專利名稱：新的抗真菌化合物、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于有抗真菌活性的新化合物，制備方法及用途。更確切地說，本發(fā)明公開了分子式(1)的化合物，含有它的藥用組合物，利用微生物發(fā)酵制備此化合物的方法，以及使用的新的微生物，和化合物及其藥用組合物在制備治療和/或預(yù)防抗真菌藥物中的用途。
背景技術(shù)1950年以后，與抗生素相關(guān)的研究快速發(fā)展并廣泛普及，開發(fā)出了對于各種感染性疾病的許多治療藥物。另一方面，近年來出現(xiàn)了由念珠菌，曲霉，隱球菌等真菌引發(fā)的深部真菌的增加和嚴(yán)重化的現(xiàn)象，這些現(xiàn)象和白血病，惡性淋巴腫，HIV感染引起的免疫不全，抗癌藥物引起的免疫能力低下以及抗生素大量使用引起的菌的變異現(xiàn)象關(guān)系密切。
現(xiàn)在，深部真菌的治療中，常使用多烯大環(huán)內(nèi)酯類，唑類，氟胞嘧啶類藥物，例如多烯類大環(huán)內(nèi)酯類藥物的一種兩性霉素B，其抗真菌活性強(qiáng)，有很好的治療效果。但因?yàn)槠淠I毒性等副作用，被指出存在安全性的問題(Gallis等，Rev.Infect.Dis.Vol 12，p309～329，1990)，氟胞嘧啶類藥物也存在安全性低和存在耐藥菌等方面的問題。
另一方面，唑類藥物被認(rèn)為安全范圍廣泛，副作用低，但有抗菌譜窄的問題，因此對嚴(yán)重的病癥的有效性低，而且被認(rèn)為耐藥性在增加。(Rex等，Antimicrob.Agents Chemother Vol 39，p1～8，1995)而且，近年來Micafungin和Caspofungin等環(huán)肽類藥物(Denning，Lancet Vol362，9330 p1142～1151，2003)被開發(fā)，用于深部真菌感染的治療。
因?yàn)橛猩鲜龅默F(xiàn)狀，應(yīng)對病因的變化、安全性的確保、耐藥菌的增加，希望能開發(fā)新的抗真菌藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種新化合物；本發(fā)明的另一目的是提供一種制備該抗真菌化合物的方法；本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供一種具有抗真菌活性的新的藥物組合物。
本發(fā)明的發(fā)明人，從微生物代謝產(chǎn)物的篩選新抗真菌藥物的過程中，發(fā)現(xiàn)屬于牽連青霉(Penicillum implicatum)的真菌培養(yǎng)物中存在抗真菌活性的化合物，接著為了確定培養(yǎng)物中活性物質(zhì)，將培養(yǎng)物分離純化并對化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)了分子式(1)新化合物具有抗真菌活性，并在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了具有抗真菌活性的分子式(1)的新化合物，而且本發(fā)明提供了對屬于青霉屬的菌種的培養(yǎng)，從它的代謝產(chǎn)物中得到式(1)表示的化合物的提取過程，提供了式(1)表示化合物的制備方法。
本發(fā)明提供了1.如分子式(1)表示的化合物及其可藥用的鹽；
2.制備上述化合物的方法，包括培養(yǎng)一種能夠產(chǎn)式(1)化合物的青霉菌屬微生物，和從培養(yǎng)物中提取純化該化合物的方法；3.產(chǎn)生化合物(1)的青霉菌屬微生物，牽連青霉(Penicillium implicatum)NCC00646 CGMCC 1079。
