專利名稱：新月菱形藻胞外多糖硫酸酯及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新月菱形藻胞外多糖硫酸酯及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新月菱形藻(Nitzschia closterium)是海洋微藻中富含多不飽和脂肪酸種類之一，在系統(tǒng)分類學(xué)上屬于硅藻門羽紋藻綱，是海洋生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)力的常見種類。由于該藻富含二十碳五烯酸(EPA)，不僅成為很多珍貴水產(chǎn)動(dòng)物的開口餌料，也是潛在的海洋生物制藥的原料。
本發(fā)明申請(qǐng)人于2004年6月18日申請(qǐng)了名為“一種培養(yǎng)新月菱形藻的方法及其專用培養(yǎng)基”發(fā)明專利申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)枮?00410047885.7，新月菱形藻采用該方法進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)可在6～8天內(nèi)達(dá)到生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，生物量(干物質(zhì))達(dá)到1.7～1.9g/L培養(yǎng)液，同時(shí)培養(yǎng)過程中積累大量的胞外多糖，含量高達(dá)1.5g/L培養(yǎng)液，向培養(yǎng)基內(nèi)加入蒸餾水可進(jìn)一步提高胞外多糖的含量。該類胞外多糖的組成分析表明，其單糖的組成基本都是葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖以及少量的葡萄糖醛酸。然而，所得到的胞外多糖的溶解度很低，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)能力較弱，因而體內(nèi)抗病毒、抗癌的藥理學(xué)活性十分微弱。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新月菱形藻胞外多糖硫酸酯及其制備方法。
本發(fā)明所提供的新月菱形藻胞外多糖硫酸酯，是通過對(duì)新月菱形藻胞外多糖進(jìn)行硫酸酯化得到的。
該新月菱形藻胞外多糖硫酸酯的制備方法，包括如下步驟1)將新月菱形藻胞外多糖與甲酰胺混合，然后加入酯化試劑進(jìn)行酯化反應(yīng)，所述酯化試劑由重量份數(shù)比為2∶1-1∶1的吡啶和氯磺酸的在冰浴條件下反應(yīng)制得；2)步驟1)所述酯化反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)物中和至pH6.8-7.2，用有機(jī)溶劑沉淀，將所得沉淀溶解、透析得到所述新月菱形藻胞外多糖硫酸酯。
其中，進(jìn)行步驟1)酯化反應(yīng)時(shí)，所述新月菱形藻胞外多糖與甲酰胺的重量比為1.2∶1-1.5∶1；所述新月菱形藻胞外多糖酯化試劑的重量份數(shù)比1.5∶1-1∶1；反應(yīng)溫度為0-4℃；反應(yīng)時(shí)間為100-120min。
步驟2)對(duì)酯化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行中和通常采用NaOH溶液，如0.1mol/L NaOH溶液；進(jìn)行沉淀所用的有機(jī)溶劑一般也可選用乙醇等；沉淀溶解所用溶劑采用水即可。
其中，酯化反應(yīng)所用原料-新月菱形藻胞外多糖可通過發(fā)酵培養(yǎng)新月菱形藻得到。在發(fā)酵培養(yǎng)新月菱形藻時(shí)，所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件優(yōu)選發(fā)明專利申請(qǐng)200410047885.7所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件。為了能提高單位體積新月菱形藻胞外多糖的含量，在新月菱形藻生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期按20ml/L培養(yǎng)液的量加入蒸餾水，可以刺激胞外多糖的分泌。培養(yǎng)結(jié)束后，用NaOH溶液使藻細(xì)胞沉淀，培養(yǎng)上清液經(jīng)濃縮、乙醇沉淀、透析、干燥等步驟即可得到新月菱形藻胞外多糖。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供新月菱形藻胞外多糖硫酸酯的用途。
