專利名稱：改善的抗腫瘤治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及阿普立定(aplidine)或阿普立定類似物與其它抗腫瘤藥物的聯(lián)合，這些聯(lián)合在治療癌、特別是在治療白血病和淋巴瘤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿普立定(脫氫膜海鞘素B)是環(huán)狀縮肽酚(depsipeptide)，從地中海海洋被囊類Aplidium albicans中分離出來(lái)的，其是WO9109485的主題。定涉及已知為膜海鞘素的化合物，并具有以下結(jié)構(gòu) 關(guān)于阿普立定、阿普立定類似物、其應(yīng)用、制劑和合成的更多信息可在專利申請(qǐng)WO 98 1352、WO 99 42125、WO 01 76616、WO 01 35974、WO 02 30441和WO 02 02596中找到。我們將這些PCT文本并入本文作為參考文獻(xiàn)。
在動(dòng)物和人的臨床前研究和I期臨床研究中都顯示了該物質(zhì)具有對(duì)抗包括白血病和淋巴瘤的廣譜腫瘤類型的潛在細(xì)胞毒作用。例如參見(jiàn)Faircloth，G.等″Dehydrodidemnin B(DDB)a new marinederived anticancer agent with activity against experimentaltumour models″，第九屆NCI-EORTC癌癥治療新藥研討會(huì)(Symp NewDrugs Cancer Ther)(三月12-15，Amsterdam)1996，摘要第111頁(yè)；Faircloth，G.等″Preclinical charac terization of Aplidine，a new marine anticancer depsipeptide″，Proc Amer Assoc CancerRes 1997，38Abst 692；Depenbrock H，Peter R，F(xiàn)aircloth GT，Manzanares I，JimenoJ，Hanauske AR.″In vitro activity of Aplidine，a newmarine-derived anti-cancer compound，on freshly explantedclonogenic human tumour cells and haematopoietic precursorcells″Br.J.Cancer，1998；78739-744；Faircloth G，Grant W，Nam S，Jimeno J，Manzanares I，Rinehart K.″Schedule-dependency of Aplidine，a marinedepsipeptide with antitumor activity″′，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.1999；40394；Broggini M，Marchini S，D，lncalci M，Taraboletti G，Giavazzi R，F(xiàn)aircloth G，Jimeno J.″Aplidine blocks VEGFsecretion and VEGF/VEGF-R1 autocrine loop in a human leukemiccell line″，Clin Cancer Res 2000；6(supp l)4509；Erba E，Bassano L，Di Liberti G，Muradore I，Chiorino G，Ubezio P，Vignati S，Codegoni A，Desiderio MA，F(xiàn)aircloth G，Jimeno J和D，lncalci M.″Cell cycle phase perturbations andapoptosis in tumour cells induced by Aplidine″，Br J Cancer2002；861510-1517；Paz-Ares L，Anthony A，Pronk La Twelves C，Alonso S，Cortes-Funes H，Celli N，Gomez C，Lopez-Lazaro L，Guzman C，Jimeno J，Kaye S.″Phase I clinical and pharmacokinetic studyof Aplidine，a new marine didemnin，administered as 24-hourinfusion weekly″Clin.Cancer Res.2000；6(suppl)4509；Raymond E，Ady-Vago N，Baudin E，Ribrag V，F(xiàn)aivre S，LecotF，Wright T，Lopez Lazaro L，Guzman C，Jimeno J，Ducreux M，Le Chevalier T，Armand JP.