專利名稱：脂質(zhì)體制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備脂質(zhì)體制劑的方法和通過這些方法生產(chǎn)的脂質(zhì)體制劑。
背景技術(shù)：
存在許多制備各種有效成分(通常為抗腫瘤劑、抗真菌劑等)的脂質(zhì)體制劑的公知方法。這些方法包括，例如，乙醇稀釋、薄膜水合、二氯甲烷方法等。
已經(jīng)提出了其他方法，包括用叔丁醇溶解形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)以通過凍干制備干燥脂質(zhì)粉(見例如，美國(guó)專利6,146,659和6,090,407)。用適當(dāng)?shù)乃越橘|(zhì)水合干燥液體粉劑導(dǎo)致形成多層脂質(zhì)體，將其通過超聲處理將尺寸減小并霧化后施用。然而，叔丁醇沒有被用作制備脂質(zhì)體的首選溶劑，主要是由于i)其在叔丁醇中的有限脂質(zhì)溶解度(尤其膽固醇)。ii)其作為腸胃外劑型中藥物賦形劑的可接受性。iii)脂質(zhì)體形成后需要除去叔丁醇。
盡管在小規(guī)?；A(chǔ)上有效，當(dāng)前方法通常不適于大量生產(chǎn)許多有效成分、尤其是紫杉醇和其他抗癌劑的脂質(zhì)體制劑。結(jié)果，當(dāng)前制備脂質(zhì)體制劑的方法不足以提供商業(yè)量的許多藥劑的脂質(zhì)體制劑。從而，需要可以大規(guī)模或商業(yè)規(guī)模使用的制備有效成分的脂質(zhì)體的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了脂質(zhì)體制劑的制備方法。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)方面，將脂質(zhì)體制劑溶于水混溶性有機(jī)溶劑中。含有脂質(zhì)部分的該溶液可在適于形成本體脂質(zhì)體制劑的控制條件下加入水溶液并與之混合，形成本體(bulk)脂質(zhì)體制劑。
理想地，制劑可以包括一種或多種有效成分。根據(jù)本發(fā)明方法的另一方面，至少一種有效成分和脂質(zhì)部分溶于水混溶性有機(jī)溶劑中。含有有效成分和脂質(zhì)部分的該溶液可在適于形成本體脂質(zhì)體制劑的控制條件下加入水溶液并與之混合，形成本體脂質(zhì)體制劑。
根據(jù)需要，可以例如通過尺寸分級(jí)或減小、除去水混溶性有機(jī)溶劑，通過膜過濾除菌、凍干或其他處理進(jìn)一步加工本體脂質(zhì)體制劑。
本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的制備方法生產(chǎn)脂質(zhì)體制劑和使用這些制劑的方法。
本發(fā)明允許商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)脂質(zhì)體制劑。根據(jù)下面的詳述和附圖，本發(fā)明的這些優(yōu)點(diǎn)和其他創(chuàng)造性特征將是明顯的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是表示通過叔丁醇方法制備的含有紫杉醇的脂質(zhì)體尺寸減小后的粒度分布的直方圖。
圖2是通過切向流過濾除去溶劑的流程圖。
圖3是表示通過叔丁醇方法制備的含有紫杉醇的脂質(zhì)體尺寸減小并通過切向流過濾除去溶劑后粒度分布的直方圖。
圖4是通過叔丁醇方法制備的含有紫杉醇的脂質(zhì)體(凍干后重構(gòu))的粒度分布的直方圖。
圖5是通過叔丁醇方法制備的含有紫杉醇的脂質(zhì)體(凍干后重構(gòu))的冷凍斷裂電子顯微照片。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明方法，水混溶性有機(jī)溶劑被用于溶解脂質(zhì)部分和/或一種或多種有效成分。許多這些水混溶性有機(jī)溶劑(例如，二甲亞砜、乙醇和甲醇)可用于本發(fā)明上下文中。然而，最優(yōu)選的水混溶性有機(jī)溶劑是叔丁醇。
脂質(zhì)部分可以含有任何適當(dāng)?shù)囊环N或幾種脂質(zhì)，希望其形成脂質(zhì)體。脂質(zhì)部分中優(yōu)選的脂質(zhì)包括，例如，一種或多種膽固醇、二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、四肉豆蔻酰心磷脂、和生育酸琥珀酸酯。在一些實(shí)施方案中，四肉豆蔻酰心磷脂可被帶正電的陽(yáng)離子心磷脂，如1，3-二-(1，2-二-四癸氧基-丙基-3-二甲基乙氧基溴化銨)-丙-2-醇[(R)-PCL-2]等代替。優(yōu)選地，脂質(zhì)部分包括抗氧化劑，如生育酸琥珀酸酯。更優(yōu)選地，脂質(zhì)部分包括至少兩種(如三種或以上)這些化合物，最優(yōu)選地，脂質(zhì)部分包括該組的全部化合物。根據(jù)所希望的脂質(zhì)部分組成，可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)各種脂質(zhì)的量。然而，脂質(zhì)部分的優(yōu)選的組成包括DOPC作為主要脂質(zhì)，例如，DOPC∶膽固醇∶心磷脂摩爾比為90∶5∶5。當(dāng)包括抗氧化劑時(shí)，適當(dāng)?shù)哪柋仁?9∶5∶5∶1DOPC∶膽固醇∶心磷脂∶生育酸琥珀酸酯。
