專利名稱：：組織蛋白酶s抑制劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及作為組織蛋白酶S(一種半胱氨酸蛋白酶)抑制劑具有活性的肽基化合物。所述的化合物是組織蛋白酶S的選擇性可逆抑制劑。因此用于治療自身免疫以及其它疾病。本發(fā)明還涉及這些化合物的制備方法以及包含它們的藥物組合物。
背景技術：
：組織蛋白酶S是木瓜蛋白酶家族的一個成員，在半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族內。木瓜蛋白酶家族是半胱氨酸蛋白酶的最大組并且包括蛋白酶如組織蛋白酶B、H、K、L、O和S。(A.J.Barrett等人，1996，PerspectivesinDrugDiscoveryandDesign，6，1)。半胱氨酸蛋白酶在人類生物學及疾病中具有重要作用，包括動脈粥樣硬化、肺氣腫、骨質疏松癥、慢性炎癥和免疫疾病(H.A.Chapman等人，1997，Ann.Rev.Physiol.，59，63)。組織蛋白酶S在調節(jié)抗原呈遞和免疫性中起關鍵作用(H.A.Chapman，1998，CurrentOpinioninImmunology，10，93；R.J.Riese等人，1998，J.Clin.Invest.，101，2351；R.J.Riese等人，1996，Immunity，4，357)。組織蛋白酶S缺乏的小鼠具有受損的不變鏈降解，其導致抗原呈遞降低及生發(fā)中心的形成，以及減小膠原蛋白引起的關節(jié)炎的敏感性，顯示對組織蛋白酶S抑制劑治療的潛在性(G.Shi等人，1999，Immunity，10，197；T.Y.Nakagawa等人，1999，Immunity，10，207)。免疫反應的特異性取決于外源蛋白的加工以及在細胞表面處抗原肽的呈遞?？乖呐cMHC類別II結合存在，一種在某些造血細胞系的抗原呈遞細胞(例如B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)中表達的異二聚糖蛋白。效應細胞如T-細胞的抗原呈遞在非自我識別中是基本步驟并因此引發(fā)免疫反應。最近表明，MHC類別II異二聚體與稱為不變鏈的第三分子在細胞內結合。不變鏈促進II型運輸至內體結構并在用抗原裝填前穩(wěn)定II型蛋白。不變鏈在抗原結合槽中直接與II型二聚物相互作用，因此必須進行蛋白水解和去除，或者不能裝填或存在抗原。當前研究表明，不變鏈被組織蛋白酶S選擇性地蛋白水解，其在細胞內與MHC類別II絡合物區(qū)分。組織蛋白酶S將不變鏈降解成小肽(稱為CLIP)，其占據(jù)抗原-結合槽。通過MHC類別II與HLA-DM的相互作用，從MHC類別II中釋放出CLIP，由此從MHC類別II中釋放出的類MHC分子與抗原肽結合。然后，MHC類別II-抗原絡合物運輸至細胞表面，以呈遞至T-細胞并引發(fā)免疫反應。通過不變鏈的蛋白降解成CLIP，組織蛋白酶S提供產生免疫反應的基本步驟。從而通過組織蛋白酶S阻止不變鏈降解來抑制抗原呈遞，可以提供一種免疫調節(jié)機理。已經長時間希望通過控制抗原特異性免疫反應作為自身免疫疾病的有用的和安全的治療。這些疾病包括克羅恩病和關節(jié)炎，以及其它T-細胞介導的免疫反應(C.JanewayandP.Travers，1996，Immunobiology，TheImmuneSysteminHealthandDisease，Chapter12)。此外，組織蛋白酶S，其具有寬的pH特異性，已經與涉及胞外蛋白水解的各種其它疾病有關，例如阿爾茨海默氏病(U.Muller-Ladner等人，1996，PerspectivesinDrugDiscoveryandDesign，6，87)、動脈粥樣硬化(G.K.Sukhova等人，1998，J.Clin.Invest.，102，576)和子宮內膜異位(WO9963115，1999)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶S抑制劑阻斷IgE值上升和肺過敏癥的小鼠模型的肺中的嗜曙紅細胞滲入，表明組織蛋白酶S可能與哮喘有關(R.J.Riese等人，J.Clin.Investigation，1998，101，2351)。半胱氨酸蛋白酶的特點在于在活性位點處具有半胱氨酸殘基其起親核基團的作用。該活性位點還含有組氨酸殘基。組氨酸上的咪唑環(huán)起堿的作用，在活性位點半胱氨酸上生成硫醇鹽陰離子，以增加它的親核性。當?shù)孜锉坏鞍酌缸R別時，待裂解的酰胺鍵指向該活性位點，其中此硫醇鹽進攻羰基碳，形成酰基酶-中間體并裂解該酰胺鍵，釋放出胺。接著，水裂解該?；?酶物質，生成該酶并釋放出該底物的其它裂解產物，一種羧酸。半胱氨酸蛋白酶抑制劑含有可以與該活性位點半胱氨酸可逆或不可逆反應的官能度。在半胱氨酸蛋白酶抑制劑上，已經描述(D.Rasnick，1996，PerspectivesinDrugDiscoveryandDesign，6，47)的活性官能度的例子包括肽基重氮甲烷、環(huán)氧化物、單氟烷烴和酰氧基甲烷，其不可逆地烷基化該半胱氨酸硫醇。其它不可逆抑制劑包括Michael受體例如肽基乙烯基酯以及其它羧酸衍生物(S.Liu等人，J.MedChem.，1992，35，1067)和乙烯基砜(J.T.Palmer等人，1995，J.MedChem.，38，3193)。與所述的活性位點半胱氨酸形成可逆絡合物的活性官能度包括肽基醛(R.P.Hanzlik等人，1991，Biochim.Biophys.Acta.，1073，33)，其是非選擇性的，抑制半胱氨酸和絲氨酸蛋白酶以及其它親核物質。肽基腈(R.P.Hanzlik等人，1990，Biochim.Biophys.Acta.，1035，62)比醛活性更低，因此對更大親核性的半胱氨酸蛋白酶具有更高的選擇性。據(jù)報道，各種活性酮也是半胱氨酸蛋白酶的可逆抑制劑(D.Rasnick，1996，ibid)。除與活性位點的親核性半胱氨酸反應外，活性酮可以與水反應，生成一種可以作為過渡態(tài)抑制劑的半酮縮醇。已經報道了組織蛋白酶S抑制劑的例子。J.L.Klaus等人(WO96/40737)描述了包括組織蛋白酶S的半胱氨酸蛋白酶的可逆抑制劑，其含有乙二胺。Palmer等人的美國專利號5,776,718在它的最寬的一般方面公開了一種蛋白酶抑制劑，該蛋白酶抑制劑包含通過兩碳原子鏈與吸電子基團(EWG)連接的目標基團。本申請的化合物在結構上是不同的，并因此從所述的5,776,718專利中排除，本發(fā)明的具體實施方案具有出乎意料地比現(xiàn)有技術最接近化合物更大的活性。US6,353,017描述了具有作為組織蛋白酶B、K、L和S抑制劑活性的二肽腈?；诙碾娴慕M織蛋白酶S抑制劑的例子已經由Novartis申請WO99/24460,1999和有關的美國專利6,353,017報道。一般結構之一描述在下面。公開了R4和R5一起表示低級亞烷基，任選被O、S或NR6間斷，以便與它們相連的碳原子一起形成環(huán)，R3是低級烷基(定義為支鏈的或無支鏈的1-7個碳原子)。然而，在這些文獻中，R4和R5的具體例子被限定為氫、甲基或連接在一起形成環(huán)丙基。沒有描述R4和R5是雜環(huán)稠合的例子。