專利名稱：在人轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的糖蛋白抗原sima135的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及診斷癌癥和減少哺乳動(dòng)物(例如人類)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法。具體來(lái)講，本發(fā)明涉及到一種腫瘤標(biāo)記蛋白質(zhì)的用途，用于產(chǎn)生可用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中該蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加的抗體，并涉及所述抗體的用途，用來(lái)減少產(chǎn)生所述腫瘤標(biāo)記蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的組織并且產(chǎn)生次生腫瘤，而良性腫瘤不會(huì)產(chǎn)生次生腫瘤。這種產(chǎn)生次生腫瘤的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)移，是一種復(fù)雜的過(guò)程，次生腫瘤細(xì)胞集結(jié)位點(diǎn)遠(yuǎn)離初生腫瘤。腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是癌癥患者死亡的主要原因，然而對(duì)腫瘤細(xì)胞傳播的分子機(jī)制不是很清楚。
轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步過(guò)程，其中腫瘤細(xì)胞必需從初生瘤分離、侵入細(xì)胞基質(zhì)、滲透血管，進(jìn)而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)(intravasate)、停滯在一個(gè)較遠(yuǎn)的位點(diǎn)、從血液中釋放出來(lái)(extravasate)并且生長(zhǎng)。參見(jiàn)例如G.L.Nicolson(1982)Biochim.Biophis.Acta.695113-176；G.L.Nicolson和G.Poste(1983)In.Rev.Exp.Pathol.2577-181；G.Poste和I.J.Fidler(1980)Nature 283139-145；以及E.Roos(1984)Biochim.Biophis.Acta.738263-284。由于該過(guò)程復(fù)雜，據(jù)認(rèn)為很多基因介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性表型確實(shí)與包括蛋白酶、粘附分子等在內(nèi)的很多蛋白的表達(dá)相關(guān)。然而往往缺乏或者很難證明一種特定蛋白直接參與傳播。L.A.Liotta和W.Stetler-Stevenson(1989)J.Natl.Cancer Inst.81556-557。
人鱗狀細(xì)胞癌HEp-3提供了一個(gè)能檢測(cè)和表征實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性傳播的基因的獨(dú)特系統(tǒng)。通過(guò)在雞尿囊絨膜(CAM)上系列傳代而繁殖的HEp-3細(xì)胞具有致瘤和自發(fā)轉(zhuǎn)移能力(T+M+)。Ossowski和E.Reich(1980a)CancerRes.402300-2309)。然而，這些細(xì)胞在體外持續(xù)生長(zhǎng)，它們很容易形成初級(jí)腫瘤，但是隨著時(shí)間日益增長(zhǎng)，它們轉(zhuǎn)變?yōu)榉寝D(zhuǎn)移型(T+M-)。L.Ossowski和E.Reich(1980b)Cancer Res.402310-2315)。在體外持續(xù)培養(yǎng)，它們最終轉(zhuǎn)變?yōu)榉侵铝鲂?T-M-)。轉(zhuǎn)移能力的喪失是可逆的。T+M-細(xì)胞轉(zhuǎn)到尿囊絨膜上生長(zhǎng)2至3代將恢復(fù)形成自發(fā)瘤轉(zhuǎn)移。因而，通過(guò)改變生長(zhǎng)條件，研究者可以操縱這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。
人尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)直接參與HEp-3的傳播，人尿激酶型纖溶酶原激活物的特異性抗體可以抑制雞胚胎中HEp-3細(xì)胞的自發(fā)轉(zhuǎn)移性。L.Ossowski和E.Reich(1983b)Cell 35611-619。隨后發(fā)現(xiàn)，抑制uPA活性阻斷了單個(gè)的HEp-3細(xì)胞對(duì)CAM間葉細(xì)胞的侵潤(rùn)。L.Ossowski(1988a)Cell 52321-328。然而，有活性的uPA顯然對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)而非滲出血管是必需的。L.Ossowski(1988a)。因此，一些其他的因子也一定參與HEp-3的傳播和癌細(xì)胞的普遍傳播。J.P.Quigley等(1988)，CibaFoundation Symposium 14122-4.7，Brooks等(1993)，J.Cell Biol.122(6)1351-1359，以及Testa等，美國(guó)專利號(hào)6,245,898和6,498,014報(bào)道了利用“消減免疫(subtractive immunization)”產(chǎn)生單克隆抗體(mAbs)，它能識(shí)別HEp-3細(xì)胞表達(dá)的表面抗原，并且抑制在尿囊絨膜模型中腫瘤的轉(zhuǎn)移。然而，這些抗原與體內(nèi)轉(zhuǎn)移不相關(guān)，并且也沒(méi)有顯示出直接參與體內(nèi)轉(zhuǎn)移的過(guò)程。
