專利名稱：Bcg作為激活細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞活性蛋白的佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療腫瘤的重組融合蛋白CTL疫苗及其佐劑卡介苗組成的疫苗組合物，用于預(yù)防和治療病毒感染疾病的重組融合蛋白CTL疫苗及其佐劑BCG組成的疫苗組合物，特別是涉及用來(lái)預(yù)防和治療人乳腺癌、直腸癌、結(jié)直腸癌、喉癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌等的人類腫瘤，以及用來(lái)預(yù)防和治療SARS病毒感染疾病、乳頭瘤病毒感染、宮頸癌、丙型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染和乙型肝炎病毒感染導(dǎo)致的肝癌、肝硬化等病毒感染所引起的疾病的重組融合蛋白CTL疫苗及其佐劑BCG組成的疫苗組合物。。
背景技術(shù)：
腫瘤、病毒感染所引起的疾病都是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人們健康的疾病，攻克這些疾病是人類面臨的重大難題。
特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是人體殺傷腫瘤細(xì)胞和清除體內(nèi)病毒感染細(xì)胞最高效的免疫細(xì)胞。
體內(nèi)CTL的激活需要未致敏的T淋巴細(xì)胞同時(shí)接受抗原遞呈細(xì)胞提供的兩個(gè)信號(hào)，一個(gè)是外源抗原肽經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)加工處理后與MHCI類分子結(jié)合形成復(fù)合物并遞呈在APC的表面，被T淋巴細(xì)胞的TCR所識(shí)別；另一個(gè)信號(hào)是APC表面表達(dá)的協(xié)同刺激分子，即B7分子的表達(dá)，被T淋巴細(xì)胞的CD28分子所識(shí)別。只有T淋巴細(xì)胞同時(shí)接受APC所提供的這樣兩個(gè)信號(hào)時(shí)，才能被激活。
大量的研究表明熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)能夠攜帶它們所融合的蛋白進(jìn)入抗原遞呈細(xì)胞中，并協(xié)助所融合的蛋白經(jīng)過(guò)抗原遞呈細(xì)胞的加工處理后與MHCI類分子結(jié)合遞呈在APC的表面。為激活特異性的CTL提供第一信號(hào)。而在機(jī)體沒(méi)有感染時(shí)，抗原遞呈細(xì)胞只表達(dá)自身肽，而不表達(dá)B7分子，因此針對(duì)自身肽的T細(xì)胞不能被激活。所以，如果T淋巴細(xì)胞只接受了遞呈在APC表面與MHCI類分子結(jié)合的肽這樣的第一信號(hào)是不能被激活的；APC還需要給T淋巴細(xì)胞提供第二信號(hào)。通常情況下，當(dāng)機(jī)體有微生物入侵時(shí)，抗原遞呈細(xì)胞開始表達(dá)B7分子。因此，如果能夠給機(jī)體一個(gè)類似微生物的危險(xiǎn)信號(hào)，則類似微生物的危險(xiǎn)信號(hào)就能夠刺激APC表達(dá)B7分子，為激活T淋巴細(xì)胞提供第二信號(hào)。(Ruslan Medzhitov and CharlesJaneway.Innate Immunity，The New England Journal of Medcine，2000，343(5)338-344)。
BCG是應(yīng)用多年的免疫佐劑，有研究表明BCG能夠通過(guò)Toll樣受體激活天然免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)和抗原遞呈細(xì)胞的表面協(xié)同刺激分子(B7分子)的表達(dá)(Ruslan Medzhitov，1999)。未致敏的T淋巴細(xì)胞的激活，需要抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)提供兩個(gè)信號(hào)，如果APC只提供第一信號(hào)，會(huì)導(dǎo)致免疫耐受。APC還必須表達(dá)表面協(xié)同刺激分子，即B7分子，才能激活未致敏的T淋巴細(xì)胞。根據(jù)上述的機(jī)制，利用BCG能夠刺激APC表面協(xié)同刺激分子表達(dá)的作用，為了提高重組融合蛋白CTL疫苗激活特異性CTL的效能，本發(fā)明利用卡介苗作為重組融合蛋白CTL疫苗的佐劑，使重組融合蛋白CTL疫苗進(jìn)入機(jī)體后能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的刺激特異性CTL產(chǎn)生的作用。
卡介苗進(jìn)入機(jī)體后，機(jī)體會(huì)識(shí)別其為能夠引起感染的危險(xiǎn)信號(hào)，抗原遞呈細(xì)胞表面的B7分子開始表達(dá)，為激活CTL提供第二信號(hào)。BCG是減毒的微生物不能引起機(jī)體的感染，但其仍保留著微生物的保守結(jié)構(gòu)，通過(guò)激活Toll樣受體，誘導(dǎo)B7分子的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)CTL激活的效力和速度(Ruslan Medzhitov and Charles A.Janeway Jr.Decoding the patterns of selfand nen-self by the innate immune system.Science，296(5566)298。SybilleThoma-Uszynski，Steffen Stenger，Osamu Takkkeuchi et a1.Induction of directantimicrobial activity through mamalian Toll-like receptors.Science，291(5508)1544。Hans D.Brightbill，Danidl H.Libraty，Stephan R.Kruzzik et al.Hostdefense mechanisms triggered by microbial liporoteins through Toll-like receptors.Science，285(5428)732.)。
機(jī)體識(shí)別非幾微生物主要是通過(guò)Toll樣受體識(shí)別微生物生理結(jié)構(gòu)中比較保守的分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，雖然這些PAMP不是微生物所獨(dú)有，卻是所有微生物能夠產(chǎn)生的。PAMPs包括革蘭式陰性菌的脂多糖(lipopolysaccharides LPS)，革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖和脂多肽(peptidoglycans and lipopeptides)，以及細(xì)菌的鞭毛、細(xì)菌的DNA、病毒的雙鏈RNA。Toll樣受體是由胞外段富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)類似于IL-1受體的結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成的跨膜蛋白。TLR主要表達(dá)在與免疫功能相關(guān)的組織，如脾、外周血白細(xì)胞以及與外界有接觸的組織器官，如肺和胃腸道。(www.InvivoGen.Toll-like<http//www.InvivoGen.Toll-like>)迄今為止，已發(fā)現(xiàn)有十種人的Toll樣受體和九種鼠的Toll樣受體，不同的Toll樣受體有其各自的配體。TLR2主要識(shí)別各種PAMPs，包括細(xì)菌脂蛋白、肽聚糖和脂壁酸。TLR3參與病毒來(lái)源的雙鏈RNA的識(shí)別。TLR4優(yōu)先被脂多糖激活。TLR5能夠識(shí)別細(xì)菌的鞭毛而非甲基化的CpGDNA的識(shí)別則需要TLR9。最近的研究表明TLR7和TLR8能夠識(shí)別小的合成的抗病毒分子。而且，在很多情況下，Toll樣受體發(fā)揮作用時(shí)需要與協(xié)同受體的協(xié)同發(fā)揮作用，如TLR4發(fā)揮作用時(shí)常與MD2和CD14協(xié)同作用。(www.InvivoGen.Toll-like<http//www.InvivoGen.Toll-like>)新近的發(fā)現(xiàn)表明Toll樣受體是機(jī)體激活天然免疫系統(tǒng)防御微生物反應(yīng)的必要成分，是獲得性免疫系統(tǒng)激活的前提(www.lnvivoGen.Toll-like<http//www.InvivoGen.Toll-like>)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以卡介苗作為佐劑的重組融合蛋白疫苗組和物，其中卡介苗能夠使重組融合蛋白進(jìn)入機(jī)體后產(chǎn)生較強(qiáng)的刺激特異性CTL的作用。這種疫苗可用于預(yù)防和治療腫瘤以及病毒感染所引起的疾病。所述的病毒感染所引起的疾病包括SARS病毒感染疾病、乳頭瘤病毒感染、丙型肝炎、乙型肝炎等。由于乳頭瘤病毒感染能夠?qū)е聦m頸癌，因此，本發(fā)明中的重組融合蛋白亦可用于預(yù)防和或治療宮頸癌。丙型肝炎病毒感染和乙型肝炎病毒感染的初期會(huì)導(dǎo)致感染者的肝臟炎性改變，隨著感染的反復(fù)，感染者最終出現(xiàn)肝癌、肝硬化的病理改變，所以，本發(fā)明中的重組融合蛋白也可以用于預(yù)防和或治療肝癌和肝硬化。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種疫苗組合物，其特征在于包括重組融合蛋白和佐劑，所述重組融合蛋白是融合了熱休克蛋白65的融合蛋白，所述佐劑為卡介苗。
具體地說(shuō)，上述重組融合蛋白可以是結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合粘蛋白1構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-MUC1、結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合人上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-HER2、結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合人前列腺特異抗原構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-PSA、結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合乳頭瘤病毒多表位抗原構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-HPV、結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合人SARS病毒多表位抗原構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-SARS或者結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合乙型肝炎核心抗原構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-HBcAg、結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合丙型肝炎抗原表位構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-HCV。
上述的重組融合蛋白HSP65-MUC1、HSP65-HER2、HSP65-PSA、HSP65-HBcAg、HSP65-HPV、HSP65-SARS、HSP65-HCV為申請(qǐng)人研制開發(fā)的產(chǎn)品且已申請(qǐng)國(guó)家專利(此處應(yīng)標(biāo)出相關(guān)專利申請(qǐng)?zhí)?。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及疫苗組合物在制備預(yù)防和治療腫瘤的藥物中的用途，其可用于人乳腺癌、直腸癌、結(jié)直腸癌、喉癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌等的預(yù)防和治療。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及疫苗組合物在制備預(yù)防和治療人病毒感染性疾病的藥物中的用途，其可用于人SARS病毒感染疾病、乳頭瘤病毒感染、宮頸癌、丙型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染和乙型肝炎病毒感染導(dǎo)致的肝癌、肝硬化等的預(yù)防和治療。
本發(fā)明的重組融合蛋白CTL疫苗及其佐劑的使用方法可以是以下三種1.給予卡介苗，后接種本發(fā)明中的重組融合蛋白CTL疫苗；2.先接種本發(fā)明中的重組融合蛋白CTL疫苗，后給予卡介苗；3.本發(fā)明中的重組融合蛋白CTL疫苗和卡介苗同時(shí)使用。
