專利名稱：含有l(wèi)k8蛋白作為活性成分的抗癌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含某蛋白作為活性成分的抗癌劑，更明確地，涉及一種抗癌劑，該藥劑含一種與載脂蛋白(a)的半胱氨酸卷曲區(qū)(kringle)KV38相對(duì)應(yīng)的蛋白作為活性成分。
背景腫瘤由失控的混亂的異常的細(xì)胞增殖發(fā)展而成。如果腫瘤顯示出破壞性的生長(zhǎng)、入侵和轉(zhuǎn)移，則被認(rèn)為是惡性腫瘤。入侵性是一種浸潤(rùn)或破壞周圍組織的特性，尤其，形成組織邊界的基底層被這種特性破壞，導(dǎo)致局部擴(kuò)散及有時(shí)腫瘤通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)流入。轉(zhuǎn)移指腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶通過(guò)淋巴管或血管向其它區(qū)域的擴(kuò)散。廣義上講，轉(zhuǎn)移性也指腫瘤細(xì)胞通過(guò)腹腔或其它空間直接擴(kuò)散。
迄今為止，外科手術(shù)、放射性治療和化學(xué)治療已單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于癌癥治療。外科手術(shù)是除去患病組織的一種方法。這樣，特定區(qū)域內(nèi)的腫瘤，如乳房、結(jié)腸和皮膚，可由外科手術(shù)有效去除。然而，脊椎內(nèi)的腫瘤或分散性腫瘤如白血病則不能通過(guò)外科手術(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委煛?br> 化學(xué)治療阻斷了細(xì)胞復(fù)制或代謝，并已被應(yīng)用于乳腺癌、肺癌和睪丸癌的治療。然而，接受化學(xué)治療的癌癥患者嚴(yán)重遭受了全身化療的副作用的痛苦。其中普遍但嚴(yán)重的例子是暈動(dòng)病和嘔吐?；瘜W(xué)治療的副作用甚至?xí)绊懟颊叩纳?，因?yàn)檫@些副作用可能使患者的適應(yīng)性迅速降低。另外，劑量限制毒性(DLT)也是化學(xué)治療的一個(gè)主要副作用，它引起了對(duì)藥品服用的仔細(xì)的關(guān)注。粘膜炎就是針對(duì)抗癌藥的DLT的一個(gè)例子，這些抗癌藥如抗代謝細(xì)胞毒劑5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、以及抗癌抗生素如多柔比星等。如果患者受化療副作用影響嚴(yán)重，他或她應(yīng)該住院并被施以鎮(zhèn)痛劑以減輕痛苦。所以，化學(xué)治療或放射性治療的副作用是癌癥患者治療中的最大問(wèn)題。
因此，急需開發(fā)一種源于生物體內(nèi)的抗癌劑以減輕化學(xué)治療的副作用。特別地，在一種生物體內(nèi)產(chǎn)生的物質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)了一種有希望的物質(zhì)，它不直接攻擊癌癥細(xì)胞，但通過(guò)對(duì)眾多輔助癌細(xì)胞生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生作用而阻止癌細(xì)胞生長(zhǎng)。所以，含此物質(zhì)的抗癌劑不僅可以治療癌癥還可以阻止轉(zhuǎn)移。
Kringle是一種包含80個(gè)氨基酸和三個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的蛋白結(jié)構(gòu)。Kringle結(jié)構(gòu)在許多蛋白中都有發(fā)現(xiàn)，如凝血酶原(Walz，D.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，741069-1073，1977)、尿激酶(Pennica，D.等，Nature，301579-582，1983)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Lukker，N.A.等，Protein Eng.，7895-903，1994)和載脂蛋白(a)(下文中稱為’apo(a)’)(McLean，J.W.等，Nature，330132-137，1987)。Kringle包含一個(gè)單獨(dú)的折疊單元。Kringle的功能尚未完被清楚闡明。
