專利名稱：脫氫卡維丁類化合物及其在醫(yī)藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從中藥巖黃連中分離提取的脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物及其在醫(yī)藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝炎是目前世界上危害最為嚴重的傳染性疾病之一，且又與肝癌發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，目前，全球約有3.5億人為慢性肝炎患者或為無癥狀病毒感染者。這些慢性肝炎的病人有轉(zhuǎn)為肝硬化，肝癌的高危險性，每年有100多萬人死于和肝炎、肝硬化及肝癌有關(guān)的疾病。我國是肝炎病高發(fā)地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計，肝癌患者中有90％有肝炎病毒感染的背景，而目前肝癌已占腫瘤致死率的第二位。為預(yù)防和治療這一常見病、多發(fā)病、難治病，多年來國內(nèi)外有關(guān)研究人員一直關(guān)注與從事著保肝解毒的臨床和藥理研究。大多數(shù)國家治療慢性乙型肝炎采用的藥物是α-干擾素(IFN)，其作用主要是免疫調(diào)節(jié)。目前，醫(yī)學界對乙型和丙型病毒性肝炎的治療尚缺乏專屬性較強的治療藥物，抗乙肝病毒的藥物多數(shù)為抗HIV逆轉(zhuǎn)酶抑制劑和抗皰疹病毒DNA聚合酶抑制劑，這兩種病毒酶的抑制劑也是抗乙肝病毒的靶點；而用于抗丙肝病毒的藥物多數(shù)為廣譜抗病毒藥或RNA病毒抑制劑以及具有抗病毒活性的免疫調(diào)節(jié)劑，但現(xiàn)在的抗肝炎藥物普遍存在耐藥性的問題。
人類細胞染色體末端含有長達7～15千TTAGGG重復序列。這些重復序列和與之結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)(telomeric repeat-binding factors，TRFs)構(gòu)成一種特殊結(jié)構(gòu)稱之為端粒。正常人類體細胞由于“末端復制問題”，隨著細胞不斷分裂，端粒呈現(xiàn)漸進性縮短，細胞每分裂一個周期，端粒長度就要減少30～120bp。當端粒減少到一定程度，細胞發(fā)生永久性不可逆轉(zhuǎn)的生長停滯，即所謂“細胞老化”。這種端?？s短所造成的“細胞老化”將細胞的分裂次數(shù)和壽命限制在一定范圍之內(nèi)，防止了他們的無限增殖，這一過程被認為是人類進化過程中獲得的特有抗腫瘤機制。此外，端粒的DNA序列與結(jié)構(gòu)可抵抗各種DNA限制型內(nèi)切酶，連接酶的作用，從而保護染色體免受損害或畸變性重組，維護遺傳學或基因組的穩(wěn)定及完整。因為細胞遺傳學的改變與癌癥發(fā)生密切相關(guān)，所以端粒的這一功能同樣對預(yù)防癌變有著重要意義。
端?？s短是如何觸發(fā)細胞老化程序尚不十分明了。近期研究顯示過度縮短的端粒因失去與之結(jié)合的TRFs(特別是TRF2)，不能維持他們的D和T環(huán)結(jié)構(gòu)，導致末端TTAGGG序列外露。這些裸露在外的端粒DNA，本質(zhì)上相當于斷裂的雙鏈DNA(Double-stranded DNABreaks，DSB)，能夠激活DNA損傷監(jiān)控通路(DNA Damage Response Pathway，DDRP)。已有證據(jù)表明DDRP通路的ATM，p53在端?？s短誘導細胞老化過程中至關(guān)重要。此外，腫瘤抑制因子p16，Rb亦同樣發(fā)揮關(guān)鍵作用。眾所周知，p53或Rb等具有腫瘤抑制活性的蛋白功能失活極易導致腫瘤發(fā)生，其中一個重要原因即端?？s短誘導細胞老化的效應(yīng)減弱甚或消失。
