專利名稱：人尿激肽原酶在制備肺動(dòng)脈高壓癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及人尿激肽原酶的新醫(yī)藥用途，即人尿激肽原酶在制備治療和/或預(yù)防肺動(dòng)脈高壓癥藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺動(dòng)脈高壓癥(Pulmonary Artery Hypertension，PAH)是指肺動(dòng)脈平均壓在靜息時(shí)高于2.67kPa(20mmHg)或在運(yùn)動(dòng)時(shí)高于4.00kPa(30mmHg)。但出生后2周的新生兒，正常肺動(dòng)脈壓力可比上述數(shù)值高些。廣義來講，肺動(dòng)脈高壓不僅僅指肺動(dòng)脈壓力的升高，無論肺動(dòng)脈壓超過正常，還是動(dòng)靜脈壓差升高，或是肺血管阻力超出正常范圍均可提示肺動(dòng)脈高壓。肺動(dòng)脈高壓包括特發(fā)性肺高壓、繼發(fā)性肺高壓、肺靜脈閉塞性疾病三種情況。①特發(fā)性肺高壓可能由于以下幾種原因所致先天性肺小動(dòng)脈發(fā)育不全、多因素肺血管攣縮、反復(fù)發(fā)作的肺小動(dòng)脈血栓栓塞、自身免疫、多發(fā)性肺栓塞、家族性肺高壓等。②繼發(fā)性肺高壓可由于以下幾種原因所致心臟疾病，梗阻性氣道疾病、肺實(shí)質(zhì)疾病、肺血管疾病、神經(jīng)肌肉疾病等呼吸疾病。③肺靜脈閉塞性疾病可由以下幾種原因所致占位性病變、結(jié)核、類肉瘤病、纖維化縱隔炎等。
低氧性肺動(dòng)脈高壓是嬰幼兒肺炎、慢性肺源性心臟病、呼吸窘迫綜合征等多種疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理環(huán)節(jié)。各種原因所致肺泡缺氧均會(huì)引起肺血管的收縮反應(yīng)，增加肺循環(huán)阻力，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的肺動(dòng)脈高壓。慢性缺氧時(shí)，肺小動(dòng)脈長(zhǎng)期處于收縮狀態(tài)，可引起肺血管中膜平滑肌肥大，血管硬化，形成穩(wěn)定的肺動(dòng)脈高壓。缺氧所致紅細(xì)胞增多，血液粘度增高以及肺循環(huán)內(nèi)微血栓的形成，也可增加肺循環(huán)阻力。肺動(dòng)脈高壓可增加右心室射血的阻力，導(dǎo)致右心室肥大，甚至心力衰竭。
人尿激肽原酶(Human Urinary Kallidinogenase)，是從健康男性人尿中提取精制的糖蛋白，分子量約54000道爾頓，具有激活人血漿激肽原轉(zhuǎn)化為激肽、擴(kuò)張血管增加血流量、改善血液循環(huán)的作用，并且還有增加紅細(xì)胞的變形性和抑制血小板聚集、延長(zhǎng)再鈣化時(shí)間改善血液粘稠的作用。本申請(qǐng)人的在先專利申請(qǐng)“02116783.4人尿激肽原酶在制備治療和預(yù)防腦梗塞藥物中的應(yīng)用”公開了它的一種醫(yī)藥用途。還有關(guān)于人尿激肽原酶用于改善下肢循環(huán)的臨床研究報(bào)道。本發(fā)明人經(jīng)過認(rèn)真研究和動(dòng)物試驗(yàn)證明，人尿激肽原酶對(duì)肺動(dòng)脈高壓有明顯的治療和/或預(yù)防作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人尿激肽原酶用于治療和/或預(yù)防肺動(dòng)脈高壓癥的用途，即用于制備治療和/或預(yù)防肺動(dòng)脈高壓的藥物的用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于治療和/或預(yù)防肺動(dòng)脈高壓的含有人尿激肽原酶的藥物組合物。
