專利名稱：一種治療結(jié)膜炎、角膜炎的滴眼劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種滴眼劑，特別是關(guān)于一種用生物制劑與中藥合成的滴眼劑。
背景技術(shù)：
結(jié)膜炎、角膜炎是我國(guó)常見眼病。結(jié)膜、角膜直接與外界接觸，容易受到感染和外傷，臨床以結(jié)膜充血、眼瞼腫脹、分泌物增多、角膜混濁等炎癥病變?yōu)橹?。因此，控制感染，消除炎癥是治療結(jié)膜、角膜炎的核心。結(jié)膜、角膜炎的病因比較復(fù)雜，直接原因不外乎感染(包括細(xì)菌和病毒)、過敏、外傷等三個(gè)方面。結(jié)膜、角膜炎的病理改變①充血是基本變化之一，在角膜、瞼結(jié)膜上呈現(xiàn)彌漫性充血狀態(tài)，在球結(jié)膜上，呈現(xiàn)特有的結(jié)膜性充血；②滲出是另一基本變化，分泌物的性質(zhì)因病因不同而有很大差異，有漿液性，粘液性，纖維素性和膿性之分；③在炎癥的刺激下，瞼結(jié)膜上尚可出現(xiàn)濾泡增殖和乳頭肥大的變化，濾泡為結(jié)膜上皮下淋巴細(xì)胞的聚集，在結(jié)膜表面呈現(xiàn)泡狀隆起，而乳頭肥大則為結(jié)膜上皮的增生狀態(tài)，同時(shí)伴有上皮下彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制成一種治療結(jié)膜炎、角膜炎的滴眼劑，它采用生物制劑與中藥合成滴眼劑，它療效顯著，無毒副作用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是設(shè)計(jì)一種治療結(jié)膜炎、角膜炎的滴眼劑，其特征是滴眼劑中含α-甘露聚糖肽10-50％、黃精多糖10-60％、玻璃酸鈉10-70％。
所述的一種治療結(jié)膜炎、角膜炎的滴眼劑每1000g中含α-甘露聚糖肽500g，黃精多糖300g，玻璃酸鈉200g。
本發(fā)明的特點(diǎn)是由于α-甘露聚糖肽是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，能調(diào)節(jié)眼局部的免疫功能，增強(qiáng)抗感染能力，抑制過度的免疫反應(yīng)，減少淋巴細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)；黃精多糖可以降低血管的通透性，具有抗?jié)B出和抗增生的作用，還具有抗全身遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；玻璃酸鈉具有優(yōu)良的保濕和潤(rùn)滑作用，制成滴眼劑后，用于各種原因引起的淚腺分泌不足，角膜上皮輕度損傷之不適癥狀。
具體實(shí)施例方式
由于本發(fā)明將α-溶血鏈球菌菌種搭載返回式太空飛行器(宇宙飛船或返回式衛(wèi)星)，利用太空中微(零)重力、宇宙射線、交變磁場(chǎng)、高真空、高熱深冷等因素的綜合作用，使菌株的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)斷裂，基因組發(fā)生重排，從而產(chǎn)生新的菌株。返回地面后，對(duì)經(jīng)過太空搭載的菌株進(jìn)行培養(yǎng)和篩選，通過研究其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物、遺傳性狀及蛋白表達(dá)、遺傳穩(wěn)定性、中試生產(chǎn)指標(biāo)等內(nèi)容，優(yōu)選出其中的正變異、遺傳特性穩(wěn)定的菌種，經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵后得到治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物。該菌種已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCCNo.1082。
特別是α-溶血鏈球菌D33菌株經(jīng)太空搭載誘變，地面上的篩選、分離和純化后，選育出發(fā)酵單位更高、所分泌的甘露聚糖肽含量更高的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)菌株T33株。通過中國(guó)科學(xué)院微生物研究所對(duì)T33菌株及D33菌株的全細(xì)胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分析和菌株的基因組DNA限制性酶切分析(RFLP/PFGE)比較，可以證明空間誘變及地面篩選出的T33菌株其基因有變異。