專利名稱：人尿激肽原酶在制備急性冠脈疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及人尿激肽原酶的新醫(yī)藥用途，即人尿激肽原酶在制備治療急性冠狀動脈疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心血管疾病已成為21世紀(jì)人類健康的頭號殺手，其中最為兇險的是急性冠狀動脈綜合征(ACS)。ACS包括不穩(wěn)定心絞痛和急性心肌梗塞。統(tǒng)計資料顯示，全球每年有1700萬人死于心血管疾病，其中一半以上死于急性心肌梗塞。
人尿激肽原酶(Human Urinary Kallidinogenase)，是從健康男性人尿中提取精制的糖蛋白，分子量約54000道爾頓，具有激活人血漿激肽原轉(zhuǎn)化為激肽、擴張血管增加血流量、改善血液循環(huán)的作用，并且還有增加紅細(xì)胞的變形性和抑制血小板聚集、延長再鈣化時間改善血液粘稠的作用。本申請人的在先專利申請“0211678 3.4人尿激肽原酶在制備治療和預(yù)防腦梗塞藥物中的應(yīng)用”公開了它的一種醫(yī)藥用途。本發(fā)明人經(jīng)過認(rèn)真研究和動物試驗證明，人尿激肽原酶對急性冠狀動脈疾病有明顯的治療作用。
不穩(wěn)定心絞痛是心肌急劇的暫時的缺血與缺氧所引起的臨床癥候。急性心肌梗塞是由于冠狀動脈粥樣硬化、血栓形成或冠狀動脈持續(xù)痙攣，使冠狀動脈或分枝閉塞，導(dǎo)致心肌因持久缺血缺氧而發(fā)生壞死。盡快地改善心臟供血，改善冠狀動脈系統(tǒng)的血液循環(huán)，改善心肌細(xì)胞的氧供，減少心臟的負(fù)荷和心肌耗氧量是目前臨床上普遍的治療原則。目前對心絞痛發(fā)作最有效的處置措施是含服硝酸甘油片，而硝酸甘油呈速效但短效的特征，并不能滿足對心絞痛的治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人尿激肽原酶用于治療急性冠狀動脈疾病的用途，即用于制備治療急性冠狀動脈疾病的藥物的用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于治療急性冠狀動脈疾病的含有人尿激肽原酶的藥物組合物。
本發(fā)明的人尿激肽原酶對急性冠狀動脈疾病有明顯的治療作用，一般以藥物組合物的形式使用。這種組合物含有治療有效量的作為活性成分的人尿激肽原酶和可藥用輔料，主要劑型包括凍干粉針劑和注射液劑，通常以靜脈注射途徑給藥。
經(jīng)靜脈注射給藥的人尿激肽原酶組合物，一般是固體的滅菌組合物形式。這些組合物還可以含有添加劑，特別是甘露醇、右旋糖苷、水解明膠、檸檬酸鈉、甘氨酸等。在使用時溶解于滅菌注射用水或其它注射用滅菌介質(zhì)中。
經(jīng)靜脈注射給藥的人尿激肽原酶組合物也可以是水溶液形式。組合物還可以含有添加劑，特別是甘露醇、氯化鈉、葡萄糖等。
人尿激肽原酶組合物治療急性冠狀動脈疾病的劑量根據(jù)病情的嚴(yán)重程度、治療時間而定，一般靜脈注射給藥每次0.1-0.2PNA單位，每天給藥1-2次。
人尿激肽原酶具有腺性激肽原酶特征，在血液中促進(jìn)胰激肽生成，后者再轉(zhuǎn)化為緩激肽。在下述實驗中人尿激肽原酶效應(yīng)長于硝酸甘油的原因，可能與此轉(zhuǎn)化過程有關(guān)。緩激肽能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，NO與平滑肌細(xì)胞內(nèi)鳥苷酸環(huán)化酶(GC)的血紅素基團(tuán)(heme)結(jié)合，形成NO-heme-GC復(fù)合物，使GC激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的cGMP，激活cGMP依賴性蛋白激酶，使許多鈣依賴性的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白磷酸化，細(xì)胞內(nèi)鈣減少，從而抑制鈣介導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈磷酸化，使血管舒張。