在一些實(shí)施方案中，可以順序加入或溶解形成脂質(zhì)部分的脂質(zhì)于水混溶性有機(jī)溶劑中來生產(chǎn)有效制劑。最優(yōu)選地，該方法包括順序加入膽固醇、DOPC、四肉豆蔻酰心磷脂、和生育酸琥珀酸酯從而將各自溶于水混溶性有機(jī)溶劑中。在許多實(shí)施方案中，希望脂質(zhì)部分在高于室溫(即，約25℃)的溫度下溶于水混溶性有機(jī)溶劑。這樣，當(dāng)叔丁醇是所希望的溶劑時(shí)，可以在約35℃到約65℃，如約45℃到約55℃的溫度下加入脂質(zhì)。
脂質(zhì)部分加入到水混溶性有機(jī)溶劑后，可以將所得溶液加入水溶液中形成本體脂質(zhì)體制劑。在該階段，該本體脂質(zhì)體制劑通常含有多層脂質(zhì)體，這通過例如，動(dòng)態(tài)光散射來評(píng)估。
為了形成本體脂質(zhì)體制劑，水溶液的量可以改變，但是通常其是主要的批量大小，即總脂質(zhì)體制劑的體積。優(yōu)選地，水溶液的量為批量大小的至少約80％，水溶液的量更優(yōu)選為批量大小的至少約90％。在一些實(shí)施方案中，水溶液的量可以大于批量大小。
水溶液可以是水，但是更通常地含有一種或多種額外的成分，如糖、張力調(diào)節(jié)劑等。適當(dāng)?shù)膹埩φ{(diào)節(jié)劑包括鹽(優(yōu)選氯化鈉)和本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員公知的其他試劑。張力調(diào)節(jié)劑可以以任何適當(dāng)?shù)牧看嬖?；然而，?dāng)存在時(shí)，張力調(diào)節(jié)劑通常表示水溶液的約2％以下，更典型地，水溶液的約1％以下。優(yōu)選地，水溶液含有保護(hù)性糖(如，例如，海藻糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、葡聚糖等，以及它們的組合)。一種或多種這些保護(hù)性糖可以以任一適當(dāng)?shù)牧看嬖?。然而，?dāng)存在時(shí)，保護(hù)性糖調(diào)節(jié)劑通常表示溶液的至少約5％，更一般地，水溶液的約20％以下(更典型地，水溶液的約15％以下)。用于該目的最優(yōu)選的水溶液是10-12％蔗糖和0.4-0.9％氯化鈉。
可以通過能夠?qū)崿F(xiàn)本體脂質(zhì)體制劑形成的任一方法將含有脂質(zhì)部分的水混溶性有機(jī)溶劑溶液加入水溶液中。然而，允許叔丁醇中的脂質(zhì)溶液冷卻到40℃以下，導(dǎo)致脂質(zhì)沉淀。同樣地，將脂質(zhì)溶液加入保持在室溫的水相溶液也可以導(dǎo)致脂質(zhì)和(當(dāng)存在時(shí))有效成分沉淀。因此，優(yōu)選在例如約300rpm到約400rpm混合下(例如，使用常規(guī)混合器，如Labmaster所生產(chǎn)的)將水混溶性有機(jī)溶劑溶液加到水溶液中，而保持溫度高于30℃，如保持水溶液在約30℃到約40℃之間。而且，在含有脂質(zhì)體部分的水混溶性有機(jī)溶劑溶液加入水溶液時(shí)保持溫度約35℃將通常有助于脂質(zhì)體形成。例如，當(dāng)水混溶性有機(jī)溶劑加入水溶液時(shí)可以保持在約25℃到約40℃，更優(yōu)選約30℃到約40℃，最優(yōu)選約30℃到約35℃，特別當(dāng)水混溶性有機(jī)溶劑是叔丁醇時(shí)。
含有脂質(zhì)部分的水混溶性有機(jī)溶劑加入水溶液的速度和該加入期間水溶液混合的速度表明了含有脂質(zhì)可溶的有效成分(紫杉醇、多西他賽)的脂質(zhì)體形成而無沉淀。例如，當(dāng)叔丁醇被用作水混溶性有機(jī)溶劑時(shí)，叔丁醇和水溶液被混合約5分鐘到約1小時(shí)，更典型地約10分鐘到約45分鐘，典型地約15分鐘到約30分鐘后可以組合。對(duì)于大規(guī)模制備，加入的時(shí)間(即混合的時(shí)間)可以大大延長(zhǎng)，如幾小時(shí)或更長(zhǎng)。而且，如果需要，混合速度可以稍小于300rpm或者稍大于400rpm，如上面指出的，如，例如，至少約200rpm或至少約500rpm和可達(dá)約800rpm或者甚至可達(dá)約1000rpm。從而，混合速度可以為約200rpm到約800rpm，如約500rpm到約1000rpm。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)，優(yōu)選的范圍是約600rpm到約800rpm。
備選地，可以在溶液冷卻時(shí)將含有脂質(zhì)部分的水混溶性有機(jī)溶劑溶液加入水溶液。典型地，這包括將含有脂質(zhì)部分的水混溶性溶劑加入水溶液后冷卻時(shí)混合溶液。例如，將水混溶性有機(jī)溶劑溶液與脂質(zhì)部分加到水溶液后冷卻到約25℃到約30℃的溫度。