如上所述，正常人類體細胞因進行性端?？s短最終激活DDRP而停止生長。然而，惡性細胞最顯著特征之一恰是他們的無限增殖能力。根據(jù)上述端?？s短控制細胞壽命學說，細胞永生或無限分裂的先決條件是維持他們的恒定端粒長度。大量試驗及臨床研究表明，絕大多數(shù)腫瘤細胞(近90％)通過激活一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶即所謂端粒酶而達此目的。端粒酶作為蛋白質(zhì)-核酸復合體，主要由RNA模板(telomerase RNA，hTER)，端粒酶相關(guān)蛋白(telomerase associated protein，hTEPs)，和催化亞單位即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerasereverse transcriptase，hTERT)組成，他能夠利用自身的RNA模板合成TTAGGG序列，延長端粒，從而補償由細胞分裂所致的端粒DNA丟失，進而賦予細胞持續(xù)生長的潛能。大多數(shù)正常人類體細胞通常缺乏端粒酶活性(干細胞及活化的淋巴細胞除外)，他們的端粒自然隨細胞分裂而縮短。近期的體外試驗發(fā)現(xiàn)，當腫瘤細胞的端粒酶活性受抑，他們會因無法保持端粒長度而發(fā)生生長停滯，凋亡并失去致瘤性，說明端粒酶表達確系維持腫瘤細胞惡性表達及無限增殖所必須。因此，抑制端粒酶活性被認為是一種全新的極具前途的腫瘤治療手段。確實，當腫瘤細胞被導入并表達突變后無活性的hTERT(Dominant negativehTERT，DN-hTERT)，端粒酶活性受抑制，端粒進行性縮短，細胞最終生長停滯，凋亡并失去致瘤性。此外，許多研究采用不同的策略阻斷端粒酶活性，亦獲類似結(jié)論。
一種安全有效的端粒酶抑制劑可以被用來治療所有類型的腫瘤，是一全新的腫瘤治療的靶點，也是近年來國內(nèi)外研究的熱點。雖然尋求端粒酶抑制劑的研究在全球十分活躍，許多實驗室發(fā)明不同的策略阻斷/抑制端粒酶活性，但至今尚缺乏有應(yīng)用前景并適于臨床的端粒酶抑制劑。
開發(fā)創(chuàng)新藥物是我國目前的一項緊迫任務(wù)。從中藥中尋找有效的活性成分是一條有效的途徑，也是我國創(chuàng)新藥物研制的優(yōu)勢所在。我國中醫(yī)藥學具有悠久的歷史，用中草藥治療惡性腫瘤也積累了豐富的經(jīng)驗，在這些植物有效成分中，推測極有可能存在抑制端粒酶活性的物質(zhì)。所以，從天然產(chǎn)物中篩選具有端粒酶抑制活性的先導化合物不失為一理想途徑；進而通過進行先導化合物的結(jié)構(gòu)修飾及全合成，再從一系列衍生化合物中篩選活性較強的單體，并結(jié)合端粒酶抑制活性的構(gòu)效關(guān)系研究，最終發(fā)現(xiàn)具有臨床應(yīng)用前景的藥物。
巖黃連為罌粟科紫堇屬植物石生黃堇(Corydalis saxicola Bunting[C.thalictrifolia Franch.non Jameson ex Regel])的全草，又名巖胡(貴州)、巖連(四川、云南)、菊花黃、土黃連(廣西)。廣西民間用其根止痛消腫，拔毒，治療疥瘡腫毒?，F(xiàn)代臨床用其總生物堿提取物治療肝炎和肝硬化等疾病(國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草(第三卷)638-640.上海上海科學技術(shù)出版社)。
陳重陽等在1982年，研究了巖黃連主要成分脫氫卡維丁(dehydrocavidine)的藥理活性，實驗結(jié)果表明脫氫卡維丁(dehydrocavidine)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜作用，對腸道平滑肌有解痙作用，在體外對多種細菌有效，對正常小鼠血糖無影響，并能增加肝糖元的生成。葉琦莉于1984年研究了脫氫卡維丁(dehydrocavidine)的體外抗菌活性，實驗證明脫氫卡維丁(dehydrocavidine)對革蘭陽性菌株有一定抑制作用。1996年，謝沛珊等的抗腫瘤實驗證實巖黃連總堿在1.6mg/kg水平對S180肉瘤抑制率可達到30％。近10年來，又有研究表明巖黃連總堿對小鼠免疫功能有增強作用，對大鼠腦中的DA和5-HT的代謝有一定抑制作用。
巖黃連在臨床上用作肝炎輔助治療藥物，任仲軒等應(yīng)用巖黃連注射液治療病毒性肝炎患者33例，結(jié)果顯示巖黃連注射液可以有效的改善急慢性肝炎患者的臨床癥狀。巖黃連注射液合并生脈注射液對肝硬化有明顯療效，巖黃連注射液與丹參注射液合用可有效改善肝功能，減輕和抑制肝纖維化的發(fā)生。