本發(fā)明的重組融合蛋白進(jìn)入機(jī)體后，能夠進(jìn)入MHCI類抗原遞呈途徑，激活特異性的CTL，佐劑BCG進(jìn)入機(jī)體后，則能夠通過(guò)Toll樣受體激活抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)協(xié)同刺激分子，為激活CTL提供更強(qiáng)的第二信號(hào)。


圖1BCG+HSP65-MUC1和HSP65-MUC1對(duì)樹突狀細(xì)胞激活程度的比較圖2BCG加強(qiáng)HSP65-MUC1注射所激發(fā)的特異性抑瘤作用圖3BCG+HSP65-MUC1和HSP65-MUC1誘生特異性CTL作用的比較圖4BCG增強(qiáng)HSP65-MUC1免疫所激發(fā)的特異性抑瘤作用圖5BCG+HSP65-HER2和HSP65-HER2對(duì)樹突狀細(xì)胞激活程度的比較圖6BCG增強(qiáng)HSP65-HER2注射所激發(fā)的特異性抑瘤作用圖7BCG+HSP65-HER2和HSP65-HER2誘生特異性CTL作用的比較圖8BCG增強(qiáng)HSP65-HER2免疫所激發(fā)的特異性抑瘤作用圖9BCG+HSP65-PSA和HSP65-PSA對(duì)樹突狀細(xì)胞激活程度的比較圖10BCG增強(qiáng)HSP65-PSA注射所激發(fā)的特異性抑瘤作用圖11BCG+HSP65-PSA和HSP65-PSA誘生特異性CTL作用的比較圖12BCG加強(qiáng)HSP65-PSA免疫所激發(fā)的特異性抑瘤作用圖13BCG+HSP65-HPV和HSP65-HPV對(duì)樹突狀細(xì)胞激活程度的比較圖14BCG加強(qiáng)HSP65-HPV注射所激發(fā)的特異性殺傷HPV感染細(xì)胞作用圖15BCG+HSP65-HPV和HSP65-HPV誘生特異性CTL作用的比較圖16BCG加強(qiáng)HSP65-HPV免疫所激發(fā)的特異性殺傷HPV感染細(xì)胞的作用圖17BCG+HSP65-SARS和HSP65-SARS對(duì)樹突狀細(xì)胞激活程度的比較圖18BCG加強(qiáng)HSP65-SARS注射所激發(fā)的特異性殺傷SARS感染細(xì)胞的作用圖19BCG+HSP65-SARS和HSP65-SARS誘生特異性CTL作用的比較圖20BCG增強(qiáng)HSP65-SARS免疫所激發(fā)的特異性殺傷SARS感染細(xì)胞的作用圖21BCG+HSP65-HBV和HSP65-HBV對(duì)樹突狀細(xì)胞激活程度的比較圖22BCG加強(qiáng)HSP65-HBcAg注射所激發(fā)的特異性殺傷HBV感染細(xì)胞的作用圖23BCG+HSP65-HBV和HSP65-HBV誘生特異性CTL作用的比較圖24BCG增強(qiáng)HSP65-HBcAg免疫所激發(fā)的特異性的殺傷HBV感染細(xì)胞的作用圖25BCG+HSP65-HCV和HSP65-HCV對(duì)樹突狀細(xì)胞激活程度的比較圖26BCG加強(qiáng)HSP65-HCV注射所激發(fā)的特異性殺傷HCV感染細(xì)胞的作用圖27BCG+HSP65-HCV和HSP65-HCV誘生特異性CTL作用的比較圖28BCG增強(qiáng)HSP65-HCV免疫所激發(fā)的特異性的殺傷HCV感染細(xì)胞的作用具體實(shí)施方式
實(shí)施例1BCG和HSP65-MUC1體外誘導(dǎo)人的樹突狀細(xì)胞的活化和成熟一、分離人外周血單核細(xì)胞1.向50ml離心管中加入12.5ml泛影葡胺。
2.汲取50ml PBS/EDTA緩沖液移入一燒瓶中。
3.血袋經(jīng)70％乙醇洗滌后，將其中的血移入于含PBS/EDTA的燒瓶中，混勻。
4.從燒瓶中汲取25ml血液和PBS的混合液移入于含12.5ml泛影葡胺的50ml離心管中。
5.將上述試管離心，室溫，3000rpm/min(不使用剎車)，離心20-25min。
6.離心后棄去上清，汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
7.向含有分層細(xì)胞的離心管中加入PBS/EDTA緩沖液至45ml，1800rpm/min，4℃離心10min。
此為第一次沖洗；第二次沖洗時(shí)為1200rpm/min，4℃離心7min。
8.離心后，加入PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞。
9.第三次洗滌，1200rpm/min，4℃離心7min(不用剎車)。
10.以6ml冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞，取2只試管分別加入6ml 52％冷的Percol。
11.汲取3ml細(xì)胞懸液緩慢移入(勿攪動(dòng)Percol)含6ml冷的52％Percol試管中，在無(wú)剎車條件下2000rpm/min，4℃離心20min。
12.汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
13.以冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液洗滌分層細(xì)胞，4℃，1300rpm/min，無(wú)剎車離心10min。
14.以200目濾網(wǎng)濾過(guò)因死亡而成團(tuán)的細(xì)胞。
15.計(jì)數(shù)單核細(xì)胞數(shù)。
二、誘導(dǎo)未成熟的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)1.以IMDM稀釋單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)2×106/ml。
2.向12孔板中每一個(gè)孔加入1ml細(xì)胞懸液和1ml IMDM，將細(xì)胞于37℃，5％ CO2孵箱內(nèi)中培養(yǎng)2h。
3.2h后用IMDM洗滌去掉每孔中未粘附的細(xì)胞。
4.每孔中加入2ml含100ng(200U)/ml的GM-CSF和200U/ml的IL-4的IMDM培養(yǎng)液。
5.于37℃，5％ CO2孵箱中培養(yǎng)5d，每2-3d換一次培養(yǎng)液。
三、用BCG和HSP65-MUC1融合蛋白裝載樹突狀細(xì)胞1.于第五天，分別設(shè)立陰性對(duì)照組只加培養(yǎng)液；BCG組加入BCG使其終濃度達(dá)30μg/ml；BCG+HSP65-MUG1組加入BCG和HSP65-MUC1使其終濃度分別為30μg/ml和100μg/ml；HSP65-MUC1組加入HSP65-MUC1使其終濃度達(dá)100μg/ml；陽(yáng)性對(duì)照組加入下列因子并使其終濃度分別達(dá)到10ng/mlTNFα、10ng/mlIL-6、10ng/mlIL-1β和10μg/mlPGE2。直接將上述的BCG和HSP65-MUC1蛋白及細(xì)胞因子加入未成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)中繼續(xù)培養(yǎng)2d。
2.于第7d收獲樹突狀細(xì)胞，進(jìn)行活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定。
四、樹突狀細(xì)胞活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定1.于第7天收集樹突狀細(xì)胞于96孔板中，每孔加入200μl的細(xì)胞懸液。
2.1500rpm，4℃離心5分鐘，棄掉上清液，留存孔底的細(xì)胞。
3.每孔中加入200μlPBS緩沖液，洗滌兩次，棄掉上清液，留存孔底細(xì)胞。
4.輕輕彈起孔底的細(xì)胞，分別向每孔中加入1.5μlFITC標(biāo)記的CD86熒光抗體(BD，USA)。
5.避光，冰上染色30分鐘。
6.染色完畢后，用PBS緩沖液，每孔200μl，洗滌細(xì)胞兩次。
7.洗滌完畢后，用400μl PBS緩沖液收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。
五、結(jié)果流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果表明同HSP65-MUC1組相比較，BCG+HSP65-MUC1能夠顯著的誘導(dǎo)DC的活化和成熟。DC是人體內(nèi)最為重要的抗原遞呈細(xì)胞，DC的活化和成熟標(biāo)志著DC的抗原遞呈能力加強(qiáng)，激活針對(duì)MUC1的細(xì)胞毒性殺傷性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力加強(qiáng)；這樣有助于人體內(nèi)被激活的CTL殺傷體內(nèi)表達(dá)MUC1的腫瘤細(xì)胞，因此，可用于預(yù)防和或治療MUC1陽(yáng)性腫瘤。HSP65-MUC1和BCG+HSP65-MUC1對(duì)樹突狀細(xì)胞激活程度的比較見(jiàn)圖1。
實(shí)施例2 BCG增強(qiáng)HSP65-MUC1注射所激發(fā)的小鼠體內(nèi)的特異性抑瘤作用1.方法設(shè)立PBS組(陰性對(duì)照組)、BCG組、HSP65-MUC1組、BCG+HSP65-MUC1組和卡鉑組(陽(yáng)性對(duì)照組)。每組10只7周齡的C57BL/6雌性小鼠。于第0天給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染MUC1表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105/200μlPBS，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。于第2天，按不同分組對(duì)小鼠進(jìn)行第一次注射，注射部位為小鼠四只皮下向心端。劑量為HSP65-MUC1組10μg HSP65-MUC1/200μlPBS/只小鼠；BCG+HSP65-MUC1組10μg HSP65-MUC1+1.32mgBCG/PBS200μl/只小鼠；PBS組200μl PBS/只小鼠；BCG組1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組小鼠每4天注射一次卡鉑，腹腔注射0.5mg卡鉑/只小鼠，連續(xù)注射四次。于第16天時(shí)，對(duì)各組小鼠進(jìn)行第二次注射，注射劑量和部位同第一次免疫。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況，當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?。稱取各組小鼠的腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-MUC1轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)MUC1的克隆，用于功能試驗(yàn)。
3.結(jié)果BCG+HSP65-MUC1組小鼠的腫瘤重量顯著低于HSP65-MUC1組(秩和檢驗(yàn)，P＜0.05)，說(shuō)明BCG能夠加強(qiáng)HSP65-MUC1注射所激發(fā)的特異性抑瘤作用。
BCG+HSP65-MUC1組與HSP65-MUC1組及其它組腫瘤重量的比較，見(jiàn)圖2。
4.結(jié)論BCG能明顯增強(qiáng)HSP65-MUC1注射所激發(fā)的特異性抑瘤作用，抑制MUC1陽(yáng)性腫瘤的生長(zhǎng)。
實(shí)施例3 BCG增強(qiáng)HSP65-MUC1誘生MUC1特異性CTL的作用1.方法分別在0、14、21天，用BCG和HSP65-MUC1經(jīng)小鼠四只皮下向心端免疫7周齡的C57BL/6雌性小鼠。BCG+HSP65-MUC1組注射劑量為1.32mg BCG+10μgHSP65-MUC1/200μlPBS/只小鼠；PBS注射組200μl PBS/只小鼠；HSP65-MUC1組10μg HSP65-MUC1/200μlPBS/只小鼠；BCG組1.32mg BCG/200μlPBS/只小鼠。免疫結(jié)束后第5d，分離小鼠的脾及淋巴結(jié)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。MUC1表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染MUC1表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按常規(guī)方法測(cè)定CTL活性(C.Stremmel，E.A.Greenfield，E.Howard，G.J.Freeman and V.K.Kuchroo.B7-2 Expressed on EL4lymphoma Suppresses Antitumor Immunity by an Interleukin4-dependent Mechanism.J.Exp.Med，1999，189(6)919-930.)。
2.結(jié)果同HSP65-MUC1組相比較，MUC1表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，BCG+HSP65-MUC1免疫組小鼠的脾及淋巴結(jié)CTL在效靶比為1∶20時(shí)的殺傷率為45％，HSP65-MUC1免疫組小鼠的脾和淋巴結(jié)CTL的殺傷率為34％。這表明BCG能夠加強(qiáng)HSP65-MUC1在小鼠所誘生的MUC1特異性的殺傷性T淋巴細(xì)胞的作用。BCG+HSP65-MUC1和HSP65-MUC1誘生特異性的CTL作用的比較見(jiàn)圖3。
3.結(jié)論BCG能顯著增強(qiáng)HSP65-MUC1所誘生的特異性CTL的作用。