WO99/24460舉例說明了更大的R4和R5是稠合碳環(huán)如環(huán)己基，但是沒有提供雜環(huán)的例子或教導它們將帶來任何好處。此外，雖然R3的描述在種屬上可能包括烷基P2側鏈，但是它沒有舉例說明提供本發(fā)明好處的具體結構。另一類基于二肽腈的組織蛋白酶S抑制劑描述在美國專利6,492,362中。在本專利中要求的一個具體實例是具有N-甲基哌啶P1雜環(huán)。然而，根據(jù)US6,492,362所包含的主題的定義，要求下面一般結構所說明的含有P2側鏈的磺?；?。美國專利號6,525,052和6,420,364，由本申請的受讓人共同擁有，描述了帶P1雜環(huán)的二肽腈，在此所述的本發(fā)明提供一種改善選擇性分布的非顯而易見的好處。其它的肽基腈已經作為蛋白酶抑制劑被報道。例如，B.A.Rowe等人(US5,714,471)描述了作為蛋白酶抑制劑的腈和酮基雜環(huán)，用于治療神經變性疾病。B.Malcolm等人(WO9222570)報道了肽基腈作為微小RNA病毒蛋白酶的抑制劑。B.J.Gour-Salin(Can.J.Chem.，1991，69，1288)和T.C.Liang(Arch.Biochim.Biophys.，1987，252，626)描述了作為木瓜蛋白酶抑制劑的肽基腈?？赡嬉种苿┍憩F(xiàn)出比不可逆抑制劑更吸引人的療效。即使對特定蛋白酶具有高特異性的化合物也可能結合非靶酶。因此，不可逆化合物可能永久地使非靶酶失活，增加毒性的可能性。此外，由靶酶失活引起的任何毒性作用可以通過可逆抑制劑減輕，并且可能通過修飾或降低劑量很容易補救。最后，通過不可逆抑制劑的酶共價改性可能潛在地發(fā)生起半抗原作用的抗體反應。高選擇性蛋白酶抑制劑還提供更吸引人的治療選擇。通常，為了避免潛在的與抑制其它靶標有關的毒性，選擇性是需要的。組織蛋白酶L是組織蛋白酶S的一種密切相關的家族成員。現(xiàn)已表明，缺乏組織蛋白酶L或具有非功能性組織蛋白酶L的小鼠表現(xiàn)出許多不希望的表型，包括腦萎縮(U.Felbor等人，2002，PNASUSA，99(12)7883)進行性心肌病(J.Stypmann，等人，2002，PNASUSA，99(9)6234)、男性生殖系統(tǒng)損傷(W.W.Wright，等人，2003，BiologyofReproduction，68(2)680)和嚴重的表皮增生(F.Benavides，等人，2002，AmericanJoumalofPatholog，161(2)693)。綜上所述，需要這樣的化合物，其可逆地和選擇性地抑制組織蛋白酶S，以用于這些蛋白酶使疾病惡化的適應癥。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的是提供如文中所述的可逆地和選擇性地抑制半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶S的化合物。本發(fā)明的另一目的是提供治療由這些組織蛋白酶S惡化的疾病和病理狀態(tài)的方法，例如，但不限于，類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化和哮喘。本發(fā)明的還有另一目的是提供制備上述化合物的方法。發(fā)明的詳細說明本發(fā)明化合物的特征在于特異性的P2側鏈3，3-二甲基戊基(I)、2，2，3，3-四甲基丁基(II)和3，3-二甲基丁基(III)，其顯著改善了這些抑制劑對組織蛋白酶S超過對它的密切相關的家庭成員組織蛋白酶L的選擇性。因此，一方面本發(fā)明提供式(I)、(II)的化合物，或其藥學上可接受的鹽，其對于組織蛋白酶S是選擇性的其中X在每種情況下選自和R1選自氫或支鏈烷基或直鏈烷基，鏈中的每個碳原子任選被1-3個選自O、S和N-R2的雜原子所代替其中R2是氫或烷基；以及其中R1任選進一步被一個或多個烷氧基、胺、鹵素、碳環(huán)、雜芳基或雜環(huán)取代。在本發(fā)明的另一種實施方案中，本發(fā)明提供上述式(I)的化合物其中X選自R1選自氫或支鏈的C1-10烷基或直鏈的C1-10烷基，鏈中的每個碳原子任選被1-3個選自O、S和N-R2的雜原子所代替其中R2是氫或C1-5烷基；以及其中R1任選進一步被一個或多個C-15烷氧基、胺、雜環(huán)或鹵素取代。R1的一種優(yōu)選實施方案包括C1-5烷基，優(yōu)選C1-3烷基，最優(yōu)選甲基。在R1的另一種優(yōu)選實施方案中，R1選自和在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供根據(jù)上述任一種實施方案的式(I)的化合物，以及其中下面所示的手性碳是具有一種天然氨基酸構型的(S)對映異構體本發(fā)明的另一方面，提供了對組織蛋白酶S是選擇性的下列化合物或其藥學上可接受的鹽和在本發(fā)明的另一種實施方案中，本發(fā)明提供了對組織蛋白酶S是選擇性的下列化合物或其藥學上可接受的鹽其中下面所示的手性碳是具有一種天然氨基酸構型的(S)對映異構體。本發(fā)明的第二方面，提供了對組織蛋白酶S是選擇性的下式(III)的化合物或其藥學上可接受的鹽和除非另有說明，含有一個或多個不對稱碳原子的本發(fā)明任何化合物可以以外消旋體和外消旋混合物、單一對映異構體、非對映異構體混合物和單個非對映異構體的形式出現(xiàn)。所有這些化合物的異構形式清楚地包括在本發(fā)明內。除非另有說明，每一立體異構碳可以是R或S構型或構型的組合。在優(yōu)選的本發(fā)明的化合物中，P2手性碳是具有一種天然氨基酸構型的(S)對映異構體。本發(fā)明的一些化合物可以以不止一種互變異構的形式存在。本發(fā)明包括所有這些互變異構體。本領域普通熟練技術人員應該理解，本發(fā)明的所有化合物是化學穩(wěn)定的。本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的藥學上可接受的衍生物。″藥學上可接受的衍生物″是指本發(fā)明化合物的任何藥學上可接受的酸、鹽或酯，或當給藥于患者時能(直接或間接地)提供本發(fā)明化合物的任何其它化合物，其藥理學活性代謝物或藥理學活性殘基。此外，本發(fā)明的化合物包括前藥。前藥包括那些化合物，其在經過簡單轉化后，被修飾生成本發(fā)明的化合物。簡單化學轉化包括發(fā)生酶、代謝或其它的水解、氧化和還原。具體地說，當將本發(fā)明的前藥給予患者時，可將該前藥轉化為本發(fā)明的化合物，由此賦予所需的藥理學作用。根據(jù)本發(fā)明，特別重要的是式(I)、(II)或(III)的化合物，其中X和R1具有所示的含義，用作具有抗組織蛋白酶S活性的藥物組合物。本發(fā)明還涉及式(I)、(II)或(III)化合物的用途，其中X和R1具有所示的含義，用于制備用于治療和/或預防與組織蛋白酶S相關的疾病或病癥的藥物組合物。本發(fā)明還涉及藥物制劑，含有作為活性物質的一種或多種式(I)、(II)或(III)的化合物，其中X和R1具有所示的含義，或其藥學上可接受的衍生物，任選與常規(guī)賦形劑和/或載體結合。為了更全面地理解本發(fā)明，將進行下列更詳細的說明。