專利名稱：從小牛血中提取刺激細(xì)胞呼吸活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從血液中提取具有促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氧和葡萄糖的攝取和利用作用的血液提取物的方法，尤其涉及采用超濾等生物技術(shù)從小牛血中提取刺激細(xì)胞呼吸活性物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
小牛血去蛋白提取物是以小牛血液為原料，制備的小分子(分子量＜6000)肽、核苷酸和寡糖類物質(zhì)。其主要藥理作用是促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氧和葡萄糖的攝取和利用，使葡萄糖的無氧代謝轉(zhuǎn)向有氧代謝，促使能量物質(zhì)生成增多，延長細(xì)胞生存時(shí)間，促進(jìn)組織細(xì)胞代謝及功能恢復(fù)和組織修復(fù)。
我國衛(wèi)生部1992年批準(zhǔn)進(jìn)口奧地利HAFSLUND NYCOMED藥廠的Actovegin注射劑及片劑在臨床上使用，臨床療效肯定，國產(chǎn)該品種的注射劑型已獲得生產(chǎn)批文。
中國專利(專利號(hào)為96120777.9)公開了一種提取小牛血去蛋白提取物的方法，此方法采用乙醇為溶媒去蛋白，然后去除溶媒，這種方法使提取的物質(zhì)的活性損失，并且還存在處理量低、生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量和收率低等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從小牛血中提取刺激細(xì)胞呼吸活性物質(zhì)的方法，該方法解決了目前技術(shù)存在的處理量低、生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量和收率低，并且活性損失較高的問題。
為了解決上述技術(shù)問題本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的
一種從小牛血中提取刺激細(xì)胞呼吸活性物質(zhì)的方法，它包括下述步驟1).取非傳染區(qū)的、經(jīng)檢驗(yàn)合格的健康小牛，采用無菌動(dòng)脈方法采血，在采集過程中，不斷用表面消毒過的棒狀器具進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的棒狀器具上，除去纖維蛋白，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃～40℃下反復(fù)凍融，于低溫(0～8℃)條件下膠體磨中反復(fù)勻漿，顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；3).將勻漿液經(jīng)過濾、不同截留分子量超濾膜分級(jí)超濾，超濾后最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮并病毒滅活后得小牛血去蛋白提取物。
所述的一種從小牛血中提取刺激細(xì)胞呼吸活性物質(zhì)的方法，其特征在于它包括下述步驟1).取非傳染區(qū)的、經(jīng)檢驗(yàn)合格的、出生6個(gè)月以內(nèi)的健康小牛，采用無菌動(dòng)脈方法采血，在采集過程中，不斷用表面消毒過的器具，器具為木棒進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在木棒上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃～40℃下反復(fù)凍融二-四次，于0--8℃下膠體磨中勻漿2分鐘，重復(fù)三次，在顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；3).取勻漿液離心后，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；取濾液A，用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量8000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，經(jīng)低溫減壓濃縮5-8倍得濃縮液；將濃縮液病毒在55-65℃下滅活10小時(shí)；滅活后的濃縮液用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾后的濃縮液；將檢驗(yàn)合格的超濾后的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，低溫(-18℃±2℃)貯存，即得小牛血去蛋白提取物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果如下采用生物技術(shù)及分級(jí)超濾手段，在本產(chǎn)品的制造工藝中，首次采用分級(jí)超濾手段。超濾膜分離技術(shù)作為二十一世紀(jì)六大高新技術(shù)之一，以其常溫低壓下操作、無相變、能耗低等顯著特點(diǎn)已成為一種分離過程的標(biāo)準(zhǔn)，在歐美等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)得到了廣泛的使用，超濾膜的分離過程具有以下幾個(gè)顯著特點(diǎn)1)在常溫和低壓下進(jìn)行分離，因而能耗低，從而使設(shè)備的運(yùn)行費(fèi)用低；2)設(shè)備體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，故投資費(fèi)用低；3)超濾分離過程只是簡(jiǎn)單的加壓輸送液體，工藝流程簡(jiǎn)單，易于操作管理；4)超濾膜是由高分子材料制成的均勻連續(xù)體，純物理方法過濾，物質(zhì)在分離過程中不發(fā)生質(zhì)的變化，并且在使用過程中不會(huì)有任何雜質(zhì)脫落，保證超濾液的純凈。
采用分級(jí)超濾技術(shù)手段，使本品活性物質(zhì)活性狀態(tài)保持好，不經(jīng)過除溶媒過程，提高質(zhì)量，提高收率；可進(jìn)行工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)，生產(chǎn)周期短、成本降低。
傳統(tǒng)技術(shù)提取工藝 本發(fā)明提取工藝處 理 量 25萬ml 50萬ml生產(chǎn)周期 7天 4天產(chǎn)量 2.5萬ml 10萬ml活性 QO2＝4.0～4.4μlO2/mg·h QO2＝4.2～4.8μlO2/mg·hSI＝2.5～2.8 SI＝2.7～3.0收率 10％ 20％