實(shí)施例4 BCG增強(qiáng)HSP65-MUC1免疫所激發(fā)的特異性抑瘤作用1.方法于第0，14，28天，按照不同的分組，給予7周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫。實(shí)驗(yàn)小鼠分為4組，每組10只小鼠PBS組、HSP65-MUC1組、BCG組、BCG+HSP65-MUC1組。免疫部位小鼠四只皮下向心端，劑量PBS組，200μlPBS/只小鼠；HSP65-MUC1組，10μgHSP65-MUC1/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；BCG+HSP65-MUC1組，10μg HSP65-MUC1+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠。最后一次免疫后第5天，在小鼠右側(cè)背部皮下給小鼠接種轉(zhuǎn)染MUC1表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μlPBS/只小鼠。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況以及小鼠體重。當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱取各組小鼠的腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-MUC1轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)MUC1的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-MUC1組小鼠的腫瘤重量顯著低于HSP65-MUC1組。各組間腫瘤重量的比較見(jiàn)圖4。
4.結(jié)論BCG能夠顯著加強(qiáng)HSP65-MUC1免疫所激發(fā)的特異性抑瘤作用，能明顯抑制小鼠體內(nèi)MUC1陽(yáng)性腫瘤的生長(zhǎng)。
實(shí)施例5 BCG和HSP65-HER2體外誘導(dǎo)人的樹突狀細(xì)胞的活化和成熟一、分離人外周血單核細(xì)胞1.向50ml離心管中加入12.5ml泛影葡胺。
2.汲取50ml PBS/EDTA緩沖液移入一燒瓶中。
3.血袋經(jīng)70％乙醇洗滌后，將其中的血移入于含PBS/EDTA的燒瓶中，混勻。
4.從燒瓶中汲取25ml血液和PBS的混合液移入于含12.5ml泛影葡胺的50ml離心管中。
5.將上述試管離心，室溫，3000rpm/min(不使用剎車)，離心20-25min。
6.離心后棄去上清，汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
7.向含有分層細(xì)胞的離心管中加入PBS/EDTA緩沖液至45ml，1800rpm/min，4℃離心10min。此為第一次沖洗；第二次沖洗時(shí)為1200rpm/min，4℃離心7min。
8.離心后，加入PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞。
9.第三次洗滌，1200rpm/min，4℃離心7min(不用剎車)。
10.以6ml冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞，取2只試管分別加入6ml 52％冷的Percol。
11.汲取3ml細(xì)胞懸液緩慢移入(勿攪動(dòng)Percol)含6ml冷的52％ Percol試管中，在無(wú)剎車條件下2000rpm/min，4℃離心20min。
12.汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
13.以冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液洗滌分層細(xì)胞，4℃，1300rpm/min，無(wú)剎車離心10min。
14.以200目濾網(wǎng)濾過(guò)因死亡而成團(tuán)的細(xì)胞。
15.計(jì)數(shù)單核細(xì)胞數(shù)。
二、誘導(dǎo)未成熟的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)1.以IMDM稀釋單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)2×106/ml。
2.向12孔板中每一個(gè)孔加入1ml細(xì)胞懸液和1mlIMDM，將細(xì)胞于37℃，5％ CO2孵箱內(nèi)中培養(yǎng)2h。
3.2h后用IMDM洗滌去掉每孔中未粘附的細(xì)胞。
4.每孔中加入2ml含100ng(200U)/ml的GM-CSF和200U/ml的IL-4的IMDM培養(yǎng)液。
5.于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)5d，每2-3d換一次培養(yǎng)液。
三、用BCG和HSP65-HER2重組融合蛋白裝載樹突狀細(xì)胞1.于第五天，分別設(shè)立對(duì)照組只加培養(yǎng)液；BCG組加入BCG使其終濃度達(dá)30μg/ml；BCG+HSP65-HER2組加入BCG和HSP65-HER2使其終濃度分別為30μg/ml和100μg/ml；HSP65-HER2組加入HSP65-HER2使其終濃度達(dá)100μg/ml；陽(yáng)性對(duì)照組分別加入下列因子并使其終濃度分別為10ng/mlTNFα、10ng/mlIL-6、10ng/mlIL-1β和10μg/mlPGE2。直接將上述的BCG和HSP65-HER2蛋白和細(xì)胞因子加入未成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)中繼續(xù)培養(yǎng)2d。
2.于第7d收獲樹突狀細(xì)胞，進(jìn)行活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定。
四、樹突狀細(xì)胞活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定1.于第7天，收集樹突狀細(xì)胞于96孔板中，每孔加入200μl的細(xì)胞懸液。
2.1500rpm，4℃離心5分鐘，棄掉上清液，留存孔底的細(xì)胞。
3.每孔中加入200μlPBS緩沖液，洗滌兩次，棄掉上清液，留存孔底細(xì)胞。
4.分別向每孔中加入1μlFITC標(biāo)記的CD86熒光抗體(BD，USA)。
5.避光，冰上染色30分鐘。
6.染色完畢后，用PBS緩沖液，每孔200μl，洗滌細(xì)胞兩次。
7.洗滌完畢后，用400μl PBS緩沖液收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。
五、結(jié)果流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果表明同HSP65-HER2組相比較，BCG+HSP65-HER2能夠顯著地誘導(dǎo)DC的活化和成熟。DC是人體內(nèi)最為重要的抗原遞呈細(xì)胞，DC的活化和成熟標(biāo)志著DC的抗原遞呈能力加強(qiáng)，激活針對(duì)HER2的細(xì)胞毒性殺傷性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力加強(qiáng)；這樣有助于人體內(nèi)被激活的CTL殺傷體內(nèi)表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞，因此，可用于預(yù)防和或治療HER2陽(yáng)性腫瘤。各組間CD86熒光值的比較見(jiàn)圖5。
實(shí)施例6 BCG增強(qiáng)HSP65-HER2注射所激發(fā)的小鼠體內(nèi)的特異性抑瘤作用1.方法設(shè)立BCG+HSP65-HER2組、PBS組、BCG組、HSP65-HER2組、陽(yáng)性對(duì)照組(卡鉑注射組)。每組10只7周齡的C57BL/6雌性小鼠。于第0天給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染HER2表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μlPBS/只小鼠，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。于第2天按不同的分組給小鼠進(jìn)行第一次注射，注射部位是小鼠四只皮下向心端。PBS組200μl PBS/只小鼠；HSP65-HER2組10μg HSP65-HER2/200μlPBS/只小鼠；HSP65-HER2+BCG組10μgHSP65-HER2+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；BCG組1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；陽(yáng)性對(duì)照組卡鉑腹腔注射0.5mg/只小鼠。陽(yáng)性對(duì)照組每4天注射一次卡鉑，連續(xù)注射四次。于第16天時(shí)對(duì)各組小鼠進(jìn)行第二次注射，注射劑量和部位同第一次注射。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況，當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱取各組小鼠的腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-HER2轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)HER2的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-HER2組的小鼠腫瘤重量顯著低于HSP65-HER2組。
4.結(jié)論BCG能夠顯著增強(qiáng)HSP65-HER2注射所激發(fā)的特異性抑瘤作用，抑制HER2陽(yáng)性腫瘤的生長(zhǎng)。各組間腫瘤大小的比較見(jiàn)圖6。
實(shí)施例7 BCG加強(qiáng)HSP65-HER2誘生HER2特異性CTL的作用1.方法實(shí)驗(yàn)共設(shè)BCG+HSP65-HER2組、PBS注射組、HSP65-HER2組和BCG組，每組10只7周齡的C57BL/6雌性小鼠。分別在0、14、21d根據(jù)不同的分組對(duì)小鼠進(jìn)行免疫BCG+HSP65-HER2組，1.32mg BCG+10μgHSP65-HER2/200μlPBS/只小鼠；PBS注射組，200μl PBS/只小鼠；HSP65-HER2組，10μg HSP65-HER2/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μlPBS/只小鼠。免疫結(jié)束后第5d，分離各組小鼠的脾及淋巴結(jié)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，HER2表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染HER2表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按常規(guī)方法測(cè)定CTL活性。
2.結(jié)果同HSP65-HER2組相比較，BCG+HSP65-HER2免疫組小鼠的脾及淋巴結(jié)CTL在效靶比為1∶20的殺傷率為52％，HSP65-HER2免疫組小鼠的脾和淋巴結(jié)CTL的殺傷率為41％。這表明BCG能夠加強(qiáng)HSP65-HER2所誘生的HER2特異性CTL的作用。BCG+HSP65-HER2和HSP65-HER2誘生特異性CTL作用的比較見(jiàn)圖7。
3.結(jié)論BCG能夠顯著加強(qiáng)HSP65-HER2所誘生的HER2特異性的CTL，抑制HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
實(shí)施例8 BCG增強(qiáng)HSP65-HER2免疫所激發(fā)的特異性抑瘤作用1.方法于第0，14，28天，按照不同的分組，給予7周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫。小鼠分為4組，每組10只小鼠PBS組、HSP65-HER2組、BCG組、BCG+HSP65-HER2組。免疫部位小鼠四只皮下向心端。免疫劑量PBS組，200μlPBS/只小鼠；HSP65-HER2組，10μgHSP65-HER2/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；BCG+HSP65-HER2組，10μg HSP65-HER2+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠。最后一次免疫后第5天，給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染HER2表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μlPBS/只小鼠，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況以及小鼠體重。當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱取各組小鼠的腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-HER2轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)HER2的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-HER2組的小鼠腫瘤重量顯著低于HSP65-HER2組。各組間腫瘤重量的比較見(jiàn)圖8。
