專利名稱：高親和力抗人類IgE抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高親和力人類單克隆抗體，尤其那些針對免疫球蛋白E(IgE)的同型決定子的高親和力人類單克隆抗體，以及這些抗體的直接等效物及衍生物。這些抗體可以一比原始親代抗體高至少100倍的親和力與其各自的靶相結(jié)合。這些抗體可用于診斷、預(yù)防和治療疾病。
背景技術(shù)：
過敏為一種由對一異源物質(zhì)(例如過敏原)的過度免疫反應(yīng)引發(fā)的超敏狀態(tài)。速發(fā)型(I型)超敏反應(yīng)的特征為與過敏原接觸后立即出現(xiàn)過敏反應(yīng)，其通過B細胞介導(dǎo)并且是基于抗原-抗體反應(yīng)。遲發(fā)型超敏反應(yīng)通過T細胞介導(dǎo)并且是基于細胞免疫機理。近些年來，術(shù)語“過敏”變得越來越與I型超敏反應(yīng)具有相同含義。
速發(fā)型超敏反應(yīng)這一反應(yīng)是基于由B細胞產(chǎn)生免疫球蛋白E類的抗體(IgE抗體)這一現(xiàn)象，當(dāng)B細胞與過敏原接觸時其會分化成抗體分泌漿細胞。IgE引發(fā)反應(yīng)是一發(fā)生在過敏原進入身體的位置(即粘膜表面及/或局部淋巴結(jié))處的局部事件。局部產(chǎn)生的IgE將首先敏化局部肥大細胞，即IgE抗體的恒定區(qū)與肥大細胞表面上的Fcε受體結(jié)合，然后“溢出”的IgE進入循環(huán)系統(tǒng)并整個身體中的循環(huán)嗜堿性粒細胞及組織固定的肥大細胞二者上的受體結(jié)合。當(dāng)所結(jié)合的IgE隨后與過敏原接觸時，F(xiàn)cε受體通過過敏原的結(jié)合而被交聯(lián)，造成細胞脫粒并釋放許多過敏介體，例如組胺、前列腺素、白細胞三烯等。這些物質(zhì)的釋放導(dǎo)致速發(fā)型超敏反應(yīng)的典型臨床癥狀，即呼吸道或腸道平滑肌收縮，小血管擴張且其對水及血漿蛋白質(zhì)的通透性增加，分泌粘液并從而導(dǎo)致例如過敏性鼻炎，變應(yīng)性濕疹及哮喘，以及刺激皮膚神經(jīng)末端從而導(dǎo)致瘙癢及疼痛。另外，當(dāng)?shù)诙闻c過敏原接觸時反應(yīng)加劇，這是因為某些B細胞在第一次與過敏原接觸后通過在細胞表面上表達IgE而形成表面IgE陽性B細胞(sIgE+B細胞)的“記憶池”。
有兩大類IgE受體，即高親和力受體FcεRI及低親和力受體FcεRII。FcεRI主要在肥大細胞及嗜堿性粒細胞的表面上表達，但在人類朗格漢斯細胞、樹突細胞及單核細胞上亦有少量表達，其中FcεRI在IgE介導(dǎo)的過敏原呈現(xiàn)中起作用。另外，已報導(dǎo)在人類嗜伊紅細胞及血小板存在FcεRI(Hasegawa，S.等人，Hematopoiesis，1999，932543-2551)。在B細胞、T細胞或嗜中性粒細胞的表面上未發(fā)現(xiàn)FcεRI。The expression of FcεRI在朗格漢斯細胞及皮膚樹突細胞上的表達在功能及生物學(xué)上對于過敏性個體中的IgE結(jié)合抗原的呈現(xiàn)均較為重要(KlubalR.等人，J.Invest.Dermatol.1997，108(3)336-42)。
低親和力受體FcεRII(CD23)為一凝集素樣分子，其包含三個完全相同的亞單位，該些亞單位具有自細胞質(zhì)膜的α螺旋卷曲柄延伸的頭結(jié)構(gòu)(Dierks，A.E.等人，J.Immunol.1993，1502372-2382)。當(dāng)與IgE結(jié)合時，F(xiàn)cεeRII與B細胞上參與調(diào)節(jié)IgE合成的CD21聯(lián)合(Sanon，A.等人，J.Allergy Clin.Immunol.1990，86333-344，Bonnefoy，J.等人，Eur.Resp.J.1996，963s-66s)。人們早已認識到FcεRII對于過敏原呈現(xiàn)的作用(Sutton及Gould，1993，Nature，366421-428)。與上皮細胞上的FcεRII結(jié)合的IgE負責(zé)特定及迅速的過敏原呈現(xiàn)(Yang，P.P.，J.Clin.Invest，2000，106879-886)。FceRII存在于數(shù)種細胞類型上，包括B細胞、嗜伊紅細胞、血小板、天然殺傷細胞、T細胞、濾泡樹突細胞及朗格漢斯細胞。
已鑒別出IgE細胞上與FcεRI及FcεRII相互作用的結(jié)構(gòu)實體。誘變研究已顯示，CH3結(jié)構(gòu)域同時介導(dǎo)IgE與FcεRI的相互作用(Presta等人，J.Biol.Chem.1994，26926368-26373；Henry A.J.等人，Biochemistry，1997，3615568-15578)及與FcεRII的相互作用(Sutton及Gould，Nature，1993，366421-428；Shi，J.等人，Biochemistry，1997，362112-2122)。這兩種高及低親和力受體的結(jié)合位點沿一穿過兩個CH3結(jié)構(gòu)域的中心旋轉(zhuǎn)軸對稱分布。FcεRI結(jié)合位點位于CH3結(jié)構(gòu)域中接近CH2結(jié)構(gòu)域接點的外側(cè)上，而FcεRII結(jié)合位點位于CH3的羧基端上。
一種前景良好的治療過敏的概念涉及施用單克隆抗體，這些單克隆抗體具IgE同種型特異性，因此能結(jié)合IgE。該方法是基于通過減量調(diào)節(jié)IgE免疫反應(yīng)來抑制過敏反應(yīng)，而IgE免疫反應(yīng)是引發(fā)過敏的最早事件并維持過敏狀態(tài)。由于不影響其他類抗體的反應(yīng)，因此可以對過敏癥狀達成一迅速并持久的影響。關(guān)于人類嗜堿性粒細胞密度的早期研究顯示，患者血漿中IgE的水平與每一嗜堿性粒細胞上FcεeRI受體的數(shù)量之間有關(guān)聯(lián)(Malveaux等人，J.Clin.Invest，1978，62176)。他們注意到，過敏性及非過敏性個體中的FcεRI密度介于每一嗜堿性粒細胞104至106個受體之間。后來證明，用抗IgE劑治療過敏性疾病可將循環(huán)IgE的量降低至治療前水平的1％(MacGlashan等人，J.Immunol.，1997，1581438-1445)。MacGlashan對從用全抗IgE抗體治療的患者中獲得的血清進行分析，其中全抗IgE抗體可結(jié)合在患者血清中循環(huán)的游離IgE。他們報導(dǎo)，降低患者體內(nèi)循環(huán)IgE的水平可導(dǎo)致嗜堿性粒細胞表面上的受體數(shù)量減少。因此，他們猜測，嗜堿性粒細胞及肥大細胞表面上FcεRI的密度直接或間接由循環(huán)IgE抗體的水平調(diào)節(jié)。
最近，WO 99/62550揭示使用IgE分子及片段，其結(jié)合至FcεRI及FcεRII IgE結(jié)合位點，從而阻斷IgE與受體的結(jié)合。然而，對這些過敏性疾病的治療不具有有害副作用的有效治療方法仍極為有限。一種治療過敏性疾病的方法涉及使用人源化抗IgE抗體來治療過敏性鼻炎及哮喘(Corne，J.等人，J.Clin.Invest.1997，99879-887；Racine-Poon，A.等人，Clin.Pharmcol.Ther.1997，62675-690；Fahy，J.V.等人，Am.J.Resp.Crit.Care Med.1997，1551824-1834；Boulet，L.P.等人，Am.J.Resp.Crit.Care Med.，1997，1551835-1840；Milgrom，E.等人，N.Engl.J.Med.，1999，3411966-1973)。這些臨床數(shù)據(jù)表明，抑制IgE與其受體的結(jié)合是一種治療過敏性疾病的有效方法。
適合作為抗過敏劑的抗體應(yīng)與可分化成產(chǎn)生IgE的血漿細胞的表面IgE陽性B細胞反應(yīng)，因此其可用于在功能上消除那些B細胞。然而，IgE抗體原則上亦可通過交聯(lián)Fcε受體引發(fā)IgE敏化的肥大細胞釋放介體，從而拮抗施加于血清IgE及slgE+B細胞水平上的有益作用。因此，適合于治療過敏的抗體必須能與敏化肥大細胞及嗜堿性粒細胞上結(jié)合的IgE反應(yīng)，但亦能保持識別slgE+B細胞的能力。
此等IgE同種型特異性抗體已由Chang等人(Biotechnology 8，122-126(1990))、歐洲專利第EP0407392號及數(shù)個美國專利例如美國專利第5,449,760號闡述。然而，由于所揭示的抗體不是來自人類，因此作為異源蛋白質(zhì)的免疫原性導(dǎo)致其不適合用于人類。這一缺點有可能通過將(例如)一嚙齒動物抗IgE單克隆抗體轉(zhuǎn)化成一嵌合抗體而降低，其中該嵌合抗體將嚙齒動物抗體的可變結(jié)構(gòu)域與人類抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起。該方法保留了嚙齒動物親代抗IgE抗體的抗原結(jié)合位點，同時賦予人類同種型及效應(yīng)功能。嵌合抗體的免疫原性可通過下述方法降低，即將嚙齒動物超變區(qū)(亦稱為互補決定區(qū)(CDR))嫁接到人類輕和重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的骨架，產(chǎn)生重構(gòu)人類抗體。該技術(shù)涉及將那些存在于“一般的”人類重及輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的序列用抗原特異性嚙齒動物CDR序列取代或重組嫁接(美國專利第6,180,370號)。
天然完整的免疫球蛋白或抗體包含一通常呈Y形的四聚體分子，該四聚體分子在每一上臂的末端具有一抗原結(jié)合位點。一抗原結(jié)合位點由一輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合一重鏈的可變結(jié)構(gòu)域而組成。更具體而言，一抗體的抗原結(jié)合位點主要由一重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)的3個CDR和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VI)的3個CDR形成。在VL及VH二者中，CDR均與4個骨架區(qū)(FR)交替出現(xiàn)，形成一具有以下通式的多肽鏈(i)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I)，其中該多肽鏈闡述為在N末端開始并在C末端結(jié)束。VH與VL的CDR亦分別稱為H1、H2、H3和L1、L2、L3。FR或CDR構(gòu)成成份通常是通過比較在同一物種中獲得的多個抗體的氨基酸序列來確定且一般鑒定規(guī)則在業(yè)內(nèi)為人習(xí)知(“Sequences of proteins of immunological interest”，Kabat E.A.等人，USdepartment of health and human service，Public health service，National Institute ofHealth)。
一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)合力的影響與相關(guān)重鏈可變結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)合力的影響相比較小，并且單獨的重鏈可變結(jié)構(gòu)域自身即具有一抗原結(jié)合活性。這些分子通常稱為單結(jié)構(gòu)域抗體(Ward，E.S.等人，Nature 341，544-546(1989))。
這些CDR形成環(huán)，其在該些結(jié)構(gòu)域內(nèi)與一β片狀骨架相連接。環(huán)的氨基酸序列與結(jié)構(gòu)間的關(guān)系可以用一個規(guī)則結(jié)構(gòu)模型描述(Chothia等人，Nature 342，887-883(1989))。根據(jù)此模型，抗體的每一超變區(qū)僅具有幾個主鏈構(gòu)造或“規(guī)則結(jié)構(gòu)”。這些構(gòu)造通過在CDR中和(對于某些環(huán)而言)在骨架區(qū)中特定位點處存在幾個關(guān)鍵氨基酸殘基來確定。
在不同的免疫球蛋白中具有相同構(gòu)造的超變區(qū)在這些位點處具有相同或非常相似的氨基酸殘基。
人們已對單克隆抗體實施CDR嫁接，產(chǎn)生結(jié)合親和力顯著低于嚙齒動物CDR供體抗體的人源化人類抗體。各種發(fā)現(xiàn)已經(jīng)顯示，除了CDR轉(zhuǎn)移外，在某些情況下可能需要在人類序列骨架內(nèi)進行變化，以在CDR嫁接產(chǎn)品中提供滿意的抗原結(jié)合活性。Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))揭示，一鼠科動物抗-Tac單克隆抗體的CDR可嫁接到一人類骨架中。該些人類骨架經(jīng)選擇，以最大化與鼠科動物序列的同源性。作者使用鼠科動物親代抗體的計算機模型來確定位于FR內(nèi)的其接近程度足以與這些CDR或抗原相互作用的氨基酸殘基。將這些殘基突變成在鼠科動物序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。此人源化抗-Tac抗體僅具有一約為該鼠科動物抗-Tac抗體的1/3的親和力，并且此抗體人類特征的維持也頗成問題。
治療IgE水平極高的疾病可需要一具較高親和力的抗體，以降低免疫原性的風(fēng)險，并將臨床適應(yīng)癥擴展至具有極高IgE水平的疾病，例如異位性皮炎。因此，人類期望獲得一人源化程度更高且對IgE的親和力更高的抗IgE抗體。本發(fā)明中的抗體為一抗人類IgE抗體，其具有超高親和力且更高程度的人類序列同源性，從而降低免疫原性風(fēng)險。
因此，人們需要更高親和力人源化抗體，這些更高親和力人源化抗體應(yīng)能降低治療疾病所需抗體的量，從而降低由藥物免疫原性對患者造成的潛在副作用并降低患者的花費。此外，本發(fā)明提高識別出高親和力抗體的可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及由一親代抗體產(chǎn)生的高親和力抗體，尤其是極高親和力抗IgE抗體。這些高親和性抗體可以一比原始親代抗體高至少20倍的結(jié)合親和力與靶抗原決定部位結(jié)合，其中親和力的增加為高約100倍至約5000倍。
本發(fā)明還涉及一種自一親代抗體分子制造此類高親和力抗體的方法，其係將人源化與親合力成熟的一非人類抗體結(jié)合于一與其它方法相比可顯著增強結(jié)合親和力的快速高效方法中。此方法涉及，通過產(chǎn)生一經(jīng)隨機取代的CDR及/或骨架區(qū)的文庫來同時或順次修飾親代抗體分子的CDR和骨架區(qū)，及篩選高親和力分子。
本發(fā)明一實施例


圖1是用于抗體克隆和篩選的噬菌體載體的示意圖。
圖2是用于產(chǎn)生抗體變體的寡核苷酸的示意圖。
圖3A繪示鼠科動物抗-IgE抗體TES-C21的輕鏈與L16和JK4組合人類模板的比較情況。
圖3B繪示TES-21的重鏈與組合人類模板DP88和JH4b的比較情況。
圖4展示與親代TES-21比較具高親和力的骨架殘基變體表。
圖5A及B繪示純系4、49、72、78、及136的ELISA滴定曲線，此是與TES-C21的親代Fab及陰性對照(5D12)相比較。
圖6繪示對純系2C、5A、及51的抑制分析，此是與親代TES-21和一陰性對照抗體相比較。
圖7A繪示具有一可導(dǎo)致甚至更高IgE親和力的有益突變組合的純系的序列。
圖8A和8B繪示純系136、1、2、4、8、13、15、21、30、31、35、43、44、53、81、90和113的整個輕鏈可變區(qū)的骨架序列。
圖9A和9B繪示35個純系的整個重鏈可變區(qū)的骨架序列。圖10A至F繪示純系136、2C、5I、5A、2B、及1136-2C的完整重鏈和輕鏈序列。
圖10A至F繪示純系136、2C、5I、5A、2B及1136-3C的完整重及輕鏈序列。
具體實施例方式
整個本申請案中所用術(shù)語應(yīng)理解為具有所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員習(xí)知的通常及典型意義。然而，本申請案的申請者期望下列術(shù)語具有如下所定義的特定定義。
短語“實質(zhì)上相同的”就一抗體鏈多肽序列而言可解釋為與參考多肽序列相比顯示至少70％、或80％、或90％或95％的序列一致性的抗體鏈。該術(shù)語就一核酸序列而言可解釋為與參考核酸序列相比顯示至少約85％、或90％、或97％的序列一致性的核酸序列。
術(shù)語“一致性”或“同源性”應(yīng)理解為指在比對序列并引入空位(若需要)以達到整個序列的最高百分比一致性后，候選序列中與擬比較對應(yīng)序列的殘基相同的氨基酸殘基的百分比，其中不將任何保守取代視為序列一致性的一部分。N-或C-末端延伸或插入均不應(yīng)理解為降低一致性或相同性。用于比對的方法及計算機程序在業(yè)內(nèi)眾所周知。序列一致性可使用序列分析軟件測量。
術(shù)語“抗體”以廣義使用，并且具體而言涵蓋單克隆抗體(包含全長單克隆抗體)、多克隆抗體和多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。抗體(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。盡管抗體可對于一特定靶展示結(jié)合特異性，但免疫球蛋白既包括抗體亦包括其他缺乏靶特異性的抗體樣分子。天然抗體和免疫球蛋白通常為約150,000道爾頓的四異聚體糖蛋白，由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成。每一條重鏈在一端均具有一可變結(jié)構(gòu)域(VH)，后接多個恒定結(jié)構(gòu)域。每一條輕鏈均在一端具有一可變結(jié)構(gòu)域(VL)并在其另一端具有一恒定結(jié)構(gòu)域。