″A phase I and pharmacokineticstudy of Aplidine given as a 24-hour continuous infusion everyother week in patients with solid tumor and lymphoma″，Clin.Cancer Res.2000；6(suppl)4510；Maroun J，Belanger K，Seymour L，Soulieres D，CharpentierD，Goel R，Stewart D，Tomiak E，Jimeno J，Matthews S.″PhaseI study of Aplidine in a 5 day bolus q 3 weeks in patients withsolid tumors and lymphomas″，CHn.Ccmcer.Res.2000；6(suppl)4509；Izquierdo MA，Bowman A，Martinez M，Cicchella B，Jimeno J，Guzman C，Germa J，Smyth J.″Phase I trial of Aplidine givenas a 1 hour intravenous weekly infusion in patients withadvanced solid tumors and lymphoma″，Clin.Cancer Res.2000；6(suppl)4509。
機(jī)理研究表明阿普立定可阻滯ALL-MOLT4細(xì)胞中的VEGF分泌，并且在得自兒科患者的AML和ALL樣品中觀察到其在低濃度(5nM)下具有體外細(xì)胞毒活性，所述兒科患者患有新生的或復(fù)發(fā)的ALL和AML。阿普立定似乎在用藥治療的白血病細(xì)胞中體外誘導(dǎo)G1和G2停止。除了下調(diào)VEGF受體之外，幾乎不知道阿普立定的作用方式。
在阿普立定的I期臨床研究中，給予L-肉毒堿作為24小時(shí)預(yù)治療或共同施用以防止骨髓中毒性，參見(jiàn)例如WO 02 30441。共同施用L-肉毒堿被證實(shí)能改善藥物誘導(dǎo)的肌肉毒性的恢復(fù)并使阿普立定的劑量逐步增加。
因此在I期臨床研究中，阿普立定在最大耐受劑量下不引起骨髓中毒性，除了發(fā)生輕微的淋巴細(xì)胞減少之外。這些特征使得阿普立定成為可能有用的白血病治療藥物。向目前的白血病化療中加入阿普立定可改善藥物效力而沒(méi)有必要減少具有經(jīng)證實(shí)的抗白血病活性的藥物的劑量，因?yàn)楹性黾拥墓撬柚卸拘?。這似乎特別與復(fù)發(fā)性ALL和新診斷的AML和復(fù)發(fā)性AML的治療有關(guān)，因?yàn)檫@些疾病具有相對(duì)差的預(yù)后，目前使用具有骨髓中毒性的藥物組合治療這些疾病。
發(fā)明概述我們首次確定了阿普立定和阿普立定類似物增強(qiáng)其它抗癌藥物的效力并因此可成功地用于癌治療的聯(lián)合治療。本發(fā)明涉及使用這些聯(lián)合治療用于治療癌的藥物組合物，藥物劑型，藥包和方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，我們提供了使用其它有效治療癌的藥物并基于阿普立定和阿普立定類似物的聯(lián)合治療。優(yōu)選其它藥物有效治療白血病和/或淋巴瘤。最優(yōu)選其它藥物選自氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍和阿霉素。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括治療原發(fā)性癌和/或轉(zhuǎn)移性癌的方法，該方法包括對(duì)需要這種治療的患者給予治療有效量的阿普立定或阿普立定類似物、或其藥學(xué)可接受的前藥、鹽、溶劑化物或水合物，以及治療有效量的另一種有效治療癌的藥物、或其藥學(xué)可接受的前藥、鹽、溶劑化物或水合物，所述另一種藥物在阿普立定或阿普立定類似物給藥之前、過(guò)程中、或之后給藥。
優(yōu)選其它藥物有效治療白血病和/或淋巴瘤。最優(yōu)選其它藥物選自氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍和阿霉素。其它藥物可形成同一組合物的一部分，或作為相同時(shí)間或不同時(shí)間給藥的單獨(dú)組合物。
待治療的癌優(yōu)選白血病或淋巴瘤，最優(yōu)選ALL、AML、CML、MML或CLL。
