專利名稱：來自羊膜的醫(yī)用材料及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自羊膜的醫(yī)用材料及其使用。本發(fā)明的醫(yī)用材料，例如可用于填補(bǔ)創(chuàng)傷的材料、保護(hù)創(chuàng)傷的材料、治愈創(chuàng)傷的材料、防止愈合的材料、人工組織等，具體來說，可用于制作移植用的上皮(例如角膜上皮)或移植用的內(nèi)皮(例如角膜內(nèi)皮)。
背景技術(shù)：
在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步的背景下，試圖重建(再生)不能發(fā)揮原來功能的組織的嘗試，以各種組織為目標(biāo)進(jìn)行著。例如，有這樣的嘗試在適當(dāng)?shù)幕纳鲜蛊つw表皮或角膜上皮在體外(invitro)重新構(gòu)建，將其作為移植用的組織來利用。對(duì)于在構(gòu)建這樣的移植用組織中所用的基材，要求其對(duì)生命體有高的親和性(及低的免疫原性)，并且與目的細(xì)胞良好地接合，還要有可以增殖等的特性。以往，羊膜作為具備這種特性的材料被廣泛地利用。羊膜是與羊水一起將胎兒包入的膜，由于其免疫原性低，被認(rèn)為是制作移植片的特別優(yōu)選的材料。羊膜概略上說，具有在含有膠原的實(shí)質(zhì)層上，通過基底膜形成上皮層的構(gòu)造。如上所述，羊膜雖然是免疫原性低的組織，但為了獲得更低的免疫原性，并在其上構(gòu)建細(xì)胞層來構(gòu)建移植用的組織的時(shí)候，有必要防止混入來自羊膜的細(xì)胞，為此，認(rèn)為優(yōu)選除去上皮層后使用(參照特開平5-56987號(hào)公報(bào))。

發(fā)明內(nèi)容
制作除去上皮層的羊膜，例如可按以下進(jìn)行。首先，洗凈采取的羊膜，去除多余的附著物，然后剝離上皮層。如此得到的不含有上皮的羊膜，除了制作后立刻使用的情況外，可冷藏或凍結(jié)保存直至使用。因此，要求在使用前有充分的溫度管理，其操作(特別是運(yùn)送的時(shí)候)需要特別地注意。另外，因?yàn)槭窍蛏w移植的材料，所以在使用前需要進(jìn)行滅菌處理，但本發(fā)明人等的研究結(jié)果表明，如果對(duì)冷藏狀態(tài)或者凍結(jié)狀態(tài)下的不含有上皮的羊膜進(jìn)行γ線或電子射線等的處理，可觀察到溶液的變色等，其不能耐受必要的滅菌處理。
本發(fā)明鑒于上述課題，其主要目的是提供作為基材具有良好功能的來自羊膜的醫(yī)用材料，該材料容易操作，可進(jìn)行充分的滅菌處理，并在其上可構(gòu)建細(xì)胞層。
本發(fā)明人等關(guān)注羊膜的基底膜，為了作為可構(gòu)建細(xì)胞層的基材成為適宜的醫(yī)用材料，認(rèn)為使基底膜殘存的同時(shí)維持其構(gòu)造是重要的。另外，從操作的角度講，認(rèn)為在使用前為干燥的形態(tài)是最優(yōu)選的。在上述思考下，本發(fā)明人等將羊膜作為初始原料，嘗試構(gòu)建能達(dá)到上述目的的醫(yī)用材料。首先，使基底膜的至少一部分殘存，去除羊膜的上皮。接著，通過真空凍結(jié)干燥的方法去除水分，得到干燥狀態(tài)的羊膜(不含有上皮的羊膜)。為了研究得到的不含有上皮的羊膜的特性，以該羊膜作為基材嘗試構(gòu)建細(xì)胞層。結(jié)果是，在用角膜上皮細(xì)胞作為模型時(shí)，觀察到細(xì)胞在該羊膜上有良好的接合及增殖，更進(jìn)一步，觀察到重層化。然后，將最終得到的細(xì)胞層(角膜上皮樣片)作為移植片，進(jìn)行移植試驗(yàn)，結(jié)果移植片確實(shí)地附著在生命體上生長(zhǎng)，并確認(rèn)了良好的角膜重建效果。本發(fā)明是在上述成果的基礎(chǔ)上的產(chǎn)物，提供以下的各種構(gòu)成。
具備以下的性狀(1)～(3)的來自羊膜的醫(yī)用材料(1)是干燥狀態(tài)；(2)不具有上皮層；及(3)具有在使用時(shí)在其上保持著細(xì)胞可結(jié)合及增殖的構(gòu)造的基底膜。
如[1]中所述的來自羊膜的醫(yī)用材料，其特征為，進(jìn)一步具備以下的性狀(4)(4)在與氧沒有實(shí)質(zhì)地接觸的狀態(tài)下，被裝入容器中。
如[1]或[2]中所述的來自羊膜的醫(yī)用材料，上述與氧沒有實(shí)質(zhì)地接觸的狀態(tài)是容器內(nèi)作成真空或是用氮置換了的狀態(tài)。
如[1]～[3]中任一項(xiàng)所述的來自羊膜的醫(yī)用材料，其中上述細(xì)胞是角膜上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞或口腔粘膜上皮細(xì)胞。
來自羊膜的醫(yī)用材料的制作方法，包括以下的步驟(i)和(ii)(i)殘留基底膜的至少一部分，從羊膜上去除上皮層的步驟；及(ii)在殘存的基底膜在使用時(shí)在其上保持著細(xì)胞可接合及增殖的構(gòu)造的條件下，將步驟(i)得到的不含有上皮的羊膜干燥的步驟。
如[5]所述的來自羊膜的醫(yī)用材料的制作方法，其中上述步驟(ii)是通過凍結(jié)干燥處理來實(shí)施的。
如[5]或[6]所述的來自羊膜的醫(yī)用材料的制作方法，進(jìn)一步包括以下的步驟(iii)(iii)將步驟(ii)得到的干燥體，在使之與氧沒有實(shí)質(zhì)地接觸的狀態(tài)下，裝入容器中的步驟。
如[7]所述的來自羊膜的醫(yī)用材料的制作方法，上述與氧沒有實(shí)質(zhì)地接觸的狀態(tài)是容器內(nèi)作成真空或是用氮置換了的狀態(tài)。
角膜上皮樣片的制作方法，包括以下的步驟在[1]～[4]中任一項(xiàng)所述的醫(yī)用材料上培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞的步驟。
角膜上皮樣片的制作方法，包括以下的步驟(a)及(b)(a)在[1]～[4]中任一項(xiàng)所述的醫(yī)用材料上培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞或是具有向角膜上皮樣細(xì)胞分化的能力的細(xì)胞的步驟；及(b)在上述細(xì)胞增殖、重層化之后，使最表層與空氣接觸的步驟。
如[10]所述的角膜上皮樣片的制作方法，上述步驟(a)是在支持細(xì)胞的共存下實(shí)施的。
如[10]所述的角膜上皮樣片的制作方法，上述步驟(a)是在支持細(xì)胞的共存下、并且在該支持細(xì)胞和上述醫(yī)用材料之間存在該支持細(xì)胞不能通過的孔徑的隔離膜的狀態(tài)下實(shí)施的。
如[10]～[12]中任一項(xiàng)所述的角膜上皮樣片的制作方法，在上述步驟(a)中培養(yǎng)的細(xì)胞是口腔粘膜上皮細(xì)胞。
角膜內(nèi)皮樣片的制作方法，包括以下的步驟(A)～(C)(A)培養(yǎng)采取的角膜內(nèi)皮細(xì)胞，使之增殖的步驟；(B)將增殖的角膜內(nèi)皮細(xì)胞回收，制作細(xì)胞懸浮液的步驟；及(C)將上述細(xì)胞懸浮液在[1]～[4]中任一項(xiàng)所述的醫(yī)用材料上播種、培養(yǎng)的步驟。
如[14]所述的角膜內(nèi)皮樣片的制作方法，在上述步驟(B)之后實(shí)施以下的步驟(B-1)(B-1)通過離心處理，提高上述細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞密度的步驟。
如[14]或[15]所述的角膜內(nèi)皮樣片的制作方法，其特征為，在上述步驟(C)中，播種細(xì)胞懸浮液后作離心處理。
如[14]或[15]所述的角膜內(nèi)皮樣片的制作方法，上述步驟(C)包括以下的步驟(C-1)～(C-5)(C-1)在培養(yǎng)容器內(nèi)，留置具有由培養(yǎng)液可以通過的孔徑的膜形成的底面的容器的步驟；(C-2)在上述容器的上述底面上，載置[1]～[4]中任一項(xiàng)所述的醫(yī)用材料的步驟；(C-3)將上述細(xì)胞懸浮液播種在上述醫(yī)用材料上的步驟；(C-4)離心處理的步驟；及(C-5)培養(yǎng)的步驟。
只要沒有特別地記述，本說明書中所說的“角膜上皮細(xì)胞”是作為包括角膜上皮細(xì)胞層中含有的細(xì)胞，即也包含角膜上皮干細(xì)胞。同樣，所洗的“角膜內(nèi)皮細(xì)胞”是作為包括角膜內(nèi)皮細(xì)胞層中含有的細(xì)胞，即也包含角膜內(nèi)皮干細(xì)胞。另外，本說明書中所說的“角膜上皮樣片”是作為意味著具有類似角膜上皮的特征、可以代替角膜上皮供給移植的細(xì)胞層的用語使用的。同樣，所說的“角膜上皮移植用片”是作為意味著備有具有類似角膜上皮特征的細(xì)胞層、可用于角膜上皮重建供給移植的組合物的用語使用的。另一方面，所說的“角膜內(nèi)皮樣片”是作為意味著具有類似角膜內(nèi)皮特征、可代替角膜內(nèi)皮供給移植的細(xì)胞層的用語使用的。同樣，所說的“角膜內(nèi)皮移植用片”是作為意味著備有具有類似角膜內(nèi)皮特征的細(xì)胞層、可用于角膜內(nèi)皮重建供給移植的組合物的用語使用的。


圖1是用掃描電鏡顯示的羊膜的圖像。A是正常狀態(tài)(沒有進(jìn)行上皮處理的狀態(tài))的羊膜表面的圖像；B是對(duì)上皮作搔扒處理后的羊膜表面的圖像。在A中可觀察到多角形的羊膜上皮。另一方面，在B中無法看出羊膜上皮，確認(rèn)上皮被完全地除去了。