本文所用“抗人類IgE抗體”指一以可抑制或?qū)嵸|(zhì)降低人類IgE與高親和力受體FcεRI結(jié)合的方式結(jié)合至人類IgE的抗體。術(shù)語“可變”在抗體可變結(jié)構(gòu)域之語境中指此一事實，即抗體之間的這些可變結(jié)構(gòu)域的某些部分在序列上極為不一致，并用于每一特定抗體對其特定靶的結(jié)合及特異性。然而，此可變性在抗體的所有可變區(qū)域中并非均勻分布。其集中于三個在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中均存在的片段中，這些片段稱為互補決定區(qū)(CDR)，又稱為超變區(qū)。可變結(jié)構(gòu)域中保守程序更高的的部分稱為骨架(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各包括4個主要采用一β-薄片構(gòu)造的FR區(qū)，其由三個CDR連接，形成環(huán)連接，在某些情況下形成β-薄片結(jié)構(gòu)的一部分。每一鏈中的CDR皆借助FR區(qū)緊密地結(jié)合在一起并與其他鏈的CDR一起促成抗體的靶結(jié)合位點的形成(參見Kabat等人)。除非另有說明，否則本文所用免疫球蛋白氨基酸殘基編號乃依照Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸殘基編號系統(tǒng)進行(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，National Institute of Health，Bethesda，Md.1987)。
術(shù)語“抗體片段”指一全長抗體的一部分，通常指靶結(jié)合或可變區(qū)。抗體片段的實例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。短語一抗體的“功能片段或類似物”是具有與全長抗體一樣的定性生物活性的化合物。例如，抗IgE抗體的一功能片段或類似物是一可與一IgE免疫球蛋白結(jié)合以便可防止此分子具有與該高親和力受體FcεRI結(jié)合的能力或?qū)嵸|(zhì)降低該能力的化合物。本文所用“功能片段”就抗體而言是指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。一“Fv”片段是最小的抗體片段，其包含一完整的靶識別和結(jié)合位點。此區(qū)域由一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域與一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域呈緊密非共價聯(lián)接的二聚體(VH-V1二聚體)組成。每一可變結(jié)構(gòu)域的三個CDR即是以該構(gòu)造相互作用，從而在該VH-V1二聚體的表面上界定一靶結(jié)合位點。這六個CDR共同賦予了此抗體靶結(jié)合特異性。然而，即使一單個可變結(jié)構(gòu)(或僅包含三個對一靶具特異性的CDR的半個Fv)亦具有識別和與靶結(jié)合的能力，但其親和力以比整個結(jié)合位點要低?！皢捂淔v”或“sFv”抗體片段包括一抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域呈一單多肽鏈形式。一般而言，F(xiàn)v多肽進一步包含一位于VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接體，該連接體能使sFv形成期望的靶結(jié)合結(jié)構(gòu)。Fab片段包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域及重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab′片段因在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端增加了幾個殘基而與Fab片段不同，這些殘基包括一或多個來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。F(ab′)片段是由在F(ab′)2胃蛋白酶消化產(chǎn)物的鉸鏈半胱氨酸處的二硫鍵斷裂而產(chǎn)生?？贵w片段的其他化學(xué)結(jié)合已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員習(xí)知。
本文所用術(shù)語“單克隆抗體”指一自一群實質(zhì)上同源的抗體獲得的抗體，即，構(gòu)成該抗體群的單個抗體除了可能含有天然發(fā)生的可少量存在的突變外完全相同。單克隆抗體具高度特異性，其針對一單個靶位點。而且，與通常包括針對不同決定子(抗原決定部位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制品相反，每一單克隆抗體皆針對靶上的一單個決定子。除其特異性外，單克隆抗體的優(yōu)勢在于其可通過雜交瘤培養(yǎng)合成，不受其他免疫球蛋白的污染。修飾詞“單克隆的”表明該抗體是自一實質(zhì)上同源的抗體群獲得的特性，不能理解為需要借助任一特殊方法來生產(chǎn)該抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可使用習(xí)知技術(shù)自噬菌體抗體文庫分離得到。依照本發(fā)明使用的親代單克隆抗體可通過由Kohler和Milstein(Nature 256，495，495(1975))最先闡述的雜交瘤方法制得，或可通過重組方法制得。
非人類(例如鼠科動物)抗體的“人源化”形式為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如，F(xiàn)v、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其他靶結(jié)合序列)，其包含最低限度的源自非人類免疫球蛋白的序列。一般而言，人源化抗體包含實質(zhì)上全部的至少一個且通常兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中全部的或?qū)嵸|(zhì)上全部的CDR區(qū)對應(yīng)于一非人類免疫球蛋的CDR區(qū)，且全部的或?qū)嵸|(zhì)上全部的FR區(qū)為人類免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。人源化抗體也可包括一免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)(通常為一所選人類免疫球蛋白模板的恒定區(qū))的至少一部分。
術(shù)語“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”包括子代。也應(yīng)了解，所有子代的DNA含量可能因特意的或無意的突變而不精確相同。當(dāng)在最初轉(zhuǎn)化的細胞中篩選時具有相同功能或生物學(xué)特性的變異子代可包括在內(nèi)。本發(fā)明所用的“宿主細胞”通常為原核宿主或真核宿主。
用DNA“轉(zhuǎn)化”一細胞有機體意指將DNA引入一有機體中，使該DNA可作為一染色體外因子或借助染色體整合而復(fù)制。用DNA“轉(zhuǎn)染”一細胞有機體是指細胞或有機體接納DNA(例如，一表達載體)，無論事實上是否有任何編碼序列被表達。術(shù)語“經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細胞”和“經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞”是指一將DNA引入其中的細胞。該細胞稱為“宿主細胞”，并且其可為原核細胞或真核細胞。典型的原核宿主細胞包括多種大腸桿菌菌株。典型的真核宿主細胞為哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人源細胞。所引入的DNA序列可能來自與宿主細胞相同的物種或來自一與宿主細胞不同的物種，或其可為一含有一些外來DNA和一些同源DNA的雜合DNA序列。
術(shù)語“載體”意指一種DNA構(gòu)筑體，其包含一可以操作方式連接至一能夠影響該DNA在一適宜宿主細胞中表達的控制序列的DNA序列。此類控制序列包括影響轉(zhuǎn)錄的啟動子、控制此轉(zhuǎn)錄的可選操縱序列、編碼適合的mRNA核糖體結(jié)合位點的序列和控制轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯的終止的序列。所述載體可為一質(zhì)粒、一噬菌體微?；騼H為一潛在的基因組插入體。一旦轉(zhuǎn)化到一適合的宿主中，該載體可不受宿主基因組限制而進行復(fù)制并行使作用，或在某些情況下可整合進基因組本身中。在本說明書中，由于質(zhì)粒是載體的最常用形式，因此“質(zhì)粒”和“載體”有時可互換使用。然而，本發(fā)明意欲涵蓋可起到等效作用并已經(jīng)或正在為業(yè)內(nèi)人士所了解的其他載體形式。
表述“控制序列”指一以可操作方式連接的編碼序列在一特定宿主有機體內(nèi)表達所必需的DNA序列。舉例而言，適于原核生物的控制序列包括啟動子、視情況操縱序列及核糖體結(jié)合位點。人們已經(jīng)知道，真核細胞可利用啟動子、聚腺苷酸化信號和增強子。若前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA表達為一參與一多肽分泌的前蛋白，則該前序列或分泌前導(dǎo)序列DNA能以可操作方式連接至此多肽的DNA；若一啟動子或增強子可影響一編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則此啟動子或增強子能以可操作方式連接至該編碼序列；或者，若一核糖體結(jié)合位點可影響一編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該核糖體結(jié)合位點能以可操作方式連接至該編碼序列；或者，若一核糖體結(jié)合位點之位置可促進轉(zhuǎn)譯，則該核糖體結(jié)合位點能以可操作方式連接至一編碼序列。一般而言，“以可操作方式連接”指被連接的DNA序列是連續(xù)的，并且當(dāng)為一分泌前導(dǎo)序列時是既連續(xù)又處于閱讀狀態(tài)。然而，增強子則無需是連續(xù)的。用于治療目的的“哺乳動物”指任何歸為哺乳動物的動物，包括人類、家畜及飼養(yǎng)動物、非人類靈長類動物，以及動物園中的動物、運動場上的動物或?qū)櫸?，例如狗、馬、貓、牛等等。
術(shù)語“抗原決定部位標記的”當(dāng)用于多肽語境中時指一與“抗原決定部位標簽”融合的多肽。該抗原決定部位標簽多肽具有足夠多的殘基以提供一可制造針對其的抗體的抗原決定部位，但卻足夠短而不會干擾多肽的活性。該抗原決定部位標簽最好也是相當(dāng)獨特，這樣抗體基本不會與其他抗原決定部位發(fā)生交叉反應(yīng)。適合的標簽多肽一般具有至少6個氨基酸殘基并通常介于約8至50個氨基酸殘基之間(較佳介于約9至30個殘基之間)。實例包括流感HA標簽多肽及其抗體12CA5(Field等人，Mol Cell.Biol.82159-2165(1988)))；c-myc標簽和針對其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體(Evan等人，Mol Cell.Biol.5(12)3610-3616(1985))；及單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標簽及其抗體(Paborsky等人，Protein Engineering 3(6)547-553(1990))。在某些實施例中，該抗原決定部位標簽可為一IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區(qū)的抗原決定部位，其中Fc負責(zé)增加IgG分子的體內(nèi)血清半衰期。
本文所用詞語“標記”指一可直接或間接地與一分子或蛋白質(zhì)(例如，抗體)結(jié)合的可檢測到的化合物或組合物。該標記自身可檢測到(例如，放射性同位素標記或熒光標記)或當(dāng)為酶標記時可催化一可檢測的基質(zhì)化合物或組合物的化學(xué)改變。
本文所用“固相”指一本發(fā)明抗體可粘附于其上的非水性基質(zhì)。本文所涵蓋固相的實例包括那些部分或完全由玻璃(例如，可控孔徑玻璃)、多糖(例如，瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮形成的固相。在某些實例中，視上下文而定，固相可包括分析板孔；在其他實施例中其可為一提純柱(例如，一親和色譜柱)。
本文所用術(shù)語“IgE-介導(dǎo)的病癥”指一種狀況或疾病，其特征在于免疫球蛋白IgE超量產(chǎn)生及/或?qū)gE具有超敏性。特定言之，其應(yīng)理解為包括與過敏性超敏反應(yīng)和變應(yīng)性過敏有關(guān)的狀況，包括(例如)哮喘、過敏性鼻炎和結(jié)膜炎(干草熱)、濕疹、蕁麻疹、異位性皮炎和食物過敏。由(例如)蜜蜂蜇、蛇咬、食物或藥物引起的過敏性休克這一嚴重的生理學(xué)狀況也涵蓋于此術(shù)語范圍內(nèi)。
抗體的產(chǎn)生起始或“親代”抗體可用業(yè)內(nèi)現(xiàn)有的用于產(chǎn)生此類抗體的技術(shù)制得。這些技術(shù)眾所周知。產(chǎn)生起始抗體的例示性方法在隨后部分中有更詳盡的闡述。這些闡述內(nèi)容是制備或選擇一親代抗體的可能替代方法，而絕非限制產(chǎn)生此一分子的方法。
該抗體的結(jié)合親和力在產(chǎn)生一本發(fā)明高親和力抗體前確定。并且，此抗體可經(jīng)受其他生物學(xué)活性測定，例如，以便評價作為治療劑的效力。此等測試在業(yè)內(nèi)已知并取決于此抗體的靶和期望用途。
為篩選出結(jié)合至一特定抗原決定部位(例如，那些可阻斷IgE結(jié)合至其高親和力受體的抗原決定部位)的抗體，可實施一常規(guī)阻斷測試，例如闡述于“AntibodiesA Laboratory Manual”(Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988))中的常規(guī)阻斷測試?；蛘?，也可實施抗原決定部位作圖以確定抗體與一相關(guān)抗原決定部位相結(jié)合的位置。視情況，可使用業(yè)內(nèi)熟知的技術(shù)評價抗體對用來產(chǎn)生此抗體的靶同源物(其中該同源物來自一不同物種)的結(jié)合親和力。在一實施例中，該其它物種為一將在臨床前研究中將該抗體投予其的非人類哺乳動物。因此，該物種可為一非人類靈長類動物，例如恒河猴、獼猴、狒狒、黑猩猩和短尾猿。在其他實施例中，該物種可為(例如)一嚙齒動物、貓或狗。此親代抗體可依照本發(fā)明經(jīng)改變而產(chǎn)生一比親代抗體具有更高或更強靶結(jié)合親和力的抗體。所得高親和力抗體的靶結(jié)合親和力優(yōu)選比親代抗體靶結(jié)合親合力高至少約10倍或至少約20倍或至少約500倍或可能高1000至5000倍。需要或期望的結(jié)合親和力增強的程度將取決于親代抗體的初始結(jié)合親和力。
一般而言，自一親代抗體制備高親和力抗體的方法包括以下步驟1.獲得或選擇一可結(jié)合至相關(guān)靶的親代抗體，其應(yīng)包含重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。此可通過傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、或任一其他可產(chǎn)生靶特異性抗體的方法完成。
2.選擇一序列與親代骨架序列接近的骨架序列，較佳為一人類模板序列。該模板的選擇可基于(例如)其相對總長度、CDR大小、位于骨架與CDR之間連接點處的氨基酸殘基、總體同源性等。所選模板可為多個序列的混合體或可為共有模板。
3.通過在各個和所有可能的CDR位置進行隨機氨基酸取代產(chǎn)生一純系文庫。亦可用所有可能的氨基酸隨機取代人類骨架模板中(例如)毗鄰CDR或可影響結(jié)合或折疊的氨基酸，產(chǎn)生一骨架取代文庫?？晒烙嬤@些骨架取代對靶結(jié)合和抗體折疊的潛在影響。骨架中的氨基酸取代可與CDR中的氨基酸取代同時進行或順次進行。一種用來產(chǎn)生變體文庫的方法是寡核苷酸合成。
4.構(gòu)建一包含步驟(3)中產(chǎn)生的重鏈和/或輕鏈變體的表達載體，其包括式FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4(I)及FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4(II)，其中FRL1、FRL2、FRL3、FRL4、FRH1、FRH2、FRH3及FRH4代表步驟3中所選骨架模板輕鏈和重鏈序列的變體，并且CDR代表親代抗體CDR的變體CDR。一含有此等輕鏈和重鏈序列的載體實例繪示于圖1中。
5.針對該特定靶篩選純系文庫，對那些可與該靶結(jié)合的純系進行篩選以確定其是否具提高的結(jié)合親和力。選出那些具有比親代分子高的結(jié)合親和力的純系。最佳高親和力候選者與親代抗體比較應(yīng)具有盡可能高的結(jié)合親和力，優(yōu)選為比后者高20倍、100倍、1000倍或5000倍。若所選變體包含某些非期望的氨基酸，例如一已被引入的糖基化位點或一潛在的免疫原性位點，則可用更有益的氨基酸殘基取代那些氨基酸，并重新評估結(jié)合親和力。
通過保持人類骨架區(qū)不動，僅隨機地取代CDR區(qū)，也可使用此方法自一全人類親代抗體產(chǎn)生高親和力抗體。
改良的高容量篩選技術(shù)及載體(例如圖1中所載體)使得技術(shù)人員可迅速并高效地對一給定CDR和/或骨架區(qū)中所有位點處的綜合取代文庫進行篩選。通過同時隨機地取代所有位點的所有氨基酸，能夠篩選出原來不能由單個取代預(yù)見或識別的因(例如)協(xié)同作用而顯著增強親和力的可能組合。
親代抗體制備A.靶制備可溶性靶或其片段可用作產(chǎn)生抗體的免疫原?？贵w針對相關(guān)靶。較佳地，靶為一生物學(xué)上重要的多肽，并且將抗體投予一患有疾病或病癥的哺乳動物后可在此動物體內(nèi)產(chǎn)生治療益處。然而，抗體可針對非多肽靶。當(dāng)靶為一多肽時，其可為一跨膜分子(例如受體)或配體，例如一生長因子。本發(fā)明的一靶為IgE。全細胞可用作免疫原來制備抗體。靶可以重組方式制備或使用合成方法制造。靶亦可自一天然來源分離出來。
對于跨膜分子，例如受體，其片段(例如，一受體的細胞外結(jié)構(gòu)域)可用作免疫原?；蛘?，表達該跨膜分子的細胞可用作免疫原。這些細胞可源自一天然來源(例如，肥大細胞系)或可為已通過重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而表達該跨膜分子的細胞。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將明了其他靶及其用于制備抗體的形式。