在此使用以下縮寫B(tài)OC或t-BOC是叔丁氧羰基；t-Bu是叔丁基；DMF是二甲基甲酰胺；EtOAc是乙酸乙酯；THF是四氫呋喃；NMM是4-甲基嗎啉CH2Cl2是二氯甲烷；MgSO4是硫酸鎂；Na2SO4是硫酸鈉；Ar是氬氣；EDC是1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，以及HOBT是1-羥基苯并三唑。同樣，在此所使用的每一下列術語，單獨使用或與其它術語一起使用，如下面所定義(除非另有與此相反的定義)術語“烷基”是指含有1-10個碳原子的飽和脂肪族基團或含有2-12個碳原子的單-或多不飽和脂肪族烴基。所述的單-或多不飽和脂肪族烴基分別含有至少一個雙鍵或三鍵?！巴榛笔侵钢ф溚榛蜔o支鏈的烷基?！逋榛宓睦影ê?-8個碳原子的直鏈烷基和含有3-8個碳原子的支鏈烷基。其它例子包括低級烷基，其是含有1-6個碳原子的直鏈烷基和含有3-6個碳原子的支鏈烷基。應當理解，使用″alk″或″烷基″前綴的任何組合術語是指根據(jù)上面定義的″烷基″類似物。例如，術語如″烷氧基″、″烷硫基″是指通過氧或硫原子與第二個基團連接的烷基?！逋轷；迨侵概c羰基(C＝O)連接的烷基。在此所述的每一烷基或烷基類似物應該理解成任選被部分或全部鹵化的。碳環(huán)是指芳香族的″芳基″或部分飽和的，或非芳香族的環(huán)烷基。術語″環(huán)烷基″是指如上所定義的烷基的環(huán)狀類似物。環(huán)烷基的例子是飽和的或不飽和的非芳香族的含有3-8個碳原子的環(huán)烷基，以及其它例子包括具有3-6個碳原子的環(huán)烷基。在此所述的每一環(huán)烷基應該理解成被任選部分或全部鹵化的。術語″芳基″是指苯基和萘基。術語″鹵素″是指選自氟、氯、溴或碘的鹵素基團。本發(fā)明的代表性的鹵素基團是氟、氯和溴。術語″雜芳基″是指穩(wěn)定的5-8員(但優(yōu)選，5或6員)單環(huán)或8-11員二環(huán)芳香族雜環(huán)基團。每一雜環(huán)由碳原子和1-4個選自氮、氧和硫的雜原子組成。該雜環(huán)可以通過環(huán)的任何原子連接，其導致形成一種穩(wěn)定的結構?！咫s芳基″的例子包括基團例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、四唑基、噻二唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、中氮茚基、吲哚基、異吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、嘌呤基、喹嗪基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基和吩噁嗪基。術語″雜環(huán)″是指穩(wěn)定的4-8員(但優(yōu)選，5或6員)單環(huán)或8-11員二環(huán)雜環(huán)基團，其可以是飽和的或不飽和的，以及是非芳香族的。每一雜環(huán)由碳原子和1-4個選自氮、氧和硫的雜原子組成。該雜環(huán)可以通過環(huán)的任何原子連接，其導致形成一種穩(wěn)定的結構?！咫s環(huán)″的例子包括基團例如吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、哌啶基、嗎啉基、硫代嗎啉基、吡喃基、硫代吡喃基、哌嗪基、二氫吲哚基、氮雜環(huán)丁烷基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、四氫呋喃基、六氫嘧啶基、六氫噠嗪基、1，4，5，6-四氫嘧啶-2-基胺、二氫-噁唑基、1，2-噻嗪烷基(thiazinanyl)-1，1-二氧化物、1，2，6-噻二嗪烷基-1，1-二氧化物、異噻唑啉基-1，1-二氧化物和咪唑烷基-2，4-二酮。術語″雜環(huán)″、″雜芳基″或″芳基″，當與另一部分相連時，除非另有說明，應該具有上面所給出的相同含義。例如，″芳酰基″是指與羰基(C＝O)相連的苯基或萘基。除非另有說明，每一芳基或雜芳基包括它的部分或全部氫化的衍生物。例如，喹啉基可以包括十氫喹啉基和四氫喹啉基，萘基可以包括它的氫化衍生物例如四氫萘基。在此所述的芳基和雜芳基化合物的其它部分或全部氫化的衍生物對本領域普通熟練技術人員來說是顯而易見的。術語″胺″應該理解為是指-NH2基團，其中每一氫原子可以被烷基、碳環(huán)、碳環(huán)烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜環(huán)、雜環(huán)烷基代替，這樣該胺的氮可以被所述基團單-或二-取代。如上面和整個本申請所使用的，″氮″和″硫″包括氮和硫的任何氧化形式以及任何堿性氮的季銨化形式。為了更充分地理解本發(fā)明，將對下列實施例進行闡述。這些實施例用于說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是并不是以任何方式將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。下面的實施例是說明性的，這一點可以被本領域熟練技術人員認識到，如果需要，對于個別化合物可以改變具體試劑或條件。在方案中所使用的初始原料或者是市場上可買到的，或者容易地由本領域熟練技術人員從市場上可買到的原料進行制備。一般合成方法本發(fā)明還提供在此所述的本發(fā)明化合物的制備方法。本發(fā)明的化合物可以通過美國專利號6,420,364和6,525,052中所述的方法以及通過本領域熟練技術人員公知的方法進行制備，這兩篇文獻在此整個引入作為參考。為了更充分地理解本發(fā)明，將對下列實施例進行闡述。這些實施例用于說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是并不是以任何方式將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。下面的實施例是說明性的，這一點可以被本領域熟練技術人員認識到，如果需要，在沒有過度實驗的情況下，對于個別化合物可以改變具體試劑或條件。在方案中所使用的初始原料或者是市場上可買到的，或者容易地由本領域熟練技術人員從市場上可買到的原料進行制備。合成實施例實施例1-4說明用于合成新的式(I)化合物的P2氨基酸中間體的合成。實施例12-叔丁氧基羰基氨基-4，4，5，5-三甲基-己酸的合成在氬氣氛中，將二異丙基氨基鋰(LDA)(1.5M的環(huán)己烷/THF/乙苯溶液)(106mL，160mmol，1.15當量)注射到1000mL圓底燒瓶中。加入干燥THF(150mL)，接著用干冰/丙酮浴將混合物冷卻至-78℃。在10分鐘內，通過注射器滴加3，3-二甲基-丁酸乙酯(20g，23.3mL，139mmol，1.0當量)，接著在-78℃攪拌1小時。在10分鐘內，用注射器滴加碘甲烷(9.5mL，152mmol，1.1當量)，接著將該奶油狀混合物在-78℃攪拌1小時，得到一種非常稠的混合物。除去干冰浴，以0℃冰浴代替。加入另外150mL干燥THF，接著加入另外的LDA(106mL，160mmol，1.15當量)。