該突變菌株在遺傳上穩(wěn)定，有較強(qiáng)的生產(chǎn)適應(yīng)性，由其發(fā)酵產(chǎn)生的甘露聚糖肽含量提高，多肽含量比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(80％)提高3至5倍，西安市藥品檢驗(yàn)所送樣測(cè)定達(dá)到271.6％，發(fā)酵含量比對(duì)照組產(chǎn)物含量平均高出三倍以上。該菌種經(jīng)過神舟系列飛船航天搭載太空誘變，由北京中科院微生物所和西北大學(xué)生物系對(duì)菌種進(jìn)一步篩選培養(yǎng)育種形成遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，變異特征明顯的高產(chǎn)高效菌種。該菌種每發(fā)酵單位中α-太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽含量提高了幾倍以上。(見附件材料1陜西省科學(xué)技術(shù)廳陜西省科學(xué)技術(shù)成果鑒定證書材料附件材料2太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽生產(chǎn)菌株經(jīng)“神舟三號(hào)”飛船搭載公證書。
附件材料3太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽生產(chǎn)菌株經(jīng)“神舟三號(hào)”飛船搭載返回地面篩選報(bào)告附件材料4中國(guó)科學(xué)院微生物所關(guān)于“神舟三號(hào)”飛船搭載太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽生產(chǎn)菌株與地面對(duì)照菌的形態(tài)生理生化鑒定報(bào)告書附件材料5中國(guó)科學(xué)院微生物所關(guān)于“神舟三號(hào)”飛船搭載太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽生產(chǎn)菌株與地面對(duì)照菌的SDS-PAGE及RFLP/PFGE分析鑒定報(bào)告書附件材料6陜西省藥品檢驗(yàn)所“神舟三號(hào)”太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽口服液檢測(cè)報(bào)告附件材料7科技查新報(bào)告復(fù)印件附件材料8中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏菌種保藏受理通知書)
本發(fā)明菌種選育在α-溶血鏈球菌生長(zhǎng)規(guī)律的基礎(chǔ)上，選定較合適生長(zhǎng)時(shí)期的菌種，采用平皿生長(zhǎng)的菌落、浸入其它物質(zhì)中的菌懸液、帶菌的砂土等方法，于2002年3月25日搭載“神舟三號(hào)”宇宙飛船。在太空軌道(近地點(diǎn)高度200公里、遠(yuǎn)地點(diǎn)高度350公里)進(jìn)行了6天零18小時(shí)的在軌飛行。太空的特殊條件主要體現(xiàn)為微重力、高真空、高輻射、交變磁場(chǎng)等特殊環(huán)境。在外層空間飛行的菌種被置于一個(gè)與地球上的生態(tài)環(huán)境完全不同的環(huán)境中，主要包括來自磁場(chǎng)俘獲的電子、質(zhì)子及低能重粒子；來自銀河系的宇宙射線如質(zhì)子、粒子及更重的高能重粒子；來自太陽磁暴的質(zhì)子及重粒子等。這些粒子作用于微生物細(xì)胞核中的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，可導(dǎo)致雙鏈斷裂。微重力、高真空環(huán)境可使DNA的堿基序列發(fā)生重組，即基因組的重組和變異。變異后產(chǎn)生的新菌株，其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物、遺傳性狀及蛋白表達(dá)、中試生產(chǎn)指標(biāo)等均會(huì)發(fā)生不同程度的變化。在宇宙飛船返回地面后，經(jīng)過進(jìn)一步篩選，僅優(yōu)選出其中0.2％的正變異且遺傳特性穩(wěn)定的菌株，經(jīng)培育制成生產(chǎn)菌種。這種經(jīng)航天搭載誘變后選育出的菌種已經(jīng)在在2003年12月29日由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCCNo.1082。
實(shí)驗(yàn)及中試生產(chǎn)結(jié)果表明，經(jīng)空間誘變后的新型太空菌種在遺傳特性上穩(wěn)定，有較強(qiáng)的生產(chǎn)適應(yīng)性，由其發(fā)酵產(chǎn)生的甘露聚糖肽含量提高，多肽含量比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(80％)提高3至5倍，西安市藥品檢驗(yàn)所送樣測(cè)定達(dá)到271.6％，發(fā)酵含量比對(duì)照組產(chǎn)物含量平均高出三倍以上，發(fā)酵周期大大縮短。