在許多應(yīng)用中，希望脂質(zhì)體制劑用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用。對(duì)于這些應(yīng)用，該制劑可含有一種或多種有效成分。有效成分可以是希望配制到脂質(zhì)體制劑中的任一試劑(或試劑的組合)，如小分子、寡核苷酸，或者其他試劑。通常，有效成分包括至少一種抗腫瘤或抗真菌劑。優(yōu)選的有效成分是如紫杉烷類或衍生物，如紫杉醇、多西他賽，和相關(guān)化合物(例如，埃坡霉素(epothilone)A和B、埃坡霉素衍生物等)的試劑和其他抗癌劑如米托蒽醌、喜樹堿，和相關(guān)分子(如，例如，7-乙基-10-羥基喜樹堿(即SN-38)、伊立替康等)和衍生物、多柔比星、柔紅霉素、甲氨蝶呤、阿霉素(adriamycin)、他莫昔芬、托瑞米芬、順鉑、表柔比星、鹽酸吉西他濱(gemcitabicine)、mixotantrone和其他公知的用于癌癥治療的化療劑和反義寡核苷酸(如抑制癌基因表達(dá)的反義寡核苷酸，見例如，美國(guó)專利6,559,129、6,333,314和6,126,965，公開了15-聚體(mer)的抗c-raf-1寡核苷酸，其具有序列5′-GTGCTCCATTGATGC-3′)。
優(yōu)選的有效成分包括選自紫杉烷類或衍生物和喜樹堿或衍生物中的至少一種試劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到衍生物或類似物將具有與未改變的試劑相同的活性，任選較大程度或較小程度，但是不能否定。這些化學(xué)修飾將基于結(jié)構(gòu)活性關(guān)系(SAR)或分子建模。例如，功能基團(tuán)可被取代或除去。最優(yōu)選的有效成分是紫杉醇。
盡管如希望可以使用任何量的有效成分，但是使用紫杉醇時(shí)，通常將相對(duì)于批量大小至少1％重量的有效成分的溶于水混溶性有機(jī)溶劑中。更典型地，至少使用1mg/ml紫杉醇(相對(duì)于批量大小)，紫杉醇溶于按體積計(jì)至少約5％的叔丁醇(相對(duì)于批量大小)中。在一些實(shí)施方案中，有效成分的量可能超過相對(duì)于批量大小按體積計(jì)約5％。以相同的方式，可以使用按體積計(jì)可達(dá)10％叔丁醇或者叔丁醇和乙醇不超過1∶1(體積比)的混合物并且按體積計(jì)可以使用總共10％。
在配制過程期間將一種或多種有效成分以適于該化合物的化學(xué)的方式加入。例如，可以在本體脂質(zhì)體形成前將水溶性成分(例如反義寡核苷酸)加入水溶液。水溶性成分向水溶液的加入可以在加入水混溶性有機(jī)溶劑之前，從而被包埋在脂質(zhì)體中或結(jié)合脂質(zhì)體。備選地，一些水溶性有效成分(例如，SN38)可以在溶劑除去之后但是在無菌過濾和凍干之前(在下面描述的步驟)加入尺寸減小的脂質(zhì)體。此外，可以將有效成分，如在有機(jī)溶劑中可溶的有效成分在水混溶性有機(jī)溶劑中溶解加入這些有效成分。優(yōu)選地，可以在加入脂質(zhì)部分之前將可溶于有機(jī)溶劑的有效成分加入水混溶性有機(jī)溶劑中?？梢栽趯⒑兄|(zhì)部分的水混溶性有機(jī)溶劑溶液與水溶液混合期間或之后加入一種或多種活性組分。
在許多實(shí)施方案中，希望在高于室溫的溫度下(例如，約35℃)將一種或多種有效成分(包括水溶性試劑)溶于水混溶性有機(jī)溶劑，特別是叔丁醇中。從而，例如，當(dāng)紫杉醇是所希望的有效成分時(shí)，可以在約35℃到約65℃，如約40℃到約55℃的溫度下將紫杉醇溶于水混溶性有機(jī)溶劑，如叔丁醇中。其他有效成分可以溶于叔丁醇或其他水混溶性有機(jī)溶劑的溫度可以根據(jù)有效成分的性質(zhì)而變，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇一種適當(dāng)?shù)娜芙鉁囟取Ｈ缟厦嫣岬降?，通常希望將含有脂質(zhì)部分和有效成分的水混溶性有機(jī)溶劑溶液加入水溶液中，同時(shí)保持溫度。
通常優(yōu)選通過這些方法形成的本體脂質(zhì)體制劑的尺寸被減小或者被分級(jí)或者被另外控制。優(yōu)選應(yīng)用這種篩分處理以使得脂質(zhì)體的粒徑更均一。脂質(zhì)體制劑的平均尺寸可以為，例如，約50nm到約200nm，優(yōu)選100-180nm，更優(yōu)選100-160nm，該平均尺寸可通過動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)量。此外，尺寸減小的脂質(zhì)體的99％分布(D99)可以為，例如，約100nm到約400nm，優(yōu)選150-300nm，更優(yōu)選180到250nm(通過動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)量)。實(shí)現(xiàn)該目的一個(gè)示例性方法是通過具有預(yù)先選擇的尺寸(如0.2μm、0.1μm等)的篩子(如聚碳酸酯濾器)擠出。優(yōu)選地，通過經(jīng)0.2μm到0.1μm聚碳酸酯濾器以通常可達(dá)約200psi的壓力擠出以減小脂質(zhì)體尺寸而制劑不形成任一種有效成分沉淀。對(duì)于更大規(guī)模生產(chǎn)，壓力可以超過約200psi，如約200psi到約800psi。