圖2是綜合凍結(jié)干燥羊膜的表面分析結(jié)果的表。表中+表示陽(yáng)性，-表示陰性。AM(-)Fdγray在實(shí)施例5的方法中得到的干燥羊膜；AM(+)采取后只是進(jìn)行洗凈的樣本；AM(-)進(jìn)行上皮的去除、不進(jìn)行凍結(jié)干燥處理的樣本；AM(-)dispase通過分散酶處理去除上皮、不進(jìn)行干燥處理的樣本；AM(-)FD進(jìn)行去除上皮及凍結(jié)干燥處理、不進(jìn)行滅菌處理的樣本；AM(-)γray去除上皮后、不作凍結(jié)干燥處理而進(jìn)行滅菌處理的樣本。
圖3是示意地顯示在羊膜上培養(yǎng)口腔粘膜上皮細(xì)胞的時(shí)候的器具等的狀態(tài)的斷面圖。在culture dish 1內(nèi)靜置culture insert 2，在culture dish 1的底面形成3T3細(xì)胞層5。另外，顯示了在culture insert 2的底面上靜置羊膜3，在其上培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞4的狀態(tài)。符號(hào)6是培養(yǎng)基。
圖4是顯示在凍結(jié)干燥羊膜上形成的角膜上皮細(xì)胞層的圖像(HE(蘇木精伊紅)染色的圖像)。
圖5是觀察手術(shù)前眼表面的狀態(tài)的圖像(上圖)，及顯示移植角膜上皮移植用片后經(jīng)過2天時(shí)的眼表面的狀態(tài)(熒光素染色的圖像)(下圖)的圖像。用熒光素染色的部分(箭頭所示)用斜線表示。眼表面(移植部分)沒有被熒光素染色，可知移植片在眼表面附著生長(zhǎng)了。另外，在移植片的周圍整個(gè)一周可確認(rèn)有熒光素的染色性。
圖6是顯示移植角膜上皮移植用片后，經(jīng)過7天時(shí)眼表面的狀態(tài)的圖像(上圖是直接觀察的圖像，下圖是熒光素染色的圖像)?？芍浦财S持了透明性(上圖)。用熒光素染色的部分(箭頭所示)用斜線表示。可知的是，顯示染色性的區(qū)域很少，移植片殘存在眼表面上，而且與移植后2天時(shí)相比，向周圍伸展了。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的第1部分是涉及來自羊膜的醫(yī)用材料，其特征為，具備以下的性狀(1)～(3)(1)是干燥狀態(tài)，(2)沒有上皮層，(3)具有在使用時(shí)在其上保持著可以接合及增殖的構(gòu)造的基底膜。
本發(fā)明的醫(yī)用材料的第1個(gè)特征是來自羊膜。所說的“來自羊膜”意味著廣義的以羊膜為初始原料得到的物質(zhì)。從免疫原性的角度講，本發(fā)明的醫(yī)用材料優(yōu)選來自人的羊膜。人的羊膜是覆于子宮和胎盤最表層的膜，是在膠原豐富的實(shí)質(zhì)組織上形成基底膜、上皮層而構(gòu)成的。
本發(fā)明的醫(yī)用材料通過具備(1)的性狀，使操作變得容易。具體來說，即使保存在常溫(例如大約10℃～35℃)下也可以。也就是說，在使用前在冷凍以及冷藏環(huán)境下的管理變得沒有必要、其操作(保存、運(yùn)送等)變得容易。但是，以上所述并不意味著本發(fā)明的醫(yī)用材料不能在低溫保存，根據(jù)需要也可以提供冷凍以及冷藏保存。
另一方面，由于處于干燥狀態(tài)，可以進(jìn)行不影響其使用的、有效的滅菌處理。另外，因?yàn)槭歉稍餇顟B(tài)，隨時(shí)間的劣化是非常少的，可長(zhǎng)時(shí)間維持高品質(zhì)的狀態(tài)。
本發(fā)明具備的(2)的性狀對(duì)免疫原性的降低是有貢獻(xiàn)的。也就是說，羊膜本來就是免疫原性低的材料，而通過將上皮層完全地去除，免疫原性會(huì)更低。另一方面，從可以在本發(fā)明的醫(yī)用材料上良好地構(gòu)建目的細(xì)胞層的觀點(diǎn)看，沒有上皮層的性狀是重要的。如果以上皮層殘存的狀態(tài)的羊膜作為基材，在其上播種特定的細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞層，播種的細(xì)胞的增殖會(huì)因羊膜上皮細(xì)胞而被抑制。通過使用完全去除了上皮層的羊膜，就不會(huì)擔(dān)心這樣的因羊膜上皮細(xì)胞所致的抑制增殖。這樣，通過沒有上皮的特征，本發(fā)明的醫(yī)用材料可以作為構(gòu)建目的細(xì)胞層的適宜的基材而發(fā)揮功能。
本發(fā)明的醫(yī)用材料通過具備(3)的性狀，可以成為作為用于構(gòu)建目的細(xì)胞層的基材而可以適宜地使用的材料。完全去除上皮后使之自然干燥的羊膜，即只含有實(shí)質(zhì)層的自然干燥的羊膜，一般來說，由于基底膜的成分被分解，在其上播種細(xì)胞時(shí)該細(xì)胞不會(huì)良好地接合。但是，本發(fā)明的醫(yī)用材料中因?yàn)槭够啄埓娌⑶沂怪叨缺３制錁?gòu)造，通過基底膜中含有的接合因子，使在其上播種的細(xì)胞良好地接合，結(jié)果就發(fā)生了細(xì)胞的增殖及重層化。
還有，在(3)的性狀中所說的“在使用時(shí)”，是指將本發(fā)明的醫(yī)用材料浸漬在適當(dāng)?shù)娜芤褐?滅菌水、生理鹽水、磷酸緩沖液、適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基等)，使之從干燥狀態(tài)復(fù)原了的時(shí)候。
對(duì)于基底膜的有無，可用通過檢測(cè)基底膜中特征性的構(gòu)成成分膠原IV(α1、α2及α5)、膠原VII、昆布氨酸5等的存在來確認(rèn)。也就是說，在用本發(fā)明的醫(yī)用材料使之復(fù)原了的時(shí)候，這些成分的至少一個(gè)，優(yōu)選是多個(gè)，更優(yōu)選是全部被檢測(cè)出來。另外，膠原IV等的檢測(cè)，可用它們的特異性抗體通過免疫染色法來實(shí)施。
作為在本發(fā)明的醫(yī)用材料上被增殖的細(xì)胞，可舉例如上皮細(xì)胞(角膜上皮細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、口腔粘膜上皮細(xì)胞等)、內(nèi)皮細(xì)胞(角膜內(nèi)皮細(xì)胞等)。另外，口腔粘膜上皮細(xì)胞是例如在齒根部存在的細(xì)胞(口腔內(nèi)緣粘膜上皮細(xì)胞)、口唇部的粘膜上皮細(xì)胞、腭部的粘膜上皮細(xì)胞，頰部的粘膜上皮細(xì)胞等。
如上，本發(fā)明的來自羊膜的醫(yī)用材料，對(duì)于構(gòu)建以移植為前提的細(xì)胞層，是非常有用的材料。
本發(fā)明的醫(yī)用材料，優(yōu)選在實(shí)施上與氧不接觸的狀態(tài)下裝入容器中來提供。所述的形態(tài)，不會(huì)因氧而致品質(zhì)劣化，可以長(zhǎng)時(shí)間地維持高品質(zhì)。所說的“實(shí)質(zhì)上與氧不接觸的狀態(tài)”是指容器內(nèi)氧實(shí)質(zhì)上不存在的狀態(tài)，具體來說，可以舉例如將容器內(nèi)作成真空的狀態(tài)或在容器內(nèi)填充氮?dú)庵脫Q的狀態(tài)。其中的“容器”只要是適于裝入本發(fā)明的醫(yī)用材料就可以，沒有特別地限定，例如，可以使用可塑性合成樹脂制的袋狀或管狀的容器(將兩枚片狀物重合，使周邊部封上的容器亦可)、或是用玻璃等無機(jī)材料制的瓶狀容器等來作本發(fā)明的容器。
以上的本發(fā)明的醫(yī)用材料，可例如用以下的方法(本發(fā)明的第二個(gè)層面)來制作。
本發(fā)明的第二個(gè)層面涉及來自羊膜的醫(yī)用材料的制作方法，其特征為，包括以下的步驟(i)和(ii)(i)殘留基底膜的至少一部分，從羊膜上去除上皮層的步驟。
(ii)殘存的基底膜在使用時(shí)在其上保持細(xì)胞可接合及增殖的構(gòu)造的條件下，將步驟(i)得到的不含有上皮的羊膜干燥的步驟。
在步驟(i)中去除上皮層，但此時(shí)不是將基底膜一并去除，至少要使它殘存一部分。這樣的處理，例如可以用細(xì)胞刮器(cell scraper)、鑷子等在上皮層作搔扒來進(jìn)行。優(yōu)選的是，用EDTA和蛋白分解酶等來預(yù)先減緩構(gòu)成上皮層的細(xì)胞之間的接合，再用細(xì)胞刮器等來實(shí)施搔扒。但是，這樣的前處理(利用EDTA等的處理)，優(yōu)選在不破壞居于上皮層在向?qū)嵸|(zhì)層接合之間的基底膜的構(gòu)造的條件下來實(shí)施。例如，如果用分散酶在一般條件下(例如，添加分散酶至1.2IU的狀態(tài)，在37℃下使其反應(yīng)1小時(shí)的條件)處理，不只是上皮層，連基底膜也會(huì)受到很大的損害。進(jìn)行這樣的前處理時(shí)，就不能使保持原來功能的基底膜殘存下來。本發(fā)明的步驟(i)中的重點(diǎn)是，使基底膜的至少一部分在保持原來功能的狀態(tài)下殘存下來，同時(shí)完全地去除上皮層。例如通過用EDTA的前處理(例如，添加EDTA至0.02％～0.1％的狀態(tài)，在4℃～37℃下使其反應(yīng)1小時(shí)～4小時(shí)的條件)，對(duì)基底膜的影響是非常小的。
步驟(i)中所使用的羊膜優(yōu)選是人的羊膜。人的羊膜，例如可以在分娩時(shí)從產(chǎn)后得到的人胎兒膜、胎盤等上采取。具體來說，可以通過處理·精制剛剛分娩后得到的含有人胎兒膜、胎盤及臍帶的一體物來制備人的羊膜。這樣的人的羊膜的制備方法可以采用特開平5-56987號(hào)中所述的方法等公知的方法。也就是說，從分娩時(shí)得到的胎兒膜上剝離羊膜，用超聲波洗凈等的物理方法處理及酶處理等來去除殘存的組織，經(jīng)過適當(dāng)?shù)南磧艄ば蚓涂芍苽淙说难蚰?。這樣制備的人的羊膜可以凍結(jié)保存到要開始進(jìn)行步驟(i)時(shí)。人的羊膜的凍結(jié)，例如可以在-80℃下，保存在DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和甘油等體積混合的液體中。通過凍結(jié)保存可提高操作性是勿庸置疑的，還有望減少抗原性。