B.多克隆抗體多克隆抗體通常在非人類哺乳動物中通過多次皮下或腹膜腔內(nèi)注射與一佐劑聯(lián)合的相應(yīng)靶而產(chǎn)生。將相應(yīng)靶與一欲免疫物種內(nèi)具免疫原性的蛋白質(zhì)(例如鑰孔蟲戚血蘭素(keyhole limpet hemocyanin))結(jié)合較為有用。眾多可引起一免疫學(xué)反應(yīng)的因子為業(yè)內(nèi)人員所熟知。
可通過將該蛋白質(zhì)或結(jié)合物(分別對于兔子或小鼠而言)與弗羅因德氏(Freud’s)完全佐劑組合并將該溶液以皮內(nèi)方式注射使動物對靶、免疫原性結(jié)合物或衍生物免疫。一個月后，通過多位點皮下注射對這些動物追加1/5到1/10的最初量的溶于弗羅因德氏完全佐劑中的肽或結(jié)合物。7到14天后，抽取這些動物的血液并對血清進行抗體滴度分析。對這些動物追加上述溶液直至滴度達到穩(wěn)定狀態(tài)。
所選擇的哺乳動物抗體通常會具有一足夠強的靶結(jié)合親和力。例如，該抗體可以約1×10-8M的結(jié)合親和力(Kd)值與人類抗IgE靶結(jié)合?？贵w親和力可通過飽和結(jié)合法、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和競爭分析(例如，放射免疫測定)測定。
為篩選可與相關(guān)靶結(jié)合的抗體，可實施一常規(guī)交叉測試，例如Antibodies(A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow及David Lane，1988)中所述測試?；蛘?，可實施抗原決定部位作圖(例如，如Champe等人在J.Biol.Chem.2701388-1394(1995)中所闡述)以測定結(jié)合情況。
C.單克隆抗體單克隆抗體是識別一單抗原位點的抗體。其一致的特異性使單克隆抗體比多克隆抗體更有用，而多克隆抗體通常含有可識別多個不同抗原位點的抗體。單克隆抗體可使用首先由Kohler等人在Nature(256495，1975)中闡述的雜交瘤方法制備，或可使用重組DNA方法制備。在雜交瘤方法中，如上所述免疫一小鼠或其他合適的宿主動物(例如一嚙齒動物)以誘發(fā)可產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異性地與免疫所用蛋白質(zhì)相結(jié)合的抗體的淋巴細胞。或者，也可以在體外對淋巴細胞進行免疫。隨后使用一適合的融合劑(例如，聚乙二醇)使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成一雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrincipalsand Practice，pp.590-103(Academic Press，1986))。
將如此制備的雜交瘤細胞在一適宜的培養(yǎng)基中接種并生長，該培養(yǎng)基中較佳含一或多種可抑制未融合的親代骨髓瘤細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)這一酶，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤及胸苷(HAT培養(yǎng)基)、可防止HGPRT缺乏細胞的生長的物質(zhì)。較佳骨髓瘤細胞是那些可高效融合、支持所選抗體產(chǎn)生細胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體且對諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的細胞。已有人闡述，可使用人類骨髓瘤及小鼠-人雜交骨髓瘤細胞系產(chǎn)生人類單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(MarcelDekker公司，紐約，1987))。
在鑒別出可產(chǎn)生具有期望特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，可通過有限稀釋程序?qū)⑦@些純系加以亞克隆并用標準方法加以培養(yǎng)(Goding，Monoclonal AntibodiesPrincipals and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。適用于此目的的培養(yǎng)基包括。適宜情況為，由這些亞純系分泌的單克隆抗體通過傳統(tǒng)免疫球蛋白純化程序(例如，蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和色譜法)自培養(yǎng)基中分離出來。
編碼單克隆抗體的DNA可使用傳統(tǒng)程序容易地分離出來并測序(例如，通過使用能特異性地與編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞可作為此類DNA的一種來源。分離后，可將此DNA置于表達載體中，隨后將表達載體轉(zhuǎn)移至宿主細胞(例如大腸桿菌細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞)中以在這些重組宿主細胞中實現(xiàn)單克隆抗體的合成。亦可通過(例如)用人類重鏈及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列來代替同源鼠科動物序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 816851(1984))或通過共價地連接至免疫球蛋白多肽來修飾DNA。
D.人源化抗體人源化是一種制造嵌合抗體的技術(shù)，其中，實質(zhì)上少于一個完整的人類可變結(jié)構(gòu)域的部分已由來自一非人類物種的對應(yīng)序列取代。人源化抗體中引入一或多個來自一非人類來源的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基通常稱為“引入”殘基，其通常取自一“引入”可變結(jié)構(gòu)域。人源化基本上可依照Winter和合作者(Jones等人，Nature 321522-525(1986)；Riechman等人，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyens等人，Science 239；1534-1536(1988))的方法實施，用非人類CDR的或CDR序列取代人類抗體中的對應(yīng)序列(參見，例如，美國專利第4,816,567號)。如本發(fā)明中所實施，人源化抗體中的一些CDR殘基和一些FR殘基可由鼠科動物抗體中類似位點的殘基取代。
欲用于制備人源化抗體的人類可變結(jié)構(gòu)域的選擇(包括輕鏈和重鏈兩者)對于降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂“最恰當(dāng)”方法，將一非人類抗體可變結(jié)構(gòu)域的序列與一習(xí)知人類可變結(jié)構(gòu)域序列文庫相比較。然后將與非人類親代抗體的序列最接近的人類序列視為此人源化抗體的人類骨架(Sims等人，J.Immunol.1512296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.196901(1987))。另一方法使用一源自一特定輕鏈或重鏈亞型的所有人類抗體的共有序列的特定骨架。該同一骨架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等人，J.Immunol.1512623(1993))。
E.抗體片段人們已經(jīng)開發(fā)了多種制備抗體片段的技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段是通過完整抗體的蛋白水解消化獲得(參見，例如，Morimoto等人，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24107-117(1992)和Brennan等人，Science 22981(1985))。然而，這些片段如今可通過重組宿主細胞直接制備。舉例而言，這些抗體片段可以從一抗體噬菌體文庫中分離得到?；蛘撸現(xiàn)(ab′)2-SH片段可以直接從大腸桿菌重新獲得并用化學(xué)方法偶聯(lián)以形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10163-167(1992))。依照另一方法，F(xiàn)(ab′)2片段可直接自重組宿主細胞培養(yǎng)物中分離得到。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明了其他制備抗體片段的方法。在其他實施例中，所選抗體是一單鏈Fv片段(scFv)。(PCT專利申請案WO 93/16185)。
高親和力抗體的制備當(dāng)親代抗體已經(jīng)識別并分離出來后，改變此親代抗體的一或多個可變結(jié)構(gòu)域中的一或多個氨基酸殘基。或者，或另外，可將一或多個骨架殘基的取代引入該親代抗體，其中這些取代可導(dǎo)致抗體(例如對人類IgE的)結(jié)合親和力增強。欲修飾骨架區(qū)殘基的實例包括那些以非共價方式直接與靶結(jié)合的殘基(Amit等人，Science 233747-753(1986))；與CDR相互作用/影響CDR構(gòu)造的殘基(Chothiau等人，J.Mol.Biol.196901-917(1987))；和/或參與形成VL-VH接合部位的殘基(EP 239 400 B1)。在某些實施例中，對一或多個此骨架區(qū)殘基加以修飾可導(dǎo)致抗體對相關(guān)靶的結(jié)合親和力增強。
對抗體生物學(xué)特性的修飾可通過選擇對于保持下列特征的作用顯著不同的取代(例如)(a)取代區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如，呈一薄片或螺旋狀構(gòu)造形式；(b)靶位點處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的大小。非保守性取代將需要將這些種類之一調(diào)換成另一種類。
編碼氨基酸序列變體的核酸分子可通過多種業(yè)內(nèi)熟知的方法制備。這些方法包括(但不限于)該物種依賴性抗體的一早期制備變體或一非變體形式的寡核苷酸介導(dǎo)的(或定位)誘變、PCR誘變及盒式誘變。產(chǎn)生變體的較佳方法是一寡核苷酸介導(dǎo)的合成。在某些實施例中，該抗體變體將僅有單個超變區(qū)殘基受到取代，例如自約2至約15個超變區(qū)取代。
一種產(chǎn)生變體文庫的方法是根據(jù)圖2中所述方案通過由寡核苷酸介導(dǎo)的合成來達成?？煽缭秸麄€輕鏈或重鏈可變區(qū)合成三種各具有約100個核苷酸的寡核苷酸。每一寡核苷酸可包含(1)一段60個氨基酸長的序列，由三聯(lián)體(NNK)20生成，其中N為任一核苷酸且K為G或T，和(2)與下一寡核苷酸或與每一末端載體序列重疊的一約15至30個核苷酸的重疊序列。當(dāng)在一PCR反應(yīng)中將這三個寡核苷酸退火時，聚合酶將填充入相反鏈中，產(chǎn)生一完整的雙鏈重鏈或輕鏈可變區(qū)序列。三聯(lián)體的數(shù)目可調(diào)整至任一重復(fù)長度，并且其在寡核苷酸中的位置可經(jīng)選擇以便僅取代一給定CDR或骨架區(qū)中的氨基酸。通過使用(NNK)，所有二十種氨基酸皆可能位于被編碼變體中的每一位置。5至10個氨基酸(15至30個核苷酸)的重疊序列將不會被取代，但此可經(jīng)選擇落入此骨架的堆疊區(qū)內(nèi)，或可通過一單獨的或隨后的合成操作加以取代。合成寡核苷酸的方法為業(yè)內(nèi)人員所熟知，并且也可以購得。自這些寡核苷酸產(chǎn)生抗體變體的方法為業(yè)內(nèi)人員所熟知，例如，PCR。
重鏈和輕鏈變體(在其序列的任意位置處不同)的文庫可在任一表達載體中構(gòu)建，例如一噬菌體，特別是圖1的載體，每一皆含有一編碼一特定重鏈和輕鏈變體的DNA。
抗體變體產(chǎn)生后，測定變體相對于親代抗體的生物學(xué)活性。如上文所述，此涉及測定變體對靶的結(jié)合親和力。現(xiàn)有多種高效方法可用來快速篩選抗體變體結(jié)合至相關(guān)靶的能力。
隨后對從這次最初篩選得到的一或多種抗體變體實施相對于親代抗體結(jié)合親和力增強的篩選。一測定結(jié)合親和力的常用方法是使用一BIAcoreTM表面胞質(zhì)團共振系統(tǒng)(BIAcore公司)評估結(jié)合和解離速率常數(shù)。依照制造商的(BIAcore)說明，將一生物傳感器芯片激活用于靶的共價偶聯(lián)。然后將靶稀釋并注射至芯片上以獲得固定化材料的響應(yīng)單元(RU)中的一信號。由于該RU中中的信號與固定化材料的質(zhì)量成比例，所以這樣就可以表現(xiàn)基質(zhì)上固定化靶密度的范圍。將解離數(shù)據(jù)擬適至一單位點模型以獲得koff+/-s.d(測量值的標準偏差)。計算每一結(jié)合曲線的準一級速度常數(shù)(ks)，并標繪為一蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)以獲得kon+/-s.e(擬合標準誤差)。結(jié)合的平衡解離常數(shù)(Kd′s)可自SPR測量值計算得出，以koff/kon表示。由于平衡解離常數(shù)Kd與koff成反比，因此可假定結(jié)合速度(kon)是一對所有變體皆適用的常數(shù)來估算親和力提高情況。
視情況可對所得具有高親和力的候選者實施一或多種額外的生物學(xué)活性測試以證實該(等)具有增強的結(jié)合親和力的抗體變體仍舊保留著期望的治療特性。舉例而言，對于抗IgE抗體，可篩選那些阻斷IgE與其受體結(jié)合并抑制組胺釋放的變體。最佳抗體變體可保持以一顯著高于親代抗體的結(jié)合親和力與靶結(jié)合的能力。
視抗體的預(yù)期用途而定，經(jīng)?？蓪θ绱诉x擇的抗體變體進行進一步修飾。此等修飾可包括進一步改變氨基酸序列、融合至異源多肽和/或共價修飾，例如那些在下文詳細闡述者。舉例而言，通常用絲氨酸取代任何不參與維持抗體變體的正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基，以提高分子的氧化穩(wěn)定性并阻止異常交聯(lián)。相反地，可將一或多個半胱氨酸鍵添加至抗體中以提高其穩(wěn)定性(特別地在該抗體為一抗體片段例如Fv片段的情況下)。
載體本發(fā)明也提供編碼如本文所揭示抗體的單獨核酸、包含該核酸的載體及宿主細胞、和用于制造該抗體變體的重組技術(shù)。對于該抗體變體的重組制造，需將編碼該抗體變體的核酸分離出來并將其插入一可復(fù)制載體中用以進一步克隆(擴增DNA)或用以表達。編碼單克隆抗體的DNA可使用傳統(tǒng)程序容易地分離出來并測序(例如，通過使用能特異性地與編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因結(jié)合的寡核苷酸探針)。
有多種載體可以利用。載體部分一般包括(但不限于)下列中的一或多種一信號序列、一復(fù)制起點、一或多種標記基因、一增強子元件、一啟動子和一轉(zhuǎn)錄終止序列。
圖1中描繪的噬菌體表達載體由一通用M13載體和M13自身的基因III病毒分泌信號組成，該信號可用于快速分泌并篩選具有適當(dāng)結(jié)合特異性和最低親和力標準的變體Fab。此載體不使用完整的基因III序列，因此在細菌細胞的表面上沒有展示，而是將這些Fab分泌至細胞周質(zhì)間隙中?；蛘?，這些Fab可在細胞質(zhì)中表達并分離出來。此重鏈和輕鏈各自具有其自己的病毒分泌信號，但卻以依賴方式自單個強誘導(dǎo)型啟動子表達。
圖1中載體也可以提供一組氨酸標簽和一myc標簽，以便于純化及檢測。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認識到，F(xiàn)ab可自不同的啟動子獨立表達，或該分泌信號無需是所選病毒序列，但可以是一適合于自所選宿主細胞分泌抗體片段的原核或真核信號序列。亦應(yīng)了解，重鏈和輕鏈可存在于不同的載體上。
A.信號序列部分本發(fā)明的抗體變體可以重組方式制備。該變體也可以表達為一與一異源多肽融合的融合多肽，該異源多肽較佳為一信號序列或其他在成熟蛋白質(zhì)或多肽的N末端具有一特定切割位點的多肽。所選異源信號序列較佳為一被宿主細胞識別和加工(即由信號肽酶分割)的序列。對于不識別和加工天然抗體信號序列的原核宿主細胞，可用一選自(例如)堿性磷酸酶、青霉素霉、lpp、或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列的組群的原核信號序列取代該信號序列?；虍?dāng)為圖1的載體時，所選信號序列為一得自基因III的病毒信號序列。對于酵母菌分泌，該天然信號序列可用(例如)酵母菌轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、α因子前導(dǎo)序列(包括酵母屬(Saccharomyces)和克魯維酵母屬(Kluyveromyces)α因子前導(dǎo)序列)、或酸性磷酸酯酶前導(dǎo)序列、白色念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶引導(dǎo)部分、或WO 90/13646中闡述的一信號取代。在哺乳動物細胞表達中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列，例如單純孢疹gD信號。此前導(dǎo)區(qū)的DNA在閱讀框內(nèi)可連接至編碼該抗體變體的DNA上。
B.復(fù)制起點部分載體通常含有一可使該載體在一或多個所選宿主細胞內(nèi)復(fù)制的核酸序列。一般而言，此序列能使該載體獨立于宿主染色體DNA復(fù)制，并包括復(fù)制起點或自主復(fù)制序列。對于多種細菌、酵母菌、和病毒，這些序列眾所周知。來自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點適合于大多數(shù)格蘭氏陰性細菌，2μ質(zhì)粒起點適合于酵母菌，而多種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)適用于哺乳動物細胞中的載體。一般而言，哺乳動物表達載體不需要復(fù)制起點部分(通?？墒褂肧V40起點，此僅是因為其含有早期啟動子)。