將所得混合物攪拌10分鐘，然后將該圓底燒瓶再浸于干冰/丙酮浴中。再繼續(xù)攪拌50分鐘，然后滴加碘甲烷(9.5mL，152mmol，1.1當量)，除去干冰/丙酮浴，然后將所得混合物在環(huán)境溫度下攪拌14小時。反應混合物用3mL濃HCl淬滅，加入2N的HCl直到pH值調節(jié)到＜1為止?；旌衔镞M一步用150mL水和500mLEt2O稀釋。分離層，有機層用1×100mL2NHCl、1×100mL飽和NaHCO3和1×200mL鹽水洗滌。有機層在Na2SO4中干燥，然后在真空中進行濃縮，得到與乙苯混合的橙色油形式的2，2，3，3-三甲基丁酸乙酯，通過NMR分析獲知其中19.8g是產品(80％的收率)。該混合物沒有進一步提純就使用。裝有攪拌棒的500mL圓底燒瓶用氬氣沖洗，接著裝入50mL干燥THF和1MLiAlH4在Et2O中的溶液(70.6mL，70.6mmol，0.625當量)。用冰浴將該溶液冷卻至0℃，以使該溶液不會回流的速度(需要50分鐘)向其中滴加上述乙酯(19.5g，113mmol，1.0當量)(約50％的乙苯溶液)。加入所述的酯后，反應在0℃攪拌2小時，然后在環(huán)境溫度下攪拌14小時。將該反應溶液再次冷卻至0℃，然后通過加入EtOAc小心地淬火反應。加入1NNaOH直到生成粒狀沉淀為止(7.5mL)。將該混合物在硅藻土墊上過濾，然后用3×100mLEt2O洗滌。合并有機物并在Na2SO4中干燥。將所述的溶液潷析，接著在真空中進行濃縮，得到幾乎無色油形式的2，2，3，3-四甲基-丁醇(12.9g，88％的粗收率，與乙苯的混合物)。該粗產物沒有進一步提純就使用。1000mL圓底燒瓶安裝有攪拌棒，用氬氣沖洗，然后裝入500mL干燥CH2Cl2和2，2，3，3-四甲基-丁醇(12.9g，99.2mmol，1.0當量)。在5分鐘內分批加入氯鉻酸吡啶鎓(pyridiniumchlorochromate)(PCC)(20.7g，96mmol)。反應混合物迅速變?yōu)榘瞪又谑覝叵聰嚢?小時。然后潷析除掉反應溶劑，用1NHCl(1×250mL)洗滌，在旋轉蒸發(fā)儀上濃縮。所得糊狀殘余物與己烷(300mL)一起攪拌10分鐘，然后過濾。濾液用Na2SO4干燥，過濾，濃縮，得到8.3g(65％收率)的所需2，2，3，3-四甲基-丁醛，其沒有進一步提純就使用。干燥250mL圓底燒瓶安裝有攪拌棒并用氬氣沖洗。加入干燥THF(40mL)，接著加入1.0M叔丁醇鉀溶液(37.5mL，37.5mmol，1.2當量)。將所述的溶液在干冰/丙酮浴中冷卻至-78℃。在10分鐘內滴加異氰基乙酸甲酯(3.12mL，34.4mmol，1.0當量)。所得混合物再攪拌5分鐘，接著通過注射器加入2，2，3，3-四甲基-丁醛(4.0，31.2mmol，1.0當量)。除去冷卻浴，所得混合物在室溫下攪拌1小時。通過加入125mLEt2O、20g冰和2mLAcOH的混合物，對反應混合物進行稀釋。冰融后，加入50mL水，將所述的層混合，然后分離。有機層用1×50mL飽和NaHCO3洗滌，接著在Na2SO4中干燥。將有機層潷析，濃縮。將該粗烯酰胺(enamide)用硅膠快速色譜法提純，使用CH2Cl2至含4％MeOH的CH2Cl2洗脫，得到稠的油狀物的2-甲酰氨基-4，4，5，5-四甲基-己-2-烯酸乙酯(5.26g，74％)；C12H21NO3的m/z計算值227.3，實測值228.3(M+H)+。在Parr瓶中，將上述甲酯(5.26g，23.2mmol，1.0當量)溶于35MeOH中，接著加入PtO2(1g，4.4mmol，0.2當量)?；旌衔镌赑arr氫化裝置中搖動4天，在此期間用MS監(jiān)測起始物料的消耗情況。液體小心地進行潷析，Pt用20mLMeOH洗滌3次，每次進行潷析，注意不要使Pt干燥(如果讓Pt干燥，Pt可能會引燃)。合并含還原產物的MeOH溶液，接著濃縮成稠的油狀物，然后將該稠的油狀物懸浮在25mL6NHCl中，將混合物回流4小時，在第一個3小時結束時加入5mL濃HCl。冷卻混合物，在真空中在70℃的浴溫下除去水和過量的HCl。約50％濃縮后，形成片狀結晶固體。將混合物冷卻至0℃，接著通過過濾收集沉淀。濾液再次濃縮約50％，再次冷卻至0℃，得到第二次收成的晶體。合并晶體，在高真空中干燥，得到灰白色結晶固體形式的2-氨基-4，4，5，5-四甲基-己酸鹽酸鹽(1.40g，27％收率)；C10H21NO2的m/z的計算值187.3，實測值188.3(M+H)+。將上述氨基酸鹽(1.40g，6.26mmol，1.0當量)溶于100mL50/50二噁烷/4NNaOH中。溶液冷卻至0℃，加入Boc酸酐(2.05g，9.39mmol，1.5當量)。除去冷卻浴，該反應在環(huán)境溫度下攪拌16小時。用濃HCl將pH值小心調節(jié)到2，接著產物用3×100mLCH2Cl2萃取。合并有機層并在Na2SO4中干燥。溶液進行潷析接著用100mL己烷作為驅逐劑(chaser)進行濃縮，得到一稠玻璃，將其用100mL己烷研磨。劇烈攪拌4小時后，得到蠟狀固體，過濾，在空氣中干燥，得到標題化合物(1.21g，67％收率)；C15H29NO4的m/z的計算值287.4，實測值286.3(M-H)-。實施例22-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸的合成將3，3-二甲基-戊-4-烯酸甲酯(20.0mL，126mmol，1.00當量)通過移液管小心加入到含LiAlH4(3.63g，96mmol，0.76當量)的500mL無水乙醚的懸浮液的2L燒瓶中(通過冰水浴冷卻)。攪拌下將反應混合物溫熱至室溫過夜，然后通過緩慢加入飽和酒石酸鉀鈉溶液(150mL)淬火反應。該混合物用醚(200mL)稀釋，接著分離有機層，干燥(MgSO4)，濃縮，得到無色液體形式的3，3-二甲基-戊-4-烯-1-醇(11.0g，76％收率)。這種物質沒有進一步提純就使用；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.00(s，6H)，1.58(t，J＝7.3Hz，2H)，2.07(s，1H)，3.59(t，J＝7.3Hz，2H)，4.89-4.94(m，2H)，5.80(dd，J＝17.3，14.1，1H)。將無水DMSO(17.1mL，241mmol，2.5當量)滴加到用干冰/丙酮浴冷卻的草酰氯(10.5mL，120mmol，1.25當量)的干燥CH2Cl2(400mL)溶液中。將這種溶液攪拌45分鐘，然后通過套管(cannula)加入作為在CH2Cl2(50mL)中溶液形式的3，3-二甲基-戊-4-烯-1-醇(11.0g，96.3mmol，1.00當量)。將所得溶液在-78℃攪拌2小時。加入三乙胺(54mL，385mmol，4.0當量)，接著除去冷卻浴。將反應溫熱至室溫并再攪拌1.5小時。然后，將反應混合物用CH2Cl2(100mL)稀釋，接著依次用飽和Na2CO3溶液和1NHCl(500mL)洗滌。