本發(fā)明的另一個(gè)方面包括增加有效治療癌的藥物的治療效力的方法，所述藥物優(yōu)選是有效治療白血病和/或淋巴瘤的藥物，最優(yōu)選是選自氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍和阿霉素的藥物，或其藥學(xué)可接受的前藥、鹽、溶劑化物或水合物，所述方法包括對(duì)需要的患者給予一定量的阿普立定或阿普立定類似物、或其藥學(xué)可接受的前藥、鹽、溶劑化物或水合物。阿普立定或阿普立定類似物在其它藥物給藥之前、過(guò)程中、或之后給藥。
阿普立定或阿普立定類似物能夠增加某些抗癌藥物的治療效力。在一個(gè)方面，聯(lián)合的結(jié)果是優(yōu)于相加作用的協(xié)同作用。這種協(xié)同聯(lián)合代表了本發(fā)明的優(yōu)選方面。協(xié)同作用可通過(guò)使用Chou-Talalay方法或其它方法的使用得以證明。在其它情況中，可發(fā)現(xiàn)拮抗作用。
本發(fā)明的另一個(gè)方面包括藥物組合物，該藥物組合物包括阿普立定或阿普立定類似物、或其藥學(xué)可接受的前藥、鹽、溶劑化物或水合物，以及另一種有效治療癌的藥物。優(yōu)選另一種藥物有效治療白血病和/或淋巴瘤。最優(yōu)選另一種藥物選自氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍和阿霉素。
本發(fā)明還包括用于治療或預(yù)防癌的藥包，該藥包包括阿普立定或阿普立定類似物、或其藥學(xué)可接受的前藥、鹽、溶劑化物或水合物的劑型；另一種有效治療癌的藥物、或其藥學(xué)可接受的前藥、鹽、溶劑化物或水合物的藥物的劑型；供治療或預(yù)防癌的聯(lián)合中各行為者使用的用法說(shuō)明。優(yōu)選其它的藥物有效治療白血病和/或淋巴瘤。最優(yōu)選其它的藥物選自氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍和阿霉素。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及阿普立定在治療慢性淋巴細(xì)胞性白血病中的應(yīng)用。


圖1，阿普立定抑制培養(yǎng)基中CLL細(xì)胞的生長(zhǎng)。
圖2，阿普立定是培養(yǎng)基中preB-ALL細(xì)胞的強(qiáng)效抑制劑。
圖3，用阿普立定治療96小時(shí)的CCRF-CEM細(xì)胞(圖3A)、SKI-DLCL細(xì)胞(圖3B)和K562細(xì)胞(圖3C)的細(xì)胞毒劑量-應(yīng)答曲線。
圖4，在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和AraC聯(lián)合的Chou-Talalay分析。
圖5，在SKI-DLCL細(xì)胞中阿普立定和AraC聯(lián)合的Chou-Talalay分析。
圖6，在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和米托蒽醌聯(lián)合的Chou-Talalay分析。
圖7，在SKI-DLCL細(xì)胞中阿普立定和米托蒽醌聯(lián)合的Chou-Talalay分析。
圖8，在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和甲氨蝶呤聯(lián)合的Chou-Talalay分析。
圖9，在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和阿霉素聯(lián)合的Chou-talalay分析。
圖10，在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和長(zhǎng)春堿聯(lián)合的Chou-talalay分析。
圖11，在SKI-DLCL細(xì)胞中阿普立定和阿霉素聯(lián)合的Chou-Talalay分析。
圖12，在SKI-DLCL細(xì)胞中阿普立定和長(zhǎng)春堿聯(lián)合的Chou-Talalay分析。
圖13，在SKI-DLCL細(xì)胞中阿普立定和甲潑尼龍聯(lián)合的Chou-Talalay分析。
圖14，在培養(yǎng)96小時(shí)后的CCRF-CEM細(xì)胞(圖12A)和SKI-DLCL細(xì)胞(圖12B)中阿普立定的IC20降低AraC的IC50的聯(lián)合。
圖15，阿普立定作為單個(gè)藥物給藥和作為阿普立定與AraC的聯(lián)合時(shí)阿普立定體內(nèi)對(duì)腫瘤大小的作用。
發(fā)明詳述癌包括腫瘤、腫瘤形成、和任何其它惡性組織或細(xì)胞。本發(fā)明涉及阿普立定或阿普立定類似物聯(lián)合在治療通常的癌中的應(yīng)用，優(yōu)選在治療不同的白血病和淋巴瘤中的應(yīng)用。