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一1).取非傳染區(qū)的、經(jīng)檢驗(yàn)合格的出生5個(gè)月的健康小牛，采用無菌動(dòng)脈方法采血，在采集過程中，不斷用表面消毒過的木棒進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的木棒上，除去纖維蛋白，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-20℃冷凍，30℃下融化，反復(fù)三次，于低溫0--5℃條件下膠體磨中反復(fù)勻漿，顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；3).將勻漿液經(jīng)過濾、不同截留分子量的超濾膜分級(jí)超濾，超濾后最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮并病毒滅活后得小牛血去蛋白提取物。
實(shí)施例二1).取非傳染區(qū)的、經(jīng)檢驗(yàn)合格的出生6個(gè)月的健康小牛，采用無菌動(dòng)脈方法采血，在采集過程中，不斷用表面消毒過的木棒進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的木棒上，除去纖維蛋白，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-20℃冷凍，20℃下融化，反復(fù)三次，于低溫5--8℃條件下膠體磨中反復(fù)勻漿，顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；3).將勻漿液經(jīng)過濾、不同截留分子量的超濾膜分級(jí)超濾，超濾后最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮并病毒滅活后得小牛血去蛋白提取物。
實(shí)施例三1).取非傳染區(qū)的、經(jīng)檢驗(yàn)合格的出生3個(gè)月的健康小牛，采用無菌動(dòng)脈方法采血，在采集過程中，不斷用表面消毒過的木棒進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的玻璃棒，除去纖維蛋白，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-20℃冷凍，40℃下融化，反復(fù)三次，于低溫0--5℃條件下膠體磨中反復(fù)勻漿，顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；3).將勻漿液經(jīng)過濾、不同截留分子量的超濾膜分級(jí)超濾，超濾后最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮并病毒滅活后得小牛血去蛋白提取物。
實(shí)施例四1).取非傳染區(qū)的、經(jīng)檢驗(yàn)合格的、出生4個(gè)月的健康小牛，采用無菌動(dòng)脈方法采血，在采集過程中，不斷用表面消毒過的器具，器具為木棒或玻璃棒進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在木棒上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃凍，40℃下融化，反復(fù)四次，于0--5℃下膠體磨中勻漿2分鐘，重復(fù)三次，在顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；3).取勻漿液于4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量8000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，經(jīng)低溫減壓濃縮8倍得濃縮液；將濃縮液病毒在60℃下滅活，滅活10小時(shí)左右；滅活后的濃縮液用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾后的濃縮液；將檢驗(yàn)合格的超濾后的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，低溫-20℃貯存，即得小牛血去蛋白提取物。
實(shí)施例五1).取非傳染區(qū)的、經(jīng)檢驗(yàn)合格的、出生2個(gè)月的健康小牛，采用無菌動(dòng)脈方法采血，在采集過程中，不斷用表面消毒過的器具，器具為木棒進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在木棒上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白小牛血；
2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃凍，20℃下融化，反復(fù)凍融二次，于0--5℃下膠體磨中勻漿2分鐘，重復(fù)三次，在顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；3).取勻漿液離心后，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量8000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，經(jīng)低溫減壓濃縮6倍得濃縮液；將濃縮液病毒在65℃下滅活，滅活15小時(shí)左右；滅活后的濃縮液用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾后的濃縮液；將檢驗(yàn)合格的超濾后的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，低溫(-18℃±2℃)貯存，即得小牛血去蛋白提取物。