本發(fā)明的人尿激肽原酶對(duì)肺動(dòng)脈高壓有明顯的治療作用，也有明顯的預(yù)防作用，一般以藥物組合物的形式使用。這種組合物含有治療有效量的作為活性成分的人尿激肽原酶和可藥用輔料，主要?jiǎng)┬桶▋龈煞坩槃┖妥⑸湟簞?，通常以靜脈注射途徑給藥。
經(jīng)靜脈注射給藥的人尿激肽原酶組合物，一般是固體的滅菌組合物形式。這些組合物還可以含有添加劑，特別是甘露醇、右旋糖苷、水解明膠、檸檬酸鈉、甘氨酸等。在使用時(shí)溶解于滅菌注射用水或其它注射用滅菌介質(zhì)中。
經(jīng)靜脈注射給藥的人尿激肽原酶組合物也可以是水溶液形式。組合物還可以含有添加劑，特別是甘露醇、氯化鈉、葡萄糖等。
人尿激肽原酶組合物治療和/或預(yù)防肺動(dòng)脈高壓癥的劑量根據(jù)病情的嚴(yán)重程度、治療時(shí)間而定，一般靜脈注射給藥每次0.1-0.2PNA單位，每天1-2次。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1制備人尿激肽原酶干粉針取過濾滅菌的人尿激肽原酶150PNA單位，加7.5克甘露醇、2克右旋糖酐40、5克檸檬酸鈉溶解，調(diào)節(jié)PH至中性，加注射用水至500毫升，無菌過濾，分裝1000個(gè)安瓿中，無菌條件下冷凍干燥，即得。
實(shí)施例2制備人尿激肽原酶注射液取過濾滅菌的人尿激肽原酶水溶150PNA單位，調(diào)節(jié)PH至中性，加注射用水至500毫升，加氯化鈉調(diào)節(jié)等滲，無菌過濾，分裝1000個(gè)安瓿中，即得。
實(shí)施例3人尿激肽原酶對(duì)犬急性缺氧性肺動(dòng)脈高壓的作用實(shí)驗(yàn)方法選擇體重10～16kg普通雜種犬，麻醉用3％戊巴比妥鈉首次于腹腔內(nèi)注射(30mg/kg)，試驗(yàn)中再間斷小劑量靜脈注射予以維持。犬麻醉后行氣管插管，接呼吸機(jī)，并從右頸外靜脈置入熱稀釋法漂浮導(dǎo)管(Gould，5F)，待達(dá)肺動(dòng)脈后與壓力監(jiān)護(hù)儀及記錄儀相接；再分別于右股動(dòng)靜脈留置導(dǎo)管并連接壓力監(jiān)護(hù)儀或靜脈持續(xù)輸注生理鹽水(100ml/h)。采用熱稀釋法每次注射生理鹽水5ml測(cè)定心輸出量(CO，L/min)。
完成上述動(dòng)物準(zhǔn)備后，先記錄以空氣通氣時(shí)的動(dòng)脈血?dú)饧案黜?xiàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)作為基礎(chǔ)對(duì)照，然后將吸入氧濃度調(diào)為10％，通氣10min，在第10min時(shí)重復(fù)上述測(cè)定作為缺氧對(duì)照，并從股動(dòng)脈及肺動(dòng)脈分別取血4ml(內(nèi)加EDTA-Na24mg)備測(cè)。此后停止缺氧，將吸入氧濃度調(diào)至21％，待各項(xiàng)血流動(dòng)力學(xué)和血?dú)庵笜?biāo)恢復(fù)到基礎(chǔ)狀態(tài)后，從右心房注入藥物，在注射后即刻、20min時(shí)再分別進(jìn)行缺氧試驗(yàn)10min，每次缺氧試驗(yàn)均與首次相同并取血備測(cè)。血樣中血管活性物質(zhì)如血管緊張素II(AT II)血栓素TXA2及前列環(huán)素PGI2(測(cè)定其穩(wěn)定代謝產(chǎn)物TXB2和6-Keto-PGF1a)的測(cè)定采用放射免疫藥盒。用自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀和自動(dòng)液閃儀檢測(cè)。
各指標(biāo)進(jìn)行組間和自身前后比較，用t檢驗(yàn)判斷其差異顯著性。
實(shí)驗(yàn)分組普通雜種犬20只，雌雄兼用，隨機(jī)分為5組，每組4只。