為了研究使用阿普立定后其它抗癌藥物的可能的效力增強(qiáng)，我們開(kāi)始了可能用于白血病和淋巴瘤中的藥物聯(lián)合的系統(tǒng)研究。發(fā)現(xiàn)阿普立定是有效對(duì)抗患有preB-ALL(DM4)患者的原代細(xì)胞、和對(duì)抗得自六名慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)患者的新鮮細(xì)胞的體外細(xì)胞毒藥物。暴露于DM4系3天和暴露于原代CLL樣品11天后的IC50值是10nM。
在確立細(xì)胞株而非原代細(xì)胞上進(jìn)行了藥物聯(lián)合的研究。我們研究了三種細(xì)胞系，即K562、CCRF-CEM和SKI-DLCL，它們分別代表急性骨髓性白血病、成淋巴細(xì)胞的淋巴瘤和彌漫性B細(xì)胞大細(xì)胞淋巴瘤。實(shí)施例中的數(shù)據(jù)表明，在K562、CCRF-CEM和SKI-DLCL細(xì)胞中，阿普立定通過(guò)降低下述藥物的IC50值增強(qiáng)了氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍和阿霉素的效力。
因此我們發(fā)現(xiàn)阿普立定是對(duì)抗幾種血液學(xué)惡性病細(xì)胞的強(qiáng)效細(xì)胞毒藥物。重要地是，我們首次確立了阿普立定抑制培養(yǎng)基中CLL細(xì)胞的生長(zhǎng)。我們還發(fā)現(xiàn)阿普立定提高了在白血病治療中所用藥物的細(xì)胞毒性，所述藥物如氨甲喋呤(MTX)、阿糖胞苷(AraC)、米托蒽醌(Mitox)、長(zhǎng)春堿(Vinb)、甲潑尼龍(Metpred)和阿霉素(DOX)。
白血病根據(jù)其發(fā)展快慢來(lái)分類。急性白血病生長(zhǎng)迅速并可在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)遍布全身，相比之下，慢性白血病生長(zhǎng)遲緩，且隨著時(shí)間的進(jìn)行逐漸地惡化。
急性白血病的生血(造血)細(xì)胞保持在未成熟狀態(tài)，因此它們?cè)偕头e聚非常迅速。因此，急性白血病需要立即治療，否則該疾病可能在數(shù)月內(nèi)致命。幸運(yùn)地是，某些急性白血病亞型響應(yīng)現(xiàn)有的治療，并且它們是可醫(yī)治的。兒童經(jīng)常發(fā)展成為急性白血病類型，對(duì)兒童急性白血病的處理不同于成人。
在慢性白血病中，生血細(xì)胞最終是成熟的，或分化的，但是它們不是“正常”的。它們存在于血流中的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常白細(xì)胞，并且它們不能很好地對(duì)抗感染。
白血病也根據(jù)白細(xì)胞的類型進(jìn)行分類，白細(xì)胞分為淋巴細(xì)胞(免疫系統(tǒng)細(xì)胞)、粒細(xì)胞(細(xì)菌破壞性細(xì)胞)、或單核細(xì)胞(巨噬細(xì)胞形成細(xì)胞)。如果異常白細(xì)胞主要是粒細(xì)胞或單核細(xì)胞，則白血病稱為骨髓性或骨髓性白血病。另一方面，如果異常血細(xì)胞源于骨髓淋巴細(xì)胞，則白血病稱為淋巴細(xì)胞白血病。
其它的癌，已知為淋巴瘤，從淋巴結(jié)、脾和其它器官內(nèi)的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。這些癌不始發(fā)于骨髓，具有不同于淋巴細(xì)胞性白血病的生物學(xué)行為。
有多于十二種不同類型的白血病，但是四種類型的白血病最常發(fā)生。這些分類基于白血病是否是急性或慢性的，是否是骨髓性的或淋巴細(xì)胞性的，也就是說(shuō)急性骨髓性白血病(AML)又稱為急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL)，是最常見(jiàn)類型的成人白血病。大部分患者處于退休年齡(診斷時(shí)的平均年齡＝65歲)，男性多于女性。幸運(yùn)地是，因?yàn)橹委煹淖钚掳l(fā)展，在經(jīng)過(guò)適當(dāng)治療的成人患者中，約60％到70％患者的AML得到緩解(病情減輕)。初始應(yīng)答率為約65-75％，但是總治愈率更常為約40-50％。
慢性骨髓性白血病(CML)，又稱為骨髓增生病癥，是其中骨髓細(xì)胞增殖(倍數(shù)增長(zhǎng))超過(guò)骨髓組織的疾病。CML容易診斷，因?yàn)槠渚哂羞z傳特性、或標(biāo)記，也就是說(shuō)，容易在顯微鏡下識(shí)別。約95％的CML患者在他們的白血病細(xì)胞中的染色體9和22之間具有遺傳移位。費(fèi)城染色體引起所有類型的白細(xì)胞和血小板(凝血因子)的不受控制的繁殖和增殖。CML通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)療法或免疫療法仍是不可醫(yī)治的。