因此，需要鑒定功能性參與癌細(xì)胞擴(kuò)散的生物分子，以研發(fā)可用于抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新組織的療法。也需要抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法和診斷癌癥的方法，以通過(guò)減少或消除癌細(xì)胞在患有癌癥的哺乳動(dòng)物體內(nèi)擴(kuò)散而有利于控制癌癥。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)移細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白(SIMA135)(SEQ ID NO1)的鑒定和表征。因此，本發(fā)明提供糖基化和非糖基化形式的SIMA135。本發(fā)明同時(shí)提供特異地并且選擇地結(jié)合SIMA135和SIMA135片段的抗體。這些抗體能結(jié)合糖基化或非糖基化的SIMA135或者SIMA135片段。因此，本發(fā)明提供通過(guò)使用特異地結(jié)合SIMA135的抗體來(lái)抑制、減少或者消除癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法。本發(fā)明也提供在試驗(yàn)樣品中診斷癌癥和確定癌細(xì)胞存在的方法。這些方法可用于哺乳動(dòng)物，例如人類。本發(fā)明也提供含有特異地并且選擇地結(jié)合SIMA135和SIMA135片段的抗體的藥物組合物和試劑盒。本發(fā)明也提供篩選調(diào)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生SIMA135的試劑的方法。
本發(fā)明提供SIMA135和SIMA135片段。優(yōu)選地，SIMA135和SIMA135片段是非糖基化的。更優(yōu)選地，SIMA135或SIMA135片段是糖基化的。優(yōu)選地，SIMA135片段施與到生物體例如哺乳動(dòng)物或者鳥類時(shí)，其是抗原性的并且能激發(fā)免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，SIMA135的抗原性片段是糖基化的。
本發(fā)明提供了結(jié)合SIMA135或SIMA135片段的抗體，例如單克隆抗體41-2。優(yōu)選地，當(dāng)優(yōu)選的單克隆抗體選擇性和特異性地結(jié)合SIMA135時(shí)，抗體不是單克隆抗體41-2。優(yōu)選地，抗體是重組抗體。更優(yōu)選地，抗體是多克隆抗體。甚至更優(yōu)選地，抗體是人源化抗體。最優(yōu)選地，抗體是單克隆抗體。優(yōu)選地，抗體結(jié)合非糖基化的SIMA135或者非糖基化的SIMA135片段。更優(yōu)選地，抗體結(jié)合糖基化的SIMA135或者糖基化的SIMA135片段。
本發(fā)明提供抑制、減少或者消除癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法。所述方法涉及施與生物體其需要的能結(jié)合SIMA135的抗體。單克隆抗體41-2能結(jié)合SIMA135，也能與參與轉(zhuǎn)移的其它抗原結(jié)合，但是本方法優(yōu)選其它非單克隆抗體41-2的抗體。此種其它抗體能選擇地和特異地結(jié)合SIMA135。優(yōu)選地，生物體是哺乳動(dòng)物。更優(yōu)選地，生物體是人類。優(yōu)選地，抗體非特異地結(jié)合SIMA135或者其片段。更優(yōu)選地，抗體特異地結(jié)合SIMA135或者其片段。優(yōu)選地，抗體是多克隆抗體。更優(yōu)選地，抗體是重組抗體。甚至更優(yōu)選地，抗體是單克隆抗體。最優(yōu)選地，抗體是人源化抗體。優(yōu)選地，抗體結(jié)合非糖基化的SIMA135或者非糖基化的SIMA135片段。更優(yōu)選地，抗體結(jié)合糖基化的SIMA135或者糖基化的SIMA135片段。優(yōu)選地，抗體作為藥物組合物施與需要其的生物體。
本發(fā)明也提供在生物體中診斷癌癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合SIMA135的抗體與獲自生物體的試驗(yàn)樣品接觸，然后比較試驗(yàn)樣品和無(wú)癌對(duì)照樣品結(jié)合的抗體相對(duì)數(shù)量。試驗(yàn)樣品比對(duì)照樣品結(jié)合的抗體數(shù)量增多則說(shuō)明生物體患有癌癥。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在生物體診斷癌癥的免疫組織化學(xué)的方法，其中抗體與獲自生物體的試驗(yàn)樣品接觸，比較試驗(yàn)樣品顯示的抗體結(jié)合模式和對(duì)照樣品產(chǎn)生的抗體結(jié)合模式。如果使用試驗(yàn)樣品產(chǎn)生的抗體結(jié)合模式與使用致癌對(duì)照樣品產(chǎn)生的抗體結(jié)合模式匹配，生物體診斷為患有癌癥。另外，如果試驗(yàn)樣品的抗體結(jié)合模式不同于使用無(wú)癌對(duì)照樣品產(chǎn)生的抗體結(jié)合模式，這樣生物體診斷為患有癌癥。優(yōu)選地，優(yōu)選地，抗體非特異地結(jié)合SIMA135或其片段。更優(yōu)選地，優(yōu)選地，抗體特異地結(jié)合SIMA135或其片段。