將有機相進行干燥(MgSO4)，濃縮，將所得殘余物放入石油醚(100mL)中，通過硅膠短塞過濾，得到所需的無色液體形式的3，3-二甲基-戊-4-烯-1-醛(5.80g，54％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.14(s，6H)，2.33(d，J＝3.1Hz，2H)，4.98-5.03(m，2H)，5.92(dd，J＝17.0，6.0，1H)，9.71(t，J＝3.1Hz，1H)。將N-(芐氧基羰基)-α-膦酰甘氨酸三甲酯(15.0g，45.3，1.00當量)、3，3-二甲基-4-戊-4-烯-1-醛(5.64g，50.3mmol，1.11當量)和DBU(6.8mL，45.5mmol，1.0當量)在干燥THF(150mL)中的溶液在室溫下攪拌16小時。將反應混合物用醚(200mL)稀釋，用水(2×100mL)洗滌，然后用鹽水(100mL)洗滌。將有機層進行干燥(MgSO4)，濃縮。將所得殘余物進行硅膠色譜分離，使用含乙酸乙酯的己烷作為梯度洗脫液，得到黃色油狀形式的所需的烯酰胺，該黃色油靜置時固化(8.60g，60％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.03(s，6H)，2.21(d，J＝7.3Hz，2H)，3.75(s，3H)，4.94-4.98(m，2H)，5.14(s，2H)，5.78(dd，J＝10.9，10.0Hz，1H)，6.10-6.20(m，1H)，6.65(t，J＝7.3Hz)，7.33-7.38(m，5H)。在40psi氫氣下，將10％Pd/C催化劑(1.25g)、(Z)-2-芐氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚-2，6-二烯酸甲酯(8.60g，27mmol，1.0當量)和Boc酸酐(6.48g，29.7mmol，1.1當量)在甲醇(100mL)中的懸浮液在Parr氫化裝置上搖動3天。將反應混合物通過硅藻土墊過濾，濃縮，得到白色固體形式的叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸甲酯(6.10g，79％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ0.77(t，J＝15.1Hz，3H)，0.80(s，6H)，1.1-1.3(m，4H)，1.42(s，9H)，1.55-1.65(m，1H)，1.7-1.8(m，1H)，3.74(s，3H)，4.20-4.35(m，1H)，4.95-5.05m，1H)。在室溫下，將上述甲酯(6.10g，21.2mmol，1.00當量)和氫氧化鋰一水合物(6.2g，148mmol，6.98當量)在四氫呋喃(20mL)、甲醇(5mL)和水(5mL)中的懸浮液攪拌5小時。將反應混合物用乙醚(100mL)稀釋，接著用1NHCl(2×50mL)洗滌。干燥有機層(MgSO4)，濃縮，得到白色固體形式的標題化合物(5.05g，87％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ0.74-0.82(m，9H)，1.10-1.28(m，4H)，1.45(s，9H)，1.52-1.63(m，1H)，1.75-1.90(m，1H)，4.20-4.30(m，1H)，4.94-5.02(m，1H)。實施例3(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸的合成將R，R-DIPAMP環(huán)辛二烯Rh(I)四氟硼酸酯(190mg，0.25mmol，0.04當量)加入到在Paar氫化燒瓶中的(Z)-2-芐氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚-2，6-二烯酸甲酯(2.00g，6.30mmol，1.00當量)在干燥甲醇(20mL)中的溶液中。抽空反應器并用氫氣沖洗3次，然后在50psi氫氣下劇烈搖動過夜。將反應混合物在真空中進行濃縮，然后通過硅膠塞過濾，使用乙酸乙酯的己烷溶液作為梯度洗脫液，得到黃色油狀形式的(S)-2-芐氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸甲酯(1.63g，81％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ0.74-0.90(m，9H)，1.10-1.30(m，4H)，1.58-1.70(m，1H)，1.75-1.90(m，1H)，3.75(s，3H)，4.30-4.40(m，1H)，5.14(s，2H)，5.24-5.33(m，1H)，7.30-7.37(m，5H)；[α]20D＝+15.57c＝2.00，CHCl3。在Paar反應器中，將10％Pd/C催化劑(160mg)加入到上述帶Cbz保護基的氨基酸(1.63g，5.07mmol，1.00當量)和Boc酸酐(1.16g，5.32mmol，1.05當量)在甲醇(25mL)中的溶液中。將反應混合物在50psi氫氣中搖動過夜。通過硅藻土墊過濾反應混合物，濃縮所得濾液，得到1.33g(91％收率)的Boc保護的中間體。這種物質沒有進一步提純就使用。在室溫下，將上述Boc保護的中間體(1.33g，4.63mmol，1.00當量)和氫氧化鋰一水合物(1.36g，32.4mmol，7.00當量)在四氫呋喃(5mL)、甲醇(2mL)和水(2mL)中的懸浮液攪拌5小時。將反應混合物用乙醚(100mL)稀釋，接著用1NHCl(2×50mL)洗滌。干燥有機層(MgSO4)，濃縮，得到白色固體形式的標題化合物(991，78％收率)。1HNMR與外消旋產物(實施例2)相符。實施例4(R)-2-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸的合成通過它的對映異構體(實施例3)的類似方法制備得到這種化合物，但是使用R，RDuPhos銠三氟甲磺酸酯(R，RDuPhosrhodiumtriflate)作為不對稱氫化反應的催化劑。1HNMR與外消旋產物(實施例2)相符。實施例5-8說明上述本發(fā)明的新化合物的合成。實施例5嗎啉-4-羧酸[(S)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-4，4-二甲基-己基]-酰胺的合成將氯甲酸異丁酯(0.47mL，3.62mmol，1.00當量)滴加到用冰水浴冷卻下的(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸(實施例3)(991mg，3.62mmol，1.00當量)和4-甲基嗎啉(1.2mL，10.9mmol，3.00當量)在10.0mL無水THF中的溶液中。將反應混合物溫熱至室溫并攪拌30分鐘。然后，加入N-甲基哌啶氨基腈(500mg，3.60，0.99當量)在干燥THF(5.0mL)中的溶液，接著在室溫下繼續(xù)攪拌過夜。然后濃縮反應混合物，在乙酸乙酯(50mL)中吸收，接著用飽和Na2CO3(2×25mL)洗滌。將有機相進行干燥(MgSO4)，濃縮。將所得殘余物進行硅膠色譜分離，使用含甲醇的二氯甲烷作為梯度洗脫液，得到415mg(29％收率)所需的[(S)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲?；?