實(shí)施例六1).取非傳染區(qū)的、經(jīng)檢驗(yàn)合格的、出生6個(gè)月以內(nèi)的健康小牛，采用無菌動(dòng)脈方法采血，在采集過程中，不斷用表面消毒過的器具，器具為木棒進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在木棒上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-20℃凍，10℃下融化，反復(fù)凍融四次，于0～8℃下膠體磨中勻漿2分鐘，重復(fù)三次，在顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；3).取勻漿液離心后，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量6000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，經(jīng)低溫減壓濃縮5倍得濃縮液；將濃縮液病毒在60℃下滅活；滅活后的濃縮液用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾后的濃縮液；將檢驗(yàn)合格的超濾后的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，低溫(-18℃±2℃)貯存，即得小牛血去蛋白提取物。使用上述本發(fā)明提供的方法取得的小牛血去蛋白提取物性狀為淡黃色澄明液體，其檢測(cè)情況如下[檢查]pH值為6.5-7.5(中國藥典2000年版二部附錄VIH)吸收度420nm波長處的吸收度小于0.25(中國藥典2000年版二部附錄IVA)蛋白質(zhì)陰性細(xì)菌內(nèi)毒素每1ml中含細(xì)菌內(nèi)毒素量小于1EU(中國藥典2000年版二部附錄XIE)照高效液相色譜法(中國藥典2000年版二部附錄VD)測(cè)定大分子量物質(zhì)。用凝膠色譜柱(如Pharmarcia Superdex Peptide或TSKG2000SW柱)，乙腈-三氟醋酸-水(40∶0.1∶60)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為214nm，按面積歸一化法計(jì)算，含高分子量物質(zhì)(分子量＞5800D)的量不得過2.0％。
采用瓦氏呼吸檢壓儀測(cè)定豚鼠肝勻漿的呼吸活力，從測(cè)得的耗氧量計(jì)算出計(jì)算出呼吸活力QO2為4.0～6.0μlO2/mg·h；刺激指數(shù)(SI)為2.5～4.0。
(1)總固體量，精密量取2ml，置稱量瓶中，在55℃下真空干燥至恒重，計(jì)算出，每1ml中含固型物為38～60mg。
(2)采用中國生物制品規(guī)程附錄蛋白質(zhì)含量測(cè)定法測(cè)定本發(fā)明多肽含量，每1ml為0.90～1.5mg。
(3)游離氨基酸含量，用高效液相進(jìn)行氨基酸分析，游離氨基酸含量每1ml不少于0.80～1.2mg。
權(quán)利要求
1.一種從小牛血中提取刺激細(xì)胞呼吸活性物質(zhì)的方法，它包括下述步驟1).取非傳染區(qū)的、經(jīng)檢驗(yàn)合格的健康小牛，采用無菌動(dòng)脈方法采血，在采集過程中，不斷用表面消毒過的器具進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的器具上，除去纖維蛋白，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃～40℃下反復(fù)凍融，于低溫(0～8℃)條件下膠體磨中反復(fù)勻漿，顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；3).將勻漿液經(jīng)過濾、不同截留分子量的超濾膜分級(jí)超濾，超濾后最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮并病毒滅活后得小牛血去蛋白提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從小牛血中提取刺激細(xì)胞呼吸活性物質(zhì)的方法，其特征在于它包括下述步驟1).取非傳染區(qū)的、經(jīng)檢驗(yàn)合格的、出生6個(gè)月以內(nèi)的健康小牛，采用無菌動(dòng)脈方法采血，在采集過程中，不斷用表面消毒過的器具，器具為木棒或玻璃棒進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在木棒上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃～40℃下反復(fù)凍融二～四次，于0～8℃下膠體磨中勻漿2分鐘，重復(fù)三次，在顯微鏡下檢查細(xì)胞基本破碎，得勻漿液；3).取勻漿液離心后，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；取濾液A，用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量8000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，經(jīng)低溫減壓濃縮5-8倍得濃縮液；將濃縮液病毒在55～65℃下滅活10小時(shí)；滅活后的濃縮液用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾后的濃縮液；將檢驗(yàn)合格的超濾后的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，低溫(-18℃±2℃)貯存，即得小牛血去蛋白提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從小牛血中提取刺激細(xì)胞呼吸活性物質(zhì)的方法，它包括下述步驟取健康小牛，采用無菌動(dòng)脈方法采血，不斷用表面消毒過的器具進(jìn)行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的器具上，除去纖維蛋白得到去纖維蛋白小牛血；將其在－30℃～40℃下反復(fù)凍融，于低溫(0～8℃)條件下膠體磨中反復(fù)勻漿，得勻漿液；將勻漿液經(jīng)過濾、不同截留分子量的超濾膜分級(jí)超濾，超濾后最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮并病毒滅活后得小牛血去蛋白提取物。所用設(shè)備體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，投資費(fèi)用低；制備的活性物質(zhì)活性狀態(tài)保持好，不經(jīng)過除溶媒過程，提高質(zhì)量，提高收率；可進(jìn)行工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)，生產(chǎn)周期短、成本降低。
文檔編號(hào)A61K35/14GK1634137SQ200410087620
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月19日
發(fā)明者王光, 李莉, 史曉丹, 馬骉 申請(qǐng)人:沈陽斯佳科技發(fā)展有限公司