迄今為止尚未見脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物單體成分肝保護及抗肝炎病毒活性的研究報道，亦未見將脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物單體成分用于肝炎治療的報道；同時經(jīng)過文獻檢索及跟蹤，亦未見國內(nèi)外將脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物單體成分用于端粒酶抑制劑的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提出一種從中藥巖黃連中分離提取的脫氫卡維丁類化合物、以該類化合物為活性成分的藥物組合物，以及它們在治療急性和慢性病毒性肝炎、肝損傷、流感、腫瘤、AIDS、心律失常的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過體內(nèi)及體外藥理活性跟蹤篩選，從巖黃連分離純化得到具有肝損傷保護活性、抗乙肝病毒活性及端粒酶抑制活性的單體化合物成分。通過光譜數(shù)據(jù)(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、MS、UV)，此單體化合物經(jīng)鑒定結(jié)構(gòu)為脫氫卡維丁(dehydrocavidine)。通過化學合成方法，我們合成了一系列脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物。多種藥理試驗結(jié)果證明，該類化合物是較有發(fā)展前途的抗肝炎及抗腫瘤天然產(chǎn)物，可用于制備治療肝病及腫瘤的藥物。
脫氫卡維丁類化合物，具有如下結(jié)構(gòu)通式 其中，R1、R2為氫、C1-18烷基、C1-18羥烷基、可被任意取代的芳酰基；R3、R4、R5、R6、為氫、C1-4烷基或C1-4羥烷基。經(jīng)實驗研究證明，脫氫卡維丁類化合物具有抗乙肝病毒活性以及具有肝損傷保護作用，并可增進肝臟解毒功能，作為對抗化學毒物的肝保護劑，其效果優(yōu)于苦參堿；實驗研究還證明脫氫卡維丁類化合物對人端粒酶具有抑制作用，具有抗腫瘤活性、抗病毒活性，同時具有抗心律失常作用。
本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的脫氫卡維丁類化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學上可接受的載體。
本發(fā)明的化合物和藥物組合物可用于制備治療急性和慢性病毒性肝炎、肝損傷、流感、腫瘤、AIDS、心律失常的藥物。
上文所述藥學上可接受的載體是指藥學領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優(yōu)選的形式凍干粉針劑、小針劑、注射液、膠囊劑、軟膠囊、片劑、顆粒劑、沖劑、滴丸、微丸、口服液等。
本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.1％-99.5％的活性成分，最優(yōu)選含有重量比為0.5％-95％的活性成分。
下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
具體實施例方式
實施例1天然脫氫卡維丁(dehydrocavidine)的提取將巖黃連藥材全草粉碎后，用95％乙醇回流提取，提取液放冷后過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，以鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，攪拌，過濾得到酸水液，酸水液用堿調(diào)節(jié)pH值至8～10，析出沉淀，過濾得到沉淀部分，沉淀用水分散后，經(jīng)氯仿、乙酸乙酯或正丁醇萃取，萃取液減壓濃縮得到浸膏部分，經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，收集氯仿-甲醇8∶1部分，減壓濃縮得到粗品脫氫卡維丁，再以甲醇-水系統(tǒng)重結(jié)晶，得到棕褐色棱柱狀結(jié)晶單體，經(jīng)鑒定為脫氫卡維丁(dehydrocavidine)。
實施例2脫氫卡維丁(dehydrocavidine)的結(jié)構(gòu)鑒定脫氫卡維丁，棕褐色棱柱狀結(jié)晶，mp 276～278°(分解)，UVλmax(MeOH)nm268，349；EI-MSm/z[M+]351(1.46％)，337(100％)，321(27.74％)，169(12.61％)，碎片離子m/z 169由B環(huán)及C環(huán)發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生，初步判定分子結(jié)構(gòu)含有9，10-亞甲二氧基-13-甲基取代結(jié)構(gòu)；1H-NMR顯示分子中含有兩個甲氧基δ3.89(s)、3.85(s)，一個甲基δ2.97(s)，一個亞甲二氧基δ6.56(s)，芳香區(qū)顯示有5個芳香質(zhì)子，δ7.17(s)、δ7.38(s)為1、4位芳香質(zhì)子，δ9.94(s)為8位質(zhì)子，兩個臨偶芳香質(zhì)子δ8.06(d，J＝9 Hz)、δ8.01(d，J＝9Hz)分別為11、12位質(zhì)子；脂肪區(qū)四個質(zhì)子，δ3.144(2H，t)、δ4.74(2H，t)相互偶合，為5、6位質(zhì)子。脫氫卡維丁的結(jié)構(gòu)見下式所示。