在步驟(i)之后實(shí)施的步驟(ii)中，在殘存的基底膜在使用時(shí)在其上保持細(xì)胞可接合及增殖的構(gòu)造的條件下，將步驟(i)得到的不含有上皮的羊膜進(jìn)行干燥處理。只要能在這樣的條件下處理，干燥處理的方法不作限定，但優(yōu)選的是采用凍結(jié)干燥處理。凍結(jié)干燥處理一般是在使沸點(diǎn)達(dá)到約-20℃(107Pa，0.8Torr)～約-50℃(4Pa，0.03Torr)的低氣壓環(huán)境(真空)中，通過升華將水分從處于凍結(jié)固化狀態(tài)的試驗(yàn)材料(例如在約-40℃凍結(jié)保存的試驗(yàn)材料)中除去。通過凍結(jié)干燥處理，可使內(nèi)部均勻地脫去水分，另外由于實(shí)現(xiàn)了高的干燥度，可以在高度保持原本的功能及形態(tài)的狀態(tài)下使其干燥。另外，凍結(jié)干燥處理具有如下等的特征1.處理過程中的劣化少、2.可以容易地進(jìn)行無菌化、3.可得到具有良好復(fù)原性的干燥體、4.可得到具有良好保存性的干燥體。
凍結(jié)干燥處理可以用具備真空室、冷卻·加熱裝置、排氣裝置(冷槽(cold trap)及真空泵)的凍結(jié)干燥機(jī)來進(jìn)行。有很多的凍結(jié)干燥裝置在市售著，在本發(fā)明的步驟(ii)中可以使用從這些裝置中任意選擇的裝置。另外，處理?xiàng)l件可以按照使用的裝置所附的使用說明書來設(shè)定。在設(shè)定時(shí)可以考慮提供的試驗(yàn)材料的大小、干燥度等。例如可以設(shè)定干燥度使得水分活性(AM)小于0.5。
在以上的步驟(ii)后，優(yōu)選實(shí)施以下的步驟(iii)。
(iii)將由步驟(ii)得到的干燥體，以達(dá)到實(shí)質(zhì)上不與氧接觸的狀態(tài)裝入容器的步驟。
如果進(jìn)行這個(gè)步驟(iii)，可得到與氧實(shí)質(zhì)上被隔斷狀態(tài)下被包裝的不含有上皮的羊膜的干燥體。由此成為能夠長(zhǎng)期保存的來自羊膜的醫(yī)用材料。
步驟(iii)，例如在將由步驟(ii)得到的干燥體裝入適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)后，可將容器內(nèi)作成真空，或者通過將容器內(nèi)進(jìn)行氮置換來實(shí)施?；蛘?，還可通過在容器內(nèi)一起封入脫氧劑來實(shí)施。另外，作為容器可使用例如可塑性的合成樹脂制的袋狀或管狀的容器(將兩枚片狀物重合，使周邊部封上的容器亦可)、或是可以使用玻璃等無機(jī)材料制的瓶狀容器等。
本發(fā)明的其他層面涉及由本發(fā)明的第一層面提供的來自羊膜的醫(yī)用材料的利用方法，其中一種實(shí)施方式是角膜上皮樣片的制備方法。在這種實(shí)施方式中，在來自羊膜的醫(yī)用材料上培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞或是具有向角膜上皮細(xì)胞樣細(xì)胞分化的能力的細(xì)胞(以下，將這樣的細(xì)胞統(tǒng)稱“角膜上皮用細(xì)胞”)。角膜上皮細(xì)胞可由適當(dāng)?shù)墓┱叩慕悄ど先〉?。在可以利用的情況下，優(yōu)選的是使用受者自身的角膜上皮細(xì)胞。這是因?yàn)樵谔峁┮浦驳臅r(shí)候可以制作沒有免疫排斥危險(xiǎn)的角膜上皮樣片，由此可以進(jìn)行沒有免疫排斥反應(yīng)的移植手術(shù)。在不能得到受者自身的角膜上皮的時(shí)候或是難以得到的時(shí)候，也可以使用受者以外的角膜上皮細(xì)胞，但此時(shí)優(yōu)選選擇考慮到免疫適合性的供者。
所說的“具有向角膜上皮細(xì)胞樣細(xì)胞分化的能力的細(xì)胞”是指，通過在體外培養(yǎng)或是在移植后在生命體內(nèi)可以構(gòu)建角膜上皮樣細(xì)胞層的細(xì)胞。這里所說的“角膜上皮樣細(xì)胞層”是指，具有為達(dá)到作為角膜上皮的功能所必要的各種性狀(例如，具有高的透明性、最上層的細(xì)胞沒有角化、具有屏障功能等)的細(xì)胞層。
本發(fā)明人等確認(rèn)了口腔粘膜上皮細(xì)胞具有這樣的向角膜上皮樣細(xì)胞分化的能力(參照PCT/JP02/11857)?？紤]在口腔粘膜上皮細(xì)胞中可能存在干細(xì)胞，可以容易地向形成上皮樣細(xì)胞層的細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)。另外，使用口腔粘膜上皮細(xì)胞具有采取容易、可以采取大量的細(xì)胞、進(jìn)而在處置雙眼性的患者的時(shí)候可以用自身的細(xì)胞制備移植材料等的優(yōu)點(diǎn)。特別是，對(duì)于不能采取角膜上皮細(xì)胞的患者來說，可以適用來自自身細(xì)胞的移植材料的優(yōu)點(diǎn)，有望在臨床上很大地消解非常重要的排斥反應(yīng)的問題。
作為口腔粘膜上皮細(xì)胞，可使用存在于牙根部的細(xì)胞(口腔內(nèi)緣粘膜上皮細(xì)胞)、口唇部的細(xì)胞、腭部的細(xì)胞、頰部的細(xì)胞。其中，口腔內(nèi)緣粘膜上皮細(xì)胞因其增殖能力高、且抗原性低，特別優(yōu)選使用它?？谇徽衬ど掀ぜ?xì)胞可用手術(shù)刀等在目的細(xì)胞存在的地方，通過切除、搔扒的方法來采取。對(duì)于口腔內(nèi)緣粘膜上皮細(xì)胞，可以將拔下的牙齒上附著的口腔粘膜上皮從牙釉質(zhì)骨質(zhì)移行部位分離下來，在得到的組織切片上采取。另外，為了去除結(jié)締組織等不純物質(zhì)，優(yōu)選用分散酶或胰蛋白酶等酶進(jìn)行處理及過濾處理。
本發(fā)明所制備的角膜上皮樣片，可以使用從被移植患者以外的口腔中采取的口腔粘膜上皮細(xì)胞，但如果考慮免疫排斥反應(yīng)，優(yōu)選從患者自身的口腔中采取口腔粘膜上皮細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。
角膜上皮用細(xì)胞在本發(fā)明的來自羊膜的醫(yī)用材料上被培養(yǎng)。也就是說，將采取的角膜上皮用細(xì)胞在來自羊膜的醫(yī)用材料上播種，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)。例如可以將角膜上皮用細(xì)胞在來自羊膜的醫(yī)用材料上播種，使得細(xì)胞密度約為1×103個(gè)/cm2或更多，優(yōu)選約1×103個(gè)/cm2～約1×107個(gè)/cm2，更優(yōu)選約1×104個(gè)/cm2～約1×106個(gè)/cm2。
角膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)優(yōu)選是在支持細(xì)胞存在的條件下進(jìn)行。支持細(xì)胞也叫喂養(yǎng)細(xì)胞，在培養(yǎng)液中供給成長(zhǎng)因子等等。通過與支持細(xì)胞共存的條件下培養(yǎng)，可以期待角膜上皮用細(xì)胞增殖效率的提高。支持細(xì)胞例如可以使用3T3細(xì)胞(瑞士鼠3T3細(xì)胞、鼠NIH3T3細(xì)胞、3T3J2細(xì)胞等)等。其中，從增殖效率、容易操作等的角度講，優(yōu)選使用鼠NIH3T3細(xì)胞作支持細(xì)胞。
優(yōu)選預(yù)先用絲裂霉素C將支持細(xì)胞作失活處置。這是為了防止因支持細(xì)胞自身的增殖而阻害角膜上皮用細(xì)胞的增殖，從而提高角膜上皮用細(xì)胞的增殖效率。這樣的失活處置可用輻射線處理等來進(jìn)行。
角膜上皮用細(xì)胞的培養(yǎng)在與支持細(xì)胞共存的條件下進(jìn)行的時(shí)候，優(yōu)選在支持細(xì)胞和膠原層之間設(shè)置支持細(xì)胞不能通過的孔徑的隔離膜。通過利用這個(gè)隔離膜，可以在培養(yǎng)時(shí)防止支持細(xì)胞侵入到來自羊膜的醫(yī)用材料的一側(cè)(即，角膜上皮用細(xì)胞的一側(cè))。其結(jié)果是，最終得到的角膜上皮樣片內(nèi)沒有混入支持細(xì)胞的危險(xiǎn)。這意味著可以制作沒有因支持細(xì)胞所致的免疫排斥反應(yīng)問題的角膜上皮樣片，在臨床上非常有意義。
作為隔離膜，可以適當(dāng)?shù)剡x擇使用具有支持細(xì)胞不能通過的孔徑的公知的隔離膜。例如可以使用聚碳酸酯制的孔徑約0.4μm～3.0μm的膜。隔離膜的材質(zhì)沒有特別的限定，除了聚碳酸酯，還可用聚酯等。這樣的隔離膜有市售的，可以容易地得到。
作為使用隔離膜時(shí)培養(yǎng)方法的例子，可以舉出以下的方法。首先，通過在培養(yǎng)皿等的容器(第1容器)中播種不活化處理過的支持細(xì)胞并培養(yǎng)，在容器的表面上形成支持細(xì)胞層。其次，將用隔離膜形成底面的第2容器設(shè)置在第1容器內(nèi)。此時(shí)，調(diào)整第2容器的位置，使第2容器的底面浸入培養(yǎng)液中。接著，在第2容器的底面，即在隔離膜上載置來自羊膜的醫(yī)用材料。然后，在來自羊膜的醫(yī)用材料上播種角膜上皮用細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。
也可以預(yù)先在第2容器的底面載置來自羊膜的醫(yī)用材料(載置后也可進(jìn)行干燥處理)，將此第2容器設(shè)置在播種了支持細(xì)胞的第1容器內(nèi)，然后在來自羊膜的醫(yī)用材料上播種角膜上皮用細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。