制備方法太空誘變菌種生產(chǎn)甘露聚糖肽的制備過程本發(fā)明所述的太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽是由以下方法制備太空菌種制備---一級(jí)發(fā)酵---二級(jí)發(fā)酵-----發(fā)酵液提純，最終生產(chǎn)出甘露聚糖肽。
①太空菌種制備以經(jīng)過空間誘變育種精心選育的α-溶血鏈球菌作為生產(chǎn)菌種。
A.斜面種子培養(yǎng)基牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化鈉0.5％，瓊脂3％，綿羊血8％；pH7.4。
斜面種子培養(yǎng)基滅菌溫度121℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.12Mpa。
啟封菌種冷凍管，用無菌肉湯培養(yǎng)基稀釋，在無菌條件下接入血斜面，接種后置38℃恒溫培養(yǎng)30小時(shí)。
B.肉湯種子培養(yǎng)基牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化鈉0.5％；pH7.4。
肉湯種子培養(yǎng)基滅菌溫度121℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.12Mpa。
將培養(yǎng)好的斜面菌種在無菌條件下按9％接種量，接入肉湯種子培養(yǎng)基內(nèi)，38℃恒溫培養(yǎng)30小時(shí)。
②發(fā)酵過程發(fā)酵培養(yǎng)基牛肉膏0.4％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化鈉0.5％。
發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌溫度121℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.12Mpa。
A.一級(jí)發(fā)酵罐將優(yōu)良的肉湯菌種在無菌條件下按10％接種量，接入一級(jí)種子罐，在29℃恒溫培養(yǎng)30小時(shí)，罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動(dòng)培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分?jǐn)嚢琛?br> B.二級(jí)發(fā)酵罐將一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液在無菌條件下按20％接種量，接入發(fā)酵罐，在29℃恒溫培養(yǎng)70小時(shí)，罐壓不0.02Mpa，滅活放罐。滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達(dá)到100℃，保溫60分鐘，冷卻靜置。
③提取過程a、發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，使?jié)饪s液體積與發(fā)酵液體積比控制在1∶15-1∶20或酌情而定。
b、發(fā)酵液的濃縮液加入80-99％乙醇，體積量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分?jǐn)嚢桁o置后，離心去除上清液，沉淀用蒸餾水溶解，調(diào)pH5.0，得到溶解液并將溶解液靜置。
c、再將溶解液離心去除雜質(zhì)得到上清液，準(zhǔn)確量取清液體積，按上清液體積計(jì)算出所需乙醇量，調(diào)pH值，將乙醇緩慢加入到上清液中，并充分?jǐn)嚢瑁o置后離心去除上清液得到沉淀物。
d、沉淀物再用蒸餾水溶解，調(diào)pH，離心，上清液再加乙醇沉淀。這樣的工藝反復(fù)操作至中間檢測(cè)合格為止，得到的沉淀物為太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽粗品。真空干燥3-8小時(shí)，即得到太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽產(chǎn)品。
上述方法得到的產(chǎn)品的檢驗(yàn)[性狀]本品為白色或微黃色無定形粉末；無臭、無味。
本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。
比旋度取本品，精密稱定，加水溶解并稀釋成每1ml中約含10mg的溶液，依法測(cè)定(中國(guó)藥典2000年版二部附錄vIE)，比旋度為+70℃至+80℃。