即對結(jié)構(gòu)通式而言，R1為H2C，R2為氫，R3、R4為H3CO，R5、R6為氧。
實施例3脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物的合成通過大量的藥理活性篩選試驗結(jié)果，證明脫氫卡維丁具有很好的抗乙肝病毒、抗HIV作用、肝損傷保護作用及端粒酶抑制活性，因此我們設(shè)計合成了一系列脫氫卡維丁的類似物及衍生物，重點在于合成13位及8位取代的脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類衍生物。
1、13位取代脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物的合成，路線如下 R＝CH3，C2H5，CH(CH3)2，CH2COOCH3，CH2CONH2，CH2CONHC2H5，或CH2CON(C2H5)2 R，R1為CH3，C2H5，CH(CH3)2，CH2COOCH3，CH2CONH2，CH2CONHC2H5，CH2CON(C2H5)2CH2CONHC2H5，或CH2CON(C2H5)2，等等。
2、8位取代脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物的合成，路線如下 R為CH3、C2H5、CH(CH3)2或CH2C6H5以脫氫卡維丁為先導化合物，共設(shè)計合成脫氫卡維丁類化合物共33個，其結(jié)構(gòu)式如下
即對結(jié)構(gòu)通式而言，R4為H3CO，R5、R6為氧。
表1脫氫卡維丁類化合物結(jié)構(gòu)式

實施例4片劑活性成分 10mg乳糖 187mg玉米淀粉 50mg硬脂酸鎂 3mg制備方法將活性成分(即前述33個化合物之一種或若干種作為活性成分，下同)、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤，把濕潤后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，活性成分含量為10mg。
實施例5安瓿劑活性成分 2mg氯化鈉 9mg制備方法將活性成分和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓿瓶中。
實施例6脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物對試驗性肝損傷的保護作用的動物驗證(一)硫代乙酰胺致小鼠急性肝損傷模型1、試驗動物昆明種小鼠，性別不限，體重19～22g，隨意進食及飲水，室溫(23±2℃)，自然光照。
2、試驗方法將小鼠隨機分成7組，除正常對照組外，其余各組均以硫代乙酰胺(TAA)30mg/Kg，i.p，中毒后3h、6h、9h，連續(xù)給藥3次，最后一次給藥后24小時，即第二天取血，測定如下指標，同時稱肝重，并進行病理學檢查。結(jié)果見表2。
表2各組試藥對硫代乙酰胺致小鼠急性肝損傷模型各指標的影響(X+SD，n＝20)


*與陰性對照組比較_P＜0.05；__P＜0.01結(jié)果與陰性對照組比較，脫氫卡維丁類化合物可顯著降低硫代乙酰胺致小鼠急性肝損傷模型造成的肝損害。
(二)四氯化碳致大鼠急性肝中毒模型1、試驗動物成年SD大鼠，性別不限，體重在250～350g左右，喂飼普通顆粒飼料，隨意飲水。
2、試驗方法將大鼠隨機分成6組，除正常對照組外，其余各組均以50％四氯化碳0.5ml/100g，皮下注射中毒，同時給藥一次，中毒后4h、8h各給藥一次，最后一次給藥后12小時，取血測定ALT，AST等指標的變化，處死動物稱肝重，并進行病理學檢查。結(jié)果見表3。
表3各組試藥對四氯化碳致大鼠急性肝損傷模型各指標的影響(X±SD，n＝20)

*與陰性對照組比較_P＜0.05；__P＜0.01結(jié)果與陰性對照組比較，脫氫卡維丁類化合物可顯著降低四氯化碳致大鼠急性肝中毒模型造成的肝損害。
(三)D-氨基半乳糖致大鼠肝中毒模型
1、試驗動物成年SD大鼠，性別不限，體重在250～350g左右，喂飼普通顆粒飼料，隨意飲水。