支持細(xì)胞的細(xì)胞密度，例如可以為約1×102個(gè)/cm2或更多，優(yōu)選約1×102個(gè)/cm2～約1×107個(gè)/cm2，更優(yōu)選約1×103個(gè)/cm2～1×105個(gè)/cm2。就與角膜上皮用細(xì)胞數(shù)之間的對(duì)比來說，例如相對(duì)于角膜上皮用細(xì)胞數(shù)，使用的支持細(xì)胞數(shù)在1/103倍～1/10u倍，優(yōu)選是1/102～1倍的條件下可以進(jìn)行培養(yǎng)。如果支持細(xì)胞數(shù)少，角膜上皮用細(xì)胞的增殖率就低，太少的時(shí)候就得不到角膜上皮用細(xì)胞的重層化。另一方面，支持細(xì)胞數(shù)太多的時(shí)候反而使角膜上皮用細(xì)胞的增殖率低下，不適宜。
在培養(yǎng)角膜上皮用細(xì)胞時(shí)所用的培養(yǎng)液，只要是可使該細(xì)胞增殖、重層化的即可，沒有特別的限定。例如，可以使用將通常在上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)中所使用的DMEM(Dulbecco’modified Eagle’s medium)和Ham’s F12培養(yǎng)基(Ham’s F12 medium)按一定比例混合，添加了FBS、生長(zhǎng)因子、抗生素等的培養(yǎng)基。作為具體的例子，可以舉出添加了FBS(10％)、胰島素(5mg/ml)、霍亂毒素(0.1nM))、上皮細(xì)胞增殖因子(EGF)(10ng/ml)以及青霉素—鏈霉素(50IU/ml)的DMEM和Ham’s F12培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基(混合體積比為1∶1)。另外，也可以使用進(jìn)一步添加了三碘甲狀腺氨酸(例如2nM)、谷酰胺(例如4mM)、鐵傳遞蛋白(例如5mg/ml)、腺嘌呤(例如0.18mM)和/或氫化可的松(ハイドロコルチゾン)(例如0.4mg/ml)的DMEM/Ham’s F12的混合培養(yǎng)基。
通過在來自羊膜的醫(yī)用材料上培養(yǎng)角膜上皮用細(xì)胞(步驟(a))，角膜上皮用細(xì)胞在來自羊膜的醫(yī)用材料上增殖、重層化。接著，為了讓形成細(xì)胞層的細(xì)胞分化和誘導(dǎo)屏障功能，進(jìn)行使重層化的細(xì)胞層的表層與空氣接觸的步驟(步驟(b))。此步驟的過程在本說明書中叫作“空氣—上舉”(Air-lifting)。
此步驟(b)，通過用吸液玻璃管、移液管將培養(yǎng)液的一部分一時(shí)性地去除使培養(yǎng)液的表面降低，由此可以使細(xì)胞層的最表層一時(shí)性地暴露在培養(yǎng)液外來實(shí)施。另外，也可以通過將細(xì)胞層和來自羊膜的醫(yī)用材料一起抬高，使最表層從培養(yǎng)液的表面一時(shí)性地暴露來實(shí)施。進(jìn)而，還可以通過用試管等將空氣送入培養(yǎng)液中，使空氣接觸細(xì)胞層的最上層來實(shí)施該步驟。從操作的容易性的角度講，優(yōu)選的是通過使培養(yǎng)液的表面下降，從而使細(xì)胞層的最表層暴露的方法來實(shí)施進(jìn)行步驟(b)的時(shí)間，也就是使重層化的細(xì)胞層的最表層與空氣接觸的時(shí)間，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及培養(yǎng)條件等而變動(dòng)，可例如為3天～3周左右，優(yōu)選的是5天～2周，更優(yōu)選的是約1周。
通過以上本發(fā)明的方法，可以在來自羊膜的醫(yī)用材料上形成來自角膜上皮用細(xì)胞的細(xì)胞重層化而得的細(xì)胞層(角膜上皮樣片)。這種角膜上皮樣片和作為培養(yǎng)基質(zhì)使用的來自羊膜的醫(yī)用材料一起，可以作為對(duì)有角膜損傷、欠損等的患者的移植材料(角膜上皮的替代物)而使用。這種情況下，將來自羊膜的醫(yī)用材料層以成為眼球側(cè)的方式移植到角膜上皮欠損的部位。移植的時(shí)候，優(yōu)選用手術(shù)用的縫合線將移植片與周圍的組織固定，從而促使它的生長(zhǎng)附著。另外，移植后，優(yōu)選用治療用的隱形眼鏡將移植部位的表面一時(shí)性地蓋住來進(jìn)行保護(hù)。
另外，可以將去除了來自羊膜的醫(yī)用材料的一部分，或者去除了全部的片(即只有細(xì)胞層)作為移植片來使用。去除來自羊膜的醫(yī)用材料，可以通過用EDTA等的化學(xué)處理、用蛋白分解酶等的酶處理及用鑷子等的搔扒等的物理處理來進(jìn)行。
通過以上的方法，可制作經(jīng)來自角膜上皮用細(xì)胞的細(xì)胞重層化的角膜上皮樣細(xì)胞層(角膜上皮樣片)。但本方法也可視為提供在來自羊膜的醫(yī)用材料上形成該細(xì)胞層而成的角膜移植用的移植材料(角膜上皮移植用片)。也就是說，本發(fā)明方法可以作為具有這樣構(gòu)造的角膜上皮移植用片的制作方法來使用。
作為角膜上皮用細(xì)胞，在使用口腔粘膜上皮細(xì)胞的時(shí)候，在角膜上皮樣片中，來自口腔粘膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞發(fā)生重層化。來自口腔粘膜上皮的細(xì)胞，在構(gòu)成角膜上皮樣片的細(xì)胞中，可以以發(fā)現(xiàn)口腔粘膜上皮細(xì)胞特異性的角蛋白4或角蛋白13作為指標(biāo)來確認(rèn)。或者，也可以以發(fā)現(xiàn)角蛋白3作為指標(biāo)。這種角蛋白3，被認(rèn)為是角膜特異性的角蛋白之一，但口腔粘膜上皮細(xì)胞中也確認(rèn)發(fā)現(xiàn)了它。另外，從發(fā)現(xiàn)了作為角膜特異性的角蛋白的角蛋白3這一點(diǎn)來看，也可以說優(yōu)選將口腔粘膜上皮細(xì)胞作為制作角膜上皮移植用的組合物的材料來使用。
另一方面，也可以通過檢測(cè)口腔粘膜上皮細(xì)胞特異性的基因表達(dá)，來確認(rèn)形成細(xì)胞層的細(xì)胞是來自口腔粘膜上皮細(xì)胞的。
本發(fā)明所提供的角膜上皮樣片，優(yōu)選的是，具有以下性狀或特性中的幾個(gè)。特別優(yōu)選的是，具備以下的全部的性狀或特性。
(1)最上層的細(xì)胞沒有角化。這是角膜上皮具備的特征之一。通過確認(rèn)此特征，可以期待本發(fā)明的角膜上皮樣片與角膜上皮類似，并發(fā)揮與角膜上皮同樣的功能。另外，所說的角化，別名也可稱為角質(zhì)化，是指在細(xì)胞內(nèi)生出角蛋白，失去細(xì)胞核等的細(xì)胞內(nèi)小器官的現(xiàn)象。細(xì)胞是否發(fā)生角化，例如可以以細(xì)胞的扁平化或有沒有細(xì)胞核作為指標(biāo)來確認(rèn)。
(2)最上層的細(xì)胞為扁平形狀。也就是來自角膜形成用細(xì)胞的細(xì)胞層具有在由略圓柱形的細(xì)胞形成的層上形成有由扁平形狀的細(xì)胞形成的層的構(gòu)造。認(rèn)為扁平形狀的細(xì)胞通過覆蓋最上層來提高細(xì)胞間的氣密性，從而達(dá)到下面的屏障功能。在角膜上皮中，最上層的細(xì)胞也是扁平形狀的。通過確認(rèn)此特征，可以期待本發(fā)明的角膜上皮樣片與角膜上皮類似，并發(fā)揮與角膜上皮同樣的功能。
(3)具有屏障功能。所說的屏障功能，是指防止液體、氣體等在表層的浸潤(rùn)，及防止隔著表層的液體擴(kuò)散的功能。通過具有所說的屏障功能，可以使移植后在其表面保持水分(眼淚)，或是防止過多的水分?jǐn)U散。角膜通過具有屏障功能，可以在其表面保持水分，由此發(fā)揮可以耐受眨眼的功能。因此，具有屏障功能是角膜用移植材料所要求的重要特性之一。通過確認(rèn)此特征，可以期待本發(fā)明的角膜上皮樣片與角膜上皮類似，并發(fā)揮與角膜上皮同樣的功能。是否具有屏障功能，例如可以通過含有辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase)等的標(biāo)記物質(zhì)的溶液的浸潤(rùn)程度來檢測(cè)。
本發(fā)明的來自羊膜的醫(yī)用材料的其他的利用方式涉及角膜內(nèi)皮樣片的制作方法。在這種實(shí)施方式中，通過在來自羊膜的醫(yī)用材料上培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞來構(gòu)建角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞層。具體來說，按照以下的順序進(jìn)行角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的制作。
<1>角膜內(nèi)皮細(xì)胞的采取及增殖角膜內(nèi)皮細(xì)胞可以從受者自身或適當(dāng)?shù)墓┱叩慕悄ど嫌猛ǔ５姆椒ú扇?。例如將角膜組織的德斯米(Descemet)膜和內(nèi)皮細(xì)胞層從角膜的實(shí)質(zhì)上剝離后，移入培養(yǎng)皿中，用分散酶等處理。由此角膜內(nèi)皮細(xì)胞從德斯米膜上脫落。殘存在德斯米膜上的角膜內(nèi)皮細(xì)胞可以用吸管操作(pipetting)等使之脫落。去除德斯米膜后，在可以育成角膜內(nèi)皮細(xì)胞的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液中培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞。作為培養(yǎng)液，可以使用在市售的DMEM(Dulbecco’modified Eagle’s medium)中適當(dāng)添加FBS(胎兒牛血清)、b-FGF(basic-fibloblast growth factor)、EGF(epidermal growth factor)、insulin及青霉素、鏈霉素等的抗生素的培養(yǎng)液。培養(yǎng)容器(培養(yǎng)皿)優(yōu)選使用在其表面覆有I型膠原、IV型膠原、纖連蛋白、昆布氨酸、或牛內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)等的容器。因?yàn)檫@樣可以促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞向培養(yǎng)容器表面的附著，進(jìn)行良好的增殖。
