccggt 1020ctggactata aacgcaatat tctgaatgac cggaatccgg tggtgacaga ggatgtggaa 1080ggtgacaaga aaatttataa tgctgaagtt gctgaatggg ataagttacg gcaaagattg 1140cttgatgcca gaaataaaat cacctctgct gaatctgcgg taaattcggc gagaaataac 1200ctcagtgcca gaacaaatga gcaaaagcat gcaaatgacg ctcttaatgc cctgttgaag 1260gaaaaagaga atatacgtaa ccagctttcc ggcatcaatc agaagatagc ggaagagaaa 1320agaaaacagg atgaactgaa ggcaacgaaa gacgcaatta atttcacaac agagttcctg 1380aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa gctgagcagt tagccagaga gatggccggg 1440
caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac 1500cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt 1560gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct aatctgaaca gattcagtcg gggactggga 1620tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg 1680acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa acagaaacca tcatagcagg caatgccgca 1740acggctcttg tggcactggt cttcagtatt cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg 1800tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg 1860aataagttct ggggtatttc cttcggtatg cattgggtgc gtcaggcccc cgagaaaggt 1920ctggagtggg tggcctgggg taattacccc cattacgcca tggat 1965<210>9<211>654<212>PRT<213>人工序列<223>抗EB病毒所致腫瘤多肽2氨基酸序列<400>9Ser Asp Pro Val Arg Ile Thr Asn Pro Gly Ala Glu Ser Leu Gly Tyr5 10 15Asp Ser Asp Gly His Glu Ile Met Ala Val Asp Ile Tyr Val Asn Pro20 25 30Pro Arg Val Asp Val Phe His Gly Thr Pro Pro Ala Trp Ser Ser Phe35 40 45Gly Asn Lys Thr Ile Trp Gly Gly Asn Glu Trp Val Asp Asp Ser Pro50 55 60Thr Arg Ser Asp Ile Glu Lys Arg Asp Lys Glu Ile Thr Ala Tyr Lys65 70 75 80Asn Thr Leu Ser Ala Gln Gln Lys Glu Asn Glu Asn Lys Arg Thr Glu85 90 95Ala Gly Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Ala Ala Arg Glu Lys Asp Glu100 105 110Asn Thr Leu Lys Thr Leu Arg Ala Gly Asn Ala Asp Ala Ala Asp Ile115 120 125Thr Arg Gln Glu Phe Arg Leu Leu Gln Ala Glu Leu Arg Glu Tyr Gly130 135 140Phe Arg Thr Glu Ile Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Arg Leu His Thr Glu145 150 155 160Ser Arg Met Leu Phe Ala Asp Ala Asp Ser Leu Arg Ile Ser Pro Arg165 170 175Glu Ala Arg Ser Leu Ile Glu Gln Ala Glu Lys Arg Gln Lys Asp Ala180 185 190Gln Asn Ala Asp Lys Lys Ala Ala Asp Met Leu Ala Glu Tyr Glu Arg195 200 205
Arg Lys Gly Ile Leu Asp Thr Arg Leu Ser Glu Leu Glu Lys Asn Gly210 215 220Gly Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ala Gln Gln Ala Arg Leu Leu Gly225 230 235 240Gln Gln Thr Arg Asn Asp Arg Ala Ile Ser Glu Ala Arg Asn Lys Leu245 250 255Ser Ser Val Thr Glu Ser Leu Asn Thr Ala Arg Asn Ala Leu Thr Arg260 265 270Ala Glu Gln Gln Leu Thr Gln Gln Lys Asn Thr Pro Asp Gly Lys Thr275 280 285Ile Val Ser Pro Glu Lys Phe Pro Gly Arg Ser Ser Thr Asn His Ser290 295 300Ile Val Val Ser Gly Asp Pro Arg Phe Ala Gly Thr Ile Lys Ile Thr305 310 315 320Thr Ser Ala Val Ile Asp Asn Arg Ala Asn