2、試驗方法將大鼠隨機分成4組，除正常對照組外，其余各組均以D-氨基半乳糖800mg/Kg，腹腔注射中毒，同時給藥一次，給藥后12小時，取血測定SGPT，TBIL等指標的變化，處死動物稱肝重，并進行病理學檢查。結(jié)果見表4。
表4各組試藥對D-氨基半乳糖致大鼠肝中毒模型各指標的影響(X±SD，n＝20)


*與陰性對照組比較_P＜0.05；__P＜0.01結(jié)果與陰性對照組比較，脫氫卡維丁類化合物可顯著降低D-氨基半乳糖致大鼠肝中毒模型造成的肝損害。
(四)四氯化碳誘導肝纖維化模型1、試驗動物雄性Wistar大鼠，試驗開始時體重100～150g，飼育22℃室溫，光照周期12h12h環(huán)境中，隨意進食及飲水。
2、試驗方法雄性Wistar大鼠，皮下注射0.3ml/100g體重CCl4(溶于花生油中，CCl4體積比為40％)，每周2次，注射12周形成肝纖維化，均為IV期。隨后將肝纖維化大鼠隨機分為以下各組生理鹽水對照組，各樣品組，陽性對照組。每日肌肉注射樣品1次，共8周。生理鹽水對照組每日肌肉注射0.2ml生理鹽水，共進行8周。于治療8周后從下腔靜脈采血作生化測定，然后處死動物，取右葉肝組織，用10％的中性甲醛溶液固定，用于組織學檢查。結(jié)果見表5表5各組試藥對四氯化碳致大鼠慢性肝中毒模型各指標的影響(X±SD，n＝20)(連續(xù)11周后)


*與陰性對照組比較_P＜0.05；__P＜0.01結(jié)果與陰性對照組比較，脫氫卡維丁類化合物可顯著降低四氯化碳致大鼠慢性肝中毒模型造成的肝損害。
實施例7脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物對肝炎病毒的抑制作用1.試驗材料1.1 受試藥樣品，溶劑及配制方法實驗時根據(jù)所設(shè)計劑量組濃度用DMEM培養(yǎng)液配制。保存條件4′C冰箱保存。
1.2 2.2.15細胞乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細胞(Hep G2)的2.2.15細胞系，美國Mount Sinai醫(yī)學中心構(gòu)建，我室引進后自行傳代培養(yǎng)。
1.3 試劑DMEM干粉、G-418(Geneticin)，美國GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清，美國HycloneLab公司產(chǎn)品HBsAg、HBeAg固相放免測定盒，中國同位素公司北方免疫試劑研究所；卡那霉素，中國生物制品檢定所標準晶。
1.4 實驗用品及儀器培養(yǎng)瓶，丹麥Tunclon TM；培養(yǎng)板96孔板、24孔板、6孔板美國Coming公司產(chǎn)品；二氧化碳孵箱，美國Shel-Lab產(chǎn)品；γ計數(shù)儀，德國BECKMAN產(chǎn)品；2.試驗方法2.1 2.2.15細胞培養(yǎng)在長滿2.2.15細胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)加0.25％胰酶，37℃消化3分鐘，加培養(yǎng)液吹散，1∶3傳代，10天長滿。
2.2 藥物對細胞毒性試驗實驗分無藥物細胞對照組和不同藥物濃度藥物組。細胞消化，配制成每毫升20萬個細胞，接種培養(yǎng)板，96孔板每孔100～tl，37′C 5％CO2培養(yǎng)24小時，細胞長成單層后進行實驗。各樣品分別根據(jù)不同溶解度用培養(yǎng)液配制，分別稀釋為不同濃度加入96孔細胞培養(yǎng)板，每濃度3孔，每4天換同濃度藥液，以觀察細胞病變?yōu)橹笜耍?天顯微鏡下觀察細胞病變，完全破壞為4；75％為3；50％為2；25％為1；無病變?yōu)?。計算每濃度藥液平均細胞病變程度和抑制％。按Reed-Muench法計算半數(shù)有毒濃度(TC50)和最大無毒濃度(TC0)。
TC50=Antilog(B+50-BA-B×C)]]>A＝log＞50％藥物濃度 B＝log＜50％藥物濃度 C＝log稀釋倍數(shù)2.3 對HBeAg、HBsAg抑制試驗試驗設(shè)HBsAg、HBeAg陽性對照組，陰性對照組，細胞對照組及不同藥物濃度藥物組。2.2.15細胞每毫升100萬個接種24孔細胞培養(yǎng)板，每孔1ml，37℃ 5％CO2培養(yǎng)24小時，試驗藥液無毒濃度以下2倍稀釋，5個稀釋度，每濃度3孔，37℃ 5％CO2培養(yǎng)，每4天換原濃度藥液培養(yǎng)，第8天時收獲培養(yǎng)液，-20℃冰凍保存。分別測定HBsAg和HBeAg。用γ計數(shù)儀測定每孔cpm值。