培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)的溫度條件，只要可以育成角膜內(nèi)皮細(xì)胞即可，沒有特別的限定，例如，約25℃～約45℃；考慮到增殖效率，優(yōu)選的是約30℃～約40℃；更優(yōu)選的是約37℃。培養(yǎng)時(shí)間是隨使用細(xì)胞的狀態(tài)而異，可例如為7～14天。
在此，在可以利用的情況下，優(yōu)選使用受者自身的角膜內(nèi)皮細(xì)胞。因?yàn)檫@樣可以制作在提供移植時(shí)沒有免疫排斥反應(yīng)危險(xiǎn)的角膜內(nèi)皮樣片，由此，使不伴有免疫排斥反應(yīng)的移植手術(shù)成為可能。當(dāng)受者自身的角膜內(nèi)皮細(xì)胞不能得到或難以得到時(shí)，也可使用受者以外的角膜內(nèi)皮細(xì)胞，但這時(shí)優(yōu)選考慮免疫適合性來選擇供者。
<2>繼代培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮液的制作用于培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞在增殖后，可進(jìn)行繼代培養(yǎng)。優(yōu)選在亞長(zhǎng)滿狀態(tài)(subconfluent)到長(zhǎng)滿狀態(tài)(confluent)的時(shí)候進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)可按如下進(jìn)行。首先，通過用胰蛋白酶(trypsin)-EDTA等處理將細(xì)胞從培養(yǎng)容器表面剝離，然后回收細(xì)胞。在回收的細(xì)胞中加入培養(yǎng)液即成細(xì)胞懸浮液。優(yōu)選在回收細(xì)胞的時(shí)候，或回收后進(jìn)行離心處理。通過所做的離心處理可以調(diào)制細(xì)胞密度高的細(xì)胞懸浮液。另外，在此的離心處理的條件，可以例舉出500rpm(30g)～1000rpm(70g)、1～10分鐘。
細(xì)胞懸浮液可與上述初期培養(yǎng)同樣地播種在培養(yǎng)容器內(nèi)，提供培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)可以在與上述初期培養(yǎng)同樣的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。培養(yǎng)時(shí)間隨使用細(xì)胞的狀態(tài)而異，可例如7～21天。以上的繼代培養(yǎng)根據(jù)需要可以進(jìn)行多次。通過反復(fù)地進(jìn)行繼代培養(yǎng)，可以增加細(xì)胞數(shù)，還可調(diào)制細(xì)胞密度高的細(xì)胞懸浮液。優(yōu)選調(diào)制出最終具有約5×105細(xì)胞/ml～20×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度的細(xì)胞懸浮液。
<3>細(xì)胞懸浮液的播種、培養(yǎng)將細(xì)胞懸浮液播種在來自羊膜的醫(yī)用材料上，提供培養(yǎng)。此時(shí)，一般來說，為了在最終制作成的角膜內(nèi)皮樣片中形成所希望的細(xì)胞密度的細(xì)胞層，要調(diào)整播種的細(xì)胞數(shù)。具體來說，為了形成細(xì)胞密度為約2000～約4000細(xì)胞/mm2的細(xì)胞層，例如在每1mm2上播種約3000個(gè)～約7500個(gè)，優(yōu)選的是約5000個(gè)～7500個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)可以在與上述初期培養(yǎng)等相同的條件下進(jìn)行。培養(yǎng)時(shí)間隨使用細(xì)胞的狀態(tài)而異，可例如3～21天。
對(duì)于來自羊膜的醫(yī)用材料，優(yōu)選在去除上皮而露出的一面(即基底膜一側(cè))上播種角膜內(nèi)皮細(xì)胞。因?yàn)檎J(rèn)為在這一面富含IV型膠原，可以很好地使播種的角膜內(nèi)皮細(xì)胞接合、增殖。
在來自羊膜的醫(yī)用材料上例如可以進(jìn)行如下的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)。首先，將具有由培養(yǎng)液可以通過的孔徑的膜形成的底面的容器(以下稱為“培養(yǎng)插入容器”)，底面朝下置于培養(yǎng)容器內(nèi)。接著，在培養(yǎng)插入容器的底面上(培養(yǎng)插入容器的內(nèi)側(cè))放置來自羊膜的醫(yī)用材料。在來自羊膜的醫(yī)用材料上播種細(xì)胞懸浮液，進(jìn)行培養(yǎng)。另外，也可以在培養(yǎng)插入容器的底面上預(yù)先放置來自羊膜的醫(yī)用材料。也就是說，例如也可以在培養(yǎng)插入容器的底面上放置來自羊膜的醫(yī)用材料(放置后也可進(jìn)行干燥處理)，將此培養(yǎng)插入容器設(shè)置在培養(yǎng)容器內(nèi)，然后播種細(xì)胞懸浮液，進(jìn)行培養(yǎng)。
培養(yǎng)插入容器的底面上可使用的膜，例如可舉出聚碳酸酯制的、孔徑約0.4μm～3.0μm的膜。此外，還可使用聚酯制的膜等。這樣的膜可以通過市售容易地得到。
在培養(yǎng)插入容器內(nèi)播種細(xì)胞懸浮液后，可以進(jìn)行離心處理。由此，可以提高來自羊膜的醫(yī)用材料上的細(xì)胞密度。另外，細(xì)胞向來自羊膜的醫(yī)用材料的表面上的接合也變好。進(jìn)而，也可得到細(xì)胞密度的偏差變小的效果。另外，在此的離心處理的條件，可以例舉為500rpm(30g)～1000rpm(70g)、1～10分鐘。
通過進(jìn)行以上的培養(yǎng)，可以在來自羊膜的醫(yī)用材料上形成含有來自角膜內(nèi)皮的細(xì)胞的細(xì)胞層所形成的角膜內(nèi)皮樣的片。這種角膜內(nèi)皮樣片可作為對(duì)需要進(jìn)行角膜內(nèi)皮移植的疾病，例如水皰性角膜癥、角膜浮腫、角膜白斑、圓錐角膜的治療的移植材料(替代角膜內(nèi)皮)而使用。另外，還可以將去除了來自羊膜的醫(yī)用材料的一部分的片或全部去除了的片(即只有細(xì)胞層)作為移植片而使用。這種來自羊膜的醫(yī)用材料的去除可以通過用EDTA等的化學(xué)處理、用蛋白分解酶等的酶處理、用鑷子等的搔扒等的物理處理來進(jìn)行。
可以在與支持細(xì)胞共存的條件下進(jìn)行角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)(包括初期培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)及在來自羊膜的醫(yī)用材料上的培養(yǎng))。通過在與支持細(xì)胞共存的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，有望提高角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖效率、得到促進(jìn)分化等的效果。支持細(xì)胞可以使用例如，10T1/2纖維芽細(xì)胞(HyldahlLPrimary cell cultures from human embryonic corneas.J Cell Sci.66343-351，1984)、3T3細(xì)胞(瑞士鼠3T3細(xì)胞、鼠NIH3T3細(xì)胞、3T3J2細(xì)胞等)、角膜實(shí)質(zhì)細(xì)胞等。
在與支持細(xì)胞共存的條件下進(jìn)行角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選在角膜內(nèi)皮細(xì)胞和支持細(xì)胞之間用支持細(xì)胞不能通過的隔離膜隔開。通過利用此隔離膜，可防止在培養(yǎng)時(shí)支持細(xì)胞侵入到角膜內(nèi)皮細(xì)胞一側(cè)。其結(jié)果是，不存在支持細(xì)胞混雜在最終得到的角膜內(nèi)皮樣片內(nèi)的危險(xiǎn)。這樣，就意味著可以制作出不會(huì)因支持細(xì)胞而發(fā)生免疫排斥問題的角膜內(nèi)皮樣片，在臨床上非常有意義。
在使用支持細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選預(yù)先用絲裂霉素C等對(duì)支持細(xì)胞進(jìn)行失活處置。這是為了防止由于支持細(xì)胞自身的增殖而阻害角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。這樣的失活處理可用放射線處理等來進(jìn)行。
作為隔離膜，可采用與上述在培養(yǎng)插入容器中使用的膜同樣的物質(zhì)。也就是說，可使用例如由聚碳酸酯、聚酯等形成的孔徑約0.4μm～3.0μm的膜。