本發(fā)明也提供了含有結(jié)合SIMA135或者其片段抗體以及可藥用載體的藥物組合物，條件是其中所述抗體不為單克隆抗體41-2。
本發(fā)明也提供包含結(jié)合SIMA135或者其片段的抗體以及包裝材料的試劑盒。
本發(fā)明提供鑒定能調(diào)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生SIMA135的試劑的方法。本發(fā)明還包括該方法中有效的細(xì)胞系和測(cè)試方法本身。優(yōu)選地，依照所述方法鑒定的試劑增加細(xì)胞SIMA135的產(chǎn)生。這種鑒定將證明某一試劑的致癌性，因此可用于致癌劑的快速試驗(yàn)。更優(yōu)選地，依照該方法鑒定的試劑減少細(xì)胞SIMA135的產(chǎn)生。這種鑒定可證明此種試劑的抗致癌性。在一個(gè)實(shí)施方案中，將候選試劑與試驗(yàn)細(xì)胞接觸，比較試驗(yàn)細(xì)胞和未與該候選試劑接觸的對(duì)照細(xì)胞SIMA135的產(chǎn)生。與對(duì)照細(xì)胞相比，增加或者減少試驗(yàn)細(xì)胞SIMA135的產(chǎn)生，則證明候選試劑調(diào)節(jié)細(xì)胞SIMA135的產(chǎn)生。優(yōu)選地，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更優(yōu)選地，細(xì)胞是人細(xì)胞。甚至更優(yōu)選地，細(xì)胞是非轉(zhuǎn)移性的HEp3細(xì)胞。最優(yōu)選地，細(xì)胞是轉(zhuǎn)移性HEp3細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示了SIMA135的氨基酸序列。信號(hào)序列為小寫字母，推斷的跨膜結(jié)構(gòu)域用方框標(biāo)記。12個(gè)共有的N糖基化基序(motif)用實(shí)心三角形標(biāo)記。胞質(zhì)酪氨酸殘基用圓圈標(biāo)記。CUB結(jié)構(gòu)域用下劃線標(biāo)記，CUB結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為跨越221位殘基到348位殘基以及417位殘基到544位殘基。胰蛋白酶消化鑒定的三個(gè)肽段和序列用上劃線標(biāo)記。肽2前面的Arg殘基和肽3前面的Lys殘基用方框標(biāo)記，以突出與胰蛋白酶對(duì)含有Arg/Lys的底物具特異性是一致的。胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域PXXP序列用下劃線標(biāo)記。在推斷的跨膜結(jié)構(gòu)域之后共有的十六烷基化基序用實(shí)心圈標(biāo)記。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及通過(guò)消減免疫途徑，利用命名為41-2的單克隆抗體從轉(zhuǎn)移性HEp3細(xì)胞中純化的一種糖基化蛋白質(zhì)這一發(fā)現(xiàn)。該蛋白質(zhì)命名為SIMA135(消減免疫M(jìn)+Hep3相關(guān)的135kDa蛋白)。
SIMA135是指可以從細(xì)胞物理分離的蛋白質(zhì)，這不同于通過(guò)翻譯核苷酸序列而推測(cè)得到的推定蛋白質(zhì)。物理分離SIMA135對(duì)許多理由是有意義的。一個(gè)理由是，該蛋白質(zhì)的分離說(shuō)明該蛋白質(zhì)的mRNA確實(shí)轉(zhuǎn)錄成多肽。第二，此處報(bào)道的該蛋白質(zhì)的分離和鑒定說(shuō)明該蛋白質(zhì)是糖基化的。物理分離的糖基化蛋白質(zhì)證實(shí)了多肽中的糖基化位點(diǎn)可以糖基化，沒(méi)有隱藏在折疊的蛋白質(zhì)中而變得不能結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶。由于已知糖基化參與蛋白質(zhì)折疊和免疫原性的作用，這些構(gòu)象是重要的。因此，當(dāng)與由核苷酸序列推斷的理論上的多肽序列相比，分離SIMA135蛋白質(zhì)是一個(gè)重大的進(jìn)步。
此處顯示的SIMA135 cDNA編碼一個(gè)135kDa的，能特異地與mAb41-2進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的I型跨膜細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。免疫純化和氨基酸測(cè)序證實(shí)成熟的該蛋白質(zhì)起始于30位的Phe，前面切除了29個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。免疫細(xì)胞化學(xué)分析證實(shí)了此蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞表面和該蛋白質(zhì)的I型定位。此外，Western印跡分析去糖基化的細(xì)胞裂解物表明由于N連接的多糖，成熟SIMA135的表觀分子量(約135kDa)和理論分子量(約90kDa)存在多達(dá)40kDa的差異，該結(jié)果與存在的12個(gè)可能的胞外糖基化位點(diǎn)相一致。Western印跡分析證明，SIMA135是一個(gè)酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)，這與細(xì)胞內(nèi)存在5個(gè)酪氨酸殘基相一致。另外，利用PP2抑制劑證明，Src激酶家族成員參與HEp3細(xì)胞中SIMA135的酪氨酸磷酸化。