Apo(a)包含兩種kringle域，KIV和KV，和一個(gè)無(wú)活性的蛋白酶樣區(qū)域。Kringle域KIV根據(jù)氨基酸同源性分為10個(gè)亞型(KIV-1～KIV-10)，15～40個(gè)拷貝數(shù)的該域發(fā)現(xiàn)于許多人apo(a)基因的等位基因中。Apo(a)通過(guò)與apo B-100共價(jià)結(jié)合形成一種脂蛋白(a)(下文中稱為’Lp(a)’)，apo B-100是低密度脂蛋白(LDL)的一種主要蛋白成分(Fless，G.M.，J，Biol.Chem.，2618712-8717，1986)。細(xì)胞質(zhì)中Lp(a)的增加本身就是動(dòng)脈粥樣硬化的主要風(fēng)險(xiǎn)因子(Armstrong，V.W.et al.，Artherosclerosis，62249-257，1986；Assmann，G，Am.J.Cardiol.，771179-1184，1996)。
基于動(dòng)脈粥樣硬化和癌細(xì)胞生長(zhǎng)依賴于血管發(fā)生的事實(shí)，本發(fā)明人研究了KV38的抗癌活性，KV38是人apo(a)kringle結(jié)構(gòu)的一種。結(jié)果顯示，本發(fā)明人已完成了本發(fā)明，證實(shí)此蛋白可有效用作一種抗癌劑，這是由于其通過(guò)一種bFGF樣的內(nèi)源生長(zhǎng)因子抑制了血管生成，血管生成在癌細(xì)胞生長(zhǎng)中是必需的。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種包含人apo(a)kringle KV38(下文中稱為L(zhǎng)K8蛋白)作為活性成分的抗癌劑。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供一種包含LK8蛋白作為活性成分的抗癌劑。
下文中，本發(fā)明被詳述。
本發(fā)明的抗癌劑的特征在于含有具有SEQ.ID.No.1所示氨基酸序列的LK8蛋白作為活性成分。優(yōu)選使用此藥劑作為轉(zhuǎn)移抑制劑，更優(yōu)選地，其被應(yīng)用于抑制結(jié)腸癌或直腸癌向肝的軒移。
另外，該抗癌劑優(yōu)選用于原發(fā)性腫瘤的治療。更優(yōu)選地，此藥劑用于治療從由前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和直腸癌的組中選擇的癌癥。
本發(fā)明中抗癌劑優(yōu)選地含有0.1～100mg/kg LK8蛋白，更優(yōu)選地含1～50mg/kg LK8蛋白，施藥次數(shù)為每天1～4次。但組成不限于上述，并可能根據(jù)病人情況、疾病的種類和進(jìn)展速度而改變。
本發(fā)明中，“KV38”指一種apo(a)kringle，“LK8”指KV38的重組蛋白。然而，除非特別聲明，KV38和LK8蛋白都通稱為L(zhǎng)K8蛋白。
本發(fā)明中的LK8蛋白是一個(gè)與許多apo(a)kringle域的KV38kringle相對(duì)應(yīng)的域，通過(guò)體外以及體內(nèi)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的活性而具有對(duì)癌細(xì)胞增殖和分化以及轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng)。如本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案所述，LK8蛋白的全身用藥導(dǎo)致了對(duì)原發(fā)性腫瘤及其轉(zhuǎn)移的抑制(見(jiàn)圖2～圖6)。因此，由于其抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的功能，本發(fā)明中的LK8蛋白可有效用作一種針對(duì)原發(fā)性腫瘤的抗癌劑及一種轉(zhuǎn)移抑制劑。
如果本發(fā)明中LK8蛋白與常規(guī)化學(xué)治療或放射治療共同使用則其治療效果將被增強(qiáng)。放射性治療優(yōu)選破壞原發(fā)性腫瘤，如果在放射性治療中施用LK8蛋白，可更有效的阻止轉(zhuǎn)移。對(duì)于化學(xué)治療，大劑量化學(xué)抗癌劑產(chǎn)生的細(xì)胞毒性是最大的問(wèn)題。如果在化學(xué)治療中施用本發(fā)明的LK8蛋白，降低了劑量的化學(xué)抗癌劑將帶來(lái)相同甚至改善了的抗癌效果并減輕了細(xì)胞毒性。