本體脂質(zhì)體制劑(或者尺寸減小的制劑)將含有多數(shù)水混溶性有機(jī)溶劑，其最初用于溶解脂質(zhì)部分。對(duì)于許多應(yīng)用，主要是醫(yī)學(xué)應(yīng)用，希望從本體或尺寸-減小的脂質(zhì)體制劑基本除去溶劑(更希望完全除去溶劑)。此外，如果要凍干制劑，必須基本除去(優(yōu)選完全除去)水混溶性有機(jī)溶劑叔丁醇以保存脂質(zhì)體尺寸并在凍干過程期間保持脂質(zhì)體中的有效成分。從水混溶性有機(jī)溶劑(尤其是叔丁醇)基本除去脂質(zhì)體的一種優(yōu)選方法包括用切向流過濾方法透濾。
作為實(shí)例尺寸減小的脂質(zhì)體可以通過標(biāo)稱分子量截留(MWCO)(10,000道爾頓到500,000道爾頓)膜過濾箱或筒再循環(huán)，該膜過濾箱或筒的表面積為0.1平方米到幾百平方米，其允許小于1000道爾頓的小分子穿過。脂質(zhì)體溶液通過這些薄膜濾器再循環(huán)并通過限制出口流量，可以產(chǎn)生針對(duì)膜孔的跨膜壓力，其使得小分子(例如，10％糖溶液和叔丁醇)穿過。該方法可以以連續(xù)模式或者濃縮模式進(jìn)行。在連續(xù)模式中，用于制備脂質(zhì)體的水相加入再循環(huán)脂質(zhì)體的速度和濾液被除去的速度相同。在濃縮-稀釋模式中，從尺寸減小的脂質(zhì)體除去含有叔丁醇的水相，從而將脂質(zhì)體溶液濃縮到希望的體積，優(yōu)選最初體積的50％，然后將用于制備脂質(zhì)體的水相返回加到起始體積中。該過程可以以反復(fù)的方式重復(fù)直到水混溶性溶劑(例如，叔丁醇)被降低到所希望的水平，優(yōu)選小于總體積的1％。在連續(xù)或濃縮-稀釋模式中，最小4體積(最初起始體積)水相被交換以將叔丁醇降低到可接受的水平。
脂質(zhì)體產(chǎn)物的無菌過濾是常規(guī)滅菌方法(末端熱滅菌如高壓滅菌、γ輻射，和環(huán)氧乙烷處理)的備選方法，其是所有腸胃外劑型的醫(yī)學(xué)應(yīng)用的前提條件(規(guī)定要求)。通過將脂質(zhì)體穿過無菌0.22μ濾器，所有存活的微生物都從脂質(zhì)體產(chǎn)物除去。在無菌條件下將產(chǎn)品裝入消毒的容器之前實(shí)施無菌過濾。
制備并(如果希望)尺寸-控制和/或除去水混溶性有機(jī)溶劑后，優(yōu)選將本體或尺寸-減小的脂質(zhì)體制劑凍干。可以使用任一適當(dāng)?shù)难b置或方法。優(yōu)選的裝置是Genesis-25EL(Virtis生產(chǎn))和任一適當(dāng)尺寸的凍干機(jī)(例如，Virtis，Edwards，and Hull Corp.所生產(chǎn)的)。本體或尺寸-減小的脂質(zhì)體制劑可以以凍干的形式(例如，在-2-8℃冷藏)長(zhǎng)時(shí)間保存，如保存至少約數(shù)月或數(shù)年。
使用時(shí)，可以將凍干的本體或尺寸-分級(jí)的脂質(zhì)體制劑用適當(dāng)體積的重構(gòu)溶液重構(gòu)，該重構(gòu)溶液優(yōu)選為極性溶劑，最優(yōu)選為水性系統(tǒng)，其可以是去離子水或無菌水或適當(dāng)?shù)乃喳}溶液?？梢允褂萌我贿m當(dāng)體積的重構(gòu)溶液，如約1ml到約50ml，更典型地，約3ml到約25ml。使用時(shí)，可以如所希望的將脂質(zhì)體制劑稀釋，如在適當(dāng)?shù)纳韺W(xué)上相容的緩沖劑或鹽水溶液中稀釋。為了幫助重構(gòu)，可以如希望的輕輕混合或劇烈攪拌(用拇指食指劇烈運(yùn)動(dòng))制劑。
本發(fā)明還提供了通過如此處描述的制備方法生產(chǎn)的脂質(zhì)體制劑和這些制劑的使用方法。通?？梢耘渲票景l(fā)明脂質(zhì)體制劑以施用于人或動(dòng)物患者。對(duì)于這些應(yīng)用，本發(fā)明制劑除了活性劑的脂質(zhì)體制劑還可包括非毒性的、惰性的藥學(xué)上適當(dāng)?shù)馁x形劑。藥學(xué)上適當(dāng)?shù)馁x形劑包括所有類型的固體、半固體或液體稀釋劑、填充劑和制劑輔助劑。片劑、錠劑、膠囊、丸劑、顆粒劑、栓劑、溶液、混懸劑和乳劑、糊劑、軟膏劑、凝膠劑、霜?jiǎng)⑾磩?、粉劑或噴霧劑可以是適當(dāng)?shù)乃幬镏苿Ｋ▌┏酥|(zhì)體活性劑之外還可含有適當(dāng)?shù)乃苄曰蛩蝗苄再x形劑。適當(dāng)?shù)馁x形劑是其中本發(fā)明脂質(zhì)體活性劑足夠穩(wěn)定以允許治療應(yīng)用的賦形劑，例如，聚乙二醇、某些脂肪和，和酯或這些物質(zhì)的混合物。軟膏劑、糊劑、霜?jiǎng)┖湍z劑也可以含有適當(dāng)?shù)馁x形劑，脂質(zhì)體活性劑在該賦形劑中是穩(wěn)定的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)隨希望的應(yīng)用方式(例如，腸胃外、局部、口服等)制備脂質(zhì)體制劑。
本發(fā)明還包括劑量單位的藥物制劑。這意味著這些制劑是單獨(dú)部分的形式，例如，小瓶、注射器、膠囊、丸劑、栓劑或安瓿，其活性劑的脂質(zhì)體制劑含量相應(yīng)于單獨(dú)劑量的一部分或多部分。劑量單位可以含有，例如，1、2、3或4個(gè)單獨(dú)劑量，或者1/2、1/3或1/4單獨(dú)劑量。單獨(dú)劑量?jī)?yōu)選含有在一次施用中所給的活性劑劑的量并且通常相應(yīng)于日劑量的全部、一半、三分之一或四分之一。