支持細(xì)胞的細(xì)胞密度可以是例如，約1×102個(gè)/cm2或更多，優(yōu)選是1×102個(gè)/cm2～約1×107個(gè)/cm2，更優(yōu)選是1×103個(gè)/cm2～約1×105個(gè)/cm2。認(rèn)為如果支持細(xì)胞數(shù)少，角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖率就低，不優(yōu)選。另一方面，如果支持細(xì)胞數(shù)過多，反而會(huì)使角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖率變低，不優(yōu)選。
將用以上的方法制作的角膜內(nèi)皮樣片進(jìn)行移植的方法，可以例示出全層環(huán)鋸法和深層角膜切除法。前者的方法是用環(huán)鋸先將角膜全層取下，用本發(fā)明的角膜內(nèi)皮樣片置換角膜內(nèi)皮細(xì)胞層后，再將它復(fù)位到受者，具體來說，可按以下進(jìn)行。首先用環(huán)鋸將受者(主體)的角膜全層切開，將角膜的一部分(或全部)以按鈕狀取下。接著，從取下的角膜片上剝離德斯米膜及角膜內(nèi)皮細(xì)胞層。使本發(fā)明的角膜內(nèi)皮樣片接合附著在暴露出的角膜實(shí)質(zhì)上。此時(shí)，將來自羊膜的醫(yī)用材料置于實(shí)質(zhì)側(cè)。然后將角膜片復(fù)位到受者，用縫合線固定。
另外，深層角膜切除法不是將角膜全層摘出，而是只將角膜深層的部分切除，被認(rèn)為是對(duì)受者負(fù)擔(dān)較小的方法。具體來說，可以按如下進(jìn)行。首先，將受者的角膜實(shí)質(zhì)的一部分剝離，將角膜實(shí)質(zhì)深層的一部分和德斯米膜及內(nèi)皮細(xì)胞層的一部分切除。另外，也可以只將內(nèi)皮細(xì)胞層，或只將內(nèi)皮細(xì)胞層及德斯米膜剝離切除。也可以只將受損的受者角膜內(nèi)皮細(xì)胞剝離。接著，用刮勺等將本發(fā)明的角膜內(nèi)皮樣片插入到切除部。根據(jù)需要，在前房?jī)?nèi)注入空氣，將移植片固定。
另外，移植的角膜內(nèi)皮樣片對(duì)生命體來說，是否與角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞層同樣地發(fā)揮屏障功能、泵功能，可以通過例如檢查移植后角膜厚度的變化、浮腫的發(fā)生來確認(rèn)。
以下，用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
<實(shí)施例1>羊膜的采取對(duì)沒有全身合并癥的打算做剖腹產(chǎn)的孕婦，事先和婦科醫(yī)生一起征得其同意(informed consent)之后，在手術(shù)室做剖腹產(chǎn)時(shí)采取羊膜。操作要注意清潔，按手術(shù)操作標(biāo)準(zhǔn)洗手后穿上專用服裝。在分娩前準(zhǔn)備好采取羊膜用的清潔平接器和洗凈用的生理鹽水。分娩后，將胎盤組織移到平接器上，用手將羊膜組織從胎盤上剝離。羊膜與胎盤愈合強(qiáng)的部分用剪刀切除。
<實(shí)施例2>羊膜的處理羊膜的處理過程按(1)洗凈、(2)修整、(3)保存的順序進(jìn)行。對(duì)于全部的過程，操作優(yōu)選在清潔的通風(fēng)裝置內(nèi)進(jìn)行，使用的容器和器具也都要使用經(jīng)滅菌處理的，培養(yǎng)皿等使用滅菌的一次性(disposable)的用品。采取的羊膜上附著的血液成分，用生理鹽水邊洗凈邊去除，進(jìn)一步用充足的生理鹽水(添加0.005％的loxacin)洗凈。接著，用添加了青霉素—鏈霉素(50IU)的磷酸緩沖液(PBS)共計(jì)洗凈3次。接著，將羊膜移到培養(yǎng)皿內(nèi)，用剪刀分割成約4×3cm左右的大小。分割后，以形狀及厚度等為基準(zhǔn)，選出狀態(tài)好的羊膜。
<實(shí)施例3>羊膜的保存在2cc的滅菌冷凍保存管中各加入1cc的保存液，向其中將采取、洗凈、選出后的羊膜各加入一枚，標(biāo)記好后，放入-80℃的低溫冷藏柜中保存。保存液是使用在DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle MediumGIBCOBRL公司)中加入50％的滅菌后的甘油。保存的羊膜的使用期限是3個(gè)月，超過期限就焚燒處置。另外，不進(jìn)行這樣的保存處理，實(shí)施以下的上皮處理亦可。
<實(shí)施例4>羊膜上皮的處理將-80℃下保存的羊膜在室溫下解凍后，用添加了青霉素一鏈霉素(50IU)的磷酸緩沖液(PBS)洗凈2次。將洗凈后的羊膜浸入0.02％EDTA溶液(Nacalaitesque公司)中(100mm的培養(yǎng)皿)，放入CO2孵育箱中，37℃下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后，用足夠量的PBS洗凈羊膜2次，在實(shí)體顯微鏡下，用cell scraper(Nunc公司USA)像用手似的搔扒(去除)上皮。另外，用這種處理方法是否將一層的羊膜上皮完全地搔扒除去，可用光學(xué)及電子顯微鏡的操作(掃描型電子顯微鏡)來確認(rèn)(圖1)。另外，圖1是用掃描型電子顯微鏡觀察的羊膜像。A是正常的狀態(tài)(沒有進(jìn)行上皮處理的狀態(tài))的羊膜表面的像；B是進(jìn)行上皮搔扒處理(0.02％EDTA溶液)后的羊膜表面的像。
<實(shí)施例5>凍結(jié)干燥羊膜的制作用一組經(jīng)滅菌后的塑料架將去除上皮的羊膜夾持后，用夾子固定。將每個(gè)架子移入-80℃的低溫保藏箱內(nèi)，確認(rèn)羊膜凍結(jié)后，用真空凍結(jié)干燥機(jī)(Yamato，NEOCOOL)進(jìn)行凍結(jié)干燥處理(-110℃，約1小時(shí))。按照使用說明書，設(shè)定能得到充分干燥物的條件。將凍結(jié)干燥后的羊膜從架子上取下，移入具有外側(cè)是聚酰胺尼龍、內(nèi)側(cè)是聚乙烯的雙層構(gòu)造的袋子中，用家庭用真空打包器(フレ一ムノバ、マジツクパツク)進(jìn)行真空包裝。對(duì)這樣得到的真空包狀態(tài)的羊膜照射γ線(約25kGy)滅菌。將滅菌處理后的羊膜以真空包的狀態(tài)在常溫下保存到即將使用時(shí)。另外，從保存開始經(jīng)過12個(gè)月的時(shí)候，也可維持剛剛凍結(jié)干燥后的狀態(tài)。以下的試驗(yàn)是使用在常溫下保持一個(gè)月的干燥羊膜而進(jìn)行的。
<實(shí)施例6>凍結(jié)干燥羊膜的表面分析對(duì)于由實(shí)施例5得到的干燥羊膜，為了確認(rèn)在去除上皮一側(cè)的表面上殘存有基底膜，并保持該構(gòu)造，按以下的程序進(jìn)行免疫學(xué)分析。首先，將干燥的羊膜浸入PBS液中復(fù)原，以適宜的大小切下來，凍結(jié)包埋在OCTcompound中。然后在低溫恒溫器中薄薄地切，制作滑切片。將滑切片用PBS洗凈后，用1％胎兒牛血清做阻遏(blocking)，抑制非特異的抗體反應(yīng)。然后，與一次抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。一次抗體中，使用分別與膠原I～V和VII、接觸蛋白、纖連蛋白及昆布氨酸5對(duì)應(yīng)的特異性結(jié)合抗體(COSMOBIO公司制)。反應(yīng)完成后，用含有triton-X的PBS液洗15分鐘，洗3次，接著與用熒光標(biāo)記的抗體(2次抗體)在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。接著，用PBS洗15分鐘，洗3次，封入后用共焦顯微鏡來觀察組織。作為對(duì)照組，準(zhǔn)備采取后只進(jìn)行洗凈的試樣(AM(+))、去除上皮而沒有進(jìn)行凍結(jié)干燥處理的試樣(AM(-))、用分散酶處理(37℃、1小時(shí))來去除上皮而沒進(jìn)行干燥處理的試樣(AM(-)dispase)、去除上皮并進(jìn)行凍結(jié)干燥處理而沒進(jìn)行滅菌處理的試樣(AM(-)FD)、去除上皮后不做凍結(jié)干燥處理而進(jìn)行滅菌處理的試樣(AM(-)γray)，各試樣按上述同樣的方法進(jìn)行1次抗體反應(yīng)及2次抗體反應(yīng)?？偨Y(jié)了免疫學(xué)分析結(jié)果的表在圖2中示出。表中“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。另外，在實(shí)施例5的方法中得到的干燥羊膜(去除上皮、進(jìn)行凍結(jié)干燥處理及滅菌處理的羊膜)用AM(-)FDγray來表示。
如表所示，去除了上皮的試樣(AM(-))上檢測(cè)出基底膜的特征性成分膠原IV(α2及α5)、膠原V、膠原VII及昆布氨酸5。另外，上皮處理后進(jìn)行凍結(jié)干燥處理的試樣(AM(-)FD)及進(jìn)一步做滅菌處理的試樣(AM(-)FDγray)也同樣地檢測(cè)出這些成分。由此結(jié)果可知，采用實(shí)施例4的方法來做去除上皮的處理，可以在使基底膜殘存的狀態(tài)下去除上皮。另外，可知去除上皮后即使進(jìn)行凍結(jié)干燥處理也可維持基底膜殘存的狀態(tài)，進(jìn)一步做滅菌處理可使殘存的基底膜幾乎不受損傷。另一方面，用分散酶來去除上皮的試樣(AM(-)dispase)中，沒有檢測(cè)到這些基底膜的特征性成分。這表明用分散酶處理后基底膜被破壞了。
通過以上的分析結(jié)果可確認(rèn)，用上述方法調(diào)制的干燥羊膜具有保持了原來構(gòu)造的基底膜。