SIMA135的結(jié)構(gòu)域表明其可與例如可溶性配基、其它細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或者基質(zhì)成分在內(nèi)的胞外蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，這些作用有可能通過(guò)存在于其氨基端區(qū)域推測(cè)的CUB結(jié)構(gòu)域而發(fā)生。這些結(jié)構(gòu)被認(rèn)為介導(dǎo)結(jié)合許多蛋白質(zhì)配基。例如，CUB結(jié)構(gòu)域參與穩(wěn)定在補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的外源凝集素分支中起作用的MASP絲氨酸蛋白酶同型二聚體(Chen和Wallis，2001)。許多II型跨膜絲氨酸蛋白酶也含有CUB結(jié)構(gòu)域，CUB結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為介導(dǎo)酶與底物的相互反應(yīng)(Hooper等，2001)。此外，cubilin的CUB結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)結(jié)合內(nèi)在因子-維生素B12和清蛋白(Yammani等，2001)。由于SIMA135胞外結(jié)構(gòu)域糖基化程度很高，據(jù)認(rèn)為配基結(jié)合需要依靠，至少部分需要依靠糖類部分，在細(xì)胞表面糖蛋白質(zhì)CD44的多種同種型已經(jīng)證實(shí)了此現(xiàn)象(Bajorath，2000)。糖基化也被認(rèn)為有助于SIMA135蛋白質(zhì)的折疊，以及有助于運(yùn)輸至和維持在細(xì)胞表面(Gorlike等，2001；Grogan等，2002)。
SIMA135在氨基酸序列上顯示出與其它與指環(huán)狀癌相關(guān)的蛋白質(zhì)(GenBank登錄號(hào)AK026622)以及非小肺細(xì)胞癌細(xì)胞系Calu6相關(guān)的蛋白質(zhì)(GenBank登錄號(hào)AY026461)(Scher-Mostageer等，2001)不同。與之前已知的蛋白質(zhì)相比，這些差異被認(rèn)為影響SIMA135與其它分子的相互作用能力。第一個(gè)氨基酸的改變，525位Arg變?yōu)镚ln，出現(xiàn)在胞外可能的配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域；SIMA135的第二個(gè)可能的CUB結(jié)構(gòu)域。第二個(gè)氨基酸的改變，709位Gly變?yōu)锳sp，位于酪氨酸殘基后的第二個(gè)殘基。此由一個(gè)非極性的氨基酸變?yōu)閹щ姾蓺埢母淖冾A(yù)期對(duì)鄰近的酪氨酸被磷酸化的能力有很大的影響，因此，也被認(rèn)為影響SIMA135的結(jié)合能力，例如結(jié)合SH2結(jié)構(gòu)域的能力。最后一個(gè)氨基酸的改變，827位Ser變?yōu)锳sn，位于距離PXXP基序的四個(gè)殘基處。因此，此改變可能也影響SIMA135與其它蛋白質(zhì)的相互作用能力；所述其它蛋白質(zhì)在此情況下為含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。
在正常結(jié)腸組織中，蛋白質(zhì)SIMA135存在于結(jié)腸上皮細(xì)胞的基底和頂端表面以及存在于隱窩上皮細(xì)胞的頂端表面。與正常結(jié)腸中其明顯的定位形成對(duì)照，結(jié)腸瘤組織中的SIMA135呈混亂的和異型的分布，通過(guò)質(zhì)膜和胞質(zhì)染色可觀察到這種失調(diào)。在侵染結(jié)腸漿膜的深層腺體和引流血管內(nèi)部，SIMA135的表達(dá)顯得較為強(qiáng)烈。這些結(jié)果表明，蛋白質(zhì)SIMA135表達(dá)的增加更多地與癌發(fā)生的后期階段有關(guān)，例如，局部侵襲和轉(zhuǎn)移。Western印跡分析取自同一組織中的成對(duì)人瘤細(xì)胞，可在一定程度上證明這個(gè)觀點(diǎn)。例如，與同類系的且低轉(zhuǎn)移性的變體M-HEp3相比，SIMA135在高轉(zhuǎn)移性M+HEp3中的表達(dá)水平非常高。此外，不同類系的前列腺癌細(xì)胞系PC-3和LNCaP表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，前者是一個(gè)轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系，后者是一個(gè)低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞型，SIMA135在前者中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后者(Soos等，1997)。
在正常和惡性腺體的腺液中都可以觀察到明顯的游離SIMA135，此現(xiàn)象與觀察到的HEp3細(xì)胞體外釋放的該蛋白110kDa可溶形式的結(jié)果相一致。腺體組織超微結(jié)構(gòu)在腫瘤發(fā)生明顯的損失是很顯然的，這可允許可溶形式的SIMA135/CDCP1釋放到結(jié)腸癌病人的體液和血管系統(tǒng)。因此，認(rèn)為SIMA135作為血清或組織液標(biāo)記具有實(shí)用性，對(duì)跨膜蛋白質(zhì)MUC1(Rye和McGuckin，2001)、CD44(Adham等，1990)和ICAM-1(Maruo等，2002)也已提出此實(shí)用性。