C.選擇基因部分載體可含有一選擇基因，也稱為一可選標記。典型選擇基因可編碼具有以下性質(zhì)的蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如，氨芐西林(ampicillin)、新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性，(b)補足營養(yǎng)缺陷型不足，或(c)供給從復(fù)合培養(yǎng)基中無法獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)素，例如，編碼桿菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
一選擇方案的實例使用一藥物阻止一宿主細胞的生長。那些用一異源基因成功轉(zhuǎn)化的細胞可產(chǎn)生一提供抗藥性的蛋白質(zhì)并因此在選擇方案中存活下來。此優(yōu)勢選擇的實例使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
適合于哺乳動物細胞的另一可選標記實例是那些能鑒別有能力吸收抗體核酸的細胞的可選標記，例如，DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II(較佳為靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷脫胺酶、鳥氨酸脫羧酶等。
例如，用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細胞可首先通過在一含有氨甲蝶呤(Mtx)(DHFR的競爭性拮抗劑)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有轉(zhuǎn)化體識別。當(dāng)采用野生型DHFR時，一適當(dāng)?shù)乃拗骷毎麨槿狈HFR活性的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
或者，用編碼抗體、野生型DHFR蛋白和另一可選標記物(例如氨基葡萄糖苷3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH))的DNA轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細胞(特別是包含內(nèi)源性DHFR的野生型宿主細胞)可通過在一含有該可選標記的選擇劑(例如一氨基糖苷類抗生物素，例如，卡那霉素、新霉素、或G418)的培養(yǎng)基上進行細胞培養(yǎng)來選擇。(美國專利第No.4,965,199號)。
一適用于酵母菌的選擇基因是位于酵母菌質(zhì)粒Yrp7中的trp1基因(Stinchcomb等人，Nature 28239(1979))。該trp1基因可為一缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母菌變體菌株(例如，ATCC號44076或PEP4-1)提供一選擇標記。Jones，Genetics 85Z 12(1977年)。于是酵母菌宿主細胞基因組中trp1損傷的存在可提供一有效環(huán)境以檢測不存在色氨酸時的生長導(dǎo)致的轉(zhuǎn)化。同樣地，Leu2缺乏的酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)可通過已知具有Leu2基因的質(zhì)粒補足。
D.啟動子部分表達和克隆載體通常包含一可被宿主有機體識別并以可操作方式連接至抗體核酸的啟動子。適用于原核宿主的啟動子包括phoA啟動子、β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、一色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和雜合啟動子(例如tac啟動子)。然而，其他已知細菌啟動子也是適合的。用于細菌系統(tǒng)中的啟動子也可以含有一以可操作方式與編碼該抗體的DNA相連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因皆具有一AT-富集區(qū)，其位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游約25到30個堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起始點上游70到80個堿基處發(fā)現(xiàn)的另一序列為一CNCAAT區(qū)，其中N可以是任一核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3′末端是一AATAAA序列，該序列可為向該編碼序列的3′末端添加poly A尾的信號。所有這些序列皆可適合地插入真核表達載體中。
用于酵母菌宿主的適宜啟動子序列實例包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶(例如，烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸酯變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、及葡糖激酶)的啟動子。其他酵母菌啟動子是具有通過培養(yǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)勢的誘導(dǎo)型啟動子，其為醇脫氫酶2、異構(gòu)細胞色素C、酸性磷酸酯酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)。在酵母菌表達中使用的適宜載體和啟動子在EP 73,657中有進一步闡述。酵母菌增強子與酵母啟動子一起使用也較為有利。
抗體從哺乳動物細胞中的載體轉(zhuǎn)錄可(例如)用下列啟動子控制從病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、巨細胞病毒、一逆轉(zhuǎn)錄病毒、肝炎-B病毒及最佳地猿猴病毒40(SV40)基因組獲得的啟動子；從異源性哺乳動物啟動子(例如，肌動蛋白啟動子或一免疫球蛋白啟動子)獲得的啟動子；從熱激啟動子獲得的啟動子，前提條件是這些啟動子皆與宿主細胞系統(tǒng)相容。
SV40病毒的早期和晚期啟動子可方便地以亦含有SV40病毒復(fù)制起點的SV40限制性片段形式獲得。人類巨細胞病毒的立即早期啟動子可方便地以一Hindlll E限制性片段形式獲得。一使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主內(nèi)表達DNA的系統(tǒng)揭示于美國專利第4,419,446號中。該系統(tǒng)的一修改形式闡述于美國專利第4,601,978號中?；蛘撸祟惁?干擾素cDNA已在一來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下在小鼠細胞中得到表達?；蛘?，勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus)長端重復(fù)序列可用作啟動子。
E.增強子元件部分高等真核細胞對編碼本發(fā)明抗體的DNA的轉(zhuǎn)錄通常可通過將一增強子序列插入載體中而增強。如今已知許多來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素)的增強子序列。然而，通常，人們會使用一來自真核細胞病毒的增強子。實例包括在復(fù)制起點遲側(cè)上的SV40增強子(bp100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、在復(fù)制起點遲側(cè)上的多瘤病毒增強子、和腺病毒增強子。關(guān)于用于激活真核啟動子的增強元件，也可參見Yaniv，Nature 29717-18(1982)。此增強子可在抗體編碼序列的5′或3′位處剪接至載體中，但較佳位于距啟動子位點5′處。
F.轉(zhuǎn)錄終止部分在真核宿主細胞(酵母菌、真菌、昆蟲、植物、動物、人類細胞或來自其他多細胞有機體的有核細胞)中所用表達載體亦可包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所需的序列。這些序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA的5′和(偶而)3′未轉(zhuǎn)譯區(qū)獲得。這些區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄為編碼抗體的mRNA未轉(zhuǎn)譯部分中多腺苷酸化片段的核苷酸節(jié)段。一有用的轉(zhuǎn)錄終止部分為牛生長激素多腺苷酸化區(qū)。參見，例如，WO94/11026。
宿主細胞的選擇和轉(zhuǎn)化在本文中，用于克隆或表達載體中DNA的適合的宿主細胞是原核細胞、酵母菌細胞或高等真核細胞。適用于此目的的原核生物包括格蘭氏陰性菌和格蘭氏陽性菌，舉例而言，腸細菌，例如大腸桿菌、腸桿菌、歐文氏菌(Erwinia)、克雷白氏桿菌(Klebsiella)、變形菌(Proteus)、沙門氏菌(Salmonella)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia)、和志賀氏桿菌(Shigella)，以及桿菌、假單胞菌和鏈霉菌。一較佳的大腸桿菌克隆宿主為大腸桿菌294(ATCC 31,446)，但其他菌株例如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是適合的。這些實例具有例示性而不具有限制性。
除原核生物外，例如絲狀真菌或酵母菌等真核微生物也是抗體編碼載體的適宜克隆或表達宿主。在低等真核宿主微生物中最常使用的是釀酒酵母。然而，多種其他屬、種和菌株也是通常可得到并可用于本發(fā)明中，例如，稷酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬；念珠菌屬；木霉屬；粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)；及絲狀真菌，例如，脈孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、彎頸霉(Tolypocladium)和曲霉(aspergillus)宿主，例如，構(gòu)巢曲菌(A.nidulans)和黑曲霉菌(A.niger)。
適合于表達糖基化抗體的宿主細胞可從多細胞有機體獲得。原則上，任何高等真核細胞培養(yǎng)物均可行，無論其是得自脊椎動物還是非脊椎動物培養(yǎng)物。非脊椎動物細胞的實例包括植物細胞和昆蟲細胞，Luckow等人，Bio/Technology6，47-55(1988)；Miller等人，Genetic Engineering，Setlow等人，eds.Vol.8，pp.277-279(Plenam publishing 1986)；Mseda等人，Nature 315，592-594(1985)。已鑒別出大量桿狀病毒株和變體及得自宿主(例如草地黏蟲(Spodopterafrugiperda)(毛蟲)、伊蚊(Aedes)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)、和家蠶(Bombyx mori))的相應(yīng)許可性昆蟲宿主細胞。多種用于轉(zhuǎn)染的病毒株可公開獲得，例如，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株，并且這些病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，尤其是用于草地黏蟲細胞的轉(zhuǎn)染。并且，棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、西紅柿和煙草的植物細胞培養(yǎng)物亦可用作宿主。
脊椎動物細胞及在培養(yǎng)物(組織培養(yǎng)物)中增殖脊椎動物細胞已經(jīng)成為一常規(guī)程序。參見Tissue Culture，Academic Press，Kruse和Patterson，eds.(1973)。有用哺乳動物宿主細胞系的實例為猴腎臟細胞；人類胚胎腎臟細胞系；幼小倉鼠腎臟細胞；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216(1980))；小鼠塞爾托利(sertoli)細胞；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎臟細胞；人類肺細胞；人類肝臟細胞；小鼠乳腺癌；和NSO細胞。
宿主細胞可用上述用于產(chǎn)生抗體的載體轉(zhuǎn)化，并在傳統(tǒng)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該營養(yǎng)培養(yǎng)基修飾為適合于誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體、或擴增編碼期望序列的基因。
用于產(chǎn)生本發(fā)明抗體變體的宿主細胞可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基例如Ham′s F10(Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium)(DMEM，Sigma)均適合于培養(yǎng)宿主細胞。另外，Ham等人，Meth.Enzymol.5844(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102255(1980)，美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,560,655號；第5,122,469號；第5,712,163號；或第6,048,728中所述培養(yǎng)基的任一種均可用作這些宿主細胞的培養(yǎng)基。必要時這些標記中的任一種皆可補充有激素和/或其他生長因子(例如胰島素、鐵傳遞蛋白、或表皮生長因子)、鹽(例如X-氯化物，其中X為鈉、鈣、鎂；和磷酸鹽)、緩沖液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN.TM.藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾級的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或一等效能量源。任一其它需要的補充物亦均可以所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的恰當(dāng)濃度加入。培養(yǎng)條件，例如溫度、pH值和諸如此類，是先前選擇用于表達的宿主細胞時所用條件，并被所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解。
抗體純化當(dāng)使用重組技術(shù)時，抗體變體可在細胞周質(zhì)間隙中以細胞內(nèi)方式產(chǎn)生，或直接分泌至培養(yǎng)基中。如果此抗體變體是以細胞內(nèi)方式產(chǎn)生，作為一第一步驟，這些微粒碎片—宿主細胞或分解的片段可通過(例如)離心或超濾方法除去。Carter等人，Bio/Technology 10163-167(1992)闡述一用于分離分泌到大腸桿菌細胞周質(zhì)間隙的抗體的方法。簡言之，在存在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯基甲基磺?；?PMSF)下經(jīng)約30分鐘將胞漿解凍。細胞碎片可通過離心法除去。當(dāng)此抗體變體分泌在培養(yǎng)基中時，通常首先使用一市售蛋白質(zhì)濃縮過濾器(例如，一Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)濃縮取自該表達系統(tǒng)的上清液。在任一前述步驟中皆可加入一蛋白酶抑制劑(例如PMSF)以抑制蛋白質(zhì)水解，并且可加入抗生素以防止外來污染物的生長。
由這些細胞制備的抗體組合物可使用(例如)羥基磷灰石色譜法、凝膠電泳法、透析法及親和色譜法進行純化，其中親和色譜法為首選純化技術(shù)。蛋白質(zhì)A作為一親和配體的適宜性取決于該抗體變體中所含的任一免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白質(zhì)A可用于純化基于人類IgG1、IgG2或IgG4重鏈的抗體(Lindmark等人，J.Immunol Meth.621-13(1983))。蛋白質(zhì)G被推薦用于所有小鼠同種型并用于人類IgG3(Guss等人，EMBO J.51567-1575(1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最經(jīng)常為瓊脂糖，但也可利用其他基質(zhì)。物理性質(zhì)穩(wěn)定的基質(zhì)(例如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)可達成比瓊脂糖更高的流速和更短的處理時間。當(dāng)該抗體變體包含一CH3結(jié)構(gòu)域時，可使用Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)進行純化。視欲復(fù)原的抗體變體而定，亦可使用其他蛋白質(zhì)純化技術(shù)，例如，在一離子交換柱上分級分離、乙醇沉淀法、反相HPLC、硅膠色譜法、肝素色譜法、在陰離子或陽離子交換樹脂(例如一聚天冬氨酸柱)上的SEPHAROSETM色譜法、色譜聚焦法、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀法。
在任一初步純化步驟后，可使用一pH值介于約2.5至4.5之間的洗脫緩沖液對包含相關(guān)抗體變體和污染物的混合物進行低pH值疏水相互作用色譜，較佳在低鹽濃度(例如，從約0至0.25M鹽)下實施。
醫(yī)藥配方多肽或抗體的治療配方可通過將具有期望純度水平的多肽與業(yè)內(nèi)通常采用的可選“醫(yī)藥上可接受的”載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑(其皆稱為“賦形劑”)混合制備，以作為凍干配方或水溶液貯存。例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、保存劑、等滲劑、非離子型去污劑、抗氧化劑和其他雜類添加劑。(參見Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版，A.Osol，Ed.(1980))。此等添加劑在所采用劑量和濃度下必須對接受者是無毒的。