1.模型對(duì)照組2.L-精氨酸組，3.5g/kg3.人尿激肽原酶I組，人尿激肽原酶1.5×10-3PNAu4.人尿激肽原酶II組，人尿激肽原酶3×10-3PNAu5.人尿激肽原酶III組，人尿激肽原酶6×10-3PNAu實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型對(duì)照組動(dòng)物在缺氧10min后，肺動(dòng)脈平均壓(mPAP)、股動(dòng)脈平均壓(mBP)肺血管阻力(PVR)、全身血管阻力(SVR)等均較缺氧前明顯升高(P＜0.01)。L-精氨酸可顯著降低犬急性缺氧時(shí)的mPAP和mBP。用藥后10和30min，其mPAP分別下降0.61±0.19或0.65±0.24kPa；而mBP于用藥后30min下降1.85±0.51，兩項(xiàng)指標(biāo)與用藥前及對(duì)照組比較均有顯著差異(P＜0.05)。PVR及SVR雖較用藥前有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。L-精氨酸對(duì)犬急性缺氧時(shí)的心輸出量(CO)無明顯影響。
人尿激肽原酶I、II、III組均能明顯降低缺氧動(dòng)物mPAP和mBP水平，與缺氧前及對(duì)照組比較，用藥后10和30min均有顯著差異(P＜0.05)，且效應(yīng)呈劑量依賴性。人尿激肽原酶II、III組用藥后10和30min還能降低PVR和SVR，與缺血前比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，心輸出量(CO)稍有降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
模型對(duì)照組缺氧前動(dòng)脈血AT II含量(ng/L)為72.5±6.9，缺氧10min后升高為183.6±31.5；缺氧后TXB2含量也顯著上升，而前列環(huán)素穩(wěn)定代謝產(chǎn)物6-Keto-PGF1a含量卻降低，與缺氧前比較均有顯著差異(P＜0.05)。L-精氨酸治療組AT II含量和TXB2含量與模型對(duì)照組比較均有降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；6-Keto-PGF1a含量與模型對(duì)照組比較則有顯著差異(P＜0.05)。
人尿激肽原酶I、II、III組用藥后10和30min均能降低缺氧動(dòng)物AT II含量和TXB2含量，但僅人尿激肽原酶III組與模型對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)。人尿激肽原酶的三個(gè)劑量用藥后10和30min均能有效升高6-Keto-PGF1a含量，與模型對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)果表明，人尿激肽原酶能降低缺氧后TXA2/PGI2比值，舒張收縮的肺動(dòng)脈血管。
結(jié)論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，L-精氨酸和人尿激肽原酶可顯著降低麻醉犬急性缺氧時(shí)的肺動(dòng)脈平均壓，提示NO參與調(diào)節(jié)整體動(dòng)物的急性缺氧加壓反應(yīng)，NO的產(chǎn)生增多可抑制HPV。人尿激肽原酶能促進(jìn)肺部NO的生成，因此能降低肺血管張力，降低肺動(dòng)脈壓。人尿激肽原酶對(duì)急性缺氧性肺動(dòng)脈高壓具有良好的治療作用。
實(shí)施例4人尿激肽原酶對(duì)大鼠慢性間斷低氧性肺動(dòng)脈高壓的作用實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用低氧艙建立缺氧環(huán)境。向艙內(nèi)充氮?dú)?，并調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁亢桶榱骺諝饬髁?，使艙?nèi)氧濃度保持在10±0.5％，艙內(nèi)氣壓與大氣壓相等。將除正常對(duì)照組外的其它各組大鼠置于常壓低氧艙內(nèi)，每天持續(xù)缺氧8h，每周6天，共5周。各用藥組大鼠每天進(jìn)艙前尾靜脈注射相應(yīng)藥物。正常對(duì)照組置于同一室的空氣中。