本發(fā)明制劑，特別是含有活性劑的制劑促進(jìn)了脊椎動(dòng)物(如人或非人動(dòng)物)中疾病的治療方法，其包括施用如此處描述的藥物制劑的步驟，該制劑通常包括對(duì)患者的疾病治療特定的治療劑。根據(jù)本發(fā)明方法，如此處描述的制劑(希望含有活性劑)被施用于需要治療的脊椎動(dòng)物，所施用的量和位置足夠治療該脊椎動(dòng)物的疾病。通過公知的方法或者所開發(fā)的方法將藥物制劑以適于制劑類型的方式，如靜脈內(nèi)、皮下、局部地、局部(例如，皮膚或皮膚組織，或者粘膜組織)、經(jīng)口、腸胃外、腹膜內(nèi)、直腸，通過直接注射到腫瘤或者需要治療的部位施用于患者。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法的疾病是癌癥，在該情況中，藥物制劑可以含有適當(dāng)?shù)目拱﹦?，如此處描述的抗癌劑。在另一?shí)施方案中，疾病是感染，如病毒、細(xì)菌或真菌感染。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到根據(jù)本發(fā)明方法，疾病的有效治療盡管希望消除疾病或其癥狀，但是不必完全根除該疾病的影響。實(shí)際上，可通過疾病、感染的嚴(yán)重性的減小，或者患者內(nèi)疾病進(jìn)展的速度的降低來測(cè)量根據(jù)本發(fā)明方法的成功治療。
實(shí)施例該實(shí)施例闡明了本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑的制備方法。提供該實(shí)施例作為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的進(jìn)一步指導(dǎo)并且不應(yīng)當(dāng)被理解為以任何方式限制本發(fā)明。
材料和方法在下面詳述的實(shí)施例中，從Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL得到DOPC、膽固醇和四肉豆蔻酰心磷脂。從Hande Tech，Austin，TX得到紫杉醇，從J.T.Baker得到叔丁醇和乙醇，從Mallinckrodt得到蔗糖，從Sigma得到D-α生育酸琥珀酸酯。
用Partcile Sizing Systems(PSS，CA)Z-380儀器測(cè)量脂質(zhì)體尺寸。用Genesis 25-EL(VirTis生產(chǎn))實(shí)施凍干。從Millipore公司，Bedford，MA得到Pellicon 2切向流過濾系統(tǒng)和100kD MWCO聚醚砜膜箱。
對(duì)于冷凍斷裂電子顯微術(shù)，用夾層(sandwich)技術(shù)在液氮冷卻的丙烷中以10,000K/秒的速度冷卻對(duì)樣品淬滅以避免冰凍-固定過程期間形成冰晶和后生物(artifact)。用JEOL-JED-9000冰凍蝕刻設(shè)備將冰凍-固定的樣品斷裂冰將暴露的斷裂平面用鉑以25-35°的角度投影30秒并用碳涂35秒。清除復(fù)制物并用Philips CM 10電子顯微鏡檢查。
通過本發(fā)明方法用叔丁醇溶劑制備脂質(zhì)體紫杉醇制劑通過本發(fā)明方法如下面描述以1mg/ml有效成分制備脂質(zhì)體紫杉醇制劑的200ml和500ml批次。為了該實(shí)施例的目的，以200ml批次作為實(shí)例詳細(xì)描述該方法。
表1列出了用于該制劑中的制劑組合物和批次的量。
表1用叔丁醇制備的基于脂質(zhì)體的紫杉醇制劑的制劑組成和批量
*制劑中成分的最終期望濃度**比重0.789g/mL。將在該方法中除去在帶有攪拌棒的預(yù)先配衡的燒杯中首先稱量8.0g叔丁醇溶劑(保持溶劑容器在35-40℃后)。
稱量200mg紫杉醇并攪拌下加入叔丁醇，并通過在電爐上加熱保持溶劑溫度高于35℃。用鋁箔蓋住燒杯防止溶劑蒸發(fā)損失。
紫杉醇完全溶解后(持續(xù)時(shí)間約15-20分鐘)，單獨(dú)稱量150mg膽固醇并加入含有紫杉醇的叔丁醇溶液中并混合直到完全溶解(持續(xù)時(shí)間3-5分鐘)。
單獨(dú)稱量490mg四肉豆蔻酰心磷脂、5.4g DOPC和62mg生育酸琥珀酸酯并以該順序加入叔丁醇溶液并混合直到溶液沒有任何未溶解的脂質(zhì)，而同時(shí)保持溶液溫度約40-50℃。加入溶液的所有組分的總?cè)芙鈺r(shí)間為約45分鐘，溶液溫度為約48℃。
通過將400g蔗糖和36g氯化鈉溶于去離子水(Milli Q systems)中制備10％蔗糖和0.9％氯化鈉的水相溶液(4000ml)并將溶液通過MilliPak 20無菌濾器過濾。
在預(yù)先配衡的有套玻璃容器中稱量190g過濾的蔗糖溶液并用設(shè)定為36℃的循環(huán)水浴保溫。
用Labmaster lightnin混合器以300rpm混合蔗糖溶液10分鐘將溶液溫度平衡到35℃。
在300rpm攪拌下，將含有紫杉醇和脂質(zhì)部分的叔丁醇溶液以穩(wěn)定流在1分鐘內(nèi)加到水溶液中。所加入的脂質(zhì)部分(作為溶液)的重量為約15g。