急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，又稱為急性淋巴母細(xì)胞性白血病，是由早粒白細(xì)胞、或淋巴細(xì)胞的異常生長(zhǎng)和發(fā)展引起的惡性病。白血病發(fā)生于骨髓的胚細(xì)胞(B細(xì)胞)、胸腺(T細(xì)胞)、和淋巴結(jié)。ALL主要發(fā)生在至多4歲的兒童中。
慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，在北美和歐洲是最常見(jiàn)的白血病。它是在年長(zhǎng)成人中發(fā)生的疾病并且在低于50歲的較年輕的人中很少發(fā)生?；加蠧LL的男性在數(shù)量上超過(guò)患有CLL的女性，平均為2比1。CLL被認(rèn)為源于成熟、長(zhǎng)命的淋巴細(xì)胞的逐漸積聚。因此，這種癌與其說(shuō)是由過(guò)度生長(zhǎng)引起的不如說(shuō)是惡性細(xì)胞的極度長(zhǎng)命和積累引起的。盡管個(gè)體間的積聚率不同，但是廣泛的腫瘤負(fù)荷最終引起所有CLL患者的并發(fā)癥。
本發(fā)明的組合物可包括在單一的藥學(xué)可接受制劑形式中的兩種組分(藥物)?；?，所述各組合物可分別配制并彼此聯(lián)合給藥。在本發(fā)明中可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種藥學(xué)可接受制劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)給藥方式和組合物中個(gè)組分的溶解特征來(lái)常規(guī)地選擇本發(fā)明所用的適當(dāng)?shù)闹苿?br> 包含阿普立定或阿普立定類似物的藥物組合物的例子包括具有適當(dāng)組成的靜脈內(nèi)給藥用液體(溶液、懸浮液或乳液)，并且它們可含有純化合物或與任何載體或其它藥理學(xué)活性化合物的聯(lián)合。溶解的阿普立定在熱和光強(qiáng)度測(cè)試條件下發(fā)生實(shí)質(zhì)性降解，因此開(kāi)發(fā)了凍干劑型，參見(jiàn)WO99/42125，其并入本文作為參考。
本發(fā)明的阿普立定或組合物的給藥基于劑量給藥方案，優(yōu)選靜脈內(nèi)輸液。我們優(yōu)選使用至多72小時(shí)、優(yōu)選1到24小時(shí)的輸液時(shí)間，最優(yōu)選約1、約3或約24小時(shí)。特別希望短的輸液時(shí)間，使得無(wú)需整夜住進(jìn)醫(yī)院即可進(jìn)行治療。然而，如果需要，輸液可進(jìn)行約24小時(shí)或甚至更長(zhǎng)時(shí)間。輸液可以以適當(dāng)?shù)拈g隔以變化的方案進(jìn)行，例如一周一次、一周兩次、或是一周多次，每周重復(fù)輸液且任選地停藥通常一周。
聯(lián)合的化合物的正確劑量將根據(jù)特定的配制組成、施用方式、治療的特定部位、宿主和腫瘤的改變而改變。應(yīng)該考慮到其它因素如年齡、體重、性別、飲食、給藥時(shí)間、排泄速率、宿主狀況、藥物聯(lián)合、反應(yīng)靈敏性和疾病的嚴(yán)重程度。給藥可連續(xù)地或周期地在最大耐藥量范圍內(nèi)進(jìn)行。阿普立定給藥的進(jìn)一步指導(dǎo)在WO 0135974中給出，該文獻(xiàn)并入本文作為參考。
對(duì)于本發(fā)明，可使用阿普立定的類似物代替APL(阿普立定本身)。代表性的這種化合物如WO 0202596中定義。本發(fā)明化合物的例子包括在WO 0202596中給出的優(yōu)選化合物，我們特別地向本說(shuō)明書中引入了優(yōu)選化合物的討論和在WO 0202596中給出的有關(guān)方面。更優(yōu)選地，類似物在結(jié)構(gòu)上接近阿普立定，通常在一個(gè)氨基酸或末端側(cè)鏈方面與阿普立定不同。不同的氨基酸可位于分子的環(huán)狀部分內(nèi)或位于側(cè)鏈內(nèi)。這種化合物的許多例子在WO 0202596中給出，它們是供本發(fā)明之用的候選藥物。
實(shí)施例實(shí)施例1試驗(yàn)了阿普立定對(duì)抗多種得自血液學(xué)惡性病患者的原代細(xì)胞的作用。使用的細(xì)胞是-得自六名慢性淋巴細(xì)胞白血病患者的新鮮細(xì)胞-得自preB-ALL(DM4)患者的原代細(xì)胞。
患者樣品的獲得經(jīng)過(guò)事先的同意，CLL細(xì)胞通過(guò)密度梯度離心法在histopaque上分離。使用的介質(zhì)是補(bǔ)充有10％自體血清和L-谷氨酰胺的RPMI。培養(yǎng)基使用10nM阿普立定培養(yǎng)，測(cè)量3、7、11和18天的細(xì)胞生存力，并與未經(jīng)處理的細(xì)胞和STI 571(0.5mM)的生存力比較。
這些研究的結(jié)果示于圖1-2中。