本發(fā)明發(fā)明人的研究表明，新月菱形藻胞外多糖硫酸酯具有良好的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫活性，以及抗腫瘤和病毒活性，可以制備為免疫調(diào)節(jié)藥物、抗腫瘤藥物、抗病毒藥物等。
在應(yīng)用時(shí)，上述藥物需要的時(shí)候還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、甜味劑等。常用劑型有片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸、注射液、凍干粉針、口服液、分散片等，均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。使用劑量為6-8mg/公斤體重·天，3個(gè)月為一個(gè)療程。
本發(fā)明以硫酸酯化法對(duì)新月菱形藻胞外多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，引入磺酸基后產(chǎn)物新月菱形藻胞外多糖硫酸酯的水溶性大大增加。藥理實(shí)驗(yàn)表明，新月菱形藻胞外多糖硫酸酯免疫調(diào)節(jié)活性有了顯著的提高，對(duì)病毒和腫瘤的形成有顯著地預(yù)防作用。毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)硫酸酯化的新月菱形藻胞外多糖對(duì)小鼠的半數(shù)致死量為40.8g/kg。長(zhǎng)期服用對(duì)大鼠血液、肝臟以及腎臟的理化指標(biāo)沒有明顯的改變。因此，本發(fā)明所提供的新月菱形藻胞外多糖硫酸酯是一種免疫調(diào)節(jié)作用顯著毒副作用小的安全藥物，具有來源途徑簡(jiǎn)單、硫酸酯化后藥理活性顯著等特點(diǎn)，具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。


圖1為本發(fā)明藥物抗肉瘤S-180(體內(nèi))活性；圖2為本發(fā)明藥物對(duì)血液淋巴細(xì)胞增殖的影響；圖3為本發(fā)明藥物抗病毒活性。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、新月菱形藻胞外多糖硫酸酯的制備1、新月菱形藻的培養(yǎng)以ZBNC培養(yǎng)基培養(yǎng)新月菱形藻，ZBNC培養(yǎng)基的配方為硝酸鈉(NaNO3)，200mg；磷酸二氫鉀(KH2PO4)，20mg；硅酸鈉(Na2SiO3)，100mg；碳酸氫鈉(NaHCO3)，450mg；檸檬酸鐵(FeC6H5O7·5H2O)，0.5mg；維生素B12，0.4μg；維生素B1，400μg；乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)，2mg；脲素(NH2)2CO，4mg；海水，1000ml。
培養(yǎng)溫度為25℃、光照時(shí)間為10h、藻種接種量為1∶9、光強(qiáng)5000Lux條件下以每0.5m3/min通氣培養(yǎng)6～8天。
2、刺激新月菱形藻胞外多糖的分泌及采收在新月菱形藻生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期按20ml/L加入蒸餾水，刺激新月菱形藻分泌胞外多糖，在接種后的第8天，加0.1N NaOH使藻細(xì)胞沉淀，以虹吸將培養(yǎng)上清液吸出。常溫濃縮后加3倍體積的EtOH溶液沉淀多糖，去除上清，多糖以半透膜透析、60℃烘干，得新月菱形藻胞外多糖。
3、新月菱形藻胞外多糖的硫酸酯化1)酯化試劑的制備將附有冷凝管和攪拌裝置的三頸瓶置鹽水-冰浴中，加入吡啶1份(重量)，攪拌，使之充分冷卻，用分液漏斗緩慢加入氯磺酸1.5份(重量)，約60min滴加完畢，燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體，即為氯磺酸與吡啶重量比為1.51的酯化試劑，密封后置于低溫冰箱備用。