1、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液(5-100)1ml，搖勻，沿管壁緩緩加硫酸0.5ml，數(shù)分鐘后，界面呈紫紅色。
2、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取約10ul點(diǎn)于濾紙上，晾干，用無水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后.加0.2mol/L醋酸鈉溶液1.5ml與乙醇100ml，混勻即得。置暗處保存，可使用數(shù)月)中浸泡5分鐘，取出，用70％乙醇溶液沖洗，置還原液(取碘化鉀5g，硫代硫酸鈉5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L鹽酸液2.5ml，隨加隨攪拌，臨用時(shí)配)中浸泡5分鐘，取出，用70％乙醇溶液沖洗，置品紅業(yè)硫酸試液中浸泡約30分鐘，取出，用焦亞硫酸鈉溶液(取焦亞硫酸鈉0.4g，加鹽酸1ml，加水溶解使成100ml，即得)，沖洗，晾干，在濾紙片點(diǎn)樣處應(yīng)呈紫紅色。
3、取供試品和對(duì)照品適量，分別加氯化鈉注射液制成每1ml中含1mg的溶液作為供試品溶液和對(duì)照品溶液，按甘露聚糖肽免疫原性測(cè)定法試驗(yàn)，供試品和對(duì)照品管應(yīng)均無溶血發(fā)生。
1、酸度取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，依法測(cè)定(中國(guó)藥典2000年版二部附錄VIH)，pH值應(yīng)為3.0-5.0。
2、吸收度取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄VIA)，在260nm的波長(zhǎng)處，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波長(zhǎng)處，其吸收度不得大于0.20。
3、總氮量取本品，照氮測(cè)定法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄VIID第二法)測(cè)定.按干燥品計(jì)算，含總氮量應(yīng)為0.8-2.0％。
4、免疫原性取供試品和對(duì)照品適量，分別加氯化鈉注射液制成每1ml中含10mg的溶液，再分別用磷酸鹽緩沖液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀釋液作為供試品溶液和對(duì)照品溶液，依法檢查(附甘露聚糖肽免疫原性測(cè)定法)，供試品不溶血管的最低濃度應(yīng)不得高于對(duì)照品相應(yīng)濃度的一倍以上。
5、干燥失重 取本品，在105℃干燥至恒重，減失重量不得過5.0％(中國(guó)藥典2000年版二部附錄VIIIL)。
6、重金屬 取本品，在1.0g，依法檢查(中國(guó)藥典2000年版VIIIH)含重金屬不得過百萬分之二十。
7、異常毒性取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液，依法檢查(中國(guó)藥典2000年版附錄XIC).按靜脈注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定(供注射用)。
1.對(duì)照品溶液的制備精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的D-甘露糖對(duì)照品0.1g置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度.搖勻；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，搖勻.每1ml中含甘露糖50ug。
2.供試品溶液備取本品適量，精密稱定，加水溶解制成每1ml中含40ug的溶液。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液1.0ml，搖勻，沖入硫酸4.5ml，搖勻，放置于室溫，以0管為空白.照分光光度法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄IVA)在490nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以甘露糖ug數(shù)對(duì)相應(yīng)的吸收度，計(jì)算回歸方程。
4.測(cè)定法精密量取供試品溶液1.0ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下自“再加3％苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，測(cè)定吸收度，由回歸方程計(jì)算甘露糖的含量。