實(shí)施例2為了研究其它抗癌藥物的可能的效力增強(qiáng)，我們進(jìn)行了可用于白血病和淋巴瘤的藥物聯(lián)合的研究。
藥物聯(lián)合研究在確立細(xì)胞株上而不是在原代細(xì)胞上進(jìn)行。我們研究了三種細(xì)胞系，既K562(作為急性骨髓性白血病的模型)，CEM(表示急性淋巴細(xì)胞白血病)，和SKI-DLCL(表示彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤)。研究了IC20劑量的阿普立定和IC50劑量范圍的氨甲喋呤、阿糖胞苷和阿霉素的聯(lián)合，以確定阿普立定是否可增強(qiáng)這些藥物的效力。
這些結(jié)果示于表1中

p＜0.01，p＜0.05，p＜0.05這些數(shù)據(jù)清楚地表明了阿普立定通過(guò)顯著地降低了所述藥物的IC50值而增強(qiáng)了阿霉素、氨甲喋呤和阿糖胞苷的效果。
實(shí)施例3測(cè)定阿普立定作為單一藥物對(duì)CCRF-CEM、SKI-DLCL和K562細(xì)胞系的作用的體外試驗(yàn)。
CCRF-CEMS、SKI-DLCL和K562細(xì)胞保持在補(bǔ)充有10％FCS的RPMI1640中。為了測(cè)定阿普立定對(duì)所有細(xì)胞系的細(xì)胞毒效力，以及為了獲得阿普立定在這些細(xì)胞系中的IC50，將細(xì)胞裝入96孔板中并在濕潤(rùn)的含有5％CO2的培育箱中培養(yǎng)96小時(shí)。在自動(dòng)讀板器中通過(guò)XTT試驗(yàn)測(cè)量了細(xì)胞生存力。我們發(fā)現(xiàn)阿普立定對(duì)所有細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性，IC50劑量為0.5-1.0nM(圖3)。
實(shí)施例4對(duì)阿普立定+藥物的聯(lián)合對(duì)所有細(xì)胞系的體外效果研究，該聯(lián)合具有IC50∶IC50的固定劑量。
與阿普立定聯(lián)合測(cè)量了氨甲喋呤、阿糖胞苷C(ara-C)、米托蒽醌、甲潑尼龍、長(zhǎng)春堿和阿霉素。
使用Chou-Talalay分析法分析了藥物聯(lián)合。當(dāng)通過(guò)這種分析法獲得的聯(lián)合指數(shù)(CI)小于1時(shí)，藥物發(fā)生協(xié)同作用；當(dāng)CI等于1時(shí)，藥物是相加作用；如果CI大于1，則藥物發(fā)生拮抗作用。
通過(guò)使用XTT或MTS進(jìn)行所有細(xì)胞毒性研究。我們首先測(cè)定了這些藥物在SKI-DLCL、CCRF-CEM和K562細(xì)胞系中的IC50劑量。我們研究了使用IC50(阿普立定)∶IC50(藥物X)固定比的藥物聯(lián)合。
在表2中表明了在CCRF-CEM細(xì)胞中劑量為(IC50∶IC50)的阿普立定和Ara-C的聯(lián)合。
表2

在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和Ara-C聯(lián)合的Chou-talalay分析結(jié)果示于圖4。在CCRF-CEM細(xì)胞中該聯(lián)合的CI值是0.469。
在表3中表明了在SKI-DLCL細(xì)胞中劑量為(IC50∶IC50)的阿普立定和Ara-C的聯(lián)合。
表3

在SKI-DLCL細(xì)胞中阿普立定和Ara-C聯(lián)合的Chou-Talalay分析結(jié)果示于圖5中。在SKI-DLCL細(xì)胞中這些聯(lián)合的CI值是0.306。
在表4中表明了在K562細(xì)胞中劑量為(IC50∶IC50)的阿普立定和Ara-C的聯(lián)合。
表4

在K562細(xì)胞中這一聯(lián)合的CI值是0.502。
在表5中表明了在CCRF-CEM細(xì)胞中劑量為(IC50∶IC50)的阿普立定和米托蒽醌的聯(lián)合。
表5

在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和米托蒽醌聯(lián)合的Chou-Talalay分析結(jié)果示于圖6中。在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和米托蒽醌聯(lián)合的CI值是0.911。
在表6中表明了在SKI-DLCL細(xì)胞中劑量為(IC50∶IC50)的阿普立定和米托蒽醌聯(lián)合。
表6

在SKI-DLCL細(xì)胞中阿普立定和米托蒽醌聯(lián)合的Chou-Talalay分析結(jié)果示于圖7中。在SKI-DLCL細(xì)胞中阿普立定和米托蒽醌聯(lián)合的CI值是0.646。
在表7中表明了在K562細(xì)胞中劑量為(IC50∶IC50)的阿普立定和米托蒽醌聯(lián)合。