2)硫酸酯化多糖的制備將新月菱形藻胞外多糖與甲酰胺以重量比1.2∶1的比例混合30min，然后按表1所列反應(yīng)條件加入酯化試劑進(jìn)行攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束用0.1mol/L NaOH溶液等體積中和反應(yīng)液(pH為7)，然后加入等體積無水乙醇沉淀，將沉淀溶于水，透析72小時(shí)，冷凍干燥得新月菱形藻胞外多糖硫酸酯。
3)酯化產(chǎn)物中硫酸根含量的測(cè)定測(cè)定采用BaSO4濁度法。
精確稱量新月菱形藻胞外多糖硫酸酯3mg，溶于3ml 1mol/L HCl的試管中，密封后于100℃沸水浴中水解6小時(shí)。冷卻后開啟試管，于40℃減壓干燥，管內(nèi)殘留物用1ml蒸餾水溶解并做兩個(gè)平行樣A、B(各0.4ml)。向A樣中加蒸餾水至1.6ml，再加入三氟乙酸水溶液(8％)1.4ml和氯化鋇-明膠溶液1.0ml，混合后靜置20min，在360nm處測(cè)定其吸光度；B樣中以明膠溶液(5mg/ml)1.0ml代替氯化鋇-明膠溶液，加入后同法處理。以A、B兩樣品吸光度之差值表示硫酸化多糖樣品中硫酸含量。將蒸餾水空白對(duì)照和含40μg、80μg、160μg、320μg、640μg、1280μg硫酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(100μg/ml)重復(fù)上述操作，以測(cè)得空白和各標(biāo)準(zhǔn)品組A、B樣之吸光度差值對(duì)硫酸基濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得新月菱形藻胞外多糖硫酸酯中硫酸根含量。
本實(shí)施例所得新月菱形藻胞外多糖硫酸酯中硫酸根含量的測(cè)定結(jié)果列于表1，結(jié)果表明，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可以增加產(chǎn)物中硫酸根含量；酯化試劑中氯磺酸比例的適當(dāng)增加也可以提高產(chǎn)物硫酸根含量。酯化試劑中氯磺酸和吡啶的重量比為1.5∶1，胞外多糖與酯化試劑的重量比為1∶1時(shí)，在0-4℃條件下反應(yīng)2小時(shí)可獲得得率高達(dá)73.9％硫酸酯化多糖，所得新月菱形藻胞外多糖硫酸酯中硫酸根含量可達(dá)25.43％。
表1.不同條件下新月菱形藻胞外多糖的硫酸酯化結(jié)果

注a，氯磺酸和吡啶的重量比；b，胞外多糖與酯化試劑的重重比；c，取代度(DS)＝(1.62×S％)÷(32-1.02×S％)實(shí)施例2、本發(fā)明藥物對(duì)小鼠抗體生成的調(diào)節(jié)作用取KM小鼠70只，分為7組，其中的3組分別按50、100、和200mg·kg-1·d-1的本發(fā)明藥物灌胃(藥物試驗(yàn)組)；3組按50、100、和200mg·kg-1·d-1的未經(jīng)硫酸酯化的新月菱形藻胞外多糖灌胃(原生多糖組)；另設(shè)空白對(duì)照組，每天分別灌胃等體積的生理鹽水。5天后腹腔注射0.2ml 20％綿羊紅細(xì)胞(約2×109/ml)，無菌取脾臟，用PBS配成3.5×106/ml脾細(xì)胞懸液，于干凈試管中依次加入1×107/ml綿羊紅細(xì)胞、1∶10稀釋的豚鼠血清、脾細(xì)胞懸液各1ml，37℃水浴1小時(shí)，2000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清于413nm處測(cè)定吸光度?？贵w生成率＝[標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-樣品管的吸光度]/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×100％，結(jié)果如表2所示。
結(jié)果表明，本發(fā)明藥物能顯著提高小鼠抗體生成能力，其中，100mg·kg-1·d-1劑量的本發(fā)明藥物對(duì)抗體生成能力的提升作用最為顯著，劑量上升到200mg·kg-1·d-1時(shí)，提升作用減弱。三個(gè)劑量的本發(fā)明藥物對(duì)抗體的生成促進(jìn)作用均顯著高于原生多糖。
表2.本發(fā)明藥物對(duì)小鼠抗體生成能力的提升作用

注與空白對(duì)照比較aP＜0.01，bP＜0.001；與同等劑量的原生多糖組相比，eP＜0.05.