I.糖基化的或者非糖基化的SIMA135、片段和其變體本發(fā)明提供可被糖基化的或不被糖基化的蛋白質(zhì)SIMA135(SEQ IDNo1)、SIMA135片段和SIMA135的變體。這些蛋白質(zhì)、片段和其變體可作為抗原來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生結(jié)合SIMA135的抗體，例如，特異地和/或選擇性地結(jié)合SIMA135的抗體。這些選擇性結(jié)合的抗體包括那些結(jié)合SIMA135或者部分SIMA135，但不結(jié)合非SIMA135或者非SIMA135片段的其他蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段的抗體。這些蛋白質(zhì)、片段和其變體可用于選擇特異地和選擇性地結(jié)合SIMA135的抗體。這些特異地和選擇性地結(jié)合抗體包括那些結(jié)合SIMA135或者部分SIMA135，但不結(jié)合非SIMA135或者非SIMA135片段的其他蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段的抗體。這些抗體的選擇性特別地表明它們結(jié)合SIMA135或者部分SIMA135，而不結(jié)合轉(zhuǎn)移性Hep3細(xì)胞裂解產(chǎn)物產(chǎn)生的一種180kDa的蛋白質(zhì)(美國(guó)專利號(hào)6,498,014)，SIMA135或者其片段與抗體結(jié)合的解離常數(shù)具有相同的數(shù)量級(jí)，但這些抗體結(jié)合180kDa的蛋白質(zhì)可產(chǎn)生至少高于結(jié)合SIMA135或者其片段兩個(gè)數(shù)量級(jí)的解離常數(shù)。這些抗體的特異性表明免疫原性的結(jié)合是表位-高變區(qū)相互作用的結(jié)果，而不是非特異的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果。非特異的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的解離常數(shù)一般比特異的表位-高變區(qū)相互作用的解離常數(shù)高三個(gè)數(shù)量級(jí)?？贵w-抗原免疫結(jié)合對(duì)的解離常數(shù)的測(cè)定可參照Harlow等人的方法(Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Pub.1988))，此處引用作為參考。
此處所用的SIMA135片段是指一個(gè)足夠長(zhǎng)度的抗原性的肽段。一般來(lái)說(shuō)，所述片段至少包含5個(gè)氨基酸。本發(fā)明涉及糖基化的或者非糖基化的SIMA135片段，例如糖基化的或者非糖基化的SEQ ID No1的片段，其中所述的片段包含525位的氨基酸和/或827位的氨基酸。本發(fā)明涉及SIMA135片段，例如SEQ ID No1的片段，其中所述的片段中525位的氨基酸不是谷氨酰胺和/或827位的氨基酸不是天冬酰胺。本發(fā)明涉及SIMA135片段，例如，SEQ ID No1的片段，其中所述的片段中525位的氨基酸是精氨酸和/或827位的氨基酸是絲氨酸。
變體蛋白質(zhì)包括具有氨基酸替代的蛋白質(zhì)，是有生物學(xué)活性的或者作為抗原時(shí)引起產(chǎn)生抗體。SIMA135的變體旨在包括通過(guò)缺失(也叫截短)或者添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸至天然SIMA135的N端和/或C端；通過(guò)缺失或者添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸至天然SIMA135的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處；或者通過(guò)在天然SIMA135的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸而自天然SIMA135衍生的蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明的SIMA135可以通過(guò)包括氨基酸替代、缺失、截短和插入在內(nèi)的不同方法進(jìn)行改變。這些操作的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，多肽的氨基酸序列變體可通過(guò)突變編碼SIMA135的DNA來(lái)制備。誘變和核苷酸序列改變的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參照例如，Kunkel，Proc.Natl..Acad.Sci.USA，82；488(1985)；Kunkel等，Methods inEnzymoll，154；367(1987)；美國(guó)專利號(hào)4,873,192；Walker和Gaastra編著，Techniques in Molecular biology，MacMillan Publishing Company，New York(1983)和其中引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于合適的不影響目的蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的氨基酸替代的指南，可以參照Dayhoff等人的模型，Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，C.D.