4.結(jié)論BCG能夠顯著增強(qiáng)HSP65-HER2免疫所激發(fā)的特異性抑瘤作用，能明顯抑制小鼠體內(nèi)HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
實(shí)施例9 BCG和HSP65-PSA體外誘導(dǎo)人的樹突狀細(xì)胞的活化和成熟一、分離人外周血單核細(xì)胞1.向50ml離心管中加入12.5ml泛影葡胺。
2.汲取50ml PBS/EDTA緩沖液移入一燒瓶中。
3.血袋經(jīng)70％乙醇洗滌后，將其中的血移入于含PBS/EDTA的燒瓶中，混勻。
4.從燒瓶中汲取25ml血液和PBS的混合液移入于含12.5ml泛影葡胺的50ml離心管中。
5.將上述試管離心，室溫，3000rpm/min(不使用剎車)，離心20-25min。
6.離心后棄去上清，汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
7.向含有分層細(xì)胞的離心管中加入PBS/EDTA緩沖液至45ml，1800rpm/min，4℃離心10min。此為第一次沖洗；第二次沖洗時(shí)為1200rpm/min，4℃離心7min。
8.離心后，加入PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞。
9.第三次洗滌，1200rpm/min，4℃離心7min(不用剎車)。
10.以6ml冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞，取2只試管分別加入6ml 52％冷的Percol。
11.汲取3ml細(xì)胞懸液緩慢移入(勿攪動(dòng)Percol)含6ml冷的52％Percol試管中，在無(wú)剎車條件下2000rpm/min，4℃離心20min。
12.汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
13.以冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液洗滌分層細(xì)胞，4℃，1300rpm/min，無(wú)剎車離心10min。
14.以200目濾網(wǎng)濾過(guò)因死亡而成團(tuán)的細(xì)胞。
15.計(jì)數(shù)單核細(xì)胞數(shù)。
二、誘導(dǎo)未成熟的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)1.以IMDM稀釋單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)2×106/ml。
2.向12孔板中每一個(gè)孔加入1ml細(xì)胞懸液和1mlIMDM，將細(xì)胞于37℃，5％ CO2孵箱內(nèi)中培養(yǎng)2h。
3.2h后用IMDM洗滌去掉每孔中未粘附的細(xì)胞。
4.每孔中加入2ml含100ng(200U)/ml的GM-CSF和200U/ml的IL-4的IMDM培養(yǎng)液。
5.于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)5d，每2-3d換一次培養(yǎng)液。
三、用BCG和HSP65-PSA融合蛋白裝載樹突狀細(xì)胞1.于第五天，分別設(shè)立對(duì)照組只加培養(yǎng)液；BCG組加入BCG使其終濃度達(dá)30μg/ml；BCG+HSP65-PSA組加入BCG和HSP65-PSA使其終濃度分別為30μg/ml和100μg/ml；HSP65-PSA組加入HSP65-PSA使其終濃度達(dá)100μg/ml；陽(yáng)性對(duì)照組分別加入下列因子使其終濃度分別為10ng/mlTNFα、10ng/mlIL-6、10ng/mlIL-1β和10μg/mlPGE2。直接將上述的BCG和HSP65-PSA蛋白和細(xì)胞因子加入未成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)中繼續(xù)培養(yǎng)2d。
2.第7d收獲樹突狀細(xì)胞，進(jìn)行活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定四、樹突狀細(xì)胞活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定1.于第7天收集樹突狀細(xì)胞，于96孔板中，每孔加入200μl的細(xì)胞懸液。
2.1500rpm，4℃離心5分鐘，棄掉上清液，留存孔底的細(xì)胞。
3.每孔中加入200μlPBS緩沖液，洗滌兩次，棄掉上清液，留存孔底細(xì)胞。
4.分別向每孔中加入1μlFITC標(biāo)記的CD86熒光抗體(BD，USA)。
5.避光，冰上染色30分鐘。
6.染色完畢后，用PBS緩沖液，每孔200μl，洗滌細(xì)胞兩次。
7.洗滌完畢后，用400μl PBS緩沖液收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。
五、結(jié)果流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果表明同HSP65-PSA組相比較，BCG+HSP65-PSA能夠顯著地誘導(dǎo)DC的活化和成熟。DC是人體內(nèi)最為重要的抗原遞呈細(xì)胞，DC的活化和成熟標(biāo)志著DC的抗原遞呈能力加強(qiáng)，激活針對(duì)PSA的細(xì)胞毒性殺傷性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力加強(qiáng)；這樣有助于人體內(nèi)被激活的CTL殺傷體內(nèi)PSA陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，因此，可用于預(yù)防和或治療PSA陽(yáng)性腫瘤。
各組間CD86熒光值的比較見(jiàn)圖9。
實(shí)施例10 BCG增強(qiáng)HSP65-PSA注射所激發(fā)的特異性抑瘤作用1.方法設(shè)立BCG+HSP65-PSA組、PBS組(陰性對(duì)照組)、BCG組、HSP65-PSA組、陽(yáng)性對(duì)照組(卡鉑注射組)。每組10只7周齡的C57BL/6雌性小鼠。于第0天給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染PSA表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μlPBS/只小鼠，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。于第2天按不同的分組給小鼠進(jìn)行第一次注射，注射部位是小鼠四只皮下向心端。PBS組200μl PBS/只小鼠；HSP65-PSA組10μg HSP65-PSA/200μlPBS/只小鼠；HSP65-PSA+BCG組10μg HSP65-PSA+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；BCG組1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；陽(yáng)性對(duì)照組卡鉑腹腔注射0.5mg/只小鼠。陽(yáng)性對(duì)照組每4天注射一次卡鉑，連續(xù)注射四次。于第16天時(shí)對(duì)各組小鼠進(jìn)行第二次注射，注射劑量和注射部位同第一次注射。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況，當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱量各組小鼠的腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備
將pcDNA3-GFP-PSA轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)PSA的克隆。
3.結(jié)果HSP65-PSA+BCG組的小鼠腫瘤重量顯著低于HSP65-PSA組(P＜005)。
4.結(jié)論BCG能夠顯著增強(qiáng)HSP65-PSA注射所激發(fā)的特異性抑瘤作用，抑制表達(dá)PSA腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
各組腫瘤重量的比較見(jiàn)圖10。
實(shí)施例11 BCG加強(qiáng)HSP65-PSA誘生PSA特異性CTL的作用1.方法實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組PBS組、HSP65-PSA組、BCG+HSP65-PSA組和BCG組。分別在0、14、21d根據(jù)不同的分組給7周齡的C57BL/6雌性小鼠免疫，免疫部位是小鼠四只皮下向心端。免疫劑量BCG+HSP65-PSA組，1.32mg BCG+10μgHSP65-PSA/200μlPBS/只小鼠；PBS組，200μlPBS/只小鼠；HSP65-PSA組，10μgHSP65-PSA/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μlPBS/只小鼠。免疫結(jié)束后第5d，分離小鼠的脾及淋巴結(jié)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，PSA表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染PSA表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按常規(guī)方法測(cè)定CTL活性。
2.結(jié)果同HSP65-PSA組相比較，PSA轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，BCG+HSP65-PSA免疫組小鼠的脾及淋巴結(jié)CTL在效靶比為1∶20的殺傷率為47％，HSP65-PSA融合蛋白免疫組小鼠的脾和淋巴結(jié)CTL的殺傷率為36％。這表明BCG能夠加強(qiáng)HSP65-PSA免疫所誘生的PSA特異性的CTL。BCG+HSP65-PSA和HSP65-PSA免疫誘生PSA特異性CTL強(qiáng)度的比較見(jiàn)圖11。
3.結(jié)論BCG能夠顯著加強(qiáng)HSP65-PSA所誘生的特異性CTL的作用。
實(shí)施例12 BCG增強(qiáng)HSP65-PSA免疫所激發(fā)的特異性抑瘤作用1.方法于第0，14，28天，按照不同的分組，給予7周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫。小鼠分為4組，每組10只小鼠PBS組、HSP65-PSA組、BCG組、BCG+HSP65-PSA組。免疫部位小鼠四只皮下向心端。免疫劑量PBS組，200μlPBS/只小鼠；HSP65-PSA組，10μgHSP65-PSA/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；BCG+HSP65-PSA組，10μgHSP65-PSA+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠。最后一次免疫后第5天，給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染PSA表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μl PBS/只小鼠，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況以及小鼠體重。當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱量各組小鼠的腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-PSA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)PSA的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-PSA組小鼠的腫瘤重量顯著地低于HSP65-PSA組。各組間腫瘤重量的比較見(jiàn)圖12。
4.結(jié)論BCG能夠加強(qiáng)HSP65-PSA免疫所激發(fā)的特異性抑瘤作用，抑制表達(dá)PSA腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
實(shí)施例13 BCG和HSP65-HPV體外誘導(dǎo)人的樹突狀細(xì)胞的活化和成熟一、分離人外周血單核細(xì)胞1.向50ml離心管中加入12.5ml泛影葡胺。
2.汲取50ml PBS/EDTA緩沖液移入一燒瓶中。
3.血袋經(jīng)70％乙醇洗滌后，將其中的血移入于含PBS/EDTA的燒瓶中，混勻。
4.從燒瓶中汲取25ml血液和PBS的混合液移入于含12.5ml泛影葡胺的50ml離心管中。
5.將上述試管離心，室溫，3000rpm/min(不使用剎車)，離心20-25min。
6.離心后棄去上清，汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