Leu Asn Tyr Leu Leu Ser325 330 335His Ser Gly Leu Asp Tyr Lys Arg Asn Ile Leu Asn Asp Arg Asn Pro340 345 350Val Val Thr Glu Asp Val Glu Gly Asp Lys Lys Ile Tyr Asn Ala Glu355 360 365Val Ala Glu Trp Asp Lys Leu Arg Gln Arg Leu Leu Asp Ala Arg Asn370 375 380Lys Ile Thr Ser Ala Glu Ser Ala Val Asn Ser Ala Arg Asn Asn Leu385 390 395 400Ser Ala Arg Thr Asn Glu Gln Lys His Ala Asn Asp Ala Leu Asn Ala405 410 415Leu Leu Lys Glu Lys Glu Asn Ile Arg Asn Gln Leu Ser Gly Ile Asn420 425 430Gln Lys Ile Ala Glu Glu Lys Arg Lys Gln Asp Glu Leu Lys Ala Thr435 440 445Lys Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu450 455 460Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly Gln465 470 475 480Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys Thr Tyr485 490 495Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala Lys Asp Arg500 505 510Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu Ser Asp Ile Ser515 520 525Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly Tyr Ala Gly Lys Phe530 535 540Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe Gly Lys Ala Val Arg Thr545 550 555 560Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly
565 570 575Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly580 585 590Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly595 600 605Ala Leu Ilu Asp Glu Ser Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly610 615 620Ile Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu625 630 635 640Glu Trp Val Ala Trp Gly Asn Tyr Pro His Tyr Ala Met Asp645 650
權利要求
1.一種編碼抗EB病毒所致腫瘤多肽的基因，其特征在于其含有編碼可形成離子通道的大腸菌素的基因，以及編碼以抗EB病毒包膜糖蛋白抗體的CDR區(qū)為藍本而構建的引導多肽的基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗EB病毒所致腫瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的抗EB病毒所致腫瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.8所述的核苷酸序列。
4.一種抗EB病毒所致腫瘤多肽的重組質粒，其特征在于它含有權利要求1所述的基因。
5.一種抗EB病毒所致腫瘤多肽，其特征在于它由權利要求4所述的重組質粒表達而成。
6.根據(jù)權利要求5所述的抗EB病毒所致腫瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQID NO.7所述的氨基酸序列。
7.根據(jù)權利要求5所述的抗EB病毒所致腫瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQID NO.9所述的氨基酸序列。
8.權利要求5或6或7所述多肽在制備治療或預防EB病毒所致腫瘤的藥中的應用。
9.一種權利要求5或6或7所述多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟將以抗EB病毒包膜糖蛋白抗體的CDR區(qū)為藍本而構建的引導多肽的基因與編碼可形成離子通道的大腸菌素的基因可操作地連接獲得編碼重組抗腫瘤多肽的基因，將獲得的基因導入到表達系統(tǒng)中進行表達，分離表達的多肽而獲得本發(fā)明的抗腫瘤多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗EB病毒所致腫瘤多肽的基因、重組質粒和多肽。將編碼誘導多肽的基因與大腸菌素基因可操作地連接，從而獲得表達重組抗腫瘤多肽的核苷酸序列。將如上所述的編碼誘導多肽的核苷酸序列經雙鏈寡聚核苷酸點突變技術插入大腸菌素基因即形成本發(fā)明的重組質粒。將獲得的重組質粒轉染入大腸桿菌TG1工程菌中而獲得可產生重組抗腫瘤多肽的工程菌細胞；大量增菌、離心沉淀菌體、超聲破碎、高速離心沉淀破碎菌體、取上清進行處理即可得到重組抗腫瘤多肽。本發(fā)明所述抗腫瘤多肽具有特異的靶向性，特異殺滅實體腫瘤的效率高于傳統(tǒng)抗腫瘤藥物，而不會攻擊正常細胞，其毒性和不良反應遠低于傳統(tǒng)抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K38/17GK1641024SQ20041008144
公開日2005年7月20日 申請日期2004年12月10日 優(yōu)先權日2004年12月10日
發(fā)明者丘小慶 申請人:四川大學華西醫(yī)院