甘露聚糖肽免疫原性測(cè)定法(補(bǔ)體結(jié)合法)；1、試液A.酸鹽緩沖液(pH7.2)取氯化鈉8.5g、磷酸氫二鈉0.565g及磷酸二氫鉀0.135g，加水至1000ml使其溶解，加10％硫酸鎂溶液1ml，搖勻。
B.1％羊紅細(xì)胞懸液羊血紅細(xì)胞的制備 由綿羊頸靜脈無菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸鈉8.0g、氯化鈉4.2g，枸椽酸5.5g，加水至1000ml使溶解，100℃滅菌30分鐘)的無菌容器中，4℃保存。
1％羊血紅細(xì)胞懸液的制備 取上述羊血紅細(xì)胞適量，用氯化鈉注射液洗滌三次，每次離心5分鐘(2000轉(zhuǎn)/分)，取壓積羊血紅細(xì)胞，用氯化鈉注射液制成1％羊血紅細(xì)胞懸液。取懸液，用氯化鈉注射液稀釋20倍制成供試品溶液，另取等量懸液加水稀釋20倍作為空白溶液，照分光光度法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄IVA)，在541nm的波長(zhǎng)處測(cè)定，其吸收度應(yīng)為0.65-0.70，如超出限度應(yīng)調(diào)節(jié)1％羊紅細(xì)胞懸液的濃度。
C.溶血素及致敏羊血紅細(xì)胞溶血素的制備 取上述壓積羊血紅細(xì)胞，用氯化鈉注射液制成25％羊血紅細(xì)胞懸液.取家兔1只，靜脈注射上述羊血紅細(xì)胞懸液，每日一次，共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分離血清，56℃.30分鐘滅活，分裝，0℃以下保存。
溶血素單位的測(cè)定 取溶血素適量，加磷酸鹽緩沖液分別制成1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、1∶9000、1∶10000的稀釋液，各取0.1ml置試管中，加1％羊血細(xì)胞懸液0.1ml，搖勻，加稀釋度為1∶30的豚鼠血清(補(bǔ)體)0.2ml及磷酸鹽緩沖液0.2ml，搖勻，37℃保溫30分鐘，完全溶血管的最高稀釋度為1單位溶血素。
致敏羊血紅細(xì)胞的制備臨用前，將2％的羊血紅細(xì)胞懸液與2單位溶血索等體積混合，37℃保溫15分鐘即得。
補(bǔ)體取三只以上的豚鼠，心臟采血，離心分離血清，0℃以下保存。
補(bǔ)體單位的測(cè)定取補(bǔ)體適量，加磷酸鹽緩沖液，分別制成1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180的稀釋液，各取0.2ml置試管中，加0.2ml磷酸鹽緩沖液，搖勻，37℃保溫30分鐘后，分別加致敏羊血紅細(xì)胞0.2ml，搖勻，37℃再保溫30分鐘.完全溶血管的最高稀釋度為1單位的補(bǔ)體。
抗體取甘露聚糖肽對(duì)照品適量，加氯化鈉注射液制成每1ml中含10mg的對(duì)照品溶液免疫家兔，隔日采用耳靜脈注射對(duì)照品溶液一次。第一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射1.0ml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，離心分離血清，56℃下30分鐘滅活，分裝，0℃以下保存(臨用前，需56℃30分鐘再次滅活)。
抗體單位的測(cè)定取抗體適量，加磷酸鹽緩沖液分別制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32.1∶64、1∶128的稀釋液，各取0.1ml置試管中，加甘露聚糖肽對(duì)照品溶液0.1ml及2單位補(bǔ)體0.2m]，搖勻，于4-8℃放置4小時(shí)以上，置37℃保溫30分鐘，不溶血管的最高稀釋度為1單位抗體。同時(shí)設(shè)抗原(不加抗體，以0.1ml磷酸鹽緩沖液代替)、抗體(不加抗原，以0.1ml磷酸鹽緩沖液代替)、補(bǔ)體(不加抗原，抗體，以0.2ml磷酸鹽緩沖液代替)對(duì)照管，以上三種對(duì)照管應(yīng)全溶血；另設(shè)的致敏羊血紅細(xì)胞(不加抗原、抗體和補(bǔ)體，以0.4ml磷酸鹽緩沖液代替)對(duì)照管應(yīng)不溶血。
2、免疫原性測(cè)定法取甘露驟糖肽對(duì)照品與供試品適量，照藥品項(xiàng)下的規(guī)定制成不同濃度的對(duì)照品溶液和供試品溶液，各取0.1ml置試管中，加入2單位抗體0.1ml及2單位補(bǔ)體0.2ml.搖勻，于4-8℃放置4小時(shí)以上，置37℃保溫30分鐘，加入致敏羊血紅細(xì)胞0.2ml，搖勻，37℃再保溫30分鐘。觀察各管的溶血情況，不溶血管的最低濃度代表甘露聚糖肽的免疫原性。同時(shí)設(shè)抗原(不加抗體，以0.1ml磷酸鹽緩沖液代替)、抗體(不加抗原，以0.1ml磷酸鹽緩沖液代替)、補(bǔ)體(不加抗原、抗體、以0.2ml磷酸鹽緩沖液代替)對(duì)照管，以上三種對(duì)照管應(yīng)全溶血另設(shè)的致敏羊血紅細(xì)胞(不加抗原、抗體和補(bǔ)體，以0.4ml磷酸鹽緩沖液代替)對(duì)照管應(yīng)不溶血。