叔丁醇溶液加入完成時(shí)立即得到的溶液是混濁的，具有脂質(zhì)體所特有的稍微半透明。形成即刻后的本體脂質(zhì)體溶液的溫度測(cè)量為36℃并以300rpm將溶液再混合10分鐘。將混合速度增加到500rpm后持續(xù)30分鐘而本體脂質(zhì)體冷卻到25℃。
本體脂質(zhì)體的脂質(zhì)體尺寸測(cè)量表明它們是多層脂質(zhì)體，平均尺寸為1.3微米。測(cè)量本體脂質(zhì)體的pH為4.63。
將本體脂質(zhì)體以100-200psi的壓力擠壓穿過孔徑為0.2μ到0.1μ的聚碳酸酯膜濾器以減小脂質(zhì)體尺寸。在尺寸減小過程中過濾器上沒有藥物沉淀，表明有效成分、紫杉醇被包埋在脂質(zhì)體中。表2顯示了尺寸減小后基于脂質(zhì)體的紫杉醇的粒徑大小。圖1顯示了通過動(dòng)態(tài)光散射用PSS儀器測(cè)量的尺寸減小的脂質(zhì)體的粒度分布。在120.7nm測(cè)量平均直徑(標(biāo)準(zhǔn)誤＝37.3nm)，分布如下25％＜86.8nm，50％＜107.2nm，75％＜132.3nm，90％＜158.8nm，99％＜219.7nm。
表2尺寸減小期間和之后本體脂質(zhì)體的脂質(zhì)體尺寸數(shù)據(jù)。
*Chi2太大。Nicomp分布表明大多數(shù)脂質(zhì)體大于1μ(1000nm)。
尺寸減小后，用切向流過濾(TFF)方法除去脂質(zhì)體的叔丁醇溶劑。為此，使用Pellicon 2 TFF系統(tǒng)(Millipore Corp.Bedford，MA)，該系統(tǒng)裝備0.1平方米表面積的聚醚砜(PES)膜箱。圖2中顯示了用于除去本體脂質(zhì)體或尺寸減小的脂質(zhì)體形成中所用的叔丁醇的TFF系統(tǒng)的示意性表示。該特定膜箱用限制性通道篩選(C型)制造，其能夠保留大于100,000道爾頓(分子量截留或MWCO 100kD)的任何溶質(zhì)分子(例如蛋白質(zhì))或有組織的結(jié)構(gòu)如脂質(zhì)體，允許更小的溶質(zhì)分子(如蔗糖和叔丁醇)穿過膜。加入約200g 10％蔗糖溶液將尺寸減小的脂質(zhì)體首先稀釋2倍(2×)后將它們導(dǎo)入TFF系統(tǒng)以除去溶劑。在該過程中監(jiān)視入口流量、入口壓力、出口壓力(或反壓)，和濾液流量并在表3中表示。以濃縮-稀釋模式操作實(shí)施共7次反復(fù)(收集7體積濾液)。
表3從脂質(zhì)體除去叔丁醇溶劑的切向流過濾方法數(shù)據(jù)
在兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中以通過切向流濃縮-稀釋模式以及水相的連續(xù)灌輸對(duì)500ml批次實(shí)施溶劑去除，含有叔丁醇的水相作為濾液被除去(流入和流出模式)。使用高達(dá)600ml/min的脂質(zhì)體流入速度，其產(chǎn)生高達(dá)20psi的更高流入壓力。溶劑除去的大規(guī)模方法可以使用高達(dá)100l/min的流速，其產(chǎn)生高達(dá)50psi的流入壓力。具有類似的(100kD)、更小的(10kD)或更大的(300kD)MWCO和更大表面積(高達(dá)1000平方米)的TFF膜箱可用于商業(yè)規(guī)模制備以除去叔丁醇。然而，100kD MWCO膜箱是用于從脂質(zhì)體除去叔丁醇目的優(yōu)選尺寸。盡管更大的如300kD和500kD MWCO膜箱可實(shí)施該功能，但是該方法中一些脂質(zhì)體也可以流失到濾液中。圖2中的流程圖可用于從200ml規(guī)模批次到2000l規(guī)模批次除去本體脂質(zhì)體形成中所用的水混溶性有機(jī)溶劑(叔丁醇和乙醇)。盡管實(shí)施例中描述的濃縮-稀釋模式在小規(guī)模(可達(dá)1000ml)中是實(shí)用的，但是在大規(guī)模中使用連續(xù)模式(流入和流出)。
TFF方法除去溶劑后測(cè)量脂質(zhì)體的粒徑表明在溶劑除去過程期間脂質(zhì)體尺寸未受影響(見圖3)。所測(cè)量的平均直徑是115.6nm(標(biāo)準(zhǔn)誤差＝33.6nm)，分布如下25％＜84.6nm，50％＜103.2nm，75％＜125.9nm，90％＜150.2nm，和99％＜202.6nm。
除去溶劑后，冰凍干燥前通過MilliPak 20無菌濾器無菌過濾。將無菌過濾的脂質(zhì)體裝入20ml玻璃制品(每瓶10.5ml)并冰凍干燥。將冰凍干燥的脂質(zhì)體用10ml去離子水重構(gòu)。對(duì)重構(gòu)的脂質(zhì)體分析脂質(zhì)體尺寸、紫杉醇、DOPC、膽固醇和心磷脂含量。凍干后重構(gòu)的含有紫杉醇的脂質(zhì)體的大小分布(見圖4)沒有表現(xiàn)出任何顯著的變化，表明在冰凍干燥過程期間保存了脂質(zhì)體的完整性。所測(cè)量的平均直徑是117.6nm(標(biāo)準(zhǔn)誤差＝40.2nm)，分布如下25％＜81.7nm，50％＜103.3nm，75％＜130.3nm，90％＜160.4nm，和99％＜230.5nm。
還通過冷凍斷裂電子顯微術(shù)，使用上述方法分析了這些脂質(zhì)體。所得電子顯微照片顯示了多數(shù)單雙層球形脂質(zhì)體(也稱為小單層脂質(zhì)體，或者簡(jiǎn)稱SUV)的均一分布，其直徑為20到150nm。脂質(zhì)體的主要組分是單獨(dú)的并且沒有結(jié)合或聚集(見圖5)。