緩沖劑有助于將pH值保持于接近生理狀態(tài)的范圍內(nèi)。其較佳以一約2mM至約50mM的濃度存在。適用于本發(fā)明的緩沖劑包括有機和無機酸兩者及其鹽，例如檸檬酸鹽緩沖液(例如，檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物，等等)，琥珀酸鹽緩沖液(例如，琥珀酸-琥珀酸單鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混和物，等等)，酒石酸鹽緩沖液(例如，酒石酸-酒石酸鈉混和物、酒石酸-酒石酸鉀混和物、酒石酸-氫氧化鈉混和物，等等)，富馬酸鹽緩沖液(例如，富馬酸-富馬酸單鈉混和物，等等)，富馬酸鹽緩沖液(例如，富馬酸-富馬酸單鈉混和物、富馬酸-富馬酸二鈉混和物、富馬酸單鈉-富馬酸二鈉混和物，等等)，葡萄糖酸鹽緩沖液(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混和物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混和物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混和物，等等)，草酸鹽緩沖液(例如，草酸-草酸鈉混和物、草酸-氫氧化鈉混和物、草酸-草酸鉀混和物，等等)，乳酸鹽緩沖液(例如，乳酸-乳酸鈉混和物、乳酸-氫氧化鈉混和物、乳酸-乳酸鉀混和物，等等)和醋酸鹽緩沖液(例如，醋酸-醋酸鈉混和物、醋酸-氫氧化鈉混和物，等等)。另外，可能提到磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液和三甲胺鹽緩沖液，例如Tris緩沖液。
可添加保存劑以延遲微生物生長，并且其可以0.2％至1％(w/v)的量添加。適用于本發(fā)明的保存劑包括苯酚、芐醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯基氯化銨、苯扎鹵銨(例如，苯扎氯銨、苯扎溴銨、苯扎碘銨)、氯化六甲雙銨、對羥基苯甲酸烷基酯例如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。
亦可添加有時稱為“穩(wěn)定劑”的等滲劑，以確保本發(fā)明液體組合物的等滲性，且其包括多羥基糖醇，較佳為三羥基或更多羥基糖醇，例如甘油、赤蘚醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇。
穩(wěn)定劑指一大類賦形劑，其具有自疏松劑至可溶解治療劑或有助于防止變性或防止粘附至容器壁的添加劑的功能。典型穩(wěn)定劑可為多羥基糖醇(如上文所列舉)；氨基酸例如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、等等，有機糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、衛(wèi)矛醇、甘油及其類似物，包括環(huán)醇例如環(huán)己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫的還原劑，例如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基醋酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量的多肽(即＜10殘基)；蛋白質(zhì)例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮單糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖例如乳糖、麥芽糖、蔗糖；和三糖例如棉子糖；多糖例如葡聚糖。以每份重量活性蛋白質(zhì)計，穩(wěn)定劑可以自0.1至10,000份重量的量存在。
可添加非離子型表面活性劑或去污劑(亦稱作“濕潤劑”)以幫助溶解治療劑以及保護治療性蛋白質(zhì)防止攪動引起的聚合，其亦可允許此配方暴露于降低的剪切面作用力下而不會引起蛋白質(zhì)變性。適合的非離子型表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80，等等)、泊洛沙姆(polyoxamers)(184，188、188等等)、Pluronic.RTM.聚醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(Tween.RTM.-20、Tween.RTM.-80，等等)。非離子型表面活性劑可以自0.05mg/ml至約1.0mg/ml且較佳約0.07mg/ml至約0.2mg/ml的量存在。
額外雜類賦形劑包括疏松劑(例如淀粉)、鰲合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和共溶劑。本文配方亦可按需要含有一種以上用于所治療的特定適應(yīng)癥的活性化合物，較佳為那些相互間不會產(chǎn)生不利影響的具有補充活性的化合物。舉例而言，人們可能期望進一步提供一免疫抑制劑。適宜情況為，這些分子以對達成預(yù)期目的有效的量聯(lián)合存在。這些活性成份亦可裝入分別通過(例如)凝聚技術(shù)或通過接口間聚合制備的微膠囊中，例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊，這些活性成份位于膠質(zhì)藥物輸送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微滴乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或粗滴乳液中。這些技術(shù)在Remington′s PharmaceuticalSciences(第16版，A.Osol，Ed.(1980))中揭示。
用于體內(nèi)投藥的配方必須是無菌的。此可(例如)通過濾過一無菌過濾膜容易地達成。也可以制備成緩釋制劑。緩釋制劑的適宜實例包括含有該抗體變體的固態(tài)疏水聚合物的半滲透性基質(zhì)，該等基質(zhì)呈成形物件形式，例如，膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸-2-羥乙基酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)組成的可注射微球體)、和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。盡管例如乙烯-醋酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸等聚合物可使分子持續(xù)釋放超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)時間較短。當(dāng)裝入膠囊的抗體長時間停留在體內(nèi)時，在37℃下暴露于潮濕環(huán)境中會使其變性或聚集，導(dǎo)致生物活性損失并可能改變免疫原性。依據(jù)所涉及機制可設(shè)計出合理的策略以保持穩(wěn)定性。舉例而言，若發(fā)現(xiàn)聚集機制是通過硫代-二硫化物互換形成份子間S--S鍵，則穩(wěn)定性可藉由修飾巰基殘基、自酸溶液凍干、控制水分含量、使用適當(dāng)?shù)奶砑觿┖托纬商囟ň酆衔锘|(zhì)組合物而達成。
在一特定病癥或病情的治療中有效的治療性多肽、抗體或其片段的數(shù)量將視病癥或病情的性質(zhì)而定并可通過標準臨床技術(shù)確定?？赡軙r，人們希望在本發(fā)明醫(yī)藥組合物用于人體測試前能測定其劑量反應(yīng)曲線，首先是在活體外測定，然后是在有用動物模型系統(tǒng)中測定。
在一較佳實施例中，治療性多肽、抗體或其片段的水溶液通過皮下注射施用。每一給藥劑量為從約0.5μg至約50μg/kg體重，或更佳為從約3μg至約30μg/kg體重。
皮下投予的給藥方案可視多種臨床因素(包括疾病類型、疾病嚴重程度和患者對此治療劑的敏感性)從每月一次到每天一次變化。
抗體變體的用途本發(fā)明的抗體變體可用作親和力純化劑。在此過程中，用業(yè)內(nèi)熟知方法將這些抗體固定于固相例如SEPHADEXTM樹脂或濾紙上。使該固定化抗體變體與一含有欲純化靶的樣品接觸，并隨后用一適合的溶劑洗滌該支持體，此將除去實質(zhì)上所有除欲純化靶以外的材料，靶結(jié)合至該固定化抗體變體上。最后，用另一適合的溶劑(例如甘氨酸緩沖液)洗滌支持體，將靶從該抗體變體上釋放出來。
這些變體抗體也可用在診斷檢驗中，例如用于檢測一相關(guān)靶在特定細胞、組織或血清中的表達。對于診斷應(yīng)用，該抗體變體通常用一可檢測部分加以標記?？衫枚喾N標記。用于定量化熒光變化的技術(shù)在上文中有闡述。化學(xué)發(fā)光基質(zhì)可通過化學(xué)反應(yīng)處于電激發(fā)狀態(tài)，隨后發(fā)射出可測量(例如，使用化學(xué)發(fā)光計)的光或向一熒光受體提供能量。酶標記的實例包括熒光素酶(例如，螢火蟲熒光素酶和細菌熒光素酶；美國專利第4,737,456號)、熒光素、2，3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化物酶(例如辣根過氧化物酶(HRPO))、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等等。使酶結(jié)合至抗體的技術(shù)闡述于O′Sullivan等人，Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for Use in Enzyme Immunoassay，in Methods in Enzym.(Ed.J.Langone& H.Van Vunakis)，Academic press，New York，73147-166(1981)中。
有時，標記不直接與所述抗體變體結(jié)合。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解有多種技術(shù)可達成此目的。舉例而言，該抗體變體可與生物素結(jié)合，并且上文所述三大類標記中的任一種標記皆可與抗生物素蛋白結(jié)合，或反之亦然。生物素可選擇性地與抗生物素蛋白結(jié)合，因此，該標記可以此間接方式與抗體變體結(jié)合。或者，為了使此標記與此抗體變體間接結(jié)合，可將抗體變體與少量半抗原(例如地高辛(digloxin))結(jié)合并將上述不同類型標記中的一種標記與一抗半抗原抗體變體(例如，抗地高辛抗體)結(jié)合。由此，可達成標記與抗體變體的間接結(jié)合。
在本發(fā)明的另一實施例中，所述抗體變體無需標記，該抗體變體的存在可使用一可與該抗體變體結(jié)合的經(jīng)標記抗體檢測。
本發(fā)明抗體可用于任一熟知試驗方法中，例如，競爭性結(jié)合試驗、直接和間接夾心試驗和免疫沉淀試驗。Zola，Monoclonal AntibodiesA Manualof Techniques，pp.147-158(CRC Press公司1987)。
競爭性結(jié)合試驗依靠一經(jīng)標記標準樣品與測試樣品競爭與一有限數(shù)量的抗體變體結(jié)合的能力。測試樣品中靶的數(shù)量與同抗體結(jié)合的標準樣品的數(shù)量成反比。為易于測定結(jié)合的標準樣品量，通常在競爭結(jié)合之前或之后使抗體不溶解。因此，結(jié)合至抗體的標準樣品和測試樣品可方便地與保持未結(jié)合狀態(tài)的標準樣品和測試樣品分離。
夾心測試涉及使用兩種抗體，每一種都能夠結(jié)合至一不同的免疫原部分、或抗原決定部位或欲檢測的蛋白質(zhì)。在夾心測試中，欲分析的測試樣品被一固定在固體支持體上的第一抗體結(jié)合，并隨后使一第二抗體結(jié)合至此測試樣品上，由此形成一不可溶解的三部分復(fù)合物。參見(例如)美國專利第4,376,110號。該第二抗體自身可用一可檢測部分標記(直接夾心測試)或可使用一用可檢測部分標記的抗免疫球蛋白抗體測量(間接夾心測試)。舉例而言，一類夾心測試為一ELISA測試，在此情況下該可檢測部分為一酶。
對于免疫組織化學(xué)而言，此腫瘤樣品可為新鮮的或凍結(jié)的，或可嵌入石蠟中并用一保存劑(例如福爾馬林)固定。
該些抗體也可用于活體內(nèi)診斷測試。一般而言，將抗體變體用一放射性核苷酸(例如，.sup.111In、.sup.99Tc，、sup.14C、.sup.131I、.sup.3H、.sup.32P或.sup.35S)標記，以便腫瘤可使用免疫閃爍照像法定位。舉例而言，一本發(fā)明高親和力抗IgE抗體可用于檢測存在于(例如)哮喘患者肺內(nèi)的IgE數(shù)量。
本發(fā)明抗體可以一試劑盒的形式提供，即，包含預(yù)定量試劑與實施此診斷測試的說明書的成套組合。當(dāng)抗體變體用一酶標記時，該試劑盒可包含酶所需的底物和輔因子，例如，一能提供可檢測到的發(fā)色團或熒光團的底物前體。另外，可包括其他添加劑，例如，穩(wěn)定劑、緩沖劑(例如封阻緩沖劑或溶胞緩沖劑)和諸如此類。各種不同試劑的相對數(shù)量可有較大變化以提供這些試劑可充分最佳化測試敏感性的溶液濃度。具體而言，這些試劑可作為一包含賦形劑且通常凍干的干燥粉末提供，其溶解后可提供一具有適當(dāng)濃度的試劑溶液。
抗體的活體內(nèi)用途本發(fā)明涵蓋，本發(fā)明抗體可用于治療一哺乳動物。在一實施例中，舉例而言，為了獲得抗體的臨床前數(shù)據(jù)而將其施用至一非人類哺乳動物。欲治療的例示性非人類哺乳動物包括非人類靈長類動物、狗、貓、嚙齒動物和其他在體內(nèi)實施臨床前研究的哺乳動物。這些哺乳動物可為建立的用于一欲用該抗體治療的疾病的動物模型，或其可用于研究所述相關(guān)抗體的毒性。在這些實施例的每一個中，均可對哺乳動物實施劑量遞增研究。
該抗體或多肽可通過任一適合的方式(包括非經(jīng)腸、皮下、腹膜腔內(nèi)、肺內(nèi)、和鼻內(nèi))施用，并且，若期望，對于局部免疫抑制治療時，可采用病變內(nèi)方式用藥。非經(jīng)腸輸注包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜腔內(nèi)、或皮下施用。另外，適宜情況為，該抗體變體可通過脈沖輸注方式(特別是以漸低的抗體變體劑量)恰施用。較佳地，此定量給藥應(yīng)部分地視施藥期的長短而通過注射(最好是通過靜脈內(nèi)或皮下注射)施用。
對于預(yù)防或治療疾病，該抗體或多肽的適當(dāng)劑量應(yīng)視下列因素而定欲治療疾病的類型、疾病的嚴重程度和病程、施用該抗體變體的目的是預(yù)防還是治療、先前治療、患者的臨床史和對此抗體變體的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判斷力。適宜情況為，本發(fā)明此具極高親和力的抗人類IgE抗體一次性施用至患者或經(jīng)一系列治療施用。
根據(jù)疾病的類型和嚴重程度，不管是通過(例如)一次或多次分開投藥還是通過連續(xù)輸注投藥，投予患者的抗體初始候選劑量均為約0.1mg/kg至150mg/kg(例如0.1至20mg/kg)。視上文提及的因素，典型日劑量為約1mg/kg到約100mg/kg或更高。對于歷經(jīng)數(shù)天或更長時間的重復(fù)投藥，根據(jù)病情，治療應(yīng)保持到出現(xiàn)想要的疾病癥狀抑制狀況為止。然而，也可以使用其他劑量方案。該治療的進度可容易地通過常規(guī)技術(shù)和測試方法加以監(jiān)測。一抗-LFA-1或抗ICAM-1抗體的例示性定量給藥方案揭示于WO 94/04188中。
該抗體變體組合物應(yīng)以與良好的醫(yī)療實踐相一致的方式加以調(diào)配、確定劑量、給藥。在這方面，需考慮因素包括所治療的特定病癥、所治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床病情、病癥起因、試劑的遞送位點、投藥方法、投藥時間安排及醫(yī)務(wù)人員熟知的其他因素。欲施用的抗體變體的“治療有效量”應(yīng)由這些需考慮的因素決定，并且是預(yù)防、減緩或治療疾病或病癥所需的最小數(shù)量。該抗體變體無需但可視情況用一或多種當(dāng)前用于預(yù)防或治療所討論病癥的試劑加以調(diào)配。這些其他試劑的有效量取決于抗體在配方中的含量、病癥或治療的類型及上文所討論的其他因素。這些試劑通常以與先前相同的劑量使用并使用先前所用投藥途徑或以約1至99％的之前所采用劑量使用。
可將IgE識別為其靶的本發(fā)明抗體可用于治療“IgE介導(dǎo)的病癥”。這些病癥包括(例如)哮喘、過敏性鼻炎和結(jié)膜炎(干草熱)、濕疹、蕁麻疹、異位性皮炎和食物過敏。由(例如)蜜蜂蜇、蛇咬、食物或藥物引起的過敏性休克這一嚴重生理學(xué)狀況也涵蓋于本發(fā)明范圍內(nèi)。
實例提供下列實例以進行舉例說明而并非加以限制。
實例1抗IgE鼠科動物MAb TES-C21的人源化將鼠科動物mAb TES-C21的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的序列與可在公共文庫中獲得的人類抗體種系序列相比較。當(dāng)選定一如上文步驟1中所述模板時需使用多個標準，包括全長、在骨架中的類似CDR位置、總同源性、CDR大小等。同時考慮所有這些標準可提供一選擇最佳人類模板的結(jié)果，如圖3A和3B中所示的在TES-C21 MAb重鏈和輕鏈序列與相應(yīng)人類模板序列間序列之間的比對中所示。
在此情況下，使用一個以上的人類骨架模板來設(shè)計此抗體。所選用于VH鏈的人類模板為DP88(aa殘基1至95)和JH4b(aa殘基103至113)的組合(參見圖3B)。所選用于VL鏈的人類模板為L16(VK亞型III，aa殘基1至87)和JK4(aa殘基98至107)的組合(參見圖3A)。該鼠科動物與人類模板間的骨架同源性對于VH為約70％，對于VL為約74％。
模板選定后，通過DNA合成和重疊PCR構(gòu)建一Fab文庫，如上文所述和圖2中所繪示。該文庫由用相應(yīng)所選人類模板DP88/JH4b和L16/JK4合成的合成TES-C21 CDR組成。此文庫的復(fù)雜度為4096(＝212)。編碼部分VH和VL序列的重疊核苷酸可合成為其中有18至21個核苷酸重疊的約63至約76個核苷酸。
VL和VH基因的PCR擴增可在標準PCR條件下使用一包含骨架區(qū)FR1特定序列和退火至該前導(dǎo)序列(基因III)末端的懸垂序列的生物素化正向引物和一來自保守的恒定區(qū)(Ck或CH1)的反向引物實施。通過瓊脂糖凝膠電泳或用市售PCR純化試劑盒純化該PCR產(chǎn)物以除去未并入的生物素化引物和非特異性PCR產(chǎn)物。