-4，4-二甲基-己基]-氨基甲酸叔丁酯；C21H38N4O3的m/z的計算值394.5，實測值395.4(M+H)+。將上述叔丁酯(415mg，1.05mmol，1.00當量)用在二噁烷(10mL)中的4.0NHCl處理，接著將反應混合物在室溫下攪拌2小時。濃縮反應混合物，再懸浮在氯仿(50mL)中，濃縮，得到所需的(S)-2-氨基-5，5-二甲基-庚酸(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基)-酰胺鹽酸鹽(307mg，78％收率)。C16H30N4O的m/z的計算值294.4，實測值295.1(M+H)+。在室溫下，將上述鹽酸鹽(301mg，0.82mmol，1.00當量)、嗎啉羰基氯(0.10mL，0.82mmol，1.00當量)和4-甲基嗎啉(0.27mL，2.4mmol，2.93當量)在干燥THF(5.0mL)中的懸浮液攪拌過夜。然后濃縮反應混合物，吸收到乙酸乙酯(50mL)中，接著用飽和Na2CO3(2×25mL)洗滌。將有機相進行干燥(MgSO4)，濃縮。所得殘余物進行硅膠色譜分離，使用含甲醇的二氯甲烷作為梯度洗脫液，得到白色固體形式的115mg(34％收率)的標題化合物；C21H37N5O3的m/z的計算值407.6，實測值408.6(M+H)+。手性HPLC表明＞97％ee(來自高級分離技術的ChirobioticT柱)。下列化合物通過類似于上面實施例中所述的方法進行制備嗎啉-4-羧酸[1-(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-3，3，4，4-四甲基-戊基]-酰胺C24H43N5O3的m/z的計算值449.6，實測值450.6(M+H)+；嗎啉-4-羧酸[1-(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基氨基甲?；?-4，4-二甲基-戊基]-酰胺必需的P2氨基酸中間體，2-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-己酸，通過類似于下面制備2-叔丁氧基羰基氨基-5，5-二甲基-庚酸(實施例2)的方法進行制備，用市場上可買到的3，3-二甲基丁-1-醛代替中間體3，3-二甲基-戊-4-烯-1-醇；C22H39N5O3的m/z的計算值421.6，實測值422.9(M+H)+；嗎啉-4-羧酸[1-(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基氨基甲?；?-4，4-二甲基-己基]-酰胺C23H41N5O3的m/z的計算值435.6，實測值436.5(M+H)+。實施例6嗎啉-4-羧酸[(S)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲?；?-4，4-二甲基-己基]-酰胺(6)的合成將10％Pd/C(1.5g)加入到用Cbz保護的氨基酸酯(參見實施例2)(27g，84mmol)和乙酸乙酯(135mL)的溶液中。抽空反應器中的空氣并用50psi氫氣充滿。反應混合物劇烈搖動16小時，然后通過大硅藻土墊過濾。濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，得到淺黃色油形式的所需的胺中間體(15.7g，100％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ0.74-0.79(m，9H)，1.14-1.23(m，4H)，1.40-1.80(m，2H)，3.37(t，J＝3.6Hz，1H)，3.69(s，3H)。向上述胺中間體(16.0g，85.4mmol，1.00當量)在干燥THF(300mL)中的溶液中加入4-甲基嗎啉(10.4mL，94mmol，1.10當量)，接著滴加嗎啉羰基氯(10.0mL，85.7mmol，1.00當量)。所述的反應混合物在室溫下攪拌5小時，然后用乙醚(400mL)稀釋，接著用1NHCl(2×500mL)洗滌。有機相進行干燥(MgSO4)，濃縮，得到白色固體形式的所需的(S)-5，5-二甲基-2-[(嗎啉-4-羰基)-氨基]-庚酸甲酯(22.5g，88％收率)；C15H28N2O4的m/z的計算值300.4，實測值301.1(M+H)+。將上述甲酯(12.9g，42.9，1.00當量)溶于甲醇(60mL)中，然后用1NLiOH(180mL，4.20當量)處理。反應混合物在室溫下攪拌2小時，然后用乙醚(200mL)洗滌。然后，用濃HCl將水相酸化至pH＜1并用乙醚(2×200mL)萃取。合并有機相，干燥(MgSO4)，濃縮，得到所需的羧酸(9.0g，73％收率)；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ0.79(t，J＝7.5Hz，3H)，0.82(s，6H)，1.60-1.73(m，1H)，1.80-1.95(m，1H)3.37-3.42(m，4H)，3.69-3.72(m，4H)，4.30-4.40(m，1H)，4.96-5.04(m，1H)。將上述羧酸(4.5g，15.7mmol，1.08當量)、HOBT(2.93g，21.7mmol，1.5當量)和EDC(3.06g，16.0mmol，1.10當量)在干燥二氯甲烷中的混合物在0℃攪拌35分鐘。一次性加入4-氨基-1-甲基-哌啶-4-腈(2.02g，14.5mmol，1.00當量)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，接著將反應混合物溫熱至室溫過夜。在真空中除去溶劑，將粗產物溶于最少量的甲醇中，然后用水析出，得到白色固體形式的標題化合物(2.70g，42％收率)；C21H37N5O3的m/z的計算值407.6，實測值408.6(M+H)+；手性HPLC分析表明＞99％ee(來自高級分離技術的ChirobioticT柱)。下列化合物通過類似于上面實施例中所述的方法進行制備嗎啉-4-羧酸[(R)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲?；?-4，4-二甲基-己基]-酰胺C21H37N5O3的m/z的計算值407.6，實測值408.6(M+H)+；手性HPLC表明＞99％ee(來自高級分離技術的ChirobioticT柱)。實施例75，5-二甲基-2-(2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-庚酸(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基)-酰胺的合成將4-氯-苯并[e][1，3]噁嗪-2-酮(620mg，3.41mmol，2.0當量)、2-氨基-5，5-二甲基-庚酸(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基)-酰胺(675mg，1.71mmol，1.00當量)和4-甲基嗎啉(NMM)(0.56mL，5.09mmol，3.00當量)在乙腈(9.0mL)中的懸浮液在室溫下攪拌過夜。然后濃縮反應混合物，再懸浮到乙酸乙酯(50mL)中，接著用飽和Na2CO3溶液洗滌。