尺寸減小、溶劑除去后無菌過濾之后對(duì)本體脂質(zhì)體分析的結(jié)果(表4)確定本發(fā)明方法可用于用叔丁醇制備含有水不溶性有效成分，如紫杉醇的脂質(zhì)體。
表4用叔丁醇制備的基于脂質(zhì)體的紫杉醇制劑的紫杉醇和脂質(zhì)部分的含量、脂質(zhì)體尺寸結(jié)果
此處引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)、和出版物，都在此處完整并入作為參考。
盡管本發(fā)明著重于優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行描述，但是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，也可使用優(yōu)選的實(shí)施方案的變體并且本發(fā)明可以以和此處特別描述的不同的方式實(shí)施。因此，本發(fā)明包括所有修改方案，它們包括在通過下面的權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備脂質(zhì)體制劑的方法，所述方法包括(a)將脂質(zhì)部分溶于水混溶性有機(jī)溶劑中，(b)將含有所述脂質(zhì)部分的所述水混溶性有機(jī)溶劑溶液與水溶液在適于形成本體脂質(zhì)體制劑的條件下混合。
2.權(quán)利要求1的方法，其還包括加入一種或多種有效成分。
3.權(quán)利要求2的方法，其中有效成分被加入所述水混溶性有機(jī)溶劑中。
4.權(quán)利要求3的方法，其中在加入脂質(zhì)部分之前將有效成分加入水混溶性有機(jī)溶劑中。
5.權(quán)利要求2的方法，其中有效成分被加到所述水溶液中。
6.權(quán)利要求5的方法，其中在步驟(b)之前將有效成分加到水溶液中。
7.權(quán)利要求2的方法，其中在步驟(b)期間或之后加入有效成分。
8.一種制備有效成分的脂質(zhì)體制劑的方法，所述方法包括(a)將至少一種有效成分溶于水混溶性有機(jī)溶劑中，(b)將脂質(zhì)部分溶于所述水混溶性有機(jī)溶劑中，(c)將含有所述有效成分和所述脂質(zhì)部分的所述水混溶性有機(jī)溶劑溶液與水溶液在適于形成本體脂質(zhì)體制劑的條件下混合。
9.權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)的方法，其中水混溶性有機(jī)溶劑是叔丁醇。
10.權(quán)利要求2-9中任何一項(xiàng)的方法，其中有效成分包括至少一種抗腫瘤或抗真菌劑。
11.權(quán)利要求2-9中任何一項(xiàng)的方法，其中有效成分包括至少一種選自紫杉烷或衍生物和喜樹堿或衍生物的試劑。
12.權(quán)利要求2-9中任何一項(xiàng)的方法，其中有效成分包括紫杉醇或多西他賽。
13.權(quán)利要求3-4中任何一項(xiàng)的方法，其中有效成分溶于溫度高于35℃的水混溶性有機(jī)溶劑中。
14.權(quán)利要求13的方法，其中有效成分溶于溫度為約40℃到約55℃的水混溶性有機(jī)溶劑中。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中水混溶性有機(jī)溶劑是叔丁醇。
16.權(quán)利要求1-15中任何一項(xiàng)的方法，其中脂質(zhì)部分包括膽固醇、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、四肉豆蔻酰心磷脂、和生育酸琥珀酸酯中的一種或多種。
17.權(quán)利要求16中任何一項(xiàng)的方法，其中脂質(zhì)部分包括膽固醇、DOPC、四肉豆蔻酰心磷脂、和生育酸琥珀酸酯中的3種或多種。
18.權(quán)利要求17的方法，其中DOPC構(gòu)成脂質(zhì)部分的主要部分。
19.權(quán)利要求18中的方法，其中脂質(zhì)部分至少含有摩爾比為約90∶5∶5的DOPC、膽固醇和四肉豆蔻酰心磷脂。
20.權(quán)利要求1-19中任何一項(xiàng)的方法，其中水溶液為總脂質(zhì)體制劑體積的至少約90％。
21.權(quán)利要求1-20中任何一項(xiàng)的方法，其中水溶液為約10％蔗糖和約0.4-0.9％氯化鈉。
22.權(quán)利要求1的方法，其中通過將有效成分、紫杉醇或其他任何紫杉烷如多西他賽加入約35到約65℃的水混溶性有機(jī)溶劑中來實(shí)現(xiàn)步驟(a)。
23.權(quán)利要求1的方法，其中通過將構(gòu)成脂質(zhì)部分的脂質(zhì)組分、膽固醇、心磷脂、DOPC和生育酸琥珀酸酯順序加入約35到約65℃的水混溶性有機(jī)溶劑中來實(shí)現(xiàn)步驟(a)。
24.權(quán)利要求8的方法，其中通過將構(gòu)成脂質(zhì)部分的化合物順序加入水混溶性有機(jī)溶劑中實(shí)現(xiàn)步驟(b)。
25.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)包括在保持水相溶液為約30-40℃并以300-400rpm混合下將含有脂質(zhì)部分的水混溶性有機(jī)溶劑溶液加入水溶液中。