4.一種藥物組合物，含有式(1)化合物作為活性成分及藥用載體。
5.上述藥物組合物，可用于治療和/或預(yù)防真菌感染。
本發(fā)明分子式(1)表示的化合物，具有很好的抗真菌活性作為真菌感染疾病的治療和/或預(yù)防藥物，十分具有應(yīng)用前景。
本發(fā)明的上述分子式(1)表示的新化合物(以下略稱為化合物(1))有下記的物理化學(xué)性狀。
(1)顏色和外觀無色粉末
(2)分子式C49H79N7O16(3)質(zhì)譜(HRFAB-MS)測量值m/z 1022.5658[M+H]+理論值m/z 1022.5662[C49H80N7O16]+(4)相對旋光度[α]D＝-36.2°(c0.8，MeOH，25℃)(5)紫外吸收波譜λmax，nm(E1％1cm)223(sh，108)，276(15)，283(sh，13)/MeOH245(92)，291(16)/0.01N KOH+MeOH(6)紅外吸收波譜(KBr)vmax，cm-13360，2928，2855，1628，1520，1456，1232(7)1H核磁共振波譜(CDCl3，400MHz)δ(ppm)0.85(3H，d)，0.87(3H，t)，1.04(3H，d)，1.20(6H，d)，1.25～1.35(19H，m)，1.58(2H，m)，1.90(1H，m)，2.05(1H，m)，2.08(1H，m)，2.21(2H，t)，2.41(1H，m)，2.51(1H，m)，3.37(1H，dd)，3.78(1H，dd)，3.85(1H，dd)，3.91(1H，m)，3.96(1H，dd)，4.14(1H，m)，4.17(1H，dd)，4.21(1H，dd)，4.29(1H，d)，4.30(1H，d)，4.32(1H，d)，4.38(1H，dd)，4.50(1H，dd)，4.54(1H，m)，4.57(1H，dd)，4.83(1H，d)，4.94(1H，d)，5.22(1H，d)，6.74(2H，dd)，7.13(2H，dd)(8)13C核磁共振波譜(CDCl3，100MHz)δ(ppm)11.2，11.7，19.6(×2)，20.0，27.0，28.2，30.3，30.5，30.5，30.5，30.6，30.7，30.8，35.0，35.7，36.8，37.7，38.5，39.0，51.6，52.9，56.3，56.8，57.1，58.5，62.4，68.3，69.5，69.7，70.8，71.2，74.5，75.5，75.7，76.9，116.1(×2)，129.5(×2)，133.0，158.4，169.9，172.5(×2)，172.7，173.5，174.3，176.2(9)溶解性溶于甲醇，氯仿，乙酸乙酯和二甲基亞砜；不溶于正己烷和水。
和化合物(1)類似的化合物有棘白霉素B(echinocandin B)(sandoz等，Tetrahedron letters Vol 46，p4147～4150，1976)和Mulundocandin(Roy等，J.Antibiotics Vol 40，P275-289，1987)。但本發(fā)明的化合物(1)和已知化合物物理化學(xué)性狀不同，能夠明顯區(qū)別。
化合物(1)的可藥用鹽，可以舉例為鈉，鉀，鋰等堿金屬或鈣等堿土金屬鹽。
上述化合物(1)能夠使用產(chǎn)生該化合物的青霉屬真菌培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中提取該化合物。作為產(chǎn)生化合物(1)的青霉屬真菌，只要能產(chǎn)生化合物(1)并不受限制。例如牽連青霉(Penicillium implicatum)真菌NCC00646.