(1978)此處引用作為參考。保守的替代是優(yōu)選的，例如用另外一個(gè)具有相似特性的氨基酸替代一個(gè)氨基酸。保守的氨基酸替代是優(yōu)選的，并且包括例如天冬氨酸和谷氨酸是酸性氨基酸；賴氨酸/精氨酸/亮氨酸是堿性氨基酸；亮氨酸/異亮氨酸、甲硫氨酸/纈氨酸、丙氨酸/纈氨酸是疏水性氨基酸；絲氨酸/甘氨酸/丙氨酸/蘇氨酸是親水性氨基酸。保守的氨基酸替代也包括基于側(cè)鏈的分組。每一組中的成員可相互替代。例如，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是一組有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸。這些氨基酸可以互相替代。絲氨酸和蘇氨酸是一組有脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸。天冬酰胺和谷氨酰胺是一組有酰胺基側(cè)鏈的氨基酸。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是一組具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸。賴氨酸、精氨酸和組氨酸是一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸。半胱氨酸和甲硫氨酸是一組含有硫側(cè)鏈的氨基酸。例如，用異亮氨酸或者纈氨酸替代亮氨酸、用谷氨酸替代天冬氨酸、用絲氨酸替代蘇氨酸、或者用一個(gè)結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸相似地替代一個(gè)氨基酸，這些替代可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生本發(fā)明的變體多肽。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以被糖基化或者不被糖基化。通過(guò)在能夠糖基化重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞中表達(dá)這些蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可以在體內(nèi)被糖基化。備選地，通過(guò)使用糖轉(zhuǎn)移酶，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以在體外被糖基化。這些蛋白質(zhì)可以通過(guò)使用商品化的酶例如PNGase F(New England Biolabs，Beverly，MA)進(jìn)行處理，切開任一結(jié)合的聚糖。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用來(lái)產(chǎn)生結(jié)合天然SIMA135、變性的SIMA135、SIMA135的特異部分、糖基化的SIMA135和非糖基化的SIMA135的抗體。
II.選擇性結(jié)合SIMA135或者SIMA135片段的抗體本發(fā)明提供結(jié)合SIMA135的抗體。優(yōu)選的用于藥物組合物的抗體包括那些抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的抗體。腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制可以通過(guò)例如遷移試驗(yàn)、侵染試驗(yàn)或者雞尿囊絨膜試驗(yàn)在內(nèi)的很多試驗(yàn)鑒定。
通過(guò)分別使用天然的或者變性的SIMA135免疫動(dòng)物，可制備識(shí)別天然折疊的SIMA135或者變性的SIMA135的抗體。通過(guò)分別使用糖基化的或者非糖基化的SIMA135免疫動(dòng)物，可制備識(shí)別糖基化的或者非糖基化的SIMA135的抗體。識(shí)別不同形式SIMA135的抗體(例如，天然的或變性的，以及糖基化的或非糖基化的)對(duì)于確定一個(gè)細(xì)胞是否能夠正確折疊和糖基化SIMA135是有用的。這些抗體對(duì)于確定在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，一種候選試劑是否能夠干涉產(chǎn)生SIMA135的細(xì)胞活性是有用的。因此，這些抗體可用于鑒定能用于抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的試劑的作用。
使用完整的蛋白質(zhì)或者含有目的蛋白質(zhì)小段肽段的片段作為免疫抗原，可制備結(jié)合SIMA135、SIMA135片段和SIMA135變體的抗體。可用作抗原的SIMA135片段包括在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的SIMA135片段。這些片段一般是五個(gè)氨基酸或者更長(zhǎng)。用于免疫動(dòng)物的蛋白質(zhì)或者肽可衍生自翻譯的cDNA或者化學(xué)合成，需要的話，可將這些蛋白質(zhì)共軛到載體蛋白質(zhì)?；瘜W(xué)偶聯(lián)至肽的此類常用載體包括鑰孔形血藍(lán)素(KLH)，甲狀腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，和破傷風(fēng)類毒素。偶聯(lián)的蛋白質(zhì)或者肽然后用于免疫動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠或者兔子)。單克隆抗體41-2起初是一種用于分離SIMA135的抗體。它識(shí)別SIMA135和另外包括美國(guó)專利號(hào)6,245,898和6,498,014所描述的180kDa在內(nèi)的幾種其它轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)?；谠撛颍景l(fā)明優(yōu)選的抗體是這樣的單克隆抗體，例如這些抗體選擇地和/或特異地結(jié)合SIMA135、例如所述的抗體不結(jié)合其它轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、例如所述的抗體識(shí)別SIMA135的表位。