將有機相干燥(MgSO4)，濃縮，然后將所得殘余物進行硅膠色譜分離，使用含甲醇的二氯甲烷作為梯度洗脫液，得到124mg(16％收率)的標題化合物；C26H37N5O3的m/z的計算值467.6，實測值468.4(M+H)+。下列化合物通過類似于上面實施例中所述的方法進行制備5，5-二甲基-2-(2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-庚酸(4-氰基-1-(3-嗎啉-4-基-丙基)-哌啶-4-基)-酰胺C30H44N6O4的m/z的計算值552.7，實測值553.9(M+H)+；5，5-二甲基-2-(2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-己酸(4-氰基-1-(2-嗎啉-4-基-乙基)-哌啶-4-基)-酰胺C28H40N6O4的m/z的計算值524.7，實測值525.5(M+H)+；5，5-二甲基-2-(2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-己酸{4-氰基-1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-哌啶-4-基}-酰胺該標題化合物通過方法3的改進方法進行制備；C27H39N5O5的m/z的計算值513.6，實測值514.5(M+H)+；5，5-二甲基-2-(2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-己酸(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基)-酰胺C23H31N5O3的m/z的計算值425，實測值426(M+H)+。實施例82-(7-氟-2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-5，5-二甲基-庚酸(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基)-酰胺的合成將2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(365mg，1.43mmol，1.00當量)加入到7-氟-4-硫代-3，4-二氫-苯并[e][1，3]噁嗪-2-酮(280mg，1.42mmol，1.00當量)、2-氨基-5，5-二甲基-庚酸(4-氰基-1-丙基-哌啶-4-基)-酰胺(627mg，1.42mmol，1.00當量)和N，N-二異丙基乙胺(1.00mL，5.74mmol，4.04當量)在THF(10.0mL)中的懸浮液中。反應混合物在室溫下攪拌過夜，然后濃縮，再懸浮到乙酸乙酯(50mL)中，接著用飽和Na2CO3溶液洗滌。將有機相干燥(MgSO4)，濃縮，然后將所得殘余物進行硅膠色譜分離，使用含甲醇的二氯甲烷作為梯度洗脫液，得到324mg(47％收率)的標題化合物；C26H36FN5O3的m/z的計算值485.6，實測值486.5(M+H)+。下列化合物通過類似于上面實施例中所述的方法進行制備2-(7-氟-2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-5，5-二甲基-己酸{4-氰基-1-(2-嗎啉-4-基-乙基)-哌啶-4-基}-酰胺C28H39FN6O4的m/z的計算值542.6，實測值543.5(M+H)+；2-(7-氟-2-氧代-2H-苯并[e][1，3]噁嗪-4-基氨基)-5，5-.二甲基-己酸{4-氰基-1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-哌啶-4-基}-酰胺C27H38FN5O5的m/z的計算值531.6，實測值532.4(M+H)+。治療用途的方法本發(fā)明的化合物用于抑制組織蛋白酶S的活性。在這種情況下，這些化合物用于阻斷由這些半胱氨酸蛋白酶介導的疾病過程。本發(fā)明的化合物有效地阻斷不變鏈通過組織蛋白酶S降解成CLIP，由此抑制抗原呈遞和抗原特異性免疫反應?？刂瓶乖禺愋悦庖叻磻侵委熥陨砻庖呒膊∫约捌渌幌Ｍ腡-細胞介導的免疫反應的吸引人的方法。因此，本發(fā)明的化合物可以用于治療這些病癥。這些包括自身免疫疾病以及其它疾病包括不適當?shù)目乖禺愋悦庖叻磻?，包括但不限于，類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、多發(fā)性硬化、吉-巴綜合征、牛皮癬、格雷夫斯氏疾病、重癥肌無力、硬皮病、腎小球腎炎、皮炎包括接觸性和特應性皮炎、胰島素依賴性糖尿病、子宮內膜異位和哮喘包括過敏性哮喘。本發(fā)明的化合物還可以用來治療與胞外蛋白水解有關的其它疾病例如阿爾茨海默氏病和動脈粥樣硬化。本發(fā)明的化合物還可以用來治療與不適當自身免疫反應、T-細胞介導的免疫反應或組織蛋白酶S介導的胞外蛋白水解有關的其它疾病，與上面在本發(fā)明
背景技術：
部分所列或所討論的那些沒有關系。因此，本發(fā)明還提供調節(jié)自身免疫性疾病的方法，包括給予需要這種治療的患者藥學有效量的本發(fā)明的化合物。對于治療應用，本發(fā)明的化合物可以以任何常規(guī)的劑型以任何常規(guī)的方式給藥。給藥途徑包括，但不局限于，靜脈內、肌內、皮下、滑膜內、輸注、舌下、經皮、經口、局部或吸入。優(yōu)選的給藥方式是經口給藥和靜脈注射。本發(fā)明的化合物可以單獨給藥，或與助劑一同給藥，這些助劑用于提高該抑制劑的穩(wěn)定性、在一些實施方案中促進含它們的藥物組合物的給藥、增加溶解度或分散度、增加抑制活性、提供輔助治療等等，包括與其它活性成分聯(lián)合給藥。有利地，這種聯(lián)合治療使用了常規(guī)治療的較低劑量，因此避免了當這些藥物用作單一療法時所帶來的可能毒性和不良副作用。本發(fā)明的化合物實際上可以與常規(guī)治療劑或其它佐劑結合在一起形成單一的藥物組合物。有利地，然后可將該化合物以單一劑型給藥。在一些實施方案中，包含這些化合物組合的藥物組合物含有至少約15％，更優(yōu)選至少約20％的本發(fā)明的化合物(w/w)或其組合。做為選擇，所述的化合物可以單獨給藥(連續(xù)或并行)。單獨給藥考慮到給藥方法(dosingregime)的更大適應性。如上所述，本發(fā)明化合物的劑型包括本領域熟練技術人員已知的那些藥學上可接受的載體和佐劑。這些載體和佐劑例如包括離子交換劑、礬土、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白、緩沖物質、水、鹽或電解質以及基于纖維素的物質。優(yōu)選的劑型包括片劑、膠囊、小膠囊、液體、溶液、懸浮液、乳劑、錠劑、糖漿、可稀釋配制的粉劑(reconstitutablepowder)、顆粒劑、栓劑和皮膚貼劑(transdermalpatch)。制備這些劑型的方法是已知的(例如參見，H.C.Ansel和N.G.Popovish，PharmaceuticalDosageFormsandDrμgDeliverySystems，5thed.，LeaandFebiger(1990))。