化合物(1)的產(chǎn)生菌NCC00646從中國云南西雙版納(xi shuang ban na)的土壤中分離得到。
NCC00646的菌株在Czapek’s瓊脂培養(yǎng)基，potato dextrose瓊脂培養(yǎng)基中，26℃。菌落為青綠色到深綠色，絨狀，形成菌絲索，菌絲層致密。沒有可溶色素形成，背面為褐色。
分生孢子有基質(zhì)形成，直徑2～2.5μm，長100μm。該青霉為單輪生或兩個(gè)?；纬傻膹?fù)輪生，小梗8～12個(gè)密集，9～12×2～2.5μm，分生孢子球形或近球形，2.5～3μm，略粗糙。
從以上的菌學(xué)特征可以認(rèn)為NCC00646屬于真菌的牽連青霉(Penicilliumimplicatum)。
菌株NCC00646于2003年12月18日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)中，保藏號CGMCC No.1079。
本發(fā)明中化合物(1)的產(chǎn)生菌可以使用NCC00646由來的突變體(既可以自然發(fā)生也可為誘變)，質(zhì)體融合或基因重組的突變株。NCC00646菌株和突變株，可以由自然界生存的突變株，也可以為人工變異的突變株。
培養(yǎng)化合物(1)的產(chǎn)生菌，可以利用含有通常的微生物的營養(yǎng)源的培養(yǎng)基。
營養(yǎng)源，可以利用公知的真菌培養(yǎng)基。例如，用作碳源可以是葡萄糖、蔗糖、糖蜜、糊精、淀粉、甘油，動(dòng)物油和植物油。用作氮源常常是大豆粉、麥芽汁、棉子，玉米漿、蛋白胨、牛肉膏、干酪素、酵母膏，尿素，以及硫酸銨和硝酸銨等銨鹽。加入一些無機(jī)鹽也很有效，如鈉、鉀、鈣、錳、鈷、銅鹽，以及氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽。另外，加入一些有利于真菌生長的有機(jī)物和無機(jī)物也有利于真菌的生長。
可以在需氧條件下，采用靜止培養(yǎng)法或者振蕩培養(yǎng)法培養(yǎng)化合物(1)的產(chǎn)生菌，靜置培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)或罐培養(yǎng)均可，其中采用靜置培養(yǎng)更有利。培養(yǎng)溫度和時(shí)間在化合物(1)產(chǎn)生菌生長的狀況下不受限制，可以根據(jù)培養(yǎng)基不同設(shè)定。適宜的培養(yǎng)溫度為20℃～30℃，26℃附近最佳。培養(yǎng)周期一般在2～21天內(nèi)的產(chǎn)量達(dá)到最大。培養(yǎng)結(jié)束后，化合物(1)達(dá)到最高量時(shí)停止培養(yǎng)，提取化合物(1)。
從發(fā)酵液中提取的化合物(1)，根據(jù)其性狀，可以利用通常的分離手段。分離手段可以舉例為溶媒提取，吸附洗脫，各種樹脂層析及沉淀法等。這些手段的組合使用效果更好。
具體說，從NCC00646培養(yǎng)物中提取目標(biāo)產(chǎn)物，可以先用67％的丙酮水溶液從菌株目的物的發(fā)酵液中抽提，蒸發(fā)除去粗提液中的丙酮，然后用乙酸乙酯抽提。乙酸乙酯的抽提物用硅膠柱層析和凝膠過濾層析提純，最后用TLC或者HPLC純化得到化合物(1)。
化合物(1)和其可藥用鹽，具有抗真菌活性，其中任何一種含有有效成分的藥物組合物，對包含人在內(nèi)的動(dòng)物給藥后，效果明顯。具體來講，對真菌感染癥的治療和/或預(yù)防有效，可以作為抗真菌藥物。
作為經(jīng)口服給藥的制劑，可以做成片劑、丸劑、膠囊劑、散劑，口服劑，顆粒劑、粉劑、懸濁劑，糖漿，舌下劑等。作為非經(jīng)口給藥的制劑，可以做成針劑、皮膚吸收劑、吸入劑、栓劑等。本發(fā)明的藥物組合物的配方中可以加入一些可以接受的藥物添加劑，如表面活性劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、崩解劑、增溶劑、等滲劑、緩沖劑、著色劑、芳香劑等。
藥用載體可以使用制藥行業(yè)中允許使用的載體，它的種類和組成可根據(jù)給藥途徑和方法而定。例如，液體載體可以為水，醇，大豆油，芝麻油等，固體載體可以為麥芽糖，蔗糖等糖類，賴氨酸等氨基酸，羥丙基纖維素等纖維素衍生物，環(huán)糊精等多糖，硬脂酸鎂等有機(jī)酸鹽。以注射劑形式的制劑，液體載體一般為生理鹽水，各種緩沖液，葡萄糖等糖類溶液等。
本發(fā)明中化合物(1)和它的鹽作為藥物組合物給藥時(shí)，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴(yán)重性，以及給藥途徑而異，可以參考動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和具體情況，總給藥量不能超過一定范圍。具體講，對成人的口服劑量是1～1,000mg/kg/天，靜脈注射的劑量是0.1～100mg/kg/天。