實(shí)施例3、本發(fā)明藥物對(duì)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吞噬活力的調(diào)節(jié)作用取KM小鼠(18±2g)80只，分為8組，正常對(duì)照組灌以生理鹽水，陰性對(duì)照灌以20mg·kg-1·d-1環(huán)磷酰胺，另6組分別以50、100、200mg·kg-1·d-1劑量的本發(fā)明藥物(實(shí)驗(yàn)藥物組)和未經(jīng)硫酸酯化的新月菱形藻胞外多糖灌胃(原生多糖組)。七天后，各組動(dòng)物在末次給藥后一小時(shí)分別用肝素鈉處理毛細(xì)血管，然后從眼眶后靜脈叢取血50μl，立即放入5.0ml蒸餾水中使之完全溶血作為對(duì)照管；隨即從尾靜末注入10g.L-1剛果紅生理鹽水溶液，每10g小鼠給0.1ml，至注射后30秒，同法再取血50μl放入5.0ml蒸餾水中溶血，作為實(shí)驗(yàn)管，在510nm波長(zhǎng)下以蒸餾水調(diào)零，測(cè)試對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管光密度，根據(jù)兩者之差，從剛果紅標(biāo)準(zhǔn)曲線查出每毫升小鼠血中剛果紅的含量(μg)，含量越低，表明RES吞噬功能越強(qiáng)，結(jié)果如表3所示。
結(jié)果表明，灌胃20mg·kg-1·d-1環(huán)磷酰胺導(dǎo)致RES的吞噬能力大大下降(P＜0.05)；而口服本發(fā)明藥物50mg·kg-1·d-1可使RES的吞噬能力大大上升，在100mg·kg-1·d-1劑量范圍內(nèi)，對(duì)剛果紅的清除能力最為顯著，并大大高于正常小鼠對(duì)異物的清除能力，藥物劑量在200mg·kg-1·d-1時(shí)，本發(fā)明藥物對(duì)剛果紅的清除能力有所下降。三個(gè)劑量的本發(fā)明藥物均比同等劑量的原生多糖對(duì)剛果紅的清除能力更為顯著。
表3.本發(fā)明藥物對(duì)小鼠RES吞噬活性的調(diào)節(jié)作用(n＝10，x±SD)

注與正常對(duì)照比較aP＜0.05；bP＜0.05；cP＜0.01，dP＜0.001；與同等劑量的原生多糖相比，fP＜0.01。
實(shí)施例3、對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的調(diào)節(jié)作用取KM小鼠80只，分為8組，其中的7組以40mg·kg-1的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，造成NK細(xì)胞殺傷活力下降，另一組為正常對(duì)照小鼠。7組腹腔注射環(huán)磷酰胺小鼠中的6組分別以本發(fā)明藥物和原生多糖按劑量50、100和200mg·kg-1·d-1灌胃10天(藥物試驗(yàn)組)；另1組每天灌胃等體積的生理鹽水；末次給藥24小時(shí)后無菌取脾臟，制成脾細(xì)胞懸液，作為效應(yīng)細(xì)胞；以Hela細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基分別將效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞調(diào)至1×107/ml、2×105/ml，加入96孔板中，每孔100μl，使效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞＝50∶1，另設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對(duì)照，每份標(biāo)本設(shè)5個(gè)平行孔，置于37℃，5％CO2條件下殺傷4小時(shí)，加入MTT(5mg/ml)15μl，繼續(xù)孵育3小時(shí)，每孔加100μl酸化異丙醇，吹打均勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，于酶標(biāo)儀570nm處測(cè)光密度(A值)。NK細(xì)胞活性按下式公式計(jì)算，結(jié)果如表4所示

由表4可見，腹腔注射CP小鼠的NK細(xì)胞殺傷活力比正常小鼠下降10％左右，口服本發(fā)明藥物對(duì)NK細(xì)胞的殺傷活力有明顯的提升作用，其中，50mg·kg-1可恢復(fù)NK細(xì)胞殺傷活力到正常水平，100mg·kg-1將使NK細(xì)胞殺傷活力超出正常水平2倍以上左右，這種提升作用在劑量200mg·kg-1以上時(shí)有所下降。與原生多糖相比，三個(gè)劑量的本發(fā)明藥物對(duì)NK細(xì)胞的殺傷活性均顯著地提高。