脫氫卡維丁類化合物對Hep G2 2.2.15細胞的毒性情況及對HBeAg、HBsAg的抑制情況結(jié)果如表6表6脫氫卡維丁類化合物對Hep G2 2.2.15細胞的毒性情況及對HBeAg、HBsAg的抑制情況



-“未見明顯毒性”指用MTT法檢測細胞存活率≥75％+“顯示毒性”指細胞存活率≤75％。
結(jié)果脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物對HBeAg和HBsAg具有一定的抑制作用，且對HBeAg的抑制作用高于對HBsAg的抑制作用。
實施例8脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物對端粒酶的抑制作用采用無細胞系統(tǒng)從中草藥有效成分中初步篩選出具有端粒酶抑制活性的先導化合物。從端粒酶陽性腫瘤細胞中提取含端粒酶的蛋白，以Telomeric Repeat AmplificationProtocol(TRAP)標準方法檢驗每種植物有效成分對端粒酶活性的影響。TRAP方法系測定端粒酶活性的標準方法。將各有效成分(10～100μmol)與腫瘤細胞提取物共育一定時間(10～20min)，然后進行TRAP檢測并計算其半數(shù)抑制濃度IC50，結(jié)果如表7表7脫氫卡維丁類化合物對端粒酶的抑制作用


-“未見抑制活性”指用TRAP法檢測半數(shù)抑制濃度≥100mmol結(jié)果脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物對端粒酶具有一定的抑制作用。
實施例9脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物對HIV病毒的抑制作用1、試驗材料1.1 受試藥樣品，溶劑及配制方法實驗時根據(jù)所設(shè)計劑量組濃度用DMSO配制。保存條件4℃冰箱保存。AZT(zidouvdine)做為陽性對照藥。
1.2 細胞和病毒HIV-1 III B引自美國；MT4細胞株引自日本；1.3 化臺物對細胞的毒性測定將MT4細胞2×105/ml接種于96孔板中，每孔0.1ml，加入驗證化合物、對陽性對照藥AZT，同時設(shè)正常細胞對照，DMSO溶劑對照及空白MT4細胞對照，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6d。MTT法測定細胞活性，確定TC50值。
1.4 化合物對HIV誘導MT4細胞病變的抑制作用病毒毒力測定用10倍稀釋8個濃度HIV，在培養(yǎng)液RPMI-1640中觀察細胞病變，計算TCID50為10-6。同時設(shè)正常細胞對照和病毒對照，然后分別加入2倍稀釋5個濃度的樣品及AZT 100ul，每個樣品濃度均設(shè)3個平行孔，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72h后在倒置顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)，計算IC50及選擇指數(shù)SI(TC50/IC50)，結(jié)果如表8表8脫氫卡維丁類化合物對HIV病毒的抑制作用


注IC50為半數(shù)有效濃度；TC50為半數(shù)無毒濃度；51為選擇指數(shù)，-為無效結(jié)果脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物對HIV病毒具有一定的抑制作用。
實施例10脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物對流感病毒抑制作用1、試驗材料1.1 受試藥樣品，溶劑及配制方法實驗時根據(jù)所設(shè)計劑量組濃度用DMEM培養(yǎng)液配制。保存條件4℃冰箱保存。利巴韋林做為陽性對照藥。
1.2 MDCK(Madin darby canin kidney)細胞、甲1流感病毒購自中國預(yù)防醫(yī)學科學院病毒所。
1.3 MDCK細胞生長液、細胞維持液、Versene溶液和消化液按文獻(郭元吉，程小雯；1997)方法配制。
2.試驗方法2.1 MDCK細胞傳代和流感病毒培養(yǎng)按文獻(郭元吉，程小雯；1997)方法進行。
2.2 細胞毒性試驗將樣品加入已長成單層細胞的細胞板內(nèi)0.1mL/孔，并加細胞維持液至1mL/孔，37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)72h，觀察細胞病變。同時設(shè)MDCK細胞對照。實驗重復2次。結(jié)果表明樣品對MDCK細胞沒有產(chǎn)生非特異性細胞病變(CPE)。