7.向含有分層細(xì)胞的離心管中加入PBS/EDTA緩沖液至45ml，1800rpm/min，4℃離心10min。此為第一次沖洗；第二次沖洗時(shí)為1200rpm/min，4℃離心7min。
8.離心后，加入PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞。
9.第三次洗滌，1200rpm/min，4℃離心7min(不用剎車)。
10.以6ml冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞，取2只試管分別加入6ml 52％冷的Percol。
11.汲取3ml細(xì)胞懸液緩慢移入(勿攪動(dòng)Percol)含6ml冷的52％ Percol試管中，在無(wú)剎車條件下2000rpm/min，4℃離心20min。
12.汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
13.以冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液洗滌分層細(xì)胞，4℃，1300rpm/min，無(wú)剎車離心10min。
14.以200目濾網(wǎng)濾過(guò)因死亡而成團(tuán)的細(xì)胞。
15.計(jì)數(shù)單核細(xì)胞數(shù)。
二、誘導(dǎo)未成熟的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)1.以IMDM稀釋單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)2×106/ml。
2.向12孔板中每一個(gè)孔加入1ml細(xì)胞懸液和1mlIMDM，將細(xì)胞于37℃，5％ CO2孵箱內(nèi)中培養(yǎng)2h。
3.2h后用IMIM洗滌去掉每孔中未粘附的細(xì)胞。
4.每孔中加入2ml含100ng(200U)/ml的GM-CSF和200U/ml的IL-4的IMDM培養(yǎng)液。
5.于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)5d，每2-3d換一次培養(yǎng)液。
三、用BCG和HSP65-HPV融合蛋白裝載樹突狀細(xì)胞1.于第五天，分別設(shè)立對(duì)照組只加培養(yǎng)液；BCG組加入BCG使其終濃度達(dá)30μg/ml；BCG+HSP65-HPV組加入BCG和HSP65-HPV使其終濃度分別為30μg/ml和100μg/ml；HSP65-HPV組加入HSP65-HPV使其終濃度達(dá)100μg/ml；陽(yáng)性對(duì)照組分別加入下列因子使其終濃度分別為10ng/mlTNFα、10ng/mlIL-6、10ng/mlIL-1β和10μg/mlPGE2。直接將上述的BCG和HSP65-HPV融合蛋白和細(xì)胞因子加入未成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)中繼續(xù)培養(yǎng)2d。
2.第7d收獲樹突狀細(xì)胞，進(jìn)行活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定。
四、樹突狀細(xì)胞活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定
1.于第7天，收集樹突狀細(xì)胞，于96孔板中，每孔加入200μl的細(xì)胞。
2.1500rpm，4℃離心5分鐘，棄掉上清液，留存孔底的細(xì)胞。
3.每孔中加入200μlPBS緩沖液，洗滌兩次，棄掉上清液，留存孔底細(xì)胞。
4.分別向每孔中加入1μlFITC標(biāo)記的CD86熒光抗體(BD，USA)。
5.避光，冰上染色30分鐘。
6.染色完畢后，用PBS緩沖液，每孔200μl，洗滌細(xì)胞兩次。
7.洗滌完畢后，用400μl PBS緩沖液收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。
五、結(jié)果流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果表明同HSP65-HPV組相比較，BCG+HSP65-HPV能夠顯著地誘導(dǎo)DC的活化和成熟。DC是人體內(nèi)最為重要的抗原遞呈細(xì)胞，DC的活化和成熟標(biāo)志著DC的抗原遞呈能力加強(qiáng)，激活針對(duì)HPV的細(xì)胞毒性殺傷性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力加強(qiáng)；人體內(nèi)被激活的CTL殺傷體內(nèi)感染HPV的細(xì)胞，因此，可用于預(yù)防和或治療HPV感染。
各組CD86熒光值的比較見(jiàn)圖13。
實(shí)施例14 BCG加強(qiáng)HSP65-HPV注射所激發(fā)的特異性殺傷HPV感染細(xì)胞的作用1.方法設(shè)立五個(gè)試驗(yàn)組，即PBS組(陰性對(duì)照組)、BCG組、HSP65-HPV組、BCG+HSP65-HPV組和卡鉑組(陽(yáng)性對(duì)照組)。每組10只7周齡的C57BL/6雌性小鼠。于第0天給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染HPV表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μlPBS/只小鼠，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。于第2天，按不同分組對(duì)小鼠進(jìn)行第一次注射，注射部位是小鼠四只皮下向心端。注射劑量為HSP65-HPV組，10μg HSP65-HPV/200μlPBS/只小鼠；BCG+HSP65-HPV組，10μgHSP65-HPV+1.32mg BCG/PBS200μl/只小鼠；PBS組，200μl PBS/只小鼠；BCG組，1.32mgBCG/200μl PBS；陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組小鼠每4天注射一次卡鉑，腹腔注射0.5mg卡鉑/只小鼠，連續(xù)注射四次。于第16天時(shí)，對(duì)各組小鼠進(jìn)行第二次注射，注射劑量和部位同第一次注射。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況，當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱量各組小鼠腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-HPV轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)HPV的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-HPV組小鼠的腫瘤重量顯著低于HSP65-HPV組(秩和檢驗(yàn)，P＜0.05)，說(shuō)明BCG能夠加強(qiáng)HSP65-HPV注射所激發(fā)的特異性殺傷HPV感染細(xì)胞的作用。各組間腫瘤重量的比較見(jiàn)圖14。
4.結(jié)論BCG能夠加強(qiáng)HSP65-HPV所激發(fā)的小鼠體內(nèi)特異性的殺傷HPV感染細(xì)胞的作用。
實(shí)施例15 BCG加強(qiáng)HSP65-HPV在小鼠誘生HPV特異性殺傷性T淋巴細(xì)胞的作用1.方法實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組，即PBS組、BCG組、HSP65-HPV組和BCG+HSP65-HPV組，每組10只小鼠。分別在0、14、21d根據(jù)不同的分組對(duì)7周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫，免疫部位是小鼠四只向心端。免疫劑量BCG+HSP65-HPV組，1.32mg BCG+10μgHSP65-HPV/200μlPBS/只小鼠；PBS注射組，200μlPBS/只小鼠，；HSP65-HPV組，10μgHSP65-HPV/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μlPBS/只小鼠。免疫結(jié)束后第5d，分離小鼠的脾及淋巴結(jié)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，HPV表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染HPV表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按常規(guī)方法測(cè)定CTL活性。
2.結(jié)果同HSP65-HPV組相比，HPV表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，BCG+HSP65-HPV免疫組的脾及淋巴結(jié)CTL在效靶比為1∶20的殺傷率為46％，HSP65-HPV融合蛋白免疫小鼠的脾和淋巴結(jié)CTL殺傷率為37％。各組誘生特異性CTL作用的比較見(jiàn)圖15。
3.結(jié)論BCG能夠加強(qiáng)HSP65-HPV免疫所誘生的特異性CTL的作用，特異性的CTL能夠殺傷HPV感染細(xì)胞。
實(shí)施例16 BCG加強(qiáng)HSP65-HPV免疫所激發(fā)的特異性殺傷HPV感染細(xì)胞作用1.方法于第0，14，28天，按照不同的分組，給予7周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫。小鼠分為4組，每組10只小鼠PBS組、HSP65-HPV組、BCG組、BCG+HSP65-HPV組。免疫部位小鼠四只皮下向心端。免疫劑量PBS組，200μlPBS/只小鼠；HSP65-HPV組，10μgHSP65-HPV/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；BCG+HSP65-HPV組，10μg HSP65-HPV+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠。最后一次免疫后第5天，給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染HPV表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μlPBS/只小鼠，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況。當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱量各組小鼠腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-HPV轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)HPV的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-HPV組小鼠的腫瘤重量顯著低于HSP65-HPV組。說(shuō)明BCG能夠加強(qiáng)HSP65-HPV所激發(fā)的特異性殺傷HPV感染細(xì)胞的作用。各組間激發(fā)特異性殺傷HPV感染細(xì)胞作用的比較見(jiàn)圖16。
4.結(jié)論BCG能夠加強(qiáng)HSP65-HPV免疫所激發(fā)的特異性殺傷HPV感染細(xì)胞的作用。
實(shí)施例17 BCG和HSP65-SARS體外誘導(dǎo)人的樹突狀細(xì)胞的活化和成熟一、分離人外周血單核細(xì)胞1.向50ml離心管中加入12.5ml泛影葡胺。
2.汲取50ml PBS/EDTA緩沖液移入一燒瓶中。
3.血袋經(jīng)70％乙醇洗滌后，將其中的血移入于含PBS/EDTA的燒瓶中，混勻。
4.從燒瓶中汲取25ml血液和PBS的混合液移入于含12.5ml泛影葡胺的50ml離心管中。
5.將上述試管離心，室溫，3000rpm/min(不使用剎車)，離心20-25min。
6.離心后棄去上清，汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
7.向含有分層細(xì)胞的離心管中加入PBS/EDTA緩沖液至45ml，1800rpm/min，4℃離心10min。此為第一次沖洗；第二次沖洗時(shí)為1200rpm/min，4℃離心7min。
8.離心后，加入PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞。
9.第三次洗滌，1200rpm/min，4℃離心7min(不用剎車)。
10.以6ml冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞，取2只試管分別加入6ml 52％冷的Percol。
11.汲取3ml細(xì)胞懸液緩慢移入(勿攪動(dòng)Percol)含6ml冷的52％Percol試管中，在無(wú)剎車條件下2000rpm/min，4℃離心20min。
12.汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
13.以冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液洗滌分層細(xì)胞，4℃，1300rpm/min，無(wú)剎車離心10min。
14.以200目濾網(wǎng)濾過(guò)因死亡而成團(tuán)的細(xì)胞。