NK細(xì)胞是細(xì)胞免疫中的非特異性細(xì)胞，是機(jī)體免疫監(jiān)視功能的重要執(zhí)行者，先于T細(xì)胞發(fā)揮作用，它能非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，其殺傷作用毋須抗原預(yù)先致敏，也不需要抗體參加，不受MHC限制，為機(jī)體抵抗微生物侵入的第一道防線。結(jié)果表明，不同劑量的本發(fā)明藥物對(duì)小鼠NK細(xì)胞的殺傷活力有著雙向調(diào)節(jié)作用。
表4.本發(fā)明藥物對(duì)小鼠NK細(xì)胞的殺傷活力的影響(n＝10，x±SD)

注與正常對(duì)照組相比，ap＜0.01，與CP對(duì)照相比bp＜0.001；cp＜0.0001，與同等劑量的原生多糖相比，ep＜0.01。
實(shí)施例4、本發(fā)明藥物對(duì)S-180肉瘤的抑制活性選用二級(jí)昆明種小鼠，單一雄性，體質(zhì)量(20±2)g，共80只。取實(shí)體瘤勻漿傳代7d的S180瘤細(xì)胞，制成濃度為2.5×106細(xì)胞·ml-1瘤細(xì)胞懸液，每鼠于右后肢鼠蹊部接種0.2ml，接種后隨機(jī)分為8組，每組10只。其中6組分別按本發(fā)明藥物和未經(jīng)硫酸酯化新月菱形藻胞外多糖的50、100、200mg·kg-1·d-1劑量灌胃給藥10天(分別為藥物試驗(yàn)組和原生多糖組)，另2組分別為陽性對(duì)照組和模型組，陽性對(duì)照組以20mg·kg-1·d-1環(huán)磷酰胺灌胃給藥，模型組灌胃等體積的生理鹽水(NS)。施藥后小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，第11天脫頸椎處死動(dòng)物，分別測(cè)得瘤重量、按公式 抑瘤率％＝(模型組瘤重-給藥組瘤重)/模型組瘤重×100％計(jì)算抑瘤率，結(jié)果如圖1所示。
結(jié)果表明，本發(fā)明藥物的中劑量組(100mg·kg-1·d-1)對(duì)S-180肉瘤的抑制率高達(dá)74.5％，與未酯化的原生多糖相比，高出22％以上；劑量超過200mg·kg-1·d-1時(shí)，本發(fā)明藥物對(duì)S-180肉瘤的抑制率下降。
實(shí)施例5、本發(fā)明藥物對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響選用二級(jí)昆明種小鼠，單一雄性，體質(zhì)量(20±2)g，共80只。取實(shí)體瘤勻漿傳代7d的S180瘤細(xì)胞，制成濃度為2.5×106細(xì)胞·ml-1瘤細(xì)胞懸液，每鼠于右后肢鼠蹊部接種0.2ml，接種后隨機(jī)分為8組，每組10只，其中6組分別按本發(fā)明藥物和未經(jīng)硫酸酯化新月菱形藻胞外多糖50mg·kg-1·d-1(低劑量組)，100mg·kg-1·d-1(中劑量組)，200mg·kg-1·d-1(高劑量組)劑量灌胃給藥10天(分別為藥物試驗(yàn)組和原生多糖組)，另2組分別為陽性對(duì)照組和模型組，陽性對(duì)照組以20mg·kg-1·d-1環(huán)磷酰胺灌胃給藥，模型組灌胃等體積的生理鹽水(NS)。接種后小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，第11天脫頸椎處死動(dòng)物，分別測(cè)胸腺質(zhì)量和脾臟質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，結(jié)果如表5所示。
結(jié)果表明，荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比正常小鼠有顯著下降，陽性對(duì)照組(CP)對(duì)荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)有所提升，但對(duì)脾臟指數(shù)則有所下降；與模型組相比，本發(fā)明藥物和原生多糖對(duì)荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均有顯著增加。本發(fā)明藥物的中劑量組對(duì)胸腺指數(shù)增加最為顯著，高劑量組對(duì)脾臟指數(shù)增加最為顯著；與原生多糖相比，本發(fā)明藥物在中劑量組和高劑量組對(duì)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的提升作用更為顯著。
表5.本發(fā)明藥物和原生多糖對(duì)荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響(n＝10，x±SD)

注與正常組比較，bP＞0.05，與陽性對(duì)照比較，cP＜0.01，與同等劑量的原生多糖組比較，fP＜0.05.