總之，如果施用LK8與外科手術(shù)、放射性治療、化學(xué)治療或免疫治療同時(shí)進(jìn)行，治療效果將被最大化。更進(jìn)一步，LK8蛋白的連續(xù)施用延長(zhǎng)了微轉(zhuǎn)移的休眠，抑制了原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)并穩(wěn)定了病情。許多常規(guī)抗癌劑被設(shè)計(jì)用于長(zhǎng)期服用，導(dǎo)致諸如連續(xù)生產(chǎn)蛋白和產(chǎn)品的高價(jià)等問(wèn)題。它們的替代者是基因治療。如果用于基因治療，我們?nèi)匀活A(yù)期LK8蛋白能使抗癌劑或轉(zhuǎn)移抑制劑的效果最大化。
本發(fā)明含LK8蛋白的抗癌劑可口服或腸胃外給藥并用于藥物制劑的一般形式。
通過(guò)與通用的填充劑、膨脹劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、稀釋劑如表面活性劑、或賦形劑相混合，本抗癌劑可制備用于口服或腸胃外給藥。口服給藥的固體制劑包括片劑、丸劑、散劑、粒劑或膠囊。這些固體制劑通過(guò)混合一種或多種合適的賦形劑制備，如淀粉、碳酸鈣、蔗糖或乳糖、明膠等。除了簡(jiǎn)單的賦形劑，也可使用硬脂酸鎂、滑石等潤(rùn)滑劑。口服給藥的液體制劑為混懸劑、溶液、乳劑和糖漿，上述制劑在通用的稀釋劑如水和液體石蠟外可含有多種賦形劑如濕潤(rùn)劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑。腸胃外給藥制劑為無(wú)菌的水溶液、水不溶性賦形劑、混懸劑、乳劑和栓劑。水不溶性賦形劑和混懸劑可含有，除一種或多種活性化合物外，丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、可注射酯如油酸乙酯等。栓劑可含有，除一種或多種活性化合物外，witepsol、聚乙二醇、吐溫61、可可脂、月桂脂、甘油明膠等。
LK8蛋白的LD50約為1,000mg/kg，說(shuō)明本發(fā)明的抗癌劑非常安全(見(jiàn)表2)。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明中的優(yōu)選實(shí)施方案參考附圖可被最好理解，其中

圖1是LK8基因的表達(dá)載體‘pMBRI-LK8(8.25kb)’的示意圖，其中LK8 cDNA(261bp)插入于AOX1啟動(dòng)子和AOX1終止子之間。
圖2是一組照片和一幅圖，顯示了小鼠(C57BL/6)尾靜脈中注射的鼠黑素瘤細(xì)胞系B16F10的肺部轉(zhuǎn)移被LK8蛋白的治療所抑制。
(a)只用PBS處理的小鼠肺部。
(b)用1mg/kg LK8蛋白處理的小鼠肺部。
(c)圖顯示B16F10細(xì)胞向小鼠肺部的轉(zhuǎn)移被LK8蛋白處理所抑制。
圖3是一組照片和一幅圖，顯示了植入小鼠脾臟的結(jié)直腸癌細(xì)胞系CT-26向肝的轉(zhuǎn)移被LK8蛋白處理所抑制。
(a)經(jīng)PBS(對(duì)照)處理和LK8蛋白(10mg/kg/天)處理的小鼠肝臟。
(b)圖顯示轉(zhuǎn)移入用PBS(對(duì)照)處理和LK8蛋白(10mg/kg/天)處理的小鼠肝臟中的CT-26細(xì)胞的克隆數(shù)。
(c)照片顯示轉(zhuǎn)移入用PBS(對(duì)照)處理和LK8蛋白(10mg/kg/天)處理的小鼠肝臟中的CT-26癌細(xì)胞的分布，用蘇木精&曙紅染色。
圖4是一組圖顯示隨著LK8蛋白的施用，植入人前列腺癌PC-3細(xì)胞的小鼠內(nèi)腫瘤尺寸的變化。
(a)圖顯示用100mg/kg/天LK8蛋白處理后腫瘤尺寸的變化。
(b)圖顯示用50mg/kg/天LK8蛋白處理后腫瘤尺寸的變化。
圖5是一幅圖顯示隨著LK8蛋白的施用，植入人肺癌A549細(xì)胞的小鼠內(nèi)腫瘤尺寸的變化。
圖6是一組圖顯示隨著LK8蛋白的施用，植入人直腸結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞的小鼠內(nèi)腫瘤尺寸(a)和腫瘤重量(b)的變化。
實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)際的和目前優(yōu)選的實(shí)施方案例示于下述實(shí)施例中。
然而，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于本公開，可在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)做出修改和改進(jìn)。