NO不僅在決定血管張力方面發(fā)揮重要作用，而且參與許多其它調(diào)節(jié)機制，如抑制單核白細(xì)胞和血小板粘附，血管平滑肌的增殖，血管通透性和炎癥機制等，從而防止血管痙攣和血栓形成。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例1 制備人尿激肽原酶干粉針取過濾滅菌的人尿激肽原酶150PNA單位，加7.5克甘露醇、2克右旋糖酐40、5克檸檬酸鈉溶解，調(diào)節(jié)PH至中性，加注射用水至500毫升，無菌過濾，分裝1000個安瓿中，無菌條件下冷凍干燥，即得。
實施例2 制備人尿激肽原酶注射液取過濾滅菌的人尿激肽原酶水溶150PNA單位，調(diào)節(jié)PH至中性，加注射用水至500毫升，加氯化鈉調(diào)節(jié)等滲，無菌過濾，分裝1000個安瓿中，即得。
實施例3 人尿激肽原酶對犬實驗性心肌缺血及心肌氧代謝的影響實驗方法用注射垂體后葉素法制造心肌缺血模型。選用10～15kg健康家犬24只，雌雄各半，隨機分成6組空白對照組(生理鹽水)；垂體后葉素組(3U/kg)；人尿激肽原酶I組(1.5×10-3PNAu)；人尿激肽原酶II組(3×10-3PNAu)；人尿激肽原酶III組(6×10-3PNAu)；硝酸甘油治療組(5mg/kg)。垂體后葉素3U/kg在1分鐘內(nèi)緩慢靜脈推注，人尿激肽原酶和硝酸甘油各劑量藥物在注射垂體后葉素后立即靜脈注射。
用戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈注射麻醉，背位固定，氣管切開并插管，連接電動呼吸機進(jìn)行人工呼吸。描記二導(dǎo)聯(lián)心電圖，股動脈插管連接血壓換能器，股靜脈插管供注藥用。血壓、心率和心電圖接八道生理記錄儀監(jiān)測和記錄。自左側(cè)頸外靜脈插管至冠狀靜脈竇，定時采集心臟靜脈血；右側(cè)頸總動脈插管，定時采集心臟動脈血。
觀察指標(biāo)動物手術(shù)完成并觀察各生理指標(biāo)平穩(wěn)后即開始實驗。于注射藥物前及注藥后30秒、45秒、1分、1分30秒、2分，2分30秒、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、15分、20分、25分、30分描記心電圖，測定T波的變化，用它作為判斷心肌缺血的標(biāo)準(zhǔn)。同時，在注射藥物前、注藥后1分、3分、5分、10分、15分和30分采集心臟動靜脈血進(jìn)行血氣分析。各指標(biāo)進(jìn)行組間和自身前后比較，用t檢驗判斷其差異顯著性。
實驗結(jié)果1.人尿激肽原酶對家犬急性心肌缺血的治療作用靜脈注射垂體后葉素后連續(xù)描記30分鐘心電圖。結(jié)果表明，注射后T波即明顯增高并一直持續(xù)到30分鐘仍高于對照組，說明此模型是可靠的。然后采用人尿激肽原酶進(jìn)行療效觀察，并與硝酸甘油進(jìn)行對照，可見垂體后葉素組注射后5分鐘，心電圖T波波幅明顯升高(以給藥前T波值為100％計算)，與對照組比有非常顯著差異(P＜0.01)，注射后30分鐘T波值仍升高(P＜0.05)。四個治療組注射藥物5分鐘后T波升高的幅度均明顯減少(P＜0.05)，尤其以人尿激肽原酶III組降低最明顯。靜脈注藥30分鐘后，垂體后葉素組的T波仍比注射前升高(P＜0.05)，可見仍處于心肌缺血狀態(tài)。人尿激肽原酶I、II、III組與垂體后葉素組比較，T波值有所下降，且均有顯著差異(P＜0.05)。而硝酸甘油組T波值雖然下降，但與垂體后葉素組比較無顯著差異(P＞0.05)。