實(shí)施例6、本發(fā)明藥物對(duì)荷瘤小鼠血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用選用二級(jí)昆明種小鼠，單一雄性，體質(zhì)量(20±2)g，共80只。取實(shí)體瘤勻漿傳代7d的S180瘤細(xì)胞，制成濃度為2.5×106細(xì)胞·ml-1瘤細(xì)胞懸液，每鼠于右后肢鼠蹊部接種0.2ml，接種后隨機(jī)分為8組，每組10只。其中6組分別按本發(fā)明藥物和未經(jīng)硫酸酯化新月菱形藻胞外多糖50mg·kg-1·d-1，100mg·kg-1·d-1，200mg·kg-1·d-1劑量灌胃給藥10天，另2組分別為陽性對(duì)照組和空白對(duì)照組，空白對(duì)照組灌胃等體積的生理鹽水(NS)。接種后小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，于給藥后的第十一天無菌取血，置盛有適量肝素鈉(200U·ml-1)的無菌離心管中備用。另取無菌管加入與對(duì)應(yīng)管血液等體積淋巴細(xì)胞分離液，再向其中緩慢滴加各組血樣，封管后1200rpm離心20min，此時(shí)管中液體分為四層，從上到下依次是血漿、白細(xì)胞、淋巴分離液和紅細(xì)胞。吸去上層血漿液，再用微吸管慢慢吸取淋巴細(xì)胞層，注入2ml無菌指形管中，加入1ml完全DMEM培養(yǎng)液并吹打，封管后于2400rpm下離心20min；小心吸去培養(yǎng)液，同法再洗滌一次。最后用培養(yǎng)液淋巴細(xì)胞濃度為1.2×106細(xì)胞·ml-1。將各組淋巴細(xì)胞懸液分兩行以每孔200μl加入48孔培養(yǎng)板中每孔加50μl Con A(5mg·ml-1)，設(shè)六個(gè)平行樣，以不加Con A培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞作為對(duì)照孔，置37C、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入20μl MTT(5mg·ml-1)，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入200μl(0.04mol·L-1)酸化異丙醇并吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，將所得溶液取200μl置96孔板于酶標(biāo)儀570nm處測(cè)A值，用ConA孔與對(duì)照孔的差值表示淋巴細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果如圖2所示。
結(jié)果表明，低、中、高劑量的本發(fā)明藥物對(duì)荷瘤小鼠血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化均有一定的促進(jìn)作用，其中以中劑量的本發(fā)明藥物最為有效，達(dá)52.49％與模型組相比有顯著差異(P＜0.01)；而未經(jīng)酯化的菱形藻胞外多糖僅對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率最高僅達(dá)30.16％，酯化前后活性相差近二十二個(gè)百分點(diǎn)。
實(shí)施例7、本發(fā)明藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制的血清藥理學(xué)活性選取健康SD大鼠42只，體重(200±20)g，平均分為空白對(duì)照組、原生多糖組和本發(fā)明藥物組，其中原生多糖組和本發(fā)明藥物組每組分別以250mg/kg·d，500mg/kg·d和1000mg/kg·d劑量給大鼠給藥，每天一次，連續(xù)9d；空白對(duì)照組用同樣體積的生理鹽水給藥。于給藥的第三天、第六天和第九天將各實(shí)驗(yàn)組中兩只大鼠乙醚中度麻醉后固定，在無菌條件下自膈肌處打開胸腔后于左心室抽取血液，儲(chǔ)存于滅菌的離心管，室溫靜置2h后于3000rmp離心10min。血清置56℃水浴30min。滅活封存于-20℃冰箱中，備用。