實(shí)施例1滴眼劑藥物每1000克取上述α-甘露聚糖肽500g，黃精多糖300g，玻璃酸鈉200g。
制備時(shí)將上述三種藥物與適量滅菌注射用水稀釋混勻→過濾→滅菌→分裝→成品質(zhì)檢合格→入庫(kù)。
具體生產(chǎn)過程及設(shè)備按中華人民共和國(guó)藥典2000版二部滴眼劑的制備工藝，(國(guó)家藥典委員會(huì)編，化學(xué)工業(yè)出版社出版)。
本發(fā)明所述滴眼劑的毒理研究①急性毒性試驗(yàn)家兔眼局部注射2.5ml/kg，未見有死亡及任何不良反應(yīng)發(fā)生。②亞急性毒性試驗(yàn)大鼠眼局部用藥，每隔2小時(shí)一次，每次3滴，連續(xù)1個(gè)月；家兔眼局部用藥，每隔2小時(shí)一次，每次5滴，連續(xù)1個(gè)月；檢查大鼠和家兔的肝、腎功能、血象及各臟器組織均無異常變化，眼局部未見異常。③眼局部過敏試驗(yàn)陰性。④致畸致死試驗(yàn)均為陰性。
動(dòng)物藥效學(xué)試驗(yàn)摘要目的研究本發(fā)明所述滴眼液的抗菌作用及其對(duì)感染性角結(jié)膜炎癥狀的消除作用。方法對(duì)兔眼損傷金黃色葡萄球菌性結(jié)膜炎，兔眼損傷化膿性鏈球菌性結(jié)膜炎及兔眼損傷金黃色葡萄球菌性角膜炎，兔眼損傷綠膿桿菌性角膜炎進(jìn)行了研究。結(jié)果本發(fā)明所述滴眼液對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌所致的動(dòng)物感染模型，感染性結(jié)膜炎和感染性角膜炎有明顯的治療作用，給藥5d后細(xì)菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰率100％。結(jié)論本發(fā)明所述滴眼液對(duì)結(jié)、角膜炎的治療效果確切，比單用α-甘露聚糖肽和妥布霉素滴眼液效果好。
1.實(shí)驗(yàn)材料1.1藥物本發(fā)明所述滴眼液(西安亨通光華制藥有限公司提供)。
陽性對(duì)照藥物α-甘露聚糖肽滴眼液(生產(chǎn)廠商為西安亨通光華制藥有限公司)，含量1mg/ml；妥布霉素滴眼液(遼寧省醫(yī)藥工業(yè)研究院)，含量1.5mg/ml。
1.2動(dòng)物大耳白兔(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)，陜實(shí)動(dòng)字384)。
1.3試驗(yàn)菌株大腸桿菌ATCC 25922，綠膿桿菌ATCC 27853，金黃色葡萄球菌ATCC 25927，化膿性鏈球菌ATCC 19615(均由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)菌室提供)。
1.4感染模型1.4.1兔眼損傷金黃色葡萄球菌性結(jié)膜炎及兔眼損傷化膿性鏈球菌性結(jié)膜炎。
1.4.2兔眼損傷金黃色葡萄球菌性角膜炎及兔眼損傷綠膿桿菌性角膜炎。
2.方法與結(jié)果2.1兔眼損傷型結(jié)膜炎將冰箱冷藏保存的黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌，于實(shí)驗(yàn)前1天接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18小時(shí)后，用生理鹽水沖下，并用標(biāo)準(zhǔn)管比濁測(cè)定其濃度后，將其用生理鹽水稀釋成黃色葡萄球菌3×109個(gè)/ml，化膿性鏈球菌1×109個(gè)/ml，備用。
健康大耳白兔40只，體重2.0-3.0kg，雌雄均有。用無菌8號(hào)針頭于兔下瞼結(jié)膜劃4×4mm十字痕，以劃破為宜，輕拉眼瞼成小杯形，用0.25ml注射器向結(jié)膜傷痕滴0.1ml菌液，輕輕復(fù)原眼瞼。感染24小時(shí)后，給每只兔眼分級(jí)，并進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，使每組動(dòng)物模型的程度無明顯差異。分組后即刻給藥，每天滴藥3次，每眼每次0.1ml，連續(xù)給藥5天，每隔24小時(shí)給兔眼打分，分級(jí)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