用2μg PCR產(chǎn)物、1μL的T4多核苷酸激酶(10單位/μL)、2μL的10x PNK緩沖液、1μL的10mM ATP，以用ddH2O調(diào)整的20μL的總體積實施PCR產(chǎn)物的5′-磷酸化。在37℃下培養(yǎng)45分鐘后，在65℃熱變性10分鐘，通過添加ddH2O將反應(yīng)物體積調(diào)整至200μL用于下一步驟。
用200μL 2x B&W緩沖液將100μL用抗生蛋白鏈菌素包覆的磁珠洗滌兩次，并重新懸浮于200μL 2x B&W緩沖液中。將該磷酸化的PCR產(chǎn)物與磁珠混合，并在室溫(RT)下在緩緩搖動的情況下培養(yǎng)16分鐘。
使這些磁珠沉積，并用200μL 2x B&W緩沖液洗滌兩次。在緩緩搖動的情況下用300μL新制備的0.15M NaOH在RT下對該非生物素化的ssDNA(負鏈)洗提10分鐘。一第二次NaOH洗提可略微增加產(chǎn)量(可選)。離心洗提液以除去所有痕量磁珠。
通過添加1μL糖原(10mg/mL)、1/10體積的3M NaOAc(pH為5.2)和2.5體積的EtOH使該ssDNA從上清液中沉淀出來。然后用70％的EtOH洗滌沉淀的ssDNA，隨后實施凍干處理3分鐘并溶解于20μL ddH2O中。通過使用DNA標準樣品在溴化乙錠(EtBr)上點樣或通過測量OD260對該ssDNA進行定量。
實例2VH和VL克隆至噬菌體表達載體中通過雜交誘變將VH和VL克隆至一噬菌體表達載體中。通過用基于M13的噬菌體(噬菌體表達載體TN003)感染CJ236大腸桿菌珠(dut-ung-)制備尿苷化模板。
通過PCR對下列組份[200ng尿苷化噬菌體載體(8.49kb)；92ng磷酸化單鏈H鏈(489堿基)；100ng磷酸化單鏈L鏈(525堿基)；1μL 10X退火緩沖液；用ddH2O將體積調(diào)整至10μL]實施退火(以約8倍摩爾比插入至載體中)，其中先使溫度在85℃保持5分鐘(變性)，再經(jīng)1小時逐漸降至55℃。將樣品在冰上冷凍。
向退火產(chǎn)物中添加以下組份1.4μL 10X合成緩沖液；0.5μL T4 DNA連接酶(1單位/μL)；1μL T4 DNA聚合酶(1單位/μL)，隨后在冰上培養(yǎng)5分鐘，并在37℃下培養(yǎng)1.5小時。然后使此產(chǎn)物在乙醇中沉淀，并溶解于10μL ddH2O或TE中。
用1μL Xbal(10單位/μL)將DNA消化2小時，并在65℃下熱滅活20分鐘。通過電穿孔法將消化的DNA轉(zhuǎn)染至50μL電感受態(tài)DH10B細胞中。通過在37℃下在XL-1 Blue菌苔上生長過夜測定所得噬菌體的濃度。對純系實施測序以確定成份。
實例3用于文庫篩選的深孔培養(yǎng)A.平板培養(yǎng)噬菌體文庫在LB培養(yǎng)基中稀釋該噬菌體文庫以得到期望的噬斑數(shù)/板。將高滴定度的噬菌體與200μL XL-1B細胞培養(yǎng)物混合。將3mL LB頂層瓊脂混合，倒至一LB平板上，使其在室溫下靜置10分鐘。將板在37℃下培養(yǎng)過夜。
B.噬菌體洗提將100μL噬菌體洗提緩沖液(10mM Tris-Cl，pH7.5，10mM EDTA，100mMNaCl)添加至一無菌U形底96孔板的每一孔中。用一過濾吸管端將一得自該過夜文庫平板的單個噬菌體噬斑轉(zhuǎn)移至一孔內(nèi)。將此噬菌體洗提板在37℃下培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)結(jié)束后，將此板在4℃下貯存。
C.深孔板培養(yǎng)以1∶100稀釋度將得自50mL培養(yǎng)物的XL1B細胞添加至2xYT培養(yǎng)基中。使這些細胞在37℃下在一振蕩器內(nèi)生長，直至A600介于0.9至1.2之間。
D.在深孔板中用噬菌體感染當(dāng)這些細胞達到適當(dāng)?shù)腛D后中，將1M IPTG(1∶2000)添加至該XL1B培養(yǎng)物中。IPTG的最終濃度為0.5mM。將750μL細胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至一96孔深孔板(Fisher Scientific)的每一孔中。每一孔皆用25μL經(jīng)洗提的噬菌體接種。將該深孔板置于振蕩器內(nèi)(250rpm)并在37℃下培養(yǎng)過夜。
E.制備用于ELISA篩選的上清液培養(yǎng)結(jié)束后，使用Beckman JA-5.3板旋轉(zhuǎn)器將深孔板以3,250rpm離心20分鐘。從每一孔中取出50μL上清液用于ELISA。
F.15ml XL-1細胞液體培養(yǎng)物的接種使XL-1在37℃下在含10μg/mL四環(huán)素的2xYT中在振蕩器(250rpm)中生長直至A600＝0.9至1.2。對于每一欲定性的純系而言，皆以一0.5mM的終濃度添加IPTG，并將15mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至一50毫升錐形管內(nèi)。用取自高滴定度原液(滴定度＝約1011pfu/mL)的10μL噬菌體對這些細胞進行接種，并在37℃下培養(yǎng)1小時。在搖動的情況下使這些細胞在室溫下生長過夜。
G.自細胞周質(zhì)分離可溶Fab在一IEC離心機內(nèi)以4,500rpm對細胞團?；?0分鐘。除去培養(yǎng)基，將團粒重新懸浮于650μL懸浮緩沖液(50mM Tris，pH為8.0，含1mM EDTA和500mM蔗糖)中，加以渦旋，并置于冰上輕輕地搖動1小時。在4℃下以9,000rpm離心10分鐘除去細胞碎片。將含可溶Fab的上清液收集起來并在4℃下貯存。
實例4骨架修飾在骨架中上述可能的潛在關(guān)鍵部位有12個鼠科動物/人類擺動殘基。VH中的位置73在人源化文庫中保持為鼠科動物殘基蘇氨酸，這是因為已確定此位置會影響結(jié)合。然而，應(yīng)注意，在VH 73處的蘇氨酸為人類種系VH亞型1和2中的一常見人類殘基。
對在TES-C21序列與人類模板之間不同的骨架殘基按上文所述實施隨機取代，并隨后測定其對靶結(jié)合和抗體折疊的潛在影響。確定可能已影響該結(jié)合的潛在骨架殘基。在此情況下，它們是VH中的殘基12、27、43、48、67、69和VL中的殘基1、3、4、49、60、85(Kabat編號系統(tǒng))。(參見圖4)后來證明，僅位置27和69對VH區(qū)(純系編號1136-2C)中的結(jié)合有顯著影響。
所用初步篩選為一使用培養(yǎng)基的單點ELISA(SPE)(參見下文所述)。該初步篩選將與該抗體的靶分子結(jié)合的純系選擇出來。將給出與親代分子相等或比親代分子好的信號的純系選出用于下一輪篩選。
在第二輪篩選中，使單個噬菌體在一15mL的細菌培養(yǎng)物中生長，并將細胞周質(zhì)制品用于SPE和ELISA滴定測試。進一步確定在此測試中保持高親和力的純系的性質(zhì)。當(dāng)全部經(jīng)選擇的初步純系處理完成后，對上部10至15％的純系進行測序，并且依照序列布置這些純系。將各序列組的代表相互進行比較，選出最佳的純系。將這些所選純系的序列組合起來，并評價各種不同組合的影響。
就與重組人類IgE(SE44)的改良結(jié)合，用ELISA法對所構(gòu)建的文庫實施篩選。將結(jié)合親和力大于鼠科動物TES-C21 Fab的純系分離出來并測序。進一步確定標識號為4、49、72、76和136的純系的性質(zhì)。純系4、49、72、78和136的ELISA滴定曲線示于圖5A和5B中，表明它們的親和力與親代TES-C21相似。這些純系與鼠科動物TES-C21競爭與人類IgE的結(jié)合，說明此結(jié)合抗原決定部位在該人源化過程沒發(fā)生改變。該人源化Fab未結(jié)合至FcεRI結(jié)合IgE上，表明當(dāng)這些人源化抗體構(gòu)建入二價IgG時不太可能與此受體交聯(lián)而導(dǎo)致組胺釋放。
人源化純系136保留了5個鼠科動物重鏈骨架殘基(＝94.3％人類VH骨架同源性)，其中通過親和力成熟選擇一100％的人類輕鏈骨架。人源化Fab展示出對IgE與FcεRI結(jié)合的抑制(圖6)。
實例5用于篩選抗IgE的單點ELISA方案在4℃下用在碳酸鹽涂覆緩沖液中的2μg/mL羊抗人Fd涂覆平板。除去涂覆溶液，并在37℃下用200μL/孔的3％ BSA/PBS將平板封阻1小時。用PBS/0.1％TWEEN(PBST)將板洗滌4次后，添加50μL/孔的Fab樣品(即，包含高滴定度噬菌體和所分泌Fab或自DMB套組(DMB block)獲得的細胞周質(zhì)制品的上清液，或15mL制品)。將板在室溫下培養(yǎng)1小時，隨后用PBST洗滌4次。50μL/孔的生物素化的SE44(0.015μg/mL)用0.5％ BSA/PBS稀釋，并隨后添加0.05％ TWEEN。然后將板在室溫下培養(yǎng)2小時，并用PBST洗滌4次。添加50μL/孔的StreptAvidin HRP以1∶2000稀釋于0.5％ BSA/PBS和0.05％ TWEEN中的稀釋液，并將板在室溫下培養(yǎng)1小時。用PBST將板洗滌6次。添加50μL/孔的TMB底物(sigma)以顯色，并隨后通過添加50μL/孔的0.2M H2SO4使其停止。
實例6ELISA滴定抗IgE在4℃下將板用溶于碳酸鹽涂覆緩沖液中的0.25μg/mL(用于經(jīng)純化的Fab0.1μg/mL)SE44涂覆過夜。除去涂覆溶液，并在37℃下用200μL/孔的3％BSA/PBS將板封阻1小時。
用PBS/.1％TWEEN(PBST)將板洗滌4次。添加50μL/孔的Fab(取自15mL細胞周質(zhì)制品)，以1∶2的稀釋液開始，并用0.5％ BSA/PBS和.05％TWEEN20系列稀釋3倍。將板在室溫下培養(yǎng)2小時。
用PBST將板洗滌4次，并添加50μL/孔1∶1000(0.8μg/mL)溶于0.5％BSA/PBS和0.05％ TWEEN20中的生物素-羊抗人Fd稀釋液。將板在室溫下再次培養(yǎng)2小時。
用PBST洗滌4次后，添加50μL/孔的以1∶2000(0.9μg/mL)溶于0.5％BSA/PBS和0.05％ TWEEN20中的Neutra-avidin-AP溶液，并將板在室溫下培養(yǎng)1小時。
用PBST將板洗滌4次。通過添加50μL/孔的pNPP底物使其顯色。添加50μL/孔的3M NaOH使顯色停止。在405nm或410nm處讀取各孔的吸光度。
實例7M13噬菌體表達的可溶Fab的親和力純化方案第1天用5mL過夜原液XL1B對兩份含10mg/mL四環(huán)素的500mL培養(yǎng)物(2xYT)進行接種，并使其在37℃下生長至A600＝0.9至1.2。添加IPTG，至濃度為0.5mM。然后，用200μL噬菌體/培養(yǎng)物感染細胞培養(yǎng)物，并在搖動的情況下在37℃下培養(yǎng)1小時。感染后，將細胞在25℃下在搖動的情況下生長過夜。
第2天在4℃下在250mL離心管內(nèi)以3500xg使細胞團?；?0分鐘。吸出培養(yǎng)基，并將團粒重新懸浮于共12至15mL的溶胞緩沖液(緩沖液A+蛋白酶抑制劑混合物)中。
緩沖液A(1升)50mM NaH2PO4 6.9g NaH2PO4H2O(或6g NaH2PO4)300mM NaCl 17.54g NaCl
10mM咪唑 0.68g咪唑(MW 68.08)用NaOH將pH值調(diào)整至8.0溶胞緩沖液25mL緩沖液A與一Complete Protease Inhibitor Cocktail(Roche，Basel，Switzerland)片劑混合。
將重新懸浮的細胞轉(zhuǎn)移至一50mL錐形管內(nèi)，并用100μL 100mg/mL的溶菌酶通過多次倒置錐形管使其溶解，直至此混合物移動到一起成為一團狀物(由于溶胞作用)。在冰上對細胞實施超聲處理，隨后添加10μL脫氧核糖核酸酶(DNase)(約1000單位)并在4℃下輕輕搖動30分鐘。使用50mL離心管，在4℃下通過以12000xg離心將碎片團?；?0分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至一新的錐形管內(nèi)并在4℃下貯存。
依照廠商規(guī)程使用Ni-NT瓊脂糖(Qiagen，Valencis，CA)純化可溶的Fab。將溶胞產(chǎn)物與Ni-NTA混合并裝入一柱中。收集流出物用于SDS-PAGE分析。用20mL緩沖液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、15mM咪唑，用NaOH將pH調(diào)整至8.0)洗滌此柱，隨后再用一含有50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑的20mL洗液洗滌。用6×500μL洗提緩沖液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、450mM咪唑，用NaOH將pH調(diào)整至8.0)洗提Fab，并用SDSPAGE分析。將柱餾分貯存在4℃下。用SDS-PAGE分析柱餾分，并選擇具有最高量Fab的餾分在4℃下在PBS中透析。
實例8可溶解受體測試在4至8℃下用0.05mL 0.5μg/mL FcεRIα-鏈受體涂覆緩沖液(50mM碳酸鹽/二碳酸鹽，pH值為9.6)涂覆適于ELISA的一96孔測試板12小時。將這些孔抽空，并添加250μL封阻緩沖液(PBS，1％的BSA，pH為7.2)，并在37℃下培養(yǎng)1小時。在一單獨的測試板中，通過按1∶4用測試緩沖液(0.5％ BSA和0.05％ Tween 20、PBS，pH為7.2)稀釋的稀釋液將這些樣品和參照物TES-C21MAb自200μg/mL滴定至0.001μg/mL，并添加等體積的100ng/mL生物素化IgE，將板在25℃下培養(yǎng)2至3小時。用PBS和0.05％ TWEEN 20將這些經(jīng)FcεRI涂覆的孔洗滌3次，從樣品孔中轉(zhuǎn)移出50μL并在25℃下攪動培養(yǎng)30分鐘。50μL/孔的1mg/mL Streptavidin-HRP(按1∶2000稀釋于測試緩沖液中)攪動培養(yǎng)30分鐘，然后按先前方法洗滌此板。添加50μL/孔的TMB底物并顯色。通過添加等體積的0.2M H2SO4使反應(yīng)停止，并在450nm處測量吸光度。
實例9抗體與載有IgE的FcεRI的結(jié)合結(jié)合至與FcεRI的α亞單位相關(guān)聯(lián)的人類IgE的抗體可通過用10μg/mL人類IgE在4℃預(yù)培養(yǎng)30分鐘來測定。將板洗滌3次，隨后用變化濃度的鼠科動物抗人類IgE mAb E-10-10或該人源化Fab變體培養(yǎng)1小時。Fab的結(jié)合可用一生物素標記的抗人Fd抗體并隨后用SA-HRP檢測。鼠科動物ab E10-10通過與山羊抗鼠科動物Ig Fc HRP結(jié)合Ab檢測。
實例10純系分析測試每一候選純系的結(jié)合親和力，并對陽性純系進行測序。進一步測定在CDR區(qū)具有可增加結(jié)合親和力的有益突變的抗體變體的性質(zhì)。測試包括Biacore分析；IgE與其受體結(jié)合的抑制；和結(jié)合有受體的IgE的交聯(lián)。
構(gòu)建一變體文庫。各種展示出改良親和力的CDR的氨基酸序列描繪于表1中。圖7列示具有取代組合的高親和力侯選者。
表1

P＝親代圖9中列出19種重鏈變體，圖8中列出35種輕鏈變體。進一步測定3種候選者的結(jié)合親和力性質(zhì)，并將其示于表2中。
表2結(jié)合親和力

實例11抗IgE抗體的表達和純化及HRP-結(jié)合產(chǎn)生高親和力候選MAb。為產(chǎn)生完整的抗IgE MAb，將重鏈和輕鏈可變區(qū)序列自噬菌體載體模板進行PCR擴增并在一CMV啟動子作用下分別亞克隆至重鏈和輕鏈表達載體中。構(gòu)建6個全抗體純系，這些純系描述于圖10A至F中。通過業(yè)內(nèi)熟知技術(shù)用電穿孔法將適合的重鏈和輕鏈質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓瘤細胞系NS0中。參見，例如，Liou等人，J Immunol.143(12)3967-75(1989)。使用蛋白A-瓊脂糖(Pharmacia)將抗體自單個穩(wěn)定細胞系上清液中純化出來。使用280nm下之分光光度計及FCA測試(IDEXX)測定該抗體的濃度。
使用過氧化物酶試劑盒(Zymed Labs，San Francisco，CA)依照廠商規(guī)程用辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合純化的抗體。用涂覆有一單克隆人IgE(SE44)的板使用ELISA測定每一結(jié)合的抗IgE MAb的滴定度。
以下培養(yǎng)物已經(jīng)存放于American Type Culture Collection中，10801University Boulevard，Manassas Va.20110-2209US(ATCC)

該存放按照國際認可的用于專利程序目的的布達佩斯微生物存放條約及其下的條例(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder)(布達佩斯條約)的規(guī)定進行。此可確保一活培養(yǎng)物自存放之日起可保持30年。此有機體可在布達佩斯條約的條款下通過ATCC獲得，其可確保在有關(guān)美國專利發(fā)布后公眾可持久并且無限制地獲得此培養(yǎng)物的子代。
本專利申請案的受讓人已經(jīng)同意，如果所存放的培養(yǎng)物在適合的條件下培養(yǎng)時死亡或丟失或遭到破壞，將在得到通知時迅速用相同培養(yǎng)物的活樣品將其取代。不應(yīng)將所貯存株系的可獲得性理解為允許違反任一政府的權(quán)力機構(gòu)依照其專利法賦予的權(quán)利而實踐本發(fā)明。
上述書面說明書被視為足以能使所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員實踐本發(fā)明。本發(fā)明的范圍并不受限于所存放的培養(yǎng)物，因為這些所存放的實施例皆意欲闡釋示本發(fā)明的一方面，任何功能相當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)物皆涵蓋于本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文材料的存放并非等同于承認本文所含的說明不足以使本發(fā)明任一方面(包括其最佳模式)得以實施，也不可將其理解為將權(quán)利要求書的范圍限制至其描述的具體闡釋。實際上，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通過上文的說明將明了除那些本文所展示及所闡述實施例外的本發(fā)明各種修改形式，該等修改形式皆涵蓋于隨附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員使用常規(guī)實驗即可識別或能確定本文所述的本發(fā)明具體實施例的許多等效物。這些等效物均意欲涵蓋在下述權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