15.計(jì)數(shù)單核細(xì)胞數(shù)。
二、誘導(dǎo)未成熟的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)1.以IMDM稀釋單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)2×106/ml。
2.向12孔板中每一個(gè)孔加入1ml細(xì)胞懸液和1mlIMDM，將細(xì)胞于37℃，5％ CO2孵箱內(nèi)中培養(yǎng)2h。
3.2h后用IMDM洗滌去掉每孔中未粘附的細(xì)胞。
4.每孔中加入2ml含100ng(200U)/ml的GM-CSF和200U/ml的IL-4的IMDM培養(yǎng)液。
5.于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)5d，每2-3d換一次培養(yǎng)液。
三、用BCG和HSP65-SARS融合蛋白裝載樹突狀細(xì)胞1.于第五天，分別設(shè)立對(duì)照組只加培養(yǎng)液；BCG組加入BCG使其終濃度達(dá)30μg/ml；BCG+HSP65-SARS組加入BCG和HSP65-SARS使其終濃度分別為30μg/ml和100μg/ml；HSP65-SARS組加入HSP65-SARS使其終濃度達(dá)100μg/ml；陽(yáng)性對(duì)照組分別加入下列因子并使其終濃度分別為10ng/mlTNFα、10ng/mlIL-6、10ng/mlIL-1β和10μg/mlPGE2。直接將上述的BCG和HSP65-SARS蛋白和細(xì)胞因子加入未成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)中繼續(xù)培養(yǎng)2d。
2.7d收獲樹突狀細(xì)胞，進(jìn)行活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定。
四、樹突狀細(xì)胞活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定1.于第7天，收集樹突狀細(xì)胞于96孔板中，每孔加入200μl的細(xì)胞懸液。
2.1500rpm，4℃離心5分鐘，棄掉上清液，留存孔底的細(xì)胞。
3.每孔中加入200μlPBS緩沖液，洗滌兩次，棄掉上清液，留存孔底細(xì)胞。
4.分別向每孔中加入1μlFITC標(biāo)記的CD86熒光抗體(BD，USA)。
5.避光，冰上染色30分鐘。
6.染色完畢后，用PBS緩沖液，每孔200μl，洗滌細(xì)胞兩次。
7.洗滌完畢后，用400μl PBS緩沖液收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。
五、結(jié)果流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果表明同HSP65-SARS組相比較，BCG+HSP65-SARS能夠顯著地誘導(dǎo)DC的活化和成熟。DC是人體內(nèi)最為重要的抗原遞呈細(xì)胞，DC的活化和成熟標(biāo)志著DC的抗原遞呈能力加強(qiáng)，激活針對(duì)SARS的細(xì)胞毒性殺傷性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力加強(qiáng)；人體內(nèi)被激活的CTL殺傷體內(nèi)SARS感染細(xì)胞，因此，可用于預(yù)防和或治療SARS感染。
各組間CD86熒光值的比較見(jiàn)圖17。
實(shí)施例18 BCG加強(qiáng)HSP65-SARS注射所激發(fā)的特異性殺傷SARS感染細(xì)胞的作用1.方法設(shè)立五個(gè)試驗(yàn)組，即PBS組(陰性對(duì)照組)、BCG組、HSP65-SARS組、BCG+HSP65-SARS組和卡鉑組(陽(yáng)性對(duì)照組)。每組10只7周齡的C57BL/6雌性小鼠。于第0天給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染SARS表位抗原肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105/200μlPBS/只小鼠，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。于第2天，按不同分組對(duì)小鼠進(jìn)行第一次注射，注射部位為小鼠四只皮下向心端。注射劑量為HSP65-SARS組，10μg HSP65-SARS/200μlPBS/只小鼠；BCG+HSP65-SARS組，10μg HSP65-SARS+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；PBS組，200μl PBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組小鼠每4天注射一次卡鉑，腹腔注射0.5mg卡鉑/只小鼠，連續(xù)注射四次。于第16天時(shí)，對(duì)各組小鼠進(jìn)行第二次注射，注射劑量和部位同第一次注射。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況，當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱量各組小鼠腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-SARS轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)SARS的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-SARS組小鼠的腫瘤重量顯著低于HSP65-SARS組(秩和檢驗(yàn)，P＜0.05)，說(shuō)明BCG能夠加強(qiáng)HSP65-SARS注射所激發(fā)的特異性殺傷SARS感染細(xì)胞的作用。各組激發(fā)特異性殺傷SARS感染細(xì)胞作用的比較見(jiàn)圖18。
4.結(jié)論BCG能夠顯著加強(qiáng)HSP65-SARS注射所激發(fā)的特異性殺傷SARS感染細(xì)胞的作用。
實(shí)施例19 BCG加強(qiáng)HSP65-SARS誘生SARS特異性殺傷性T淋巴細(xì)胞的作用1.方法實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組，即PBS組、BCG組、HSP65-SARS組和BCG+HSP65-SARS組，每組10只小鼠。分別在0、14、21d根據(jù)不同的分組對(duì)7周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫，免疫部位是小鼠四肢皮下向心端。免疫劑量為BCG+HSP65-SARS組，1.32mg BCG+10μgHSP65-SARS/200μlPBS/只小鼠；PBS注射組，200μlPBS/只小鼠；HSP65-SARS組，10μg HSP65-SARS/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μlPBS/只小鼠。免疫結(jié)束后第5d，分離小鼠的脾及淋巴結(jié)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，SARS表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染SARS表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按常規(guī)方法測(cè)定CTL活性。
2.結(jié)果同HSP65-SARS組相比較，SARS表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，BCG+HSP65-SARS免疫組的脾及淋巴結(jié)CTL的殺傷率為46％。HSP65-SARS融合蛋白免疫小鼠的脾和淋巴結(jié)CTL殺傷率為38％。這表明BCG能夠加強(qiáng)HSP65-SARS免疫所誘生的特異性CTL的作用。各組誘生特異性CTL的作用的比較見(jiàn)圖19。
3.結(jié)論BCG能夠加強(qiáng)HSP65-SARS所誘生的特異性CTL的作用，所誘生的特異性CTL能夠殺傷HPV感染細(xì)胞。
實(shí)施例20 BCG增強(qiáng)HSP65-SARS免疫所激發(fā)的特異性殺傷SARS感染細(xì)胞的作用1.方法于第0，14，28天，按照不同的分組，給予7周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫。小鼠分為4組，每組10只小鼠PBS組、HSP65-SARS組、BCG組、BCG+HSP65-SARS組。免疫部位小鼠四只皮下向心端。免疫劑量PBS組，200μlPBS/只小鼠；HSP65-SARS組，10μgHSP65-SARS/200μlPBS/只小鼠；BCG組，BCG 1.32mg/200μl PBS/只小鼠；BCG+HSP65-SARS組，10μg HSP65-SARS+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠。最后一次免疫后第5天，給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染SARS表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μlPBS，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況以及小鼠體重。當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱量各組小鼠腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-SARS轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)MUC1的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-SARS組小鼠的腫瘤重量顯著低于HSP65-SARS組。說(shuō)明BCG能夠加強(qiáng)HSP65-SARS免疫所激發(fā)的特異性殺傷SARS感染細(xì)胞的作用。各組激發(fā)特異性殺傷SARS感染細(xì)胞作用的比較見(jiàn)圖20。
4.結(jié)論BCG能夠顯著加強(qiáng)HSP65-SARS免疫所激發(fā)的特異性殺傷SARS感染細(xì)胞作用。
實(shí)施例21 BCG和HSP65-HBcAg體外誘導(dǎo)人的樹突狀細(xì)胞的活化和成熟一、分離人外周血單核細(xì)胞1.向50ml離心管中加入12.5ml泛影葡胺。
2.汲取50ml PBS/EDTA緩沖液移入一燒瓶中。
3.血袋經(jīng)70％乙醇洗滌后，將其中的血移入于含PBS/EDTA的燒瓶中，混勻。
4.從燒瓶中汲取25ml血液和PBS的混合液移入于含12.5ml泛影葡胺的50ml離心管中。
5.將上述試管離心，室溫，3000rpm/min轉(zhuǎn)速(不使用剎車)離心20-25min。
6離心后棄去上清，汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
7.向含有分層細(xì)胞的離心管中加入PBS/EDTA緩沖液至45ml，1800rpm/min，4℃，離心10min。此為第一次沖洗；第二次沖洗時(shí)為1200rpm/min，4℃離心7min。
8.離心后，加入PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞。
9.第三次洗滌，1200rpm/min，4℃離心7min(不用剎車)。
10.以6ml冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞，取2只試管，各加6ml 52％冷的Percol。
11.汲取3ml細(xì)胞懸液緩慢移入(勿攪動(dòng)Percol)含6ml冷的52％ Percol試管中，在無(wú)剎車條件下2000r/min，4℃離心20min。
12.汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
13.以冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液洗滌分層細(xì)胞，4℃，1300rpm/min，無(wú)剎車離心10min。
14.以200目濾網(wǎng)濾過(guò)因死亡而成團(tuán)的細(xì)胞。
15.計(jì)數(shù)單核細(xì)胞數(shù)。
二、誘導(dǎo)未成熟的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)1.以IMDM稀釋單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)2×106rsub/ml。
2.向12孔板中每一個(gè)孔加入1ml細(xì)胞懸液和1mlIMDM培養(yǎng)液，將盛有細(xì)胞的12孔板于37℃，5％ CO2孵箱內(nèi)中培養(yǎng)2h。
3.2h后用IMDM洗滌去掉每孔中未粘附的細(xì)胞4.每孔中加入2ml含100ng(200U)/ml的GM-CSF和200U/ml的IL-4的IMDM培養(yǎng)液。
5.于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)5d，每2-3d換一次培養(yǎng)液。