表7

在K562細(xì)胞中這一聯(lián)合的CI值是0.487。
在表8中表明了在CCRF-CEM細(xì)胞中劑量為(IC50∶IC50)的阿普立定和氨甲喋呤的聯(lián)合。
表8

在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和氨甲喋呤聯(lián)合的Chou-Talalay分析結(jié)果示于圖8中。在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和氨甲喋呤聯(lián)合的CI值是0.950。
在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和阿霉素聯(lián)合的Chou-Talalay分析結(jié)果示于圖9中。在CCRF-CEM細(xì)胞中這一聯(lián)合的CI值是1.952。
在CCRF-CEM細(xì)胞中阿普立定和長(zhǎng)春堿聯(lián)合的Chou-Talalay分析結(jié)果示于圖10中。在CCRF-CEM細(xì)胞中這一聯(lián)合的CI值是2.046。
在表9中表明了在SKI-DLCL細(xì)胞中劑量為(IC50∶IC50)的阿普立定和阿霉素的聯(lián)合。
表9

在SKI-DLCL細(xì)胞中阿普立定和阿霉素聯(lián)合的Chou-Talalay分析結(jié)果示于圖11中。在SKI-DLCL細(xì)胞中這一聯(lián)合的CI值是0.478。
在表10中表明了在SKI-DLCL細(xì)胞中劑量為(IC50∶IC50)的阿普立定和長(zhǎng)春堿的聯(lián)合。
表10

在SKI-DLCL細(xì)胞中阿普立定和長(zhǎng)春堿聯(lián)合的Chou-Talalay分析結(jié)果示于圖12中。在SKI-DLCL細(xì)胞中這一聯(lián)合的CI值是0.760。
在表11中表明了在SKI-DLCL細(xì)胞中劑量為(IC50∶IC50)的阿普立定和甲潑尼龍的聯(lián)合表11

在SKI-DLCL細(xì)胞中阿普立定和甲潑尼龍聯(lián)合的Chou-Talalay分析結(jié)果示于圖13中。在SKI-DLCL細(xì)胞中這一聯(lián)合的CI值是0.646。
實(shí)施例5我們還研究了IC20(APL)與變化劑量的AraC的聯(lián)合對(duì)CCRF-CEM和SKI-DLCL細(xì)胞系的細(xì)胞毒作用。阿普立定在兩種細(xì)胞系中都增強(qiáng)了AraC的效果，AraC的IC50劑量在SKI-DLCL細(xì)胞系中從30nM降低到1.6nM，在CCRF-CEM細(xì)胞系中從10nM降低到0.8nM(圖14)。在細(xì)胞培養(yǎng)96小時(shí)后獲得數(shù)據(jù)并使用XTT試驗(yàn)。結(jié)果表示三次不同試驗(yàn)的平均值。
實(shí)施例6體內(nèi)研究我們進(jìn)行了體內(nèi)試驗(yàn)，以研究單獨(dú)的阿普立定以及阿普立定與其它藥物聯(lián)合在淋巴性惡性病中的效果。
在C.B.-17 scid/scid(SCID小鼠)中測(cè)定最大耐受劑量(MTD)我們使用了人淋巴瘤在SCID小鼠中的體內(nèi)模型用于上述目的。具體而言，我們使用了CCRF-CEMS細(xì)胞和CB.17scid/scid小鼠。我們具有使用這一模型的豐富經(jīng)驗(yàn)，并使用這種異種移植評(píng)價(jià)藥物治療(Lacerda J.F.等Blood 85(10)2675-2679(1995))。我們發(fā)現(xiàn)五次日劑量的總量為1毫克/千克/周是小鼠可耐受的阿普立定的最大劑量。
阿普立定作為單個(gè)藥物以及阿普立定與AraC的聯(lián)合在SCID小鼠異種移植模型中的體內(nèi)抗癌效果的測(cè)定SCID小鼠右肋皮下接種107CEM-T白血病細(xì)胞。每周觀察兩次接種部位的腫瘤形成。當(dāng)確立了明顯的腫瘤之后，注射單獨(dú)的阿普立定，和注射阿普立定與幾種劑量的AraC的聯(lián)合，測(cè)量抗癌效果。隨機(jī)分配小鼠，接受單獨(dú)的阿普立定，劑量為0.75毫克/千克和1毫克/千克，單獨(dú)的AraC，劑量為50毫克/千克，或阿普立定和AraC的聯(lián)合，劑量為所有劑量聯(lián)合。選擇為用于上述聯(lián)合的AraC的劑量是腫瘤生長(zhǎng)受到抑制但是不發(fā)生腫瘤消退的劑量。所有藥物腹膜內(nèi)給藥，與未接受任何治療的小鼠的對(duì)照組比較腫瘤大小，與接受單個(gè)藥物治療的腫瘤大小比較聯(lián)合給藥的腫瘤大小。
最有效的聯(lián)合是AraC-50毫克/千克+阿普立定-0.75毫克/千克(圖15)。