2.人尿激肽原酶對急性心肌缺血犬心臟動靜脈血氣及心肌氧代謝的影響實驗犬在注藥前后按規(guī)定時間采集心臟動靜脈血，觀察血氣及心肌氧代謝的變化。注射垂體后葉素后，心臟的氧攝取率比對照組顯著提高，說明垂體后葉素組心肌耗氧量顯著增加，證明該模型是成功的。利用此模型注射人尿激肽原酶I、II、III組三個劑量和硝酸甘油5分鐘，各治療組的心肌耗氧量雖未能下降到對照組注射前的耗氧量水平，但與垂體后葉素組比較卻大大減少。人尿激肽原酶組和硝酸甘油治療組相似，有顯著降低心肌耗氧量的作用(P＜0.05)，且作用效果非常相近。人尿激肽原酶I、II、III組在注射30分鐘后的心肌耗氧量比垂體后葉素組有所減少，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而硝酸甘油在注射30分鐘后的心肌耗氧量與垂體后葉素組比較無顯著差異(P＞0.05)。
本實驗表明，人尿激肽原酶對實驗性心肌缺血具有保護(hù)作用，能減少缺血心肌的耗氧量。
實施例4 人尿激肽原酶對大鼠實驗性心肌缺血的影響實驗方法1.人尿激肽原酶對垂體后葉素所致大鼠急性心肌缺血的影響選用健康大鼠60只，按體重隨機分成6組空白對照組(生理鹽水)；垂體后葉素組(6.5U/kg)；人尿激肽原酶I組(3.85×10-3PNAu)；人尿激肽原酶II組(8.75×10-3PNAu)；人尿激肽原酶III組(17.5×10-3PNAu)；硝酸甘油組(25mg/kg)。各劑量藥物在注射垂體后葉素后立即尾靜脈注射。大鼠腹腔注射10％水合氯醛3ml/kg麻醉，仰臥固定，將針狀電極插入四肢皮下，并調(diào)節(jié)心電圖靈敏度至1mv＝15mm，紙速為50mm/s，記錄II導(dǎo)心電圖，選擇心電圖正常動物進(jìn)行舌靜脈注射垂體后葉素(6.5U/kg)造成心肌缺血模型，注射速度為1min，注射后立即進(jìn)行15s、30s、1min、2min、5min、10min重復(fù)記錄心電圖(可據(jù)示波器所見異常情況隨時記錄)。實驗結(jié)束后，測量比較給藥前、后規(guī)定時間S-T段和T波高度及心率的變化。
2.人尿激肽原酶對結(jié)扎冠狀動脈所致大鼠急性心肌缺血的影響取體重200g±40g的雌性健康Wistar大鼠50只，按體重隨機分成5組缺血對照組(生理鹽水)；普萘洛爾組(5mg/kg)；人尿激肽原酶I組(3.85×10-3PNAu)；人尿激肽原酶II組(8.75×10-3PNAu)；人尿激肽原酶III組(17.5×10-3PNAu)。于給藥后1h腹腔注射10％水合氯醛3ml/kg麻醉，記錄正常心電圖。沿左鎖骨中線縱行切口，打開胸腔，在心臟右側(cè)圓錐與左心耳之間冠狀靜脈處結(jié)扎左冠狀動脈后，把心臟放回胸腔，縫合關(guān)閉，呼吸機輔助呼吸。結(jié)扎后即刻、1h、24h、48h分別描記一段心電圖，并于24h、48h靜脈注射各組藥物及生理鹽水。在冠脈結(jié)扎50h后斷頭取血，測定血清CPK、LDH，并于斷頭取血后迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗，除去血污，剔除血管、脂肪等非心肌組織，用吸水紙吸去水分，稱全心濕重。沿冠狀溝切除心房，留下心室，稱重，順房室溝從心尖到心基部平行將心室肌橫切成厚約0.1cm的心肌片4片，用生理鹽水沖洗干凈，將心肌片放在0.1％的N-BT溶液中，在37℃水浴條件下染色15min，立即用水洗去多余染料。梗死區(qū)不著色，非梗死區(qū)被N-BT溶液染成藍(lán)色。剪去梗死心肌，稱濕重，以梗死區(qū)濕重占全心濕重的百分比表示心肌梗死范圍。
實驗結(jié)果1.人尿激肽原酶對垂體后葉素引起S-T段、T波改變的影響對照組于注射垂體后葉素15S左右T波及ST段抬高最為明顯，T波最高可達(dá)0.45mv、S-T段最高可達(dá)0.29mv，表明大鼠急性心肌缺血模型是成功的。人尿激肽原酶I、II、III組及硝酸甘油組T波、S-T段抬高幅度顯著低于對照組水平(P＜0.01)；人尿激肽原酶I組較硝酸甘油作用為差(P＜0.05)，而人尿激肽原酶II、III組與硝酸甘油組作用相似(P＞0.05)。
2.人尿激肽原酶對冠狀動脈結(jié)扎心肌缺血大鼠心電圖的影響結(jié)扎大鼠冠狀動脈造成缺血模型，可見ST段弓背上抬，T波逐漸高聳；少數(shù)動物先見ST段下移之后又上抬，整個缺血期缺血性ST-T變化非常顯著。普萘洛爾組、人尿激肽原酶I、II、III組ST段抬高顯著低于模型組(P＜0.01)，但各組間無顯著差異(P＞0.05)。