實(shí)施例1LK8蛋白制備
<1-1>LK8表達(dá)載體pMBRI-LK8的構(gòu)建為了有效制備LK8蛋白，本發(fā)明人首先構(gòu)建了LK8表達(dá)載體。
為了表達(dá)LK8基因，pPIC9載體(8.0kb，Invitrogen，Netherland)被用作基礎(chǔ)載體。如示意圖所示，pPIC9表達(dá)載體順序包含可提供甲醇誘導(dǎo)的高表達(dá)的AOX1啟動(dòng)子、可使被表達(dá)蛋白分泌的α-因子分泌信號(hào)、3’AOX1(TT)、可使轉(zhuǎn)錄有效終止并多腺苷酸化的AOX1多腺苷酸化信號(hào)、以及一個(gè)編碼野生型Pichia pastoris組氨醇脫氫酶的DNA片斷用作上述菌株轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。
首先，LK8基因以SEQ.ID.No 2中所示引物‘LK8N-Xhol’和SEQ.ID.No 3中所示引物‘LK8C-EcoRI’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以pET15b/LK8(見(jiàn)PCT/KR99/00554)為模板。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI消化，然后將消化產(chǎn)物插入用相同限制性內(nèi)切酶消化過(guò)的pPIC9載體中。最后，構(gòu)建成為L(zhǎng)K8基因表達(dá)載體‘pMBRI-LK8(8.25kb)(圖1)。
<1-2>含pMBRI-LK8的轉(zhuǎn)化子的制備Pichia pastoris，一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母，用作制備重組轉(zhuǎn)化子的宿主。
具體地，LK8基因表達(dá)載體‘pMBRI-LK8’用限制性內(nèi)切酶SacI處理，形成線性。此載體通過(guò)同源重組插入上述宿主菌株染色體的AOXI基因中。此時(shí)，用電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從組氨酸-缺乏培養(yǎng)基中通過(guò)檢查菌落形成挑選重組酵母轉(zhuǎn)化子。用PCR驗(yàn)證LK8cDNA是否已經(jīng)插入所選重組轉(zhuǎn)化子的AOX1區(qū)。然后，重組轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)培養(yǎng)并通過(guò)甲醇誘導(dǎo)LK8基因的表達(dá)。結(jié)果，LK8基因的表達(dá)被驗(yàn)證，說(shuō)明該蛋白在培養(yǎng)基中被大量分泌。
本發(fā)明中的分泌LK8蛋白由SEQ.ID.No 1所示氨基酸序列組成。
<1-3>重組菌株的培養(yǎng)<1-3-1>種子培養(yǎng)本發(fā)明中，通過(guò)將LK8基因插入Pichia pastoris得到一個(gè)重組菌株。所構(gòu)建的菌株進(jìn)行24小時(shí)的種子培養(yǎng)以得到適量的生物量及活性(當(dāng)稀釋20倍時(shí)，OD600為0.8-1.2)。
種子培養(yǎng)在YDP培養(yǎng)基(1％酵母浸出物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中進(jìn)行24小時(shí)振蕩培養(yǎng)。使用75L發(fā)酵罐。初始培養(yǎng)基體積為20L，通過(guò)補(bǔ)料分批培養(yǎng)法將培養(yǎng)物終體積調(diào)節(jié)至40L。
<1-3-2>主培養(yǎng)在YPD培養(yǎng)基中完成種子培養(yǎng)后，以種子培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基的30％進(jìn)行主培養(yǎng)。主培養(yǎng)在含有如下表1所示成分的發(fā)酵罐中進(jìn)行。當(dāng)發(fā)酵被甲醇供應(yīng)所飽和時(shí)，回收10％以上的發(fā)酵物以生產(chǎn)LK8蛋白。同時(shí)，甲醇被連續(xù)加入以誘導(dǎo)蛋白的持續(xù)表達(dá)。重復(fù)此過(guò)程以生產(chǎn)LK8蛋白。碳源的消耗速率與細(xì)胞的數(shù)量成正比。所以，當(dāng)發(fā)酵物的一部分被回收時(shí)，甲醇的供應(yīng)速度自動(dòng)在±20％內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過(guò)上述培養(yǎng)過(guò)程的重復(fù)，其中發(fā)酵連續(xù)進(jìn)行200小時(shí)以上，得到了分泌的250mg/L LK8的蛋白培養(yǎng)液。