三、用BCG和HSP65-HBcAg融合蛋白裝載樹突狀細(xì)胞1.于第五天，分別設(shè)立對(duì)照組只加培養(yǎng)液；BCG組加入BCG使其終濃度達(dá)30μg/ml；BCG+HSP65-HBcAg組加入BCG和HSP65-HBcAg使其終濃度分別為30μg/ml和100μg/ml；HSP65-HBcAg組加入HSP65-HBcAg使其終濃度為100μg/ml；陽(yáng)性對(duì)照組分別加入下列因子使其終濃度分別為10ng/mlTNFα、10ng/mlIL-6、10ng/mlIL-1β和10μg/mlPGE2。直接將上述的BCG和HSP65-HBcAg蛋白加入未成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)中繼續(xù)培養(yǎng)2d。
2.7d收獲樹突狀細(xì)胞，進(jìn)行活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定。
四、樹突狀細(xì)胞活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定1.于第7天，收集樹突狀細(xì)胞于96孔板中，每孔加入200μl的細(xì)胞懸液。
2.1500rpm，4℃離心5分鐘，棄掉上清液，留存孔底的細(xì)胞。
3.每孔中加入200μlPBS緩沖液，洗滌兩次，棄掉上清液，留存孔底細(xì)胞。
4.分別向每孔中加入1μlFITC標(biāo)記的CD86熒光抗體(BD，USA)。
5.避光，冰上染色30分鐘。
6.染色完畢后，用PBS緩沖液，每孔200μl，洗滌細(xì)胞兩次。
7.洗滌完畢后，用400μl PBS緩沖液收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。
五、結(jié)果流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果表明同HSP65-HBcAg組相比較，BCG+HSP65-HBcAg能夠顯著地誘導(dǎo)DC的活化和成熟。DC是人體內(nèi)最為重要的抗原遞呈細(xì)胞，DC的活化和成熟標(biāo)志著DC的抗原遞呈能力加強(qiáng)，激活針對(duì)HBV的細(xì)胞毒性殺傷性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力加強(qiáng)；人體內(nèi)被激活的CTL殺傷體內(nèi)感染HBV的細(xì)胞，因此，可用于預(yù)防和或治療HBV感染。
各組間CD86熒光值的比較見(jiàn)圖21。
實(shí)施例22 BCG加強(qiáng)HSP65-HBcAg注射所激發(fā)的特異性殺傷HBV感染細(xì)胞的作用1.方法設(shè)立五個(gè)試驗(yàn)組，即PBS組(陰性對(duì)照組)、BCG組、HSP65-HBcAg組、BCG+HSP65-HBcAg組和卡鉑組(陽(yáng)性對(duì)照組)。每組10只7周齡的C57BL/6雌性小鼠。于第0天給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染HBV表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μlPBS/只小鼠，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。于第2天，按不同分組對(duì)小鼠進(jìn)行第一次注射，注射部位為小鼠四只皮下向心端。注射劑量為HSP65-HBcAg組，10μg HSP65-HBcAg/200μlPBS/只小鼠；BCG+HSP65-HBcAg組，10μg HSP65-HBcAg+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；PBS組，200μl PBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組小鼠每4天注射一次卡鉑，腹腔注射0.5mg卡鉑/只小鼠，連續(xù)注射四次。于第16天時(shí)，對(duì)各組小鼠進(jìn)行第二次注射，注射劑量和部位同第一次注射。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況，當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱量各組小鼠腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-HBV轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)HBV的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-HBcAg組小鼠的腫瘤重量顯著低于HSP65-HBcAg組(秩和檢驗(yàn)，P＜0.05)，說(shuō)明BCG能夠加強(qiáng)HSP65-HBcAg注射所激發(fā)的特異性殺傷HBV感染細(xì)胞作用。各組所激發(fā)的特異性殺傷HBV感染細(xì)胞作用的比較見(jiàn)圖22。
4.結(jié)論BCG能夠加強(qiáng)HSP65-HBcAg注射所激發(fā)的特異性殺傷HBV感染細(xì)胞的作用。
實(shí)施例23 BCG加強(qiáng)HSP65-HBcAg在小鼠誘生HBV特異性殺傷性T淋巴細(xì)胞作用1.方法實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組，即PBS組、BCG組、HSP65-HBcAg組和BCG+HSP65-HBcAg組，每組10只小鼠。分別在0、14、21d根據(jù)不同的分組對(duì)7周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫，免疫部位是小鼠四肢皮下向心端，免疫劑量為BCG+HSP65-HBcAg組，1.32mgBCG+10μgHSP65-HBcAg/200μlPBS/只小鼠；PBS組，200μlPBS/只小鼠；HSP65-HBcAg組，10μg HSP65-HBcAg/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mgBCG/200μlPBS/只小鼠。免疫結(jié)束后第5d，分離小鼠的脾及淋巴結(jié)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，HBV表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染HBV表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按常規(guī)方法測(cè)定CTL活性。
2.結(jié)果同HSP65-HBcAg組相比較，HBV表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，BCG+HSP65-HBcAg免疫組的脾及淋巴結(jié)CTL的殺傷率為49％。HSP65-HBcAg融合蛋白免疫小鼠的脾和淋巴結(jié)CTL殺傷率為38％。這表明BCG能夠加強(qiáng)重組融合蛋白HSP65-HBcAg免疫所誘生的特異性殺傷HBV感染細(xì)胞的作用。各組誘生特異性CTL殺傷HBV感染細(xì)胞作用的比較見(jiàn)圖23。
實(shí)施例24 BCG增強(qiáng)HSP65-HBcAg免疫所激發(fā)的特異性殺傷HBV感染細(xì)胞作用1.方法于第0，14，28天，按照不同的分組，給予7周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫。小鼠分為4組，每組10只小鼠PBS組、HSP65-HBcAg組、BCG組、BCG+HSP65-HBcAg組。免疫部位是小鼠四只皮下向心端。免疫劑量為PBS組，200μlPBS/只小鼠；HSP65-HBcAg組，10μgHSP65-HBcAg/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；BCG+HSP65-HBcAg組，10μg HSP65-HBcAg+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠。最后一次免疫后第5天，給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染HBV表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μlPBS/只小鼠，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況以及小鼠體重。當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×觯Q量各組小鼠的腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-HBV轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)HBV的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-HBcAg組小鼠的腫瘤重量顯著低于HSP65-HBcAg組小鼠的腫瘤重量。說(shuō)明BCG能夠增強(qiáng)HSP65-HBcAg免疫所激發(fā)的特異性殺傷HBV感染細(xì)胞的作用。各組激發(fā)的特異性殺傷HBV感染細(xì)胞的作用比較見(jiàn)圖24。
4.結(jié)論BCG能夠增強(qiáng)HSP65-HBcAg免疫所激發(fā)的特異性殺傷HBV感染細(xì)胞作用。
實(shí)施例25 BCG和HSP65-HCV體外誘導(dǎo)人的樹突狀細(xì)胞的活化和成熟一、分離人外周血單核細(xì)胞1.向50ml離心管中加入12.5ml泛影葡胺。
2.汲取50ml PBS/EDTA緩沖液移入一燒瓶中。
3.血袋經(jīng)70％乙醇洗滌后，將其中的血移入于含PBS/EDTA的燒瓶中，混勻。
4.從燒瓶中汲取25ml血液和PBS的混合液移入于含12.5ml泛影葡胺的50ml離心管中。
5.將上述試管離心，室溫，3000rpm/min轉(zhuǎn)速(不使用剎車)離心20-25min。
6離心后棄去上清，汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
7.向含有分層細(xì)胞的離心管中加入PBS/EDTA緩沖液至45ml，1800rpm/min，4℃，離心10min。此為第一次沖洗；第二次沖洗時(shí)為1200rpm/min，4℃離心7min。
8.離心后，加入PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞。
9.第三次洗滌，1200rpm/min，4℃離心7min(不用剎車)。
10.以6ml冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞，取2只試管，各加6ml 52％冷的Percol。
11.汲取3ml細(xì)胞懸液緩慢移入(勿攪動(dòng)Percol)含6ml冷的52％ Percol試管中，在無(wú)剎車條件下2000r/min，4℃離心20min。
12.汲取界面層細(xì)胞，移入一新離心管中。
13.以冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液洗滌分層細(xì)胞，4℃，1300rpm/min，無(wú)剎車離心10min。
14.以200目濾網(wǎng)濾過(guò)因死亡而成團(tuán)的細(xì)胞。
15.計(jì)數(shù)單核細(xì)胞數(shù)。
二、誘導(dǎo)未成熟的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)1.以IMDM稀釋單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)2×106rsub/ml。
2.向12孔板中每一個(gè)孔加入1ml細(xì)胞懸液和1mlIMDM培養(yǎng)液，將盛有細(xì)胞的12孔板于37℃，5％ CO2孵箱內(nèi)中培養(yǎng)2h。
3.2h后用IMDM洗滌去掉每孔中未粘附的細(xì)胞4.每孔中加入2ml含100ng(200U)/ml的GM-CSF和200U/ml的IL-4的IMDM培養(yǎng)液。
5.于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)5d，每2-3d換一次培養(yǎng)液。
三、用BCG和HSP65-HCV融合蛋白裝載樹突狀細(xì)胞1.于第五天，分別設(shè)立對(duì)照組只加培養(yǎng)液；BCG組加入BCG使其終濃度達(dá)30μg/ml；BCG+HSP65-HCV組加入BCG和HSP65-HCV使其終濃度分別為30μg/ml和100μg/ml；HSP65-HCV組加入HSP65-HCV使其終濃度為100μg/ml；陽(yáng)性對(duì)照組分別加入下列因子使其終濃度分別為10ng/mlTNFα、10ng/mlIL-6、10ng/mlIL-1β和10μg/mlPGE2。直接將上述的BCG和HSP65-HCV蛋白加入未成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)中繼續(xù)培養(yǎng)2d。
2.7d收獲樹突狀細(xì)胞，進(jìn)行活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定。
四、樹突狀細(xì)胞活化和成熟指標(biāo)的測(cè)定1.于第7天，收集樹突狀細(xì)胞于96孔板中，每孔加入200μl的細(xì)胞懸液。