3.人尿激肽原酶對冠狀動脈結(jié)扎心肌缺血大鼠心律失常和存活率的影響結(jié)扎冠脈后各組動物均有心律失常者，以室性異位心律為主，包括室性早搏、陣發(fā)性室性心動過速和纖維顫動，其中以空白對照組發(fā)生率高且嚴(yán)重?？瞻讓φ战M10只動物中有8只發(fā)生心律失常。其中有4只出現(xiàn)室顫，只有1只恢復(fù)竇性心律而繼續(xù)存活，其余3只均死于室顫，另4組動物心律失常發(fā)生率明顯低于空白對照組(P＜0.01)。其存活率各組相比無顯著差異(P＞0.05)。
4.人尿激肽原酶對冠狀動脈結(jié)扎心肌缺血大鼠心肌梗塞范圍的影響普萘洛爾組、人尿激肽原酶I、II、III組均可明顯縮小大鼠心肌梗塞范圍(P＜0.05)，其中普萘洛爾組優(yōu)于人尿激肽原酶I、II組(P＜0.05)，與人尿激肽原酶III組無顯著差異(P＞0.05)。
5.人尿激肽原酶對血清磷酸肌酸肌酶(CPK)和乳酸脫氫酶(LDH)的影響普萘洛爾組、人尿激肽原酶I、II、III組在大鼠結(jié)扎冠脈后，其血清CPK和LDH均明顯低于對照組(P＜0.01)，但各組間無明顯差異(P＞0.05)。
討論心肌中的磷酸肌酸激酶(CPK)和乳酸脫氫酶(LDH)在心肌梗塞時因缺血后膜損傷而釋放入血，可用作觀察心肌缺血的指標(biāo)。本實驗證明，人尿激肽原酶組大鼠結(jié)扎冠脈后的血清CPK和LDH含量明顯低于模型組，提示人尿激肽原酶可保護(hù)心肌細(xì)胞，增加其耐缺血缺氧能力，提高膜的穩(wěn)定性，CPK、LDH逸出減少，心肌梗塞范圍縮小。
腦垂體后葉素能使冠狀動脈痙攣，造成急性供血不足；加以外周阻力增加，導(dǎo)致心臟負(fù)荷加重，在心電圖上可見到心肌缺血變化，主要為T波抬高、S-T段抬高或低平。當(dāng)結(jié)扎動物冠脈時，心電圖S-T段抬高亦為診斷急性心肌梗塞的一項重要指標(biāo)。藥物若能防止這種心肌缺血變化，就被認(rèn)為有抗心肌缺血的價值。本實驗證明，人尿激肽原酶可拮抗垂體后葉素引起的T波抬高、S-T段抬高，亦可使結(jié)扎大鼠冠脈后升高的ST段明顯降低，因而有抗心肌缺血作用。其機理可能是通過擴張冠狀動脈，增加冠脈流量等發(fā)揮作用。
縮小心肌梗塞后梗塞范圍是評價抗心肌缺血藥物療效的主要指標(biāo)。本實驗NBT大體標(biāo)本染色法測量心梗范圍，證實人尿激肽原酶能明顯縮小結(jié)扎大鼠冠脈所致急性心肌缺血的心肌梗塞范圍，表明人尿激肽原酶有抗心肌缺血作用。
權(quán)利要求
1.人尿激肽原酶在制備治療急性冠狀動脈疾病藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1所述疾病臨床診斷為不穩(wěn)定性心絞痛。
3.權(quán)利要求1所述疾病臨床診斷為急性心肌梗塞。
4.一種用于治療急性冠狀動脈疾病的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的人尿激肽原酶和可藥用輔料。
5.權(quán)利要求4所述的藥物組合物是凍干粉針劑。
6.權(quán)利要求4所述的藥物組合物是水溶液注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及人尿激肽原酶用于治療急性冠狀動脈疾病的藥物用途及按該方法制備的藥物組合物。本發(fā)明的人尿激肽原酶對急性冠狀動脈疾病有明顯的治療作用，通常以藥物組合物配制成凍干粉針劑或注射液劑的形式使用。
文檔編號A61K38/49GK1634575SQ200410088440
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者傅和亮, 苗丕渠, 孫鐵, 謝永立 申請人:廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司