5周后行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，稱量動(dòng)物后，用10％烏拉坦(10ml/kg)麻醉大鼠，分離大鼠頸外靜脈，行肺動(dòng)脈導(dǎo)管插入，經(jīng)頸靜脈、上腔靜脈、右心房、右心室至肺動(dòng)脈，通過波形確定導(dǎo)管前端所在位置，記錄右室壓肺動(dòng)脈壓。測(cè)壓后，從肺動(dòng)脈插管到達(dá)位置取血，用毛細(xì)管離心法測(cè)血紅細(xì)胞壓積(HCT)。然后開胸，摘取心臟和右肺下葉。肺葉用福爾馬林固定，留作組織學(xué)檢查。分離右心室、左心室和室間隔，自然干燥半小時(shí)后，稱量右心室重、左心室+室間隔重。以右心室重/(左心室+室間隔重)(％)，右心室重/體重(mg/100g)來反映右心室重量的變化。
將經(jīng)福爾馬林固定的肺葉脫水固定包埋切片(4μm厚度)，并以Gomori彈力纖維加Mayer-esin復(fù)染，制片后進(jìn)行組織學(xué)觀察。隨機(jī)觀察25條具備下述3個(gè)條件的肺小動(dòng)脈a.直徑30-100μm(平均58μm)；b.彈力纖維膜完整；c.位置靠近肺腺泡。并記錄其中含有肌層的肺小動(dòng)脈數(shù)量。
各指標(biāo)進(jìn)行組間和自身前后比較，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用X2檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
實(shí)驗(yàn)分組每組8只大鼠，體重150-200g，雌雄兼用。
1.正常對(duì)照組2.低氧對(duì)照組3.尼群地平組，8mg/kg4.人尿激肽原酶I組，人尿激肽原酶3.85×10-3PNAu5.人尿激肽原酶II組，人尿激肽原酶8.75×10-3PNAu6.人尿激肽原酶III組，人尿激肽原酶17.5×10-3PNAu實(shí)驗(yàn)結(jié)果低氧環(huán)境的各組大鼠在5周中共死亡13只，而在室內(nèi)空氣中飼養(yǎng)的正常對(duì)照組無一死亡，且其體重增加(116.9±26.8g)明顯高于低氧對(duì)照組(87.2±31.3g)、尼群地平組(86.9±25.4g)及人尿激肽原酶I II III組(P＜0.05)，而低氧的各組大鼠間體重增加無顯著差異(P＞0.05)。
慢性缺氧后，右心室壓和肺動(dòng)脈壓與正常對(duì)照組比較顯著升高(P＜0.05)。尼群地平治療組的右心室壓和肺動(dòng)脈壓均較低氧對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)。人尿激肽原酶I II III組能明顯降低缺氧動(dòng)物右心室壓和肺動(dòng)脈壓，與低氧組比較，均有顯著差異(P＜0.05)，且效應(yīng)呈劑量依賴性。
慢性缺氧后，右心室重/體重右心室重/(左心室+室間隔重)(％)顯著升高，與正常對(duì)照組大鼠比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各用藥組均能減輕缺氧引起的右室肥大(P＜0.05)，其中以人尿激肽原酶III組抑制缺氧性右室肥大的作用最顯著，與低氧組比較有顯著差異(P＜0.01)。
各低氧組的血紅細(xì)胞壓積(HCT)均較正常組顯著升高(P＜0.01)。但用藥組與低氧對(duì)照組比較無顯著差異(P＞0.05)。
慢性間斷低氧后，低氧對(duì)照組肺葉中含肌肺小動(dòng)脈數(shù)量與正常組比較顯著增多(P＜0.01)。與低氧組比較，各用藥組均能顯著抑制肺小動(dòng)脈的肌化(P＜0.05)。