<實(shí)施例7>角膜上皮細(xì)胞的回收將從6周齡的日本白色家兔上采取的角膜浸入含有10％胎兒牛血清(FBS)的DMEM中，切除結(jié)膜、角膜內(nèi)皮等不需要的組織。然后，將組織在磷酸緩沖液(PBS)中洗凈，在含有1.2U/ml分散酶(Nacalai tesque公司)的磷酸緩沖液(PBS)中在37℃下浸漬1小時(shí)。取出處理后的組織，室溫下浸漬于0.02％EDTA中2分鐘，接著在室溫下浸漬于磷酸緩沖液中2分鐘使分散酶的活性終止。在含有10％胎兒牛血清(FBS)的DMEM中搔扒角膜上皮細(xì)胞后，通過離心處理濃縮、回收角膜上皮細(xì)胞。
<實(shí)施例8>共培養(yǎng)細(xì)胞的調(diào)制作為共培養(yǎng)細(xì)胞(支持細(xì)胞)，使用NIH-3T3細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱“3T3細(xì)胞”)。將事先在75F培養(yǎng)皿中(BD Falcon公司)培養(yǎng)并長(zhǎng)滿了的3T3細(xì)胞浸漬于0.05％絲裂霉素C的溶液中2小時(shí)，抑制3T3的增殖活性。接著在磷酸緩沖液(PBS)中洗凈數(shù)次來去除絲裂霉素C。將細(xì)胞在0.05％胰蛋白酶—EDTA溶液中處理后，用吸管操作(pippeting)制成細(xì)胞懸濁液(3T3細(xì)胞懸濁液)。
<實(shí)施例9>角膜上皮樣片的形成將由實(shí)施例5得到的凍結(jié)干燥羊膜在室溫下浸漬于PBS中直到充分復(fù)原。這樣調(diào)制的羊膜作為基質(zhì)，按以下的順序培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞和3T3細(xì)胞。作為培養(yǎng)器具，使用6孔的培養(yǎng)皿(culture dish)(Corning公司，NY)和培養(yǎng)插入容器(culture insert)(聚碳酸酯制的平均孔徑為0.3μm，Corning公司，NY)。
首先，在培養(yǎng)皿上以達(dá)到約1×104個(gè)/cm2的細(xì)胞密度的方式來播種3T3細(xì)胞懸濁液，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。另外，在培養(yǎng)插入容器上將基底膜一側(cè)(存在有上皮的一側(cè))向上粘貼羊膜，將它在室溫下干燥10分鐘。然后，在粘貼了羊膜的培養(yǎng)插入容器上以達(dá)到約1×105個(gè)/cm2的細(xì)胞密度的方式來播種角膜上皮細(xì)胞懸濁液。
進(jìn)行以上的操作后，如圖3所示將培養(yǎng)插入容器設(shè)置于培養(yǎng)皿內(nèi)，將3T3細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞在相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。另外，圖3為顯示培養(yǎng)中的狀態(tài)的模式斷面圖。在培養(yǎng)皿1中靜置培養(yǎng)插入容器2，在培養(yǎng)皿1的底面上形成3T3細(xì)胞層5。另外，在培養(yǎng)插入容器2的底面上靜置羊膜3，在其上顯示出角膜上皮細(xì)胞被培養(yǎng)的狀態(tài)。符號(hào)6是培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基是使用在DMEM/Ham’s F12混合培養(yǎng)基中(混合體積比1∶1)，添加了10％FBS、胰島素(5mg/ml)、霍亂毒素(0.1nM)、青霉素鏈霉素(50IU/ml)、人重組上皮細(xì)胞增殖因子(EGF)(10ng/ml)的培養(yǎng)基。
在上述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周(Submerge)。然后，為了進(jìn)行粘膜上皮的分化誘導(dǎo)，用所謂的Air-lifting法培養(yǎng)一周。所謂的Air-lifting法，是將培養(yǎng)基的液面置到在羊膜上形成的來白角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞層的表面，使該細(xì)胞層的表面暴露于空氣中的方法。Submerge過程中隔日更換培養(yǎng)基，air-lifting后每日更換培養(yǎng)基來培養(yǎng)。
<實(shí)施例10>驗(yàn)證角膜上皮樣片的組織學(xué)特征用以上的方法培養(yǎng)的結(jié)果是，從培養(yǎng)開始經(jīng)過約20天的時(shí)候，會(huì)形成類似角膜上皮的細(xì)胞層(圖4)。在細(xì)胞層中，可知與正常角膜上皮同樣地有4～5層細(xì)胞重層化了。在此細(xì)胞層的羊膜側(cè)存在著相對(duì)為圓柱形的類似基底細(xì)胞的細(xì)胞群。另外，最表層的細(xì)胞呈扁平型，但有核、與皮膚不同其表面沒有角化。這樣，可以確認(rèn)在羊膜上形成了類似角膜上皮的細(xì)胞層(角膜上皮樣層)。
使用以上的方法制作的、在羊膜上形成角膜上皮樣細(xì)胞層的移植用片(以下稱為“角膜上皮移植用片”)來進(jìn)行移植試驗(yàn)。
<實(shí)施例11>移植實(shí)驗(yàn)首先，對(duì)采取了角膜上皮細(xì)胞的白色家兔，用月牙刀從距離其輪部4mm的外側(cè)全部去除100μm厚的角膜及結(jié)膜上皮。通過此操作，使含有角膜上皮干細(xì)胞的上皮細(xì)胞不存在，從而可以認(rèn)為人為的眼表面干細(xì)胞疲勞癥得到再現(xiàn)。另外，觀察了移植前的眼表面(圖5上圖)。
接著，將角膜上皮移植用片移植到距離輪部稍微內(nèi)側(cè)的區(qū)域。移植時(shí)用10-0尼龍線與周圍的組織縫合。移植后，在移植片上縫上治療用的隱形眼鏡。手術(shù)后，2次/日涂擦抗生劑及類固醇眼軟膏。移植后的時(shí)刻，眼表面顯示出與移植前的角膜上皮移植用片同樣的透明性。
在移植后經(jīng)過2日及移植后經(jīng)過7日的時(shí)候，觀察實(shí)施了移植術(shù)的眼表面。在移植后經(jīng)過2日的時(shí)候，被移植的角膜上皮移植用片保持著透明性，另外，用熒光素染色確認(rèn)了其在眼表面上沒有缺損地殘存著(圖5下圖)。另外，移植片沒有顯示出熒光素染色性，因此確認(rèn)了角膜上皮移植用片具有與角膜上皮同樣的屏障功能。進(jìn)而，用熒光素染色，在移植片的整個(gè)周圍看到了熒光素的染色性，因此確認(rèn)在移植部位存在的組織并不是周圍殘存的結(jié)膜上皮的污染物。另外，角膜上皮的細(xì)胞之間是通過緊密接合的構(gòu)造來結(jié)合的，所以其表面沒有熒光素色素的浸潤(rùn)，不顯示熒光素染色的染色性。另一方面，在細(xì)胞間的接合變緩和、細(xì)胞自身剝離、屏障功能受損的時(shí)候，發(fā)生熒光素色素的浸潤(rùn)、將組織染色。因此，通過檢測(cè)熒光素染色的染色性，可以確認(rèn)移植的角膜上皮移植用片是否具有與角膜上皮同樣的屏障功能。
在移植后經(jīng)過7日的時(shí)候，確認(rèn)了移植的角膜上皮移植用片殘存在眼表面上，而且與移植后經(jīng)過2天的時(shí)候的狀態(tài)比較其向周圍伸展，被覆于眼表面的全部(圖6下圖)。另外，如圖6所示移植片不顯示熒光素染色性，確認(rèn)了維持著角膜上皮所必要的屏障功能。另外，也維持著透明性(圖6上圖)。
以上結(jié)果表明，用干燥羊膜制作的角膜上皮移植用片在眼表面生長(zhǎng)、伸展，術(shù)后經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間后維持著透明性。也就是說，確認(rèn)了用上述方法制作的角膜上皮移植用片含有作為角膜上皮的代替品而發(fā)揮良好功能的細(xì)胞層，可以作為在角膜損傷、缺損的時(shí)候用于再建眼表面的移植材料而適宜地利用。
<實(shí)施例12>用口腔粘膜上皮制作角膜上皮樣片將在供者拔下的牙上附著的口腔粘膜上皮從牙釉質(zhì)骨質(zhì)的移行部位上分離。另外，這一系列的操作，優(yōu)選使用經(jīng)過滅菌的器具，盡量進(jìn)行滅菌。
將取下的口腔粘膜上皮用含有50IU/ml的青霉素鏈霉素、硫酸慶大霉素的磷酸緩沖液(PBS)在室溫的條件下浸漬30分鐘，進(jìn)行2次。然后，在37℃的條件下將組織浸漬于含有1.2U分散酶(Nacalai tesque公司)的磷酸緩沖液(PBS)中1小時(shí)，接著浸漬于0.05％胰蛋白酶—EDTA溶液(GIBCOBRL公司)中30分鐘，浸漬處理后分離細(xì)胞。通過將其浸漬于含有10％胎兒牛血清(FBS)的DMEM中使酶的活性終止。然后，用60μm的細(xì)胞濾器去除多余的組織，單獨(dú)分離出口腔粘膜上皮細(xì)胞(口腔內(nèi)緣粘膜上皮細(xì)胞)。使用這樣得到的口腔粘膜上皮細(xì)胞，用與實(shí)施例8及9所示的同樣的方法，使其形成角膜上皮樣細(xì)胞層。
<實(shí)施例13>角膜內(nèi)皮樣片的制作(13-1)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的采取、初期培養(yǎng)從供者的角膜組織中用鑷子將德斯米膜和內(nèi)皮細(xì)胞層從實(shí)質(zhì)剝離后，置于35mm的培養(yǎng)皿中，用在不含鈣的PBS中稀釋2倍而得的分散酶(dispase)1ml(最終濃度為1.2U/ml)，在37℃、5％CO2的條件下處理60分鐘。通過該處理，角膜內(nèi)皮細(xì)胞的大多數(shù)從德斯米膜上脫落。為使在德斯米膜上殘存的角膜內(nèi)皮細(xì)胞脫落，進(jìn)行吸管操作(pipetting)處理。接著，去除德斯米膜，將角膜內(nèi)皮細(xì)胞移入15cc的離心管中。加入培養(yǎng)液使全部液量為5ml后，在1000rpm、70g、3分鐘的條件下離心。培養(yǎng)液可以使用在DMEM(GIBCOBRL公司制)中添加10％FBS(大日本制藥株式會(huì)社制)、b-FGF(Invitrogen公司制)2ng/ml、青霉素(50U/ml)—鏈霉素(50μg/ml)(Nacalai公司制)的培養(yǎng)液。去除上清液后，加入培養(yǎng)液制成約1ml的細(xì)胞懸浮液。將該細(xì)胞懸浮液播種于覆有IV型膠原的24孔培養(yǎng)皿中，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。以后，每48小時(shí)交換培養(yǎng)液。