<表1>
主培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成
實(shí)施例2通過(guò)靜脈注射B16F10鼠黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)B16F10細(xì)胞(1.8×105)，小鼠黑素瘤(以下稱為’黑素瘤細(xì)胞’)(American Type Culture Collection)，尾靜脈注射于C57BL/6小鼠(Charles River Japan，Inc.)。從第二天起，將LK8蛋白，由上述<實(shí)施例1>制備，連續(xù)14天每天兩次皮下注射(1mg/kg/天，0.2mg/kg/天)。對(duì)照組注射PBS而不是LK8蛋白。在細(xì)胞植入的第13天，切開小鼠取肺進(jìn)行轉(zhuǎn)移了的癌細(xì)胞(黑素瘤細(xì)胞)克隆計(jì)數(shù)。
結(jié)果，注射了PBS的對(duì)照小鼠組的肺中形成了巨大的克隆，說(shuō)明黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(圖2)。相反，注射了LK8蛋白的實(shí)驗(yàn)小鼠組中因黑素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移而形成的克隆的數(shù)量和尺寸小得多和少得多(圖2b)?？傊?，與對(duì)照組相比，1mg/kg的LK8蛋白處理顯示了53％的轉(zhuǎn)移抑制(圖2c)。
實(shí)施例3通過(guò)脾內(nèi)施用小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞CT-26進(jìn)行肝轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)CT-26細(xì)胞(American Type Culture Collection)，小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞，被注射入脾內(nèi)以誘導(dǎo)向肝的轉(zhuǎn)移。然后，研究了LK8蛋白的轉(zhuǎn)移抑制效果。特別地，CT-26細(xì)胞，在平板上長(zhǎng)至80％成熟，用PBS洗滌，然后用0.02％EDTA分散。單細(xì)胞再次用PBS洗滌，然后小心重懸于PBS。懸液用錐蟲藍(lán)染色以細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞密度調(diào)至5×105/ml，每只小鼠注射100μl。所用為6～8周齡BALB/c小鼠(CharlesRiver Japan，Inc.)。手術(shù)切開腹部右側(cè)后，用30號(hào)針頭將癌細(xì)胞懸液小心注射入脾臟。LK8蛋白皮下注射入實(shí)驗(yàn)組，一天兩次，10mg/kg/天，類似地，將鹽水注入對(duì)照組。14天后，處死小鼠檢測(cè)其肝臟(圖3a)，計(jì)數(shù)肝表面所見(jiàn)的克隆數(shù)量，其已用10％的福爾馬林溶液固定。各組的重量無(wú)大的差異。然而，施以10mg/kg/天LK8蛋白的實(shí)驗(yàn)組中轉(zhuǎn)移到肝臟中的克隆數(shù)量比對(duì)照組要少得多。注射了10mg/kg/天LK8蛋白的實(shí)驗(yàn)組中克隆數(shù)量與對(duì)照組相比降低約60％(圖3b)。另外，福爾馬林固定的肝組織切片用H&E染色進(jìn)行觀察。結(jié)果，用LK8處理的實(shí)驗(yàn)組中腫瘤區(qū)域比對(duì)照組有限得多(圖3c)。
實(shí)施例4原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)抑制為了研究LK8蛋白對(duì)體內(nèi)血管生成抑制效應(yīng)，采用了一種異種移植腫瘤模型。各相關(guān)實(shí)驗(yàn)采用4周齡隨機(jī)交叉雌性Balb/c nu/nu裸鼠(Charles River Japan，Inc.)，喂養(yǎng)于無(wú)菌條件下。