根據(jù)需要可純化單克隆或者多克隆抗體，例如，通過(guò)從結(jié)合有針對(duì)所述抗體的多肽或者肽的基質(zhì)上結(jié)合和洗脫。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道很多在免疫學(xué)領(lǐng)域用于純化和/或濃縮單克隆抗體以及多克隆抗體的常用技術(shù)(Coligan等，Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，引用作為參考)。
適用于結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體至少對(duì)該蛋白質(zhì)區(qū)域的一部分是特異的。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用蛋白質(zhì)或者肽產(chǎn)生本發(fā)明適當(dāng)?shù)目贵w。本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體以及單克隆抗體和多克隆抗體的片段。
本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗體用來(lái)治療性治療人和動(dòng)物，本發(fā)明也涉及本發(fā)明的抗體用于制備抑制哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物。
制備多克隆抗體對(duì)于本領(lǐng)域的研究人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的(Green等，Production of Polyclonal Antisera，在Immunochemical Protocols(Manson編著)一書中，1-5頁(yè)(Humana Press 1992)；Coligan等，Production ofPolyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters，在CurrentProtocols in Immunology一書中，2.4.1節(jié)(1992)，此處引用作為參考。
制備單克隆抗體同樣也是常規(guī)的(Kohler和Milstein，Nature，256；495，1975；Coligan等，2.5.1-2.6.7節(jié)；和Harlow等，AntibodiesALaboratory Manual，726頁(yè)(Cold Spring Harbor Pub.1988))，此處引用作為參考。簡(jiǎn)要地說(shuō)，單克隆抗體可通過(guò)下面的步驟得到，用包含抗原的組合物注射小鼠、取血清樣品以檢驗(yàn)抗體產(chǎn)生的存在、取出脾臟以獲得B淋巴細(xì)胞、融合B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞以產(chǎn)生雜交瘤、克隆雜交瘤、挑選產(chǎn)生抗原抗體的陽(yáng)性克隆以及從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體。通過(guò)許多成熟的技術(shù)，可從雜交瘤中分離和純化單克隆抗體。這些分離技術(shù)包括用蛋白質(zhì)A葡聚糖的親和層析、分子篩層析和離子交換層析(Coligan等，2.7.1-2.7.12節(jié)和2.9.1-2.9.3節(jié)；Barnes等，Purification of ImmunoglobulinG(IgG)，Methods in Molecular Biology，10；79-104(Humana Press 1992))。體外和體內(nèi)增殖單克隆抗體的方法對(duì)于本領(lǐng)域的研究人員是熟知的。體外增殖可在合適的培養(yǎng)基中完成，例如Dulbecco′s Modified Eagle培養(yǎng)基或者RPMI 1640培養(yǎng)基，任選地添加哺乳動(dòng)物血清例如胎牛血清或者微量元素，以及包括例如正常小鼠腹膜滲出細(xì)胞、脾細(xì)胞、骨髓巨噬細(xì)胞在內(nèi)的維持生長(zhǎng)補(bǔ)充物。體外生產(chǎn)提供相對(duì)純的抗體制品并且允許擴(kuò)大規(guī)模以產(chǎn)生大量目的抗體。大規(guī)模雜交瘤培養(yǎng)可通過(guò)在空氣反應(yīng)器中、連續(xù)攪拌反應(yīng)器中通過(guò)均相懸浮培養(yǎng)，或者固定化的或截留的細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)完成。體內(nèi)增殖可通過(guò)注射細(xì)胞克隆到與當(dāng)前細(xì)胞能夠組織相容的哺乳動(dòng)物，例如同基因型小鼠，以引起抗體產(chǎn)生瘤的生長(zhǎng)來(lái)完成。動(dòng)物在注射前任選地用碳?xì)浠衔?，尤其是例如姥鮫烷、四甲基十五烷在內(nèi)的油類進(jìn)行預(yù)處理。一至三周后，目的單克隆抗體可從動(dòng)物的體液中回收。