附圖1化合物NCC00646的紫外圖譜附圖2化合物NCC00646的紅外圖譜附圖3化合物NCC00646的核磁圖譜(1H譜)附圖4化合物NCC00646的核磁圖譜(13C譜)具體實(shí)施方式
以下為本發(fā)明的實(shí)施例，并不是對本發(fā)明的限定，也包括這里沒有顯示的改變的方法和修飾手段。
實(shí)施例1化合物NCC00646的制備(1)菌株NCC00646的培養(yǎng)將牽連青霉菌(Penicillium implicatum)的單孢子在新鮮的麥芽膏瓊脂(MEA)斜面培養(yǎng)24℃，5天。培養(yǎng)好的斜面制成含0.01％吐溫80的10毫升的孢子懸液。0.5毫升孢子懸液在含有麥芽膏瓊脂(MEA)的平皿中涂勻，培養(yǎng)5天后，用無菌環(huán)刮取平皿上的孢子，懸浮于無菌蒸餾水中，接種到含有15公斤麥麩的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)容器(不銹鋼制)200×80×17cm(2)化合物NCC00646的提取純化上述培養(yǎng)物的一部分(2kg)，先用2L 67％的丙酮水溶液抽提，獲得粗提液。過濾并蒸出丙酮，然后用1.5L乙酸乙酯抽提。乙酸乙酯抽提物蒸發(fā)后得到6.8g粗提物。粗提物用100ml甲醇溶解，加入20g硅膠(WAKOGEL C-300，Wako Pure Chemical Industries)減壓干燥，將吸附有粗提物的硅膠加到裝有30g硅膠的層析柱上，然后用氯仿∶甲醇＝99∶1(100ml)，氯仿∶甲醇＝97∶3(500ml)，氯仿∶甲醇＝90∶10(300ml)等的溶劑順序洗脫。在甲醇∶氯仿＝50∶50(500ml)部分，活性成分被洗脫出，減壓干燥后得到426mg的干燥固體。
干燥固體用甲醇溶解后，進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠過濾柱層析(Pharmacia，5cm i.d.×90cm)，并用甲醇洗脫。洗脫量為600～650ml部分的組份干燥后得到79mg固體。接著，這些固體用甲醇溶解，使用HPLC色譜柱(Cosmosil AR-II內(nèi)徑2cm×25cm Nacalai Tesque)進(jìn)行制備，流動(dòng)相為乙腈∶蒸餾水＝40∶30。流動(dòng)相的流速為10ml/min，13.5分鐘洗脫出的成分，減壓濃縮，得到化合物(1)6.2mg。
實(shí)施例2化合物NCC00646的抗真菌活性測定實(shí)施例2中得到的化合物(1)的抗真菌活性，采用液體濃度稀釋法測定對真菌菌株的最小抑菌濃度。真菌用YNBP培養(yǎng)基培養(yǎng)(含有緩沖劑的酵母氮基礎(chǔ)，含0.5％的葡萄糖，采用DIFCO方法產(chǎn)生)，28℃培養(yǎng)48小時(shí)。結(jié)果如表1。
表1.化合物(1)的抗真菌活性

表1顯示，本發(fā)明的化合物(1)有很好的抗真菌活性。
權(quán)利要求
1.如分子式(1)表示的化合物及其可藥用的鹽
2.一種制備權(quán)利要求1化合物的方法，包括培養(yǎng)一種能夠產(chǎn)式(1)化合物的青霉菌屬微生物，和從培養(yǎng)物中提取純化該化合物的方法。
3.權(quán)利要求2的方法，其中青霉菌屬微生物為牽連青霉(Penicillium implicatum)NCC00646 CGMCC 1079。
4.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1中的化合物作為活性成分及藥用載體。
5.權(quán)利要求4所述的藥物組合物，可用于治療和/或預(yù)防真菌感染。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有分子式(1)的化合物NCC00646及它的可藥用鹽，具有抗真菌活性。本發(fā)明還公開了一種制備化合物NCC00646的方法。本發(fā)明還公開了含有化合物(1)的組合物在制備治療和/或預(yù)防真菌感染藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P31/10GK1796386SQ20041009244
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月27日
發(fā)明者張華 , 董悅生, 谷匡人, 飯?zhí)镎嬉雷?申請人:華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司, 明治制果株式會(huì)社