序列表<110>唐納士公司(Tanox，Inc.)<120>高親和力抗人類IgE抗體<130>TNX-1010(1)PCT<150>60/444,229<151>2003-02-01<160>70<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>107<212>PRT<213>鼠科動物<220>
<221>misc_feature<223>TES-C21輕鏈<400>1Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asp Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Asn Ile Asn Ser Val Glu Ser65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>2<211>107<212>PRT<213>人類
<220>
<221>misc_feature<223>L16/-JK4人類輕鏈共有序列模板<400>2Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>3<211>123<212>PRT<213>鼠科動物<220>
<221>misc_feature<223>TES-C21重鏈<400>3Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser115 120<210>4<211>113<212>PRT<213>人類<220>
<221>misc_feature<223>DP88/3H4b人類重鏈共有序列模板<400>4Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Leu Val Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser100 105 110Ser<210>5<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>TES-C21 CDRL1序列(表1)<400>5Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His1 5 10<210>6<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRL1變體序列#1(表1)<400>6Arg Ala Ser Arg Ser Ile Gly Thr Asn Ile His1 5 10<210>7<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRL1變體序列#2(表1)<400>7Arg Ala Ser Gln Arg Ile Gly Thr Asn Ile His1 5 10<210>8<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>TES-C21 CDRL2序列(表1)<400>8Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser1 5<210>9<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRL2變體#1(表1)<400>9Tyr Ala Tyr Glu Ser Ile Ser1 5
<210>10<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRL2變體#2(表1)<400>10Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Tyr1 5<210>11<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRL2變體#3(表1)<400>11Tyr Ala Ser Glu Ser Asp Ser1 5<210>12<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRL2變體#4(表1)<400>12Tyr Ala Ser Glu Ser Glu Ser1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>TES-C21 CDRL3(表1)<400>13Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr Thr1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRL3變體(表)
<400>14Ala Ala Ser Trp Ser Trp Pro Thr Thr1 5<210>15<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>TES-C21 CDRH1<400>15Met Tyr Trp Leu Glu1 5<210>16<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH1變體#1(表1)<400>16Trp Tyr Trp Leu Glu1 5<210>17<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH1 #2(表1)<400>17Tyr Tyr Trp Leu Glu1 5<210>18<211>17<212>PRT<212>人工的<220>
<223>TES-C21 CDRH2(表1)<400>18Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala
<210>19<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH2變體#1(表1)<400>19Glu Ile Glu Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>20<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH2變體#2(表1)<400>20Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>21<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH2變體#3(表1)<400>21Glu Ile Ser Pro Asp Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>22<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH2變體#4(表1)
<400>22Glu Ile Ser Pro Glu Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>23<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH2變體#5(表1)<400>23Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>24<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH2變體#6(表1)<400>24Glu Ile Glu Pro Gly Thr Phe Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>25<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH2變體#7(表1)<400>25Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala
<210>26<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>TES-C21 CDRH3(表1)<400>26Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>27<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH3變體#1(表1)<400>27Phe Ser His Phe Ser Gly Met Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>28<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH3變體#2(表1)<400>28Phe Ser His Phe Ser Gly Gln Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>29<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDRH3變體#3(表1)<400>29Phe Ser His Phe Thr Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>30<211>23<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL1變體136
<400>30Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>31<211>23<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL1變體1<400>31Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>32<211>23<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL1變體2<400>32Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>33<211>23<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL1變體4<400>33Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20
<210>34<211>23<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL1變體13<400>34Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>35<211>23<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL1變體18<400>35Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>36<211>23<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL1變體25<400>36Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>37<211>23<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL1變體27<400>37
Glu Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>38<211>15<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL2變體136<400>38Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15<210>39<211>15<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL2變體1<400>39Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys1 5 10 15<210>40<211>32<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL3變體136<400>40Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>41<211>32<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL3變體1<400>41
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>42<211>32<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL3變體13<400>42Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys20 25 30<210>43<211>32<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL3變體18<400>43Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys20 25 30<210>44<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRL4變體<400>44Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys1 5 10<210>45<211>30<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRH1變體136<400>45Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser20 25 30<210>46<211>30<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRH1變體2<400>46Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser20 25 30<210>47<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRH1變體136<400>47Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met Gly1 5 10<210>48<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRH2變體2<400>48Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly1 5 10<210>49<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRH2變體8<400>49Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly1 5 10<210>50<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRH2變體21<400>50Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Val Gly1 5 10<210>51<211>32<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRH3變體136<400>51Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu1 5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>52<211>32<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRH3變體1<400>52Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu1 5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>53<211>32<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRH3變體43<400>53Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu1 5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>54<211>32<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRH3變體103<400>54Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu1 5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>55<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FRH4變體136<400>55Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser1 5 10<210>56<211>19<212>PRT<213>細菌噬菌體M13mp18<220>
<221>misc_feature<223>基因III信號序列<400>56Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser
<210>57<211>107<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系136的輕鏈可變區(qū)<400>57Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly505560Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>58<211>106<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系136的輕鏈恒定區(qū)<400>58Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln1 5 10 15Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr20 25 30Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser35 40 45Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys65 70 75 80His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro85 90 95Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys100 105<210>59<211>123<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系136的重鏈可變區(qū)<400>59Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>60<211>330<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人類IgG1的恒定區(qū)<400>60
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Va1 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100 105 110Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Va1 Phe Leu Phe Pro Pro115 120 125Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys130 135 140Val Va1 Va1 Asp Va1 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145 150 155 160Tyr Va1 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165 170 175Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu180 185 190His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn195 200 205Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly210 215 220Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu225 230 235 240Leu Thr Lys Asn Gln Va1 Ser Leu Thr Cys Leu Va1 Lys Gly Phe Tyr245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn260 265 270Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe275 280 285Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn290 295 300Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330<210>61<211>107<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系CL-2C的輕鏈可變區(qū)<400>61Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>62<211>123<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系CL-2C的重鏈可變區(qū)<400>62Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Trp Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>63<211>107<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系CL-5I的輕鏈可變區(qū)<400>63Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>64<211>123<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系CL-5I的重鏈可變區(qū)<400>64Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>65<211>107<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系CL-5A的輕鏈可變區(qū)<400>65Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>66<211>123<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系CL-5A的重鏈可變區(qū)<400>66Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Trp Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Glu Pro Gly Thr Glu Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>67<211>107<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系CL-2B的輕鏈可變區(qū)<400>67Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>68<211>123<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系CL-2B的重鏈可變區(qū)<400>68Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>69<211>107<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系CL-1136-2C的輕鏈可變區(qū)<400>69Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>70<211>123<212>PRT<213>人工的<220>
<223>純系CL-1136-2C的重鏈可變區(qū)<400>70Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120
權(quán)利要求
1.一種可變輕鏈區(qū)，其包含一具有式FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的氨基酸序列，其中FRL1由SEQ ID NO30至37中的任一個組成；CDRL1由SEQ ID NO5至7中的任一個組成；FRL2由SEQ ID NO38至39中的任一個組成；CDRL2由SEQ ID NO8至12中的任一個組成；FRL3由SEQ ID NO40至43中的任一個組成；CDRL3由SEQ ID NO13至14中的任一個組成；而FRL4由SEQ ID NO44組成。
2.如權(quán)利要求1所述的可變輕鏈區(qū)，其包含SEQ ID NO57、61、63、65、67和69中的任一個。
3.如權(quán)利要求1所述的可變輕鏈區(qū)，其進一步包含一恒定區(qū)。
4.如權(quán)利要求3所述的可變輕鏈區(qū)，其中所述恒定結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO58。
5.如權(quán)利要求2所述的可變輕鏈區(qū)，其進一步包含一恒定區(qū)。
6.如權(quán)利要求5所述的可變輕鏈區(qū)，其中所述恒定區(qū)具有SEQ ID NO58。
7.如權(quán)利要求1所述的可變輕鏈區(qū)，其進一步包含一信號肽。
8.如權(quán)利要求7所述的可變輕鏈區(qū)，其中所述信號肽具有SEQ ID NO56。
9.一種可變重鏈區(qū)，其包含一具有式FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4的氨基酸序列，其中FRH1由SEQ ID NO45至46中的任一個組成；CDRH1由SEQ ID NO15至17中的任一個組成；FRH2由SEQ ID NO47至50中的任一個組成；CDRH2由SEQ IDNO18至25中的任一個組成；FRH3由SEQ ID NO51至54中的任一個組成；CDRH3由SEQ ID NO26至29中的任一個組成；而FRH4由SEQ ID NO55組成。
10.如權(quán)利要求9所述的可變重鏈區(qū)，其包含SEQ ID NO59、62、64、66、68和70中的任一個。
11.如權(quán)利要求7所述的可變重鏈區(qū)，其進一步包含一恒定區(qū)的至少CH1結(jié)構(gòu)域。
12.如權(quán)利要求11所述的可變重鏈區(qū)，其包含一恒定區(qū)的CH1、CH2及CH3結(jié)構(gòu)域。
13.如權(quán)利要求11所述的可變重鏈區(qū)，其中所述恒定區(qū)來自一IgG抗體。
14.如權(quán)利要求13所述的可變重鏈區(qū)，其中所述IgG抗體為一IgG1抗體、一IgG2抗體、一IgG3抗體或一IgG4抗體。
15.如權(quán)利要求13所述的可變重鏈區(qū)，其中所述恒定結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO60。
16.如權(quán)利要求10所述的可變重鏈區(qū)，其進一步包含一恒定區(qū)。
17.如權(quán)利要求16所述的可變重鏈區(qū)，其中所述恒定結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO60。
18.如權(quán)利要求9所述的可變重鏈區(qū)，其進一步包含一信號肽。
19.如權(quán)利要求18所述的可變重鏈區(qū)，其中所述信號肽具有SEQ ID NO56。
20.一種包含如權(quán)利要求1所述的可變輕鏈區(qū)的抗體或抗體片段，其中所述抗體特異性地與IgE結(jié)合。
21.一種包含如權(quán)利要求9所述的可變重鏈區(qū)的抗體或抗體片段，其中所述抗體特異性地與IgE結(jié)合。
22.如權(quán)利要求20所述的抗體，其包含一如權(quán)利要求9所述的重鏈區(qū)。
23.如權(quán)利要求22所述的抗體，其包含一具有SEQ ID NO57中所示氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)和一具有SEQ ID NO59中所示氨基酸序列的可變重鏈區(qū)。
24.如權(quán)利要求23所述的抗體，其進一步包含一恒定輕鏈區(qū)和一恒定重鏈區(qū)。
25.如權(quán)利要求24所述的抗體，其中所述恒定輕鏈區(qū)具有SEQ ID NO58中所示氨基酸序列并且所述恒定重鏈區(qū)具有SEQ ID NO60中所示氨基酸序列。
26.如權(quán)利要求22所述的抗體，其包含一具有SEQ ID NO61中所示氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)和一具有SEQ ID NO62中所示氨基酸序列的可變重鏈區(qū)。
27.如權(quán)利要求26所述的抗體，其進一步包含一恒定輕鏈區(qū)和一恒定重鏈區(qū)。
28.如權(quán)利要求27所述的抗體，其中所述恒定輕鏈區(qū)具有SEQ ID NO58中所示氨基酸序列并且所述恒定重鏈區(qū)具有SEQ ID NO60中所示氨基酸序列。
29.如權(quán)利要求26所述的抗體，其由一具有ATCC存放號PTA-5678的細胞產(chǎn)生。
30.如權(quán)利要求22所述的抗體，其包含一具有SEQ ID NO63中所示氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)和一具有SEQ ID NO64中所示氨基酸序列的可變重鏈區(qū)。
31.如權(quán)利要求30所述的抗體，其進一步包含一恒定輕鏈區(qū)和一恒定重鏈區(qū)。
32.如權(quán)利要求31所述的抗體，其中所述恒定輕鏈區(qū)具有SEQ ID NO58中所示氨基酸序列并且所述恒定重鏈區(qū)具有SEQ ID NO60中所示氨基酸序列。
33.如權(quán)利要求30所述的抗體，其由一具有ATCC存放號PTA-5680的細胞產(chǎn)生。
34.如權(quán)利要求22所述的抗體，其包含一具有SEQ ID NO65中所示氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)和一具有SEQ ID NO66中所示氨基酸序列的可變重鏈區(qū)。
35.如權(quán)利要求34所述的抗體，其進一步包含一恒定輕鏈區(qū)和一恒定重鏈區(qū)。
36.如權(quán)利要求35所述的抗體，其中所述恒定輕鏈區(qū)具有SEQ ID NO58中所示氨基酸序列并且所述恒定重鏈區(qū)具有SEQ ID NO60中所示氨基酸序列。
37.如權(quán)利要求34所述的抗體，其由一具有ATCC存放號PTA-5679的細胞產(chǎn)生。
38.如權(quán)利要求22所述的抗體，其包含一具有SEQ ID NO67中所示氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)和一具有SEQ ID NO68中所示氨基酸序列的可變重鏈區(qū)。
39.如權(quán)利要求38所述的抗體，其進一步包含一恒定輕鏈區(qū)和一恒定重鏈區(qū)。
40.如權(quán)利要求39所述的抗體，其中所述恒定輕鏈區(qū)具有SEQ ID NO58中所示氨基酸序列并且所述恒定重鏈區(qū)具有SEQ ID NO60中所示氨基酸序列。
41.如權(quán)利要求22所述的抗體，其包含一具有SEQ ID NO69中所示氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)和一具有SEQ ID NO70中所示氨基酸序列的可變重鏈區(qū)。
42.如權(quán)利要求41所述的抗體，其進一步包含一恒定輕鏈區(qū)和一恒定重鏈區(qū)。
43.如權(quán)利要求42所述的抗體，其中所述恒定輕鏈區(qū)具有SEQ ID NO58中所示氨基酸序列并且所述恒定重鏈區(qū)具有SEQ ID NO60中所示氨基酸序列。
44.一種組合物，其包含一治療有效量的如權(quán)利要求20或21所述的抗體和一醫(yī)藥上可接受的載劑。
45.如權(quán)利要求20或21所述的抗體，其進一步連接至一標記。
46.一種診斷試劑盒，其包含一如權(quán)利要求20或21所述的抗體。
47.一種載體，其包含一編碼如權(quán)利要求22所述的抗體的核酸。
48.一種包含如權(quán)利要求47所述的載體的細胞。
49.如權(quán)利要求48所述的細胞，其中所述細胞為ATCC存放號PTA-5678、PTA-5679或PTA-5680。
50.一種產(chǎn)生抗體的方法，其包括將如權(quán)利要求48所述的細胞在適合于產(chǎn)生抗體的條件下培養(yǎng)，和分離所產(chǎn)生的抗體。
51.一種測量受試者體內(nèi)IgE水平的方法，其包括使所述受試者的一樣品與如權(quán)利要求22所述的抗體接觸，其中所述樣品包含IgE分子；和測定所述樣品相對于一對照受試者的對照樣品的抗體保留水平，其中若所述受試者樣品具有比所述對照樣品更高或更低的抗體保留水平則表示所述受試者具有比所述對照受試者中更高或更低的IgE分子水平。
52.一種診斷與受試者體內(nèi)異常IgE水平相關(guān)的疾病的方法，其包括使所述受試者的一樣品與如權(quán)利要求22所述的抗體接觸，其中所述樣品包含IgE分子；和測定所述樣品相對于一對照受試者的對照樣品的抗體保留水平，其中若所述受試者樣品具有比所述對照樣品更高或更低的抗體保留水平則表示所述受試者具有與異常IgE水平相關(guān)的疾病。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述與異常IgE水平相關(guān)的疾病為哮喘、過敏性鼻炎、濕疹、蕁麻疹或異位性皮炎。
54.一種治療與受試者體內(nèi)異常高IgE水平相關(guān)的疾病的方法，其包括對所述受試者施用一治療有效量的如權(quán)利要求22所述的抗體，以便在所述受試者中治療所述疾病。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中所述疾病為哮喘、過敏性鼻炎、濕疹、蕁麻疹、異位性皮炎或食物過敏。
全文摘要
本發(fā)明涉及高親和力人類單克隆抗體，尤其那些針對免疫球蛋白E(IgE)的同型決定子的高親和力人類單克隆抗體，以及這些抗體的直接等效物及衍生物。這些抗體可以一比原始親代抗體高至少100倍的親和力與其各自的靶相結(jié)合。這些抗體可用于診斷、預(yù)防和治療疾病。
文檔編號A61K39/395GK1771338SQ200480007011
公開日2006年5月10日 申請日期2004年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月1日
發(fā)明者桑賈耶·辛格, 凱瑟琳·福斯特, 赫倫·吳 申請人:唐納士公司