將S180和Hela細(xì)胞用完全1640培養(yǎng)液調(diào)成為1×106/ml的懸液，以80μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，再分別加入20μl/孔正常小鼠血清和不同給藥劑量的小鼠血清，每孔設(shè)四個(gè)平行孔，在37C、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，取10μl培養(yǎng)細(xì)胞懸液加入40μl 0.4％的臺(tái)盼藍(lán)，攪動(dòng)細(xì)胞使之與染色液混和均勻，再加950μl無菌生理鹽水稀釋后，滴入血球計(jì)數(shù)板，穩(wěn)定2min后進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)未染色細(xì)胞數(shù)(活細(xì)胞數(shù))，統(tǒng)計(jì)四大格細(xì)胞數(shù)得R值，以下式求得每毫升細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，結(jié)果如表6、表7所示 結(jié)果表明，口服本發(fā)明藥物和原生胞外多糖的SD大鼠血清對(duì)S-180、Hela、Waker256和SMCC7721細(xì)胞有顯著的抑制作用，其中低劑量組和中劑量組的抑制作用隨給藥劑量和時(shí)間的增加呈上升的趨勢(shì)；中劑量組(100mg/kg·d)在給藥的第9天對(duì)所試腫瘤細(xì)胞的抑制率最高，在88％以上；高劑量組大鼠血清對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞的抑制率有顯著降低。與原生多糖相比，本發(fā)明藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞的抑制作用更為顯著。
表6.本發(fā)明藥物大鼠給藥血清對(duì)S-180、Hela生長(zhǎng)的抑制作用(％)(n＝5，x±SD)

表7.本發(fā)明藥物大鼠給藥血清對(duì)Waker256、Smcc7721細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(％)(n＝5，x±SD)

實(shí)施例8、本發(fā)明藥物對(duì)小鼠流感病毒的體內(nèi)抑制活性本實(shí)施例所用的病毒為流感病毒小鼠肺炎適應(yīng)株(Nakamura et al.，Enhancedresistancy of thioredoxin-transgenic mice against influenza virus-inducedpneumonia.Immunology Letters 2002；82165-170)。選取14g-16g昆明小鼠，雌雄不分，隨機(jī)分為9組，每組10只，分為正常組，模型組，陽性對(duì)照組及本發(fā)明藥物和未經(jīng)酯化的菱形藻胞外多糖(原生多糖組)的各三個(gè)劑量組(分別以50、100、200mg·kg-1·d-1灌胃)，陽性對(duì)照組給以30mg·kg-1·d-1的利巴韋林。乙醚輕度麻醉后，選擇滴度為640∶1的含該病毒的雞胚鳥囊液鼻腔染毒，每只小鼠接種50μl。自感染病毒次日開始，各組灌胃給藥，每天兩次20μl·g-1，連續(xù)五天共十次，給藥第五天晚各組小鼠開始禁水、禁食(8h以上)，次日上午稱體重、摘眼球放血、脫頸椎處死和取肺，用精密天平稱重，并按如下公式計(jì)算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率，結(jié)果如圖3所示。
肺指數(shù)＝小鼠肺重(g)/小鼠體重(g)×100％

結(jié)果表明，本發(fā)明藥物的中劑量組(100mg·kg-1·d-1)對(duì)染毒小鼠的肺指數(shù)抑制率最為顯著，達(dá)43％以上，與陽性對(duì)照組體內(nèi)抗病毒活性相當(dāng)。三個(gè)劑量的本發(fā)明藥物體內(nèi)抗病毒活性均比原生多糖顯著。
實(shí)施例9、本發(fā)明藥物對(duì)感染流感病毒小鼠的免疫器官的影響選取14g-16g昆明小鼠，雌雄不分，隨機(jī)分為9組，每組10只，分為正常組，模型組，陽性對(duì)照組及本發(fā)明藥物和未經(jīng)酯化的菱形藻胞外多糖(原生多糖)的各三個(gè)劑量組(分別以50、100、200mg·kg-1·d-1灌胃)，陽性對(duì)照組給以30mg·kg-1·d-1的利巴韋林。乙醚輕度麻醉后鼻腔染毒，每鼠50μl，自感染病毒次日開始，各組灌胃給藥，每天兩次20μl·g-1，連續(xù)五天共十次，給藥第五天晚各組小鼠開始禁水、禁食(8h以上)，次日上午稱體重、摘眼球放血、脫頸椎處死。取脾臟和胸腺，計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，結(jié)果如表8所示。
結(jié)果表明，本發(fā)明藥物能顯著提高流感病毒感染小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，其中以100mg·kg-1·d-1劑量組最為顯著，該劑量組的本發(fā)明藥物比未經(jīng)酯化的菱形藻胞外多糖對(duì)染毒后小鼠免疫器具有更顯著的提升作用。
表8.本發(fā)明藥物和原生多糖對(duì)感染FM小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響(n＝10，x±SD)

注與正常組比較，bP＞0.05，與陽性對(duì)照比較cP＜0.01，與同等劑量的原生多糖組比較，fP＜0.05.