討論大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠豬和人在慢性間斷缺氧的情況下，均可發(fā)生肺動(dòng)脈高壓和右心室肥大。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧大鼠的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中Ca2+濃度升高，增加灌流液中的Ca2+濃度也能增加缺氧大鼠的肺血管收縮反應(yīng)(HPV)，因此認(rèn)為鈣離子拮抗劑對(duì)抗HPV有良好作用。
Rodman等發(fā)現(xiàn)美藍(lán)能增強(qiáng)缺氧引起的具有完整內(nèi)皮的大鼠肺動(dòng)脈段的收縮，而美藍(lán)是通過阻斷內(nèi)皮依賴性血管舒張因子(NO)而發(fā)揮藥理作用的，這就間接提示EDRF可能參與肺血管張力調(diào)節(jié)。人尿激肽原酶能促進(jìn)緩激肽的生成，進(jìn)而促進(jìn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，引起一系列生物學(xué)效應(yīng)，其中包括擴(kuò)張血管和降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。
低氧引起肺血管收縮是肺內(nèi)維持最適通氣/血流比值的一個(gè)重要調(diào)節(jié)代償機(jī)制。Nagasaka用胸膜下血管微穿刺術(shù)，證明缺氧性肺血管收縮的主要部位在30-40μm的肺小動(dòng)脈。缺氧可刺激生長(zhǎng)因子產(chǎn)生從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖，使正常時(shí)的部分非肌性動(dòng)脈發(fā)生肌化，變成肌性動(dòng)脈，使得肌性動(dòng)脈的數(shù)量明顯增多。所以慢性缺氧數(shù)天后，即發(fā)現(xiàn)肺泡區(qū)非肌性血管的肌化增加。肺泡內(nèi)動(dòng)脈中膜的增厚和血管的肌化、血管腔變窄是肺動(dòng)脈高壓形成的重要形態(tài)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)以計(jì)算符合三個(gè)條件的含肌肺小動(dòng)脈數(shù)量來反映肺小動(dòng)脈肌化情況，發(fā)現(xiàn)尼群地平和人尿激肽原酶均能抑制低氧時(shí)肺小動(dòng)脈的肌化。
結(jié)論人尿激肽原酶能有效預(yù)防慢性間斷低氧引起的肺動(dòng)脈高壓。
權(quán)利要求
1.人尿激肽原酶在制備治療和/或預(yù)防肺動(dòng)脈高壓癥藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1所述的肺動(dòng)脈高壓癥為急性缺氧引起的肺動(dòng)脈高壓癥。
3.權(quán)利要求1所述的肺動(dòng)脈高壓癥為慢性間斷低氧引起的肺動(dòng)脈高壓癥。
4.一種用于治療和/或預(yù)防肺動(dòng)脈高壓癥的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的人尿激肽原酶和可藥用輔料。
5.權(quán)利要求4所述的藥物組合物是凍干粉針劑。
6.權(quán)利要求4所述的藥物組合物是水溶液注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及人尿激肽原酶用于制備治療肺動(dòng)脈高壓癥的藥物用途及按該方法制備的藥物組合物。本發(fā)明的人尿激肽原酶對(duì)肺動(dòng)脈高壓癥有明顯的治療作用，通常以藥物組合物配制成凍干粉針劑或注射液劑的形式使用。
文檔編號(hào)A61K38/49GK1706493SQ200410088439
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2004年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者傅和亮, 孫鐵, 苗丕渠, 王曉巖 申請(qǐng)人:廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司