2.3 樣品抗流感病毒試驗96孔MDCK細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞，分別設(shè)細胞對照組、病毒對照組、陽性對照組和試驗組。將甲1流感病毒加入病毒對照組和試驗組，37℃吸附2h，吸出病毒。將不同濃度樣品分別加入到各試驗組，37℃、5％CO2培養(yǎng)3天，觀察試驗結(jié)果，并計算不同藥物對病毒的50％抑制濃度(IC50)，結(jié)果如表9表9脫氫卡維丁類化合物對流感病毒的抑制作用


試驗結(jié)果表明，脫氫卡維丁類化合物對流感病毒具有明顯的抑制作用。
實施例11脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物對心律失常拮抗作用1.脫氫卡維丁(dehydrocavidine)類化合物對烏頭堿誘導心律失常的拮抗作用1.1 試驗樣品樣品用生理鹽水加熱溶解至所需濃度，溶劑生理鹽水同時作為對照液，心律平為陽性對照藥。
1.2 試驗方法Wistar大鼠，雌雄兼用，隨機分組。ip烏拉坦1.2g/kg麻醉，記錄II導聯(lián)心電圖。
分別股靜脈緩慢注射化合物(5mg/kg，如有效可降至2.5mg/kg)5min后，心律平(7mg/kg)5min后，對照液(2ml/kg)5min后，以0.08ml/min的速度iv恒速注入烏頭堿溶液(5ug/ml)，記錄發(fā)生室性早博(VP)、室速(VT)、室顫(VF)時烏頭堿的用量，并記錄心電圖。根據(jù)各次實驗引起VF所耗烏頭堿量回歸計算得出ED50(VF)值，結(jié)果見表10表10脫氫卡維丁類化合物ED50(VF)值


靜脈注射受試化合物后，均可增加烏頭堿的用量，推遲VT和(或)VF的出現(xiàn)時間，結(jié)果說明脫氫卡維丁類化合物對烏頭堿誘發(fā)的心律失常有一定的預(yù)防作用。
權(quán)利要求
1.一種巖黃連分離提取的脫氫卡維丁類化合物，其特征在于，具有如下結(jié)構(gòu)通式
其中，R1、R2為氫、C1-18烷基、C1-18羥烷基、可被任意取代的芳?；?；R3、R4、R5、R6、為氫、C1-4烷基或C1-4羥烷基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氫卡維丁類化合物，其特征在于當R1為H2C，R2為氫，R3、R4為H3CO，R5、R6為氧基，則為脫氫卡維丁，其結(jié)構(gòu)式為
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氫卡維丁類化合物，其特征在于R4為H3CO，R5、R6為氧基，其結(jié)構(gòu)式為
R1、R2、R3取不同的基團，得到33種化合物如下
4.如權(quán)利要求1-3所述的脫氫卡維丁類化合物在制備治療急性和慢性病毒性肝炎、肝損傷、流感、腫瘤、AIDS、心律失常的藥物中的應(yīng)用。
5.一種藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1-3之一所述的脫氫卡維丁類化合物為活性成份以及含有一種或多種藥學可接受的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于所述藥物載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于活性成分的重量含量為0.5-95％。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于劑型包括凍干粉針劑、小針劑、注射液、膠囊劑、軟膠囊、片劑、顆粒劑、沖劑、滴丸、微丸、口服液。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體為一種從中藥巖黃連中分離提取的脫氫卡維丁類化合物及其醫(yī)藥中的新用途。該化合物的結(jié)構(gòu)式為如右式中，R
文檔編號A61K31/357GK1660836SQ20041009927
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日
發(fā)明者張衛(wèi)東, 李捍雄, 李慧梁, 張川, 柳潤輝, 蘇娟, 徐?？?申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學, 廣東一品紅藥業(yè)有限公司