兔眼損傷結(jié)膜炎分級(jí)0級(jí)血管正常；1級(jí)血管充血呈鮮紅色，輕微水腫，少量分泌物；2級(jí)血管充血，呈紫紅色，血管不易辨析，明顯水腫，部分眼瞼外翻，分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著；3級(jí)彌漫性充血，呈紫色，水腫至眼瞼近閉合，分泌物使整個(gè)眼瞼潮濕或粘著。
在給藥第1，3，5天進(jìn)行細(xì)菌檢定。方法是用無菌鹽水濕棉球輕輕涂擦上下眼瞼后投入內(nèi)裝5ml生理鹽水的無菌試管中，混搖均勻，在無菌室內(nèi)取0.5ml傾入已備普通瓊脂培養(yǎng)基平皿上，鋪勻后放入37℃溫箱培養(yǎng)18小時(shí)，判斷細(xì)菌培養(yǎng)陰、陽性。結(jié)果見表1、表2、表3、表4。
表1金黃色葡萄球菌所致兔眼結(jié)膜炎治療實(shí)驗(yàn)(n＝40)

注*P＜0.05，**P＜0.01表2化膿性鏈球菌所致兔眼結(jié)膜炎治療實(shí)驗(yàn)(n＝32)

注*P＜0.05，**P＜0.01表3金黃色葡萄球菌所致兔眼結(jié)膜炎細(xì)菌檢定(n＝40)

表4化膿性鏈球菌所致兔眼結(jié)膜炎細(xì)菌檢定(n＝32)

2.1兔眼損傷型角膜炎將冰箱冷藏保存的黃色葡萄球菌和綠膿桿菌菌種，于實(shí)驗(yàn)前1天接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18小時(shí)后，用生理鹽水沖下，并用標(biāo)準(zhǔn)管比濁測(cè)定其濃度后，將其用生理鹽水稀釋成黃色葡萄球菌3×109個(gè)/ml，綠膿桿菌1×109個(gè)/ml，備用。
大耳白兔40只，體重2.5-3.5kg，雌雄均有。將烏拉坦按家兔750mg/kg耳靜脈麻醉，動(dòng)物呼吸平穩(wěn)、心率正常后，每眼角膜滴1滴0.5％利多卡因表面麻醉，然后用直徑6mm打孔器壓迫于角膜表層中心，勻力旋轉(zhuǎn)，形成6mm的環(huán)形傷痕。拉開眼瞼成杯形，向角膜傷痕處滴入金黃色葡萄球菌或綠膿桿菌菌懸液0.1ml，并復(fù)原眼瞼。
兔眼損傷型角膜炎癥評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)0級(jí)眼睛明亮，無紅腫和分泌物；0.5級(jí)角膜無覆蓋物，眼睛稍有紅腫；1級(jí)角膜白色覆蓋物＜6mm；2級(jí)角膜白色覆蓋物充滿6mm；3級(jí)角膜白色覆蓋物＞6mm。
家兔眼角膜損傷感染24小時(shí)后，根據(jù)每只兔眼感染模型炎癥評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)后均勻分組，并進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，使每組動(dòng)物模型炎癥程度無明顯差異。分組后即刻給藥，每天滴藥3次，每眼每次0.1ml，連續(xù)給藥5天，每隔24小時(shí)進(jìn)行一次評(píng)分，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。于給藥第1，3，5天后分別進(jìn)行細(xì)菌檢定。將家兔固定后用0.5％利多卡因1滴行角膜麻醉，然后用滅菌的生理鹽水濕棉球輕輕涂擦角膜后，將棉球投入5ml無菌生理鹽水中(操作過程系無菌操作)混懸均勻，于超凈工作臺(tái)上取出0.5ml傾入已備普通瓊脂培養(yǎng)基平皿上。鋪勻后放入37℃溫箱培養(yǎng)18小時(shí)，判斷細(xì)菌培養(yǎng)陰、陽性。結(jié)果見表5、表6、表7、表8。
表5金黃色葡萄球菌所致兔眼角膜炎治療實(shí)驗(yàn)(n＝32)

注*P＜0.05，**P＜0.01表6綠膿桿菌所致兔眼角膜炎治療實(shí)驗(yàn)(n＝32)

注*P＜0.05，**P＜0.01表7金黃色葡萄球菌所致兔眼角膜炎細(xì)菌檢定(n＝32)

表8綠膿桿菌所致兔眼角膜炎細(xì)菌檢定(n＝32)

3.討論本發(fā)明所述滴眼液對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌所致的動(dòng)物感染模型，感染性結(jié)膜炎和感染性角膜炎的治療效果確切，療效明顯優(yōu)于α-甘露聚糖肽滴眼液和妥布霉素滴眼液。