26.權(quán)利要求8的方法，其中步驟(c)包括在混合下將含有脂質(zhì)部分的水混溶性有機(jī)溶劑溶液加入水溶液中。
27.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)包括在冷卻下將含有脂質(zhì)部分的水混溶性溶劑加入水溶液后混合溶液。
28.權(quán)利要求8的方法，其中步驟(c)包括在冷卻下將含有脂質(zhì)部分的水混溶性溶劑加入水溶液后混合溶液。
29.權(quán)利要求27或28的方法，其中冷卻到約25到約30℃的溫度。
30.權(quán)利要求1-29中任何一項(xiàng)的方法，其還包括減小本體脂質(zhì)體制劑的尺寸以得到尺寸減小的脂質(zhì)體制劑。
31.權(quán)利要求30的方法，其中通過將本體脂質(zhì)體制劑通過聚碳酸酯濾器擠出來實(shí)現(xiàn)所述尺寸減小。
32.權(quán)利要求31的方法，其中通過將本體脂質(zhì)體制劑通過0.2μm到0.1μm聚碳酸酯濾器擠出來實(shí)現(xiàn)所述尺寸減小。
33.權(quán)利要求31或32的方法，其中通過將本體脂質(zhì)體制劑以高達(dá)約200psi的壓力擠出來實(shí)現(xiàn)尺寸減小。
34.權(quán)利要求31-33中任何一項(xiàng)的方法，其中本體脂質(zhì)體制劑含有至少一種有效成分。
35.權(quán)利要求34的方法，其中實(shí)現(xiàn)尺寸減小而無有效成分的沉淀。
36.權(quán)利要求1-35中任何一項(xiàng)的方法，其還包括基本上除去脂質(zhì)體制劑的水混溶性有機(jī)溶劑。
37.權(quán)利要求30-35中任何一項(xiàng)的方法，其還包括基本上除去脂質(zhì)體制劑的水混溶性有機(jī)溶劑。
38.權(quán)利要求36或37的方法，其中通過透濾法使用切向流過濾方法和無菌過濾基本上除去脂質(zhì)體制劑的水混溶性有機(jī)溶劑。
39.權(quán)利要求36-38中任何一項(xiàng)的方法，其還包括加入一種或多種有效成分。
40.權(quán)利要求39的方法，其中有效成分是水溶性成分，其在脂質(zhì)體制劑基本上去除水混溶性有機(jī)溶劑后加入。
41.權(quán)利要求1-40中任何一項(xiàng)的方法，其還包括無菌過濾所述脂質(zhì)體制劑。
42.權(quán)利要求41的方法，其中在無菌過濾前將有效成分加入制劑。
43.權(quán)利要求1-42中任何一項(xiàng)的方法，其還包括冰凍干燥所述脂質(zhì)體制劑。
44.權(quán)利要求43的方法，其中在冰凍干燥所述脂質(zhì)體制劑之前將有效成分加入制劑。
45.通過權(quán)利要求1-37中任何一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的脂質(zhì)體制劑。
46.權(quán)利要求45的脂質(zhì)體制劑，其含有至少一種有效成分。
47.權(quán)利要求46的脂質(zhì)體制劑，其中有效成分含有至少一種抗腫瘤或抗真菌劑。
48.權(quán)利要求46的脂質(zhì)體制劑，其中有效成分含有至少一種選自紫杉烷或衍生物和喜樹堿或衍生物的試劑。
49.權(quán)利要求46的脂質(zhì)體制劑，其中有效成分含有紫杉醇或多西他賽。
50.權(quán)利要求45-49中任何一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其還含有藥學(xué)上可接受的賦形劑。
51.一種治療需要治療的患者中疾病的方法，其包括對(duì)該患者施用根據(jù)權(quán)利要求47-50中任何一項(xiàng)的組合物，施用的量和部位足夠?qū)⑺龌钚詣﹤鬟f至該患者從而治療所述疾病。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述疾病是癌癥。
53.權(quán)利要求51或52的方法，其中腸胃外施用所述組合物。
54.權(quán)利要求51或52的方法，其中局部施用所述組合物。
55.權(quán)利要求51或52的方法，其中通過直接注射到腫瘤中來施用所述組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了脂質(zhì)體制劑的制備方法。根據(jù)該方法，將脂質(zhì)部分溶于水混溶性有機(jī)溶劑中。含有脂質(zhì)部分的該溶液可在各種條件下加入水溶液并與之混合，形成本體脂質(zhì)體制劑。理想地，該制劑可包括一種或多種有效成分。還可以根據(jù)需要通過例如，尺寸分級(jí)或減小、除去水混溶性有機(jī)溶劑、冰凍干燥或其他處理進(jìn)一步加工該本體脂質(zhì)體制劑。該方法允許大規(guī)?；蛏虡I(yè)規(guī)模生產(chǎn)脂質(zhì)體制劑。
文檔編號(hào)A61K31/4745GK1753657SQ200480001194
公開日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2004年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月11日
發(fā)明者S·巴姆蒂帕梯, Z·阿赫馬, I·阿赫馬 申請(qǐng)人:新藥物公司