<4-1>人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)人前列腺癌PC-3細(xì)胞(American Type Culture Collection)培養(yǎng)于補(bǔ)充了10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCOTM，InvitrogenCorporation)，然后約5×106PC-3細(xì)胞皮下注射入裸鼠背部中心肌肉區(qū)。植入后的整10天后，LK8蛋白以100mg/kg/天進(jìn)行注射。其間，對(duì)照組只注射PBS而不是LK8蛋白。此處理持續(xù)30天，然后，每3或4天測(cè)量腫瘤的尺寸。結(jié)果顯示，腫瘤的生長(zhǎng)被LK8蛋白所抑制，與對(duì)照組相比有約60％的抑制(圖4a)。當(dāng)LK8蛋白以50mg/kg/天注射時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)以相似的方式被抑制，與對(duì)照相比有超過(guò)60％的抑制(圖.4b)。
<4-2>人肺癌細(xì)胞(A549)人肺癌A549細(xì)胞(American Type Culture Collection)培養(yǎng)于補(bǔ)充了10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(GIBCOTM，Invitrogen Corporation)。然后1×107腫瘤細(xì)胞皮下注射入裸鼠背部的中心肌肉區(qū)。植入整5天后，以50mg/kg/天注射LK8蛋白。對(duì)照組只施用PBS而不是LK8蛋白。處理持續(xù)了46天，然后，每3或4天測(cè)量腫瘤尺寸。結(jié)果顯示，腫瘤生長(zhǎng)被LK8蛋白的治療所抑制，與對(duì)照組相比抑制了61％(圖5)。
<4-3>人結(jié)直腸癌細(xì)胞(LS 174T)人結(jié)直腸癌LS 174T細(xì)胞(American Type Culture Collection)培養(yǎng)于補(bǔ)充了10％FBS的RPMI培養(yǎng)基(GIBCOTM，InvitrogenCorporation)。然后5×106腫瘤細(xì)胞皮下注射入裸鼠背部的中心肌肉區(qū)。植入整5天后，以50mg/kg/天注射LK8蛋白。對(duì)照組只施用PBS而不是LK8蛋白。處理持續(xù)了34天，然后，每3或4天測(cè)量腫瘤的尺寸。結(jié)果顯示，腫瘤生長(zhǎng)被LK8蛋白處理所抑制，與對(duì)照組相比有64％的抑制(圖6a)。并且，實(shí)驗(yàn)最后一天測(cè)量顯示，LK8蛋白處理使腫瘤的重量降低了68.7％(圖.6b)實(shí)施例5LK8蛋白的急性毒性實(shí)驗(yàn)5周齡SPF SD(Sprague Dawley)系大鼠被用于急性毒性的實(shí)驗(yàn)。將大鼠分為5組，這5組大鼠每組分別一次性通過(guò)靜脈注射施以LK8蛋白260mg/kg，364mg/kg，510mg/kg，714mg/kg和1000mg/kg(表2)。14天后，觀察大鼠中的實(shí)驗(yàn)材料、LK8蛋白、用藥、死亡、臨床癥狀和重量變化。進(jìn)行血相檢查和血液生化檢查，尸檢中用肉眼檢查胃腸或胸腹部器官任何異常狀況。結(jié)果顯示，施以1000mg/kg LK8蛋白的組檢測(cè)到微弱的毒性，但在其它組的大多數(shù)檢測(cè)中既未發(fā)現(xiàn)毒性也未發(fā)生死亡，這些檢測(cè)包括重量變化、血液檢查、血相檢查和血液生化檢查、尸檢等。因此，本實(shí)驗(yàn)中所用LK8蛋白被認(rèn)為是安全的物質(zhì)，因?yàn)槠湓诖笫髢?nèi)高至1,000mg/kg的水平時(shí)不會(huì)導(dǎo)致大鼠體內(nèi)的任何毒性變化，而且其估計(jì)的LD50值在大鼠內(nèi)遠(yuǎn)高于1,000mg/kg(表2)。
<表2>
LK8蛋白施用后隨天數(shù)變化的死亡數(shù)量
工業(yè)應(yīng)用如上文所述，LK8蛋白具有對(duì)轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng)，尤其，當(dāng)全身施用時(shí)，對(duì)人前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和直腸癌的生長(zhǎng)抑制。因此，包含本發(fā)明LK8蛋白的抗癌劑可有效用作原發(fā)性腫瘤的治療劑或轉(zhuǎn)移抑制劑。