權(quán)利要求
1.新月菱形藻胞外多糖硫酸酯，是通過對(duì)新月菱形藻胞外多糖進(jìn)行硫酸酯化得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新月菱形藻胞外多糖硫酸酯，其特征在于所述硫酸酯化反應(yīng)包括如下步驟1)將新月菱形藻胞外多糖與甲酰胺混合，然后加入酯化試劑進(jìn)行酯化反應(yīng)，所述酯化試劑由重量份數(shù)比為2∶1-1∶1的吡啶和氯磺酸的在冰浴條件下反應(yīng)制得；2)步驟1)所述酯化反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)物中和至pH6.8-7.2，用有機(jī)溶劑沉淀，將所得沉淀溶解、透析得到所述新月菱形藻胞外多糖硫酸酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的新月菱形藻胞外多糖硫酸酯，其特征在于步驟1)所述新月菱形藻胞外多糖與甲酰胺的重量份數(shù)比1.2∶1-1.5∶1，所述新月菱形藻胞外多糖酯化試劑的重量份數(shù)比為1.5∶1-1∶1，所述酯化反應(yīng)的溫度為0-4℃，反應(yīng)時(shí)間為100-120min；步驟2)所述中和是采用NaOH溶液，所述沉淀用有機(jī)溶劑為乙醇，溶解沉淀采用水。
4.新月菱形藻胞外多糖硫酸酯的制備方法，包括如下步驟1)將新月菱形藻胞外多糖與甲酰胺混合，然后加入酯化試劑進(jìn)行酯化反應(yīng)，所述酯化試劑由重量份數(shù)比為2∶1-1∶1的吡啶和氯磺酸的在冰浴條件下反應(yīng)制得；2)步驟1)所述酯化反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)物中和至pH6.8-7.2，有機(jī)溶劑沉淀，將所得沉淀溶解、透析得到所述新月菱形藻胞外多糖硫酸酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟1)所述新月菱形藻胞外多糖與甲酰胺的重量比為1.2∶1-1.5∶1；所述新月菱形藻胞外多糖酯化試劑的重量份數(shù)比1.5∶1-1∶1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于步驟1)所述酯化反應(yīng)的溫度為0-4℃；反應(yīng)時(shí)間為100-120min。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于步驟2)所述中和是采用NaOH溶液；所述沉淀用有機(jī)溶劑為乙醇；溶解沉淀采用水。
8.以新月菱形藻胞外多糖硫酸酯為活性成分的免疫調(diào)節(jié)藥物。
9.以新月菱形藻胞外多糖硫酸酯為活性成分的抗腫瘤藥物。
10.以新月菱形藻胞外多糖硫酸酯為活性成分的抗病毒藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了新月菱形藻胞外多糖硫酸酯及其制備方法與應(yīng)用。該新月菱形藻胞外多糖硫酸酯的制備包括如下步驟1)將新月菱形藻胞外多糖與甲酰胺混合，然后加入酯化試劑進(jìn)行酯化反應(yīng)，所述酯化試劑由重量份數(shù)比為2∶1－1∶1的吡啶和氯磺酸的在冰浴條件下反應(yīng)制得；2)步驟1)所述酯化反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)物中和至pH6.8－7.2，用有機(jī)溶劑沉淀，將所得沉淀溶解、透析得到所述新月菱形藻胞外多糖硫酸酯。本發(fā)明的新月菱形藻胞外多糖硫酸酯免疫調(diào)節(jié)活性有了顯著的提高，對(duì)病毒性肺炎和腫瘤的形成有顯著地預(yù)防作用，具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P37/02GK1772768SQ200410090619
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2004年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月9日
發(fā)明者鄭維發(fā), 儲(chǔ)成才 申請(qǐng)人:江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室