(13-2)內(nèi)皮細(xì)胞的繼代培養(yǎng)在培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)滿(confluent)的時(shí)候去除培養(yǎng)液，用不含有鈣的PBS1ml洗凈細(xì)胞3次。洗凈后加入0.05％胰蛋白酶(trypsin)—EDTA200μl，在37℃、5％CO2的條件下靜置3分鐘。通過此處理，附著于培養(yǎng)皿底部的內(nèi)皮細(xì)胞懸浮起來。加入培養(yǎng)液5ml后，將細(xì)胞懸浮液移入15cc離心管中，在1000rpm、70g、3分鐘的條件下做離心處理。去除上清液后，加入培養(yǎng)液成約2ml的細(xì)胞懸浮液。將該細(xì)胞懸浮液播種于覆有IV型膠原的35mm的培養(yǎng)皿中，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。以后，每48小時(shí)交換培養(yǎng)液。在細(xì)胞達(dá)到長(zhǎng)滿狀態(tài)時(shí)，進(jìn)行與上述相同的操作，反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)直到得到需要的細(xì)胞數(shù)。
(13-3)角膜內(nèi)皮樣片的制作將繼代培養(yǎng)的細(xì)胞用0.05％胰蛋白酶—EDTA處理后，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。在接下來離心處理去除上清液后，以使細(xì)胞密度為約2.0×106個(gè)/ml的方式來添加培養(yǎng)液。使用得到的細(xì)胞懸浮液，按以下的順序制作角膜內(nèi)皮細(xì)胞層。作為培養(yǎng)器具，可以使用6孔培養(yǎng)皿(Corning公司制、NY)和培養(yǎng)插入容器(culture insert聚碳酸酯制、平均孔徑為3.0μm、Corning公司制、NY)。培養(yǎng)液可以使用與上述使用相同的培養(yǎng)液。
首先，在培養(yǎng)皿內(nèi)留置培養(yǎng)插入容器。接著用PBS將由實(shí)施例5得到的干燥羊膜復(fù)原，將復(fù)原后的羊膜敷于培養(yǎng)插入容器內(nèi)(底面上)，將上皮存在的一側(cè)向上，使之伸展。接著，在羊膜上以5000個(gè)/mm2的方式播種細(xì)胞懸浮液。然后，將培養(yǎng)皿在1000rpm、70g、3分鐘的條件下離心。離心后，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。由此，構(gòu)建單層的細(xì)胞層。
本發(fā)明并不限定于上述發(fā)明的實(shí)施形態(tài)及實(shí)施例的說明。只要不超越權(quán)利要求所記載的范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員能想到的范圍的各種變形方式也包含在本發(fā)明中。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性通過本發(fā)明，可以提供操作容易且能充分耐受必要的滅菌處理的來自羊膜的醫(yī)用材料。本發(fā)明的醫(yī)用材料由于上皮被去除了，免疫原性變得非常低；同時(shí)，由于基底膜高度維持了原來的構(gòu)造、至少有一部分殘存下來，作為用于構(gòu)建細(xì)胞層的基材發(fā)揮良好的功能。
權(quán)利要求
1.具備以下的性狀(1)～(3)的來自羊膜的醫(yī)用材料(1)是干燥狀態(tài)；(2)不具有上皮層；(3)具有在使用時(shí)在其上保持著細(xì)胞可接合及增殖的構(gòu)造的基底膜。
2.權(quán)利要求1所述的來自羊膜的醫(yī)用材料，其特征為，進(jìn)一步具備以下的性狀(4)(4)在與氧沒有實(shí)質(zhì)地接觸的狀態(tài)下，被裝入容器中。
3.權(quán)利要求1或2中所述的來自羊膜的醫(yī)用材料，其中上述與氧沒有實(shí)質(zhì)地接觸的狀態(tài)是將容器內(nèi)作成真空或是用氮置換的狀態(tài)。
4.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的來自羊膜的醫(yī)用材料，其中上述細(xì)胞是角膜上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞或口腔粘膜上皮細(xì)胞。
5.來自羊膜的醫(yī)用材料的制作方法，包括以下的步驟(i)和(ii)(i)殘留基底膜的至少一部分，從羊膜上去除上皮層的步驟；(ii)在殘存的基底膜使用時(shí)在其上保持著細(xì)胞可接合及增殖的構(gòu)造的條件下，使由步驟(i)得到的不含有上皮的羊膜干燥的步驟。
6.權(quán)利要求5所述的來自羊膜的醫(yī)用材料的制作方法，其中上述步驟(ii)是通過凍結(jié)干燥處理來實(shí)施的。
7.權(quán)利要求5或6所述的來自羊膜的醫(yī)用材料的制作方法，其中進(jìn)一步包括以下的步驟(iii)(iii)將由步驟(ii)得到的干燥體，在使之與氧沒有實(shí)質(zhì)地接觸的狀態(tài)下，裝入容器中的步驟。
8.權(quán)利要求7所述的來自羊膜的醫(yī)用材料的制作方法，其中上述與氧沒有實(shí)質(zhì)地接觸的狀態(tài)是將容器內(nèi)作成真空或是用氮置換的狀態(tài)。
9.角膜上皮樣片的制作方法，包括以下的步驟在權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的醫(yī)用材料上培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞的步驟。
10.角膜上皮樣片的制作方法，包括以下的步驟(a)及(b)(a)在權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的醫(yī)用材料上培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞或是具有向角膜上皮樣細(xì)胞分化的能力的細(xì)胞的步驟；(b)在上述細(xì)胞增殖、重層化后，使最表層與空氣接觸的步驟。
11.權(quán)利要求10所述的角膜上皮樣片的制作方法，其中上述步驟(a)是在支持細(xì)胞的共存下實(shí)施的。
12.權(quán)利要求10所述的角膜上皮樣片的制作方法，其中上述步驟(a)是在支持細(xì)胞的共存下、并且在該支持細(xì)胞和上述醫(yī)用材料之間存在該支持細(xì)胞不能通過的孔徑的隔離膜的狀態(tài)下實(shí)施的。
13.權(quán)利要求10～12中任一項(xiàng)所述的角膜上皮樣片的制作方法，其中在上述步驟(a)中培養(yǎng)的細(xì)胞是口腔粘膜上皮細(xì)胞。
14.角膜內(nèi)皮樣片的制作方法，包括以下的步驟(A)～(C)(A)培養(yǎng)采取的角膜內(nèi)皮細(xì)胞，使之增殖的步驟；(B)將增殖的角膜內(nèi)皮細(xì)胞回收，制作細(xì)胞懸浮液的步驟；(C)將上述細(xì)胞懸浮液在權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的醫(yī)用材料上播種、培養(yǎng)的步驟。
15.權(quán)利要求14所述的角膜內(nèi)皮樣片的制作方法，其中在上述步驟(B)之后實(shí)施以下的步驟(B-1)(B-1)通過離心處理，提高上述細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞密度的步驟。
16.權(quán)利要求14或15所述的角膜內(nèi)皮樣片的制作方法，其特征為，在上述步驟(C)中，播種細(xì)胞懸浮液后作離心處理。
17.權(quán)利要求14或15所述的角膜內(nèi)皮樣片的制作方法，其中上述步驟(C)包括以下的步驟(C-1)～(C-5)(C-1)在培養(yǎng)容器內(nèi)，留置具有由培養(yǎng)液可以通過的孔徑的膜形成的底面的容器的步驟；(C-2)在上述容器的上述底面上，載置權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的醫(yī)用材料的步驟；(C-3)將上述細(xì)胞懸浮液播種在上述醫(yī)用材料上的步驟；(C-4)離心處理的步驟；(C-5)培養(yǎng)的步驟。
全文摘要
提供操作容易、可進(jìn)行充分的滅菌處理、以及作為基材用于在其上構(gòu)建細(xì)胞層的發(fā)揮良好功能的來自羊膜的醫(yī)用材料。(i)殘留基底膜的至少一部分，從羊膜上去除上皮層，然后(ii)在殘存的基底膜使用時(shí)在其上保持著細(xì)胞可接合及增殖的構(gòu)造的條件下，使其干燥。
文檔編號(hào)A61L15/00GK1753697SQ20048000485
公開日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2004年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月26日
發(fā)明者木下茂, 中村隆宏 申請(qǐng)人:阿姆尼奧泰克股份有限公司, 木下茂