本發(fā)明所述滴眼液給藥1天就對(duì)金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌所致的家兔眼結(jié)膜炎有明顯的治療作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯著。連續(xù)給藥2天就有非常顯著的治療作用。連續(xù)給藥5天細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率達(dá)100％。α-甘露聚糖肽滴眼液和妥布霉素滴眼液給藥1天，對(duì)金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌所致的家兔眼結(jié)膜炎的治療作用不明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無意義。連續(xù)給藥2天才有治療效果，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯著。連續(xù)給藥5天細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率達(dá)75-87.5％，未完全轉(zhuǎn)陰。
本發(fā)明所述滴眼液給藥1天對(duì)金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌所致家兔眼角膜炎有明顯的治療作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯著。連續(xù)給藥2天對(duì)金黃色葡萄球菌所致家兔眼角膜炎有明顯的治療作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理非常顯著。連續(xù)給藥3天對(duì)綠膿桿菌所致家兔眼角膜炎有明顯的治療作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理非常顯著。連續(xù)給藥5天細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率達(dá)100％。α-甘露聚糖肽滴眼液和妥布霉素滴眼液給藥1天，對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌所致的家兔眼結(jié)膜炎的治療作用不明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無意義。連續(xù)給藥3天才有治療效果，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯著。連續(xù)給藥5天細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率達(dá)75-87.5％，未完全轉(zhuǎn)陰。
本發(fā)明所述滴眼劑的臨床療效的驗(yàn)證王某，男，6歲，外出游玩一天后，晚間出現(xiàn)右眼結(jié)膜充血，紅腫，畏光，眼部分泌物增多，黃色粘稠狀，右眼視力下降至0.8，左眼視力為1.5，經(jīng)診斷為急性結(jié)膜炎。立即給予本發(fā)明所述滴眼劑局部滴眼，每天三次，每次2滴。用藥2天后，局部充血、紅腫減輕，畏光消失，分泌物減少，顏色變白。繼續(xù)用藥，7天后眼部紅腫、充血消失，分泌物恢復(fù)正常，檢查兩眼視力，右眼視力為1.5，已恢復(fù)正常，左眼視力為1.5。表明本發(fā)明所述滴眼劑對(duì)角結(jié)膜炎有獨(dú)特的療效，起效快，療效好，無任何不良反應(yīng)。
本發(fā)明所述滴眼劑大規(guī)模臨床療效統(tǒng)計(jì)收集100例臨床角結(jié)膜炎患者資料，進(jìn)行深入分析，統(tǒng)計(jì)臨床療效。結(jié)果表明治療7天后，90例患者眼局部癥狀如紅腫、充血，分泌物增多等均消失，視力檢查恢復(fù)病前水平，這部分患者已臨床痊愈；另有8例患者未徹底痊愈，其中3例結(jié)膜稍有充血，無其它癥狀，視力恢復(fù)，另有5例局部癥狀消失，但視力尚未完全恢復(fù)正常；剩余2例癥狀改善不明顯。統(tǒng)計(jì)總有效率為98％。
權(quán)利要求
1.一種治療結(jié)膜炎、角膜炎的滴眼劑，其特征是滴眼劑中含α-甘露聚糖肽10-50％、黃精多糖10-60％、玻璃酸鈉10-70％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療結(jié)膜炎、角膜炎的滴眼劑，其特征是所述滴眼劑1000g中含α-甘露聚糖肽500g，黃精多糖300g，玻璃酸鈉200g。
全文摘要
本發(fā)明是一種滴眼劑，特別是關(guān)于一種用生物制劑與中藥合成的滴眼劑，其特征是滴眼劑中含α－甘露聚糖肽10－50％、黃精多糖10－60％、玻璃酸鈉10－70％。所述的滴眼劑1000g中含α－甘露聚糖肽500g，黃精多糖300g，玻璃酸鈉200g。這種治療結(jié)膜炎、角膜炎的滴眼劑，采用生物制劑與中藥合成滴眼劑，它療效顯著，無毒副作用。
文檔編號(hào)A61P27/00GK1663609SQ20041010443
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2004年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者趙恒 申請(qǐng)人:趙恒