本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在前述的描述中公開的概念和特定的實(shí)施方案可容易地用作修改或設(shè)計(jì)其它實(shí)現(xiàn)與本發(fā)明相同目的的實(shí)施方案的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員還將理解這些等價(jià)的實(shí)施方案沒(méi)有背離本發(fā)明在所附權(quán)利要求中所闡明的精神及范圍。
序列表<110>財(cái)團(tuán)法人牧巖生命工學(xué)研究所<120>含有LK8蛋白作為活性成分的抗癌劑<130>2p-11-19<160>3<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>75<212>PRT<213>人類<400>1Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Lys Ala Thr Thr1 5 10 15Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Glu Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg20 25 30His Ser Thr Phe Ile Pro Gly Thr Asn Lys Trp Ala Gly Leu Glu Lys35 40 45Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ile Asn Gly Pro Trp Cys Tyr50 55 60Thr Met Asn Pro Arg Lys Leu Phe Asp Tyr Cys65 70 75<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>LK8N-XhoI引物<400>2tccgctcgag aaaagagaac aagactgtat gttt 34<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>LK8C-EcoRI引物
<400>3cgaattctta agaggatgca cagagaggga t 3權(quán)利要求
1.一種抗癌劑，包含SEQ.ID.No1所示的LK8蛋白作為有效成分。
2.如權(quán)利要求1中所述的抗癌劑，其中LK8蛋白的有效劑量為0.1～100mg/kg。
3.如權(quán)利要求2中所述的抗癌劑，其中LK8蛋白的有效劑量為1～50mg/kg。
4.如權(quán)利要求1中所述的抗癌劑，其中該藥劑用于癌轉(zhuǎn)移的抑制。
5.如權(quán)利要求1中所述的抗癌劑，其中癌癥的轉(zhuǎn)移為結(jié)腸癌或直腸癌的轉(zhuǎn)移。
6.如權(quán)利要求1中所述的抗癌劑，其中該藥劑用于原發(fā)性腫瘤的治療。
7.如權(quán)利要求6中所述的抗癌劑，其中原發(fā)性腫瘤選自由前列腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌和肺癌組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含LK8蛋白作為活性成分的抗癌劑。本發(fā)明的抗癌劑有效抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此，該藥劑不僅可有效用于癌轉(zhuǎn)移的抑制劑，也可有效用作原發(fā)性惡性腫瘤的治療劑。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1753685SQ200480004889
公開日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2004年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月20日
發(fā)明者柳賢京, 金章性, 安珍衡, 李好晶, 康官燁, 林瀅權(quán), 樸政奐, 林仁煥, 金圣根, 朱學(xué)奎, 李志賢, 尹燁, 樸斗鴻 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人牧巖生命工學(xué)研究所