2.1500rpm，4℃離心5分鐘，棄掉上清液，留存孔底的細(xì)胞。
3.每孔中加入200μlPBS緩沖液，洗滌兩次，棄掉上清液，留存孔底細(xì)胞。
4.分別向每孔中加入1μlFITC標(biāo)記的CD86熒光抗體(BD，USA)。
5.避光，冰上染色30分鐘。
6.染色完畢后，用PBS緩沖液，每孔200μl，洗滌細(xì)胞兩次。
7.洗滌完畢后，用400μl PBS緩沖液收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。
五、結(jié)果流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果表明同HSP65-HCV組相比較，BCG+HSP65-HCV能夠顯著地誘導(dǎo)DC的活化和成熟。DC是人體內(nèi)最為重要的抗原遞呈細(xì)胞，DC的活化和成熟標(biāo)志著DC的抗原遞呈能力加強(qiáng)，激活針對(duì)HBV的細(xì)胞毒性殺傷性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力加強(qiáng)；人體內(nèi)被激活的CTL殺傷體內(nèi)感染HCV的細(xì)胞，因此，可用于預(yù)防和或治療HCV感染。
各組間CD86熒光值的比較見(jiàn)圖25。
實(shí)施例26 BCG加強(qiáng)HSP65-HCV注射所激發(fā)的特異性殺傷HCV感染細(xì)胞的作用1.方法設(shè)立五個(gè)試驗(yàn)組，即PBS組(陰性對(duì)照組)、BCG組、HSP65-HCV組、BCG+HSP65-HCV組和卡鉑組(陽(yáng)性對(duì)照組)。每組10只7周齡的C57BL/6雌性小鼠。于第0天給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染HCV表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μlPBS/只小鼠，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。于第2天，按不同分組對(duì)小鼠進(jìn)行第一次注射，注射部位為小鼠四只皮下向心端。注射劑量為HSP65-HCV組，10μg HSP65-HCV/200μlPBS/只小鼠；BCG+HSP65-HCV組，10μg HSP65-HCV+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；PBS組，200μl PBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組小鼠每4天注射一次卡鉑，腹腔注射0.5mg卡鉑/只小鼠，連續(xù)注射四次。于第16天時(shí)，對(duì)各組小鼠進(jìn)行第二次注射，注射劑量和部位同第一次注射。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況，當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱量各組小鼠腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-HCV轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)HBV的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-HCV組小鼠的腫瘤重量顯著低于HSP65-HCV組(秩和檢驗(yàn)，P＜0.05)，說(shuō)明BCG能夠加強(qiáng)HSP65-HCV注射所激發(fā)的特異性殺傷HCV感染細(xì)胞作用。各組所激發(fā)的特異性殺傷HCV感染細(xì)胞作用的比較見(jiàn)圖26。
4.結(jié)論BCG能夠加強(qiáng)HSP65-HCV注射所激發(fā)的特異性殺傷HCV感染細(xì)胞的作用。
實(shí)施例27 BC6加強(qiáng)HSP65-HCV在小鼠誘生HCV特異性殺傷性T淋巴細(xì)胞作用1.方法實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組，即PBS組、BCG組、HSP65-HCV組和BCG+HSP65-HCV組，每組10只小鼠。分別在0、14、21d根據(jù)不同的分組對(duì)7周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫，免疫部位是小鼠四肢皮下向心端，免疫劑量為BCG+HSP65-HCV組，1.32mg BCG+10μgHSP65-HCV/200μlPBS/只小鼠；PBS組，200μlPBS/只小鼠；HSP65-HCV組，10μg HSP65-HCV/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μlPBS/只小鼠。免疫結(jié)束后第5d，分離小鼠的脾及淋巴結(jié)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，HCV表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染HCV表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按常規(guī)方法測(cè)定CTL活性。
2.結(jié)果同HSP65-HCV組相比較，HCV表位抗原多肽編碼基因轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，BCG+HSP65-HCV免疫組的脾及淋巴結(jié)CTL的殺傷率為48％。HSP65-HCV融合蛋白免疫小鼠的脾和淋巴結(jié)CTL殺傷率為38％。這表明BCG能夠加強(qiáng)重組融合蛋白HSP65-HCV免疫所誘生的特異性殺傷HCV感染細(xì)胞的作用。各組誘生特異性CTL殺傷HCV感染細(xì)胞作用的比較見(jiàn)圖27。
實(shí)施例28 BCG增強(qiáng)HSP65-HCV免疫所激發(fā)的特異性殺傷HCV感染細(xì)胞作用1.方法于第0，14，28天，按照不同的分組，給予7周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫。小鼠分為4組，每組10只小鼠PBS組、HSP65-HCV組、BCG組、BCG+HSP65-HCV組。免疫部位是小鼠四只皮下向心端。免疫劑量為PBS組，200μlPBS/只小鼠；HSP65-HCV組，10μgHSP65-HCV/200μlPBS/只小鼠；BCG組，1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠；BCG+HSP65-HCV組，10μg HSP65-HCV+1.32mg BCG/200μl PBS/只小鼠。最后一次免疫后第5天，給所有小鼠接種轉(zhuǎn)染HCV表位抗原多肽編碼基因的B16細(xì)胞1.5×105個(gè)/200μlPBS/只小鼠，接種部位是小鼠右側(cè)背部皮下。每日觀察小鼠的狀態(tài)，腫瘤的生長(zhǎng)情況以及小鼠體重。當(dāng)PBS對(duì)照組小鼠開始死亡，或PBS對(duì)照組小鼠少于20％的小鼠瘤重低于0.4g時(shí)，開始?xì)⑹笕×?，稱量各組小鼠的腫瘤重量。
2.腫瘤細(xì)胞制備將pcDNA3-GFP-HCV轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞經(jīng)G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的克隆，將這些克隆分別消化進(jìn)入培養(yǎng)瓶并擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR及Western Blot鑒定出高表達(dá)HCV的克隆。
3.結(jié)果BCG+HSP65-HCV組小鼠的腫瘤重量顯著低于HSP65-HCV組小鼠的腫瘤重量。說(shuō)明BCG能夠增強(qiáng)HSP65-HCV免疫所激發(fā)的特異性殺傷HCV感染細(xì)胞的作用。各組激發(fā)的特異性殺傷HCV感染細(xì)胞的作用比較見(jiàn)圖24。
4.結(jié)論BCG能夠增強(qiáng)HSP65-HCV免疫所激發(fā)的特異性殺傷HCV感染細(xì)胞作用。
權(quán)利要求
1一種疫苗組合物，其特征在于包括重組融合蛋白和佐劑，所述重組融合蛋白是融合了熱休克蛋白的融合蛋白，所述佐劑為卡介苗。
2如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于所述重組融合蛋白是結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65位于氨基端的融合蛋白。
3如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于所述重組融合蛋白是結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合粘蛋白1構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-MUC1。
4如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于所述重組融合蛋白是結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合人上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-HER2。
5如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于所述重組融合蛋白是結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合人前列腺特異抗原構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-PSA。
6如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于所述重組融合蛋白是結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合乳頭瘤病毒多表位抗原構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-HPV。
7如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于所述重組融合蛋白是結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合SARS病毒抗原構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-SARS。
8如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于所述重組融合蛋白是結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合乙型肝炎核心抗原構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-HBcAg。
9如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于所述重組融合蛋白是結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65融合丙型肝炎抗原表位構(gòu)成的重組融合蛋白HSP65-HCV。
10權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療腫瘤的藥物中的用途。
11如權(quán)利要求10的用途，所述腫瘤包括但不限于人乳腺癌、直腸癌、結(jié)直腸癌、喉癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌等。
12權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療病毒感染所引起的疾病的藥物中的用途。
13如權(quán)利要求12的用途，所述的病毒感染所引起的疾病包括SARS病毒感染疾病、乳頭瘤病毒感染、宮頸癌、丙型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染和乙型肝炎病毒感染導(dǎo)致的肝癌、肝硬化等。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于腫瘤預(yù)防和治療的重組融合蛋白及其佐劑，用于預(yù)防和治療病毒感染的重組融合蛋白及其佐劑。本發(fā)明的重組融合蛋白能夠激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic Tlymphocytes，CTL)。本發(fā)明中的重組融合蛋白及其佐劑主要用于預(yù)防和/或治療人類腫瘤和病毒感染所引起的疾病。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1762491SQ20041008404
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2004年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月19日
發(fā)明者王麗穎, 任淑萍, 于永利 申請(qǐng)人:北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司