這些關(guān)于阿普立定的發(fā)現(xiàn)可外延到阿普立定類似物、衍生物和有關(guān)的化合物。例如，本發(fā)明提供了如WO 02 02596中公開(kāi)的化合物與抗癌藥物的聯(lián)合，所述抗癌藥物優(yōu)選為抗白血病藥物或抗淋巴瘤藥物，特別是氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍或阿霉素。
權(quán)利要求
1.阿普立定或阿普立定類似物在制備用于通過(guò)使用阿普立定或阿普立定類似物與其它藥物的聯(lián)合治療來(lái)治療原發(fā)癌和/或轉(zhuǎn)移性癌的藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的阿普立定或阿普立定類似物的應(yīng)用，其中待治療的癌是白血病或淋巴瘤。
3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的阿普立定或阿普立定類似物的應(yīng)用，其中阿普立定或阿普立定類似物和其它藥物形成同一藥物的一部分。
4.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的阿普立定或阿普立定類似物的應(yīng)用，其中阿普立定或阿普立定類似物和其它藥物作為單獨(dú)的藥物提供，用于相同時(shí)間或不同時(shí)間給藥。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的阿普立定或阿普立定類似物的應(yīng)用，其中其它藥物選自氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍和阿霉素。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的阿普立定或阿普立定類似物的應(yīng)用，其中阿普立定或阿普立定類似物是阿普立定。
7.治療原發(fā)癌和/或轉(zhuǎn)移性癌的方法，包括對(duì)需要這種治療的患者給予治療有效量的阿普立定或阿普立定類似物和治療有效量的其它有效治療癌的藥物，其它藥物在阿普立定或阿普立定類似物給藥之前、過(guò)程中或之后給藥。
8.權(quán)利要求6的治療原發(fā)癌和/或轉(zhuǎn)移性癌的方法，其中待治療的癌是白血病或淋巴瘤。
9.權(quán)利要求7或8的治療原發(fā)癌和/或轉(zhuǎn)移性癌的方法，其中其它藥物選自氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍和阿霉素。
10.增加有效治療癌的藥物的治療效力的方法，該方法包括對(duì)需要的患者給予一定量的阿普立定或阿普立定類似物，阿普立定或阿普立定類似物在其它藥物給藥之前、過(guò)程中、或之后給藥。
11.權(quán)利要求10的增加有效治療癌的藥物的治療效力的方法，其中待治療的癌是白血病或淋巴瘤。
12.權(quán)利要求10或11的增加有效治療癌的藥物的治療效力的方法，其中藥物選自氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍和阿霉素。
13.藥物組合物，包括阿普立定或阿普立定類似物和其它有效治療癌的藥物。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中其它藥物有效治療白血病和/或淋巴瘤。
15.權(quán)利要求13或14任一項(xiàng)的藥物組合物，其中其它藥物選自氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍和阿霉素。
16.用于治療或預(yù)防癌的藥包，其包括阿普立定或阿普立定類似物的劑型、其它有效治療癌的藥物的劑型、和供治療或預(yù)防癌的聯(lián)合中供各行為者使用的用法說(shuō)明。
17.權(quán)利要求16的藥包，其中藥包用在治療或預(yù)防白血病和/或淋巴瘤中。
18.權(quán)利要求16或17的藥包，其中其它藥物選自氨甲喋呤、阿糖胞苷、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、甲潑尼龍和阿霉素。
19.阿普立定或阿普立定類似物在制備用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了阿普立定或阿普立定類似物，特別是在聯(lián)合治療中，用于治療癌的應(yīng)用，特別是在治療白血病和淋巴瘤的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/15GK1753684SQ200480005179
公開(kāi)日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者D·巴內(nèi)杰, J·R·伯蒂諾, G·T·費(fèi)爾克洛思, S·古拉, J·吉梅諾 申請(qǐng)人:法馬馬有限公司