在本領域中，劑量水平和要求是公知的，并且可以由本領域普通技術人員根據(jù)適于特定患者的方法和技術進行選擇。在一些實施方案中，對于70kg患者，劑量水平的范圍在約10-1000mg/劑量之間。雖然每天一個劑量可能已經足夠，但是每天最高可以給予5個劑量。對于口服劑量，可能需要高達2000mg/天。本領域熟練技術人員應當理解，根據(jù)特定因素可能需要較低的或較高的劑量。例如，具體劑量和治療方案將取決于因素如患者的一般健康狀況、患者疾病的嚴重程度和進程或對其的處置，以及主治醫(yī)師的判斷。生物學特性的評價重組人組織蛋白酶S的表達和純化人組織蛋白酶S的克隆使U937RNA與引物A(5’cacaatgaaacggctggtttg3’)及引物B(5’ctagatttctgggtaagaggg3’)進行逆轉錄酶/聚合酶鏈式反應，所述引物用來特異地擴增組織蛋白酶ScDNA。將所得的900bpDNA片段亞克隆入pGEM-T(Promega)并進行測序以證實它的同一性(identity)。該構建體用于所有隨后的操作中。這種方法是已知基因的常規(guī)克隆法并且已經在其領域中確定。通過如下方法從pGem-T載體(Promega，2800WoodsHollowRd，Madison，WI53711)除去人Pre-Pro-CatS限制酶SacII消化，接著用T4DNA聚合酶處理生成鈍端，然后用第二種限制酶SalI消化。將它亞克隆入已經用限制酶BamH1切割并鈍端化然后用限制酶SalI切割的pFastBac1供體質粒(GibcoBRL，8717GrovemontCr.，Gaithersburg，MD20884)中。將該連接混合物用來轉化DH5a感受態(tài)細胞(GibcoBRL)，并鋪在含100μg/ml氨芐青霉素的LB板上。菌落在含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)物中生長，分離質粒DNA，然后通過限制酶消化確認正確的插入子。將重組pFastBac供體質粒轉化入DH10Bac感受態(tài)細胞(GibcoBRL)。從含50μg/mL卡那霉素、7μg/ml慶大霉素、10μg/mL四環(huán)素、100μg/mLBluo-gal和40μg/mlIPTG的LB板中挑取大的白色菌落。分離DNA并使用CellFECTIN試劑(GibcoBRL)轉染Sf9昆蟲細胞。72小時后收獲細胞和上清液。病毒上清液傳代兩次，通過對上清液進行PCR來證實CatS的存在。SF9細胞用重組體桿狀病毒以MOI5感染48-72小時。裂解細胞，在pH4.5的緩沖液中、37℃保溫2小時以將CatS從原(pro)-形式激活為活性成熟形式(Bromme，D&McGrath，M.，ProteinScience，1996，5789-791)。使用兔抗人原(pro)CatS進行SDS-PAGE和Western印跡，來證實CatS的存在。組織蛋白酶S的抑制作用在桿狀病毒中表達的人重組體組織蛋白酶S以在緩沖液中終濃度10nM來使用。緩沖液是50mM乙酸鈉，pH6.5，2.5mMEDTA，2.5mMTCEP。酶與化合物或DMSO在37℃培養(yǎng)10分鐘。底物7-氨基-4-甲基香豆素、CBZ-L-纈氨酰-L-纈氨酰-L-精氨酸酰胺(由MolecularProbes依定制合成)在水中稀釋至20μM(最終濃度為5M)，加入以進行實驗并再在37℃培養(yǎng)10分鐘?；衔锏幕钚酝ㄟ^與DMSO對照相比，在360nm激發(fā)和460nm發(fā)射的熒光減小來測定。上面所列例子用于評價上述實驗中組織蛋白酶S的抑制作用。除嗎啉-4-羧酸[(R)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲?；?-4，4-二甲基-己基]-酰胺外，所有化合物具有100nM或更低的IC50值。組織蛋白酶L的抑制除人組織蛋白酶L(AthensResearch，Georgia)代替組織蛋白酶S外，這種方案與上述測定組織蛋白酶S抑制作用的方案相同。上面所列例子用于評價上述試驗中組織蛋白酶L的抑制作用。所有化合物具有約或大于1000nM的IC50值。除嗎啉-4-羧酸[(R)-1-(4-氰基-1-甲基-哌啶-4-基氨基甲酰基)-4，4-二甲基-己基]-酰胺外，上面的例子表明，基于這些分子試驗，組織蛋白酶S的選擇性超過組織蛋白酶L的選擇性的50至5000倍(以組織蛋白酶LIC50/組織蛋白酶SIC50計算)。權利要求1.式(I)或(II)的化合物，或其藥學上可接受的鹽其中X在每種情況下選自和R1選自氫或支鏈烷基或直鏈烷基，鏈中的每個碳原子任選被1-3個選自O、S和N-R2的雜原子所代替，其中R2是氫或烷基；以及其中R1任選進一步被一個或多個烷氧基、胺、鹵素、碳環(huán)、雜芳基或雜環(huán)取代。2.根據(jù)權利要求1的化合物，其中在式(I)中X選自R1選自氫或支鏈的C1-10烷基或直鏈的C1-10烷基，鏈中的每個碳原子任選被1-3個選自O、S和N-R2的雜原子所代替，其中R2是氫或C1-5烷基；以及其中R1任選進一步被一個或多個C1-5烷氧基、胺、雜環(huán)或鹵素取代。3.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中R1是C1-5烷基。4.根據(jù)權利要求1、2或3中任一項的化合物，其中R1是C1-3烷基，優(yōu)選甲基。5.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中R1選自和6.根據(jù)權利要求1-5中任一項的化合物，其中式(I)的化合物是(S)對映異構體，其在下面所示的手性碳處具有天然氨基酸構型7.化合物或其藥學上可接受的鹽，所述化合物選自和8.化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該化合物是其中所示的手性碳是具有天然氨基酸構型的(S)對映異構體。9.化合物或其藥學上可接受的鹽，所述化合物選自和10.權利要求1-9定義的化合物在治療疾病或病癥中的用途，所述疾病或病癥選自類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、多發(fā)性硬化、吉-巴綜合征、牛皮癬、格雷夫斯氏疾病、重癥肌無力、硬皮病、腎小球腎炎、皮炎，包括接觸性和特應性皮炎、胰島素依賴性糖尿病、子宮內膜異位、哮喘、阿爾茨海默氏病和動脈粥樣硬化。11.權利要求1-9定義的化合物的用途，用于制備適于治療自身免疫性疾病或病癥、與不適當自身免疫反應、T-細胞介導的免疫反應或由組織蛋白酶S介導的胞外蛋白水解有關的疾病的藥物組合物。全文摘要本發(fā)明涉及式(I)和(II)的肽基化合物，作為組織蛋白酶S，一種半胱氨酸蛋白酶，抑制劑具有活性。所述的化合物是組織蛋白酶S的選擇性可逆抑制劑，因此用于治療自身免疫以及其它疾病。本發(fā)明還涉及這些化合物的制備方法以及包含它們的藥物組合物。文檔編號A61P37/00GK1761652SQ200480006887公開日2006年4月19日申請日期2004年3月3日優(yōu)先權日2003年3月13日發(fā)明者尤金·R·?；?劉為民,孫三興,揚西·D·沃德,埃里克·R·R·揚申請人:貝林格爾·英格海姆藥物公司