本發(fā)明的抗體可衍生自“人源化的”單克隆抗體。人源化的單克隆抗體是通過(guò)轉(zhuǎn)移取自小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈中的互補(bǔ)決定區(qū)至人的可變結(jié)構(gòu)域，然后將小鼠的構(gòu)架區(qū)殘基替換為人的殘基。衍生自人源化單克隆抗體的抗體組成物的用途是消除與鼠類恒定區(qū)的免疫原性相關(guān)的潛在問(wèn)題?？寺∈竺庖咔虻鞍卓勺儏^(qū)的一般技術(shù)已有報(bào)道(Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863833(1989)。生產(chǎn)人源化單克隆抗體的技術(shù)已有報(bào)道(Jones等，Nature，321522，(1986)；Riechmann等，Nature，332323，(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534，(1988)；Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285，(1992)；Sandhu，Crit.Rev.Biotech，12437，(1992)以及Singer等，J.hnmunol.，1502844，(1993)，此處引用作為參考)。
此外，本發(fā)明的抗體可衍生自人的單克隆抗體。這些抗體可獲自轉(zhuǎn)基因小鼠，這些小鼠是被“設(shè)計(jì)的”對(duì)抗原性攻擊產(chǎn)生反應(yīng)，以產(chǎn)生特異的人抗體。在該技術(shù)中，將人重鏈和輕鏈基因座的元件導(dǎo)入到取自小鼠胚胎干細(xì)胞系的株系中，該胚胎干細(xì)胞系含有內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座的定向破壞。轉(zhuǎn)基因小鼠可合成特異人抗原的人抗體，并且這些小鼠可用于產(chǎn)生人抗體分泌型雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法已有報(bào)道(Green等，Nature Genet，713，(1994)；Lonberg等，Nature，368856，(1994)；和Taylor等，Int.Immunol，6579，(1994)，此處引用作為參考)。
本發(fā)明的抗體片段可以通過(guò)蛋白水解抗體或者在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)編碼片段的DNA來(lái)制備。運(yùn)用常規(guī)方法，利用胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化完整抗體可以得到抗體片段。例如，通過(guò)利用胃蛋白酶酶切抗體以提供標(biāo)記為F(ab′)2的5S片段，從而可以得到抗體片段。巰基還原劑可以進(jìn)一步地剪切此片段，并且任選地封閉由二硫鍵剪切產(chǎn)生的巰基基團(tuán)的基團(tuán)以產(chǎn)生3.5S Fab′單價(jià)片段?；蛘哂梦傅鞍酌该盖兄苯赢a(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)的Fab′片段和一個(gè)Fc片段。這些方法已有報(bào)道(Goldenberg，美國(guó)專利號(hào)4,036,945和4,331,647，這里引用作為參考，Porter，Biochem.J，73119(1959)；Edelman等，Methods in Enzymology，1422(Academic Press 1967)和Coligan等，2.8.1-2.8.10節(jié)和2.10.1-2.10.4節(jié))。
其它的剪切抗體的方法，例如分離重鏈以形成單價(jià)輕-重鏈片段，片段的進(jìn)一步剪切、或者其它酶、化學(xué)和遺傳技術(shù)也可用，只要片段結(jié)合至能被完整抗體識(shí)別的抗原上。
例如，F(xiàn)v片段包括VH和VL鏈的連接。該連接可以是非共價(jià)的(Inbar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，692659，(1972))。備選地，可變鏈可利用分子間二硫鍵進(jìn)行結(jié)合，或者用化學(xué)試劑進(jìn)行交聯(lián)，例如戊二醛(Sandhu，見(jiàn)上文)。優(yōu)選的Fv片段包含通過(guò)肽接頭連接的VH和VL鏈。通過(guò)構(gòu)建一個(gè)包含由寡核苷酸連接的編碼VH和VL區(qū)的DNA序列，可以制備這些單鏈抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(sFv)。該結(jié)構(gòu)基因插入到表達(dá)載體，然后再將此載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌.。此重組宿主細(xì)胞合成用銜接肽橋接兩個(gè)v結(jié)構(gòu)域的單鏈多肽。生產(chǎn)sFvs的方法已有報(bào)道(Whitlow等，MethodsA Companion to Methods in Enzymology，297，(1991)；Bird等，Science，242423，(1988)；Ladner等，美國(guó)專利號(hào)4,946,778；Pack等，Bio/Technology，111271(1993)和Sandhu，supra)。
抗體片段的另外一種形式是編碼單一互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)的肽。CDR肽(″最小識(shí)別單元″)可通過(guò)構(gòu)建編碼目的抗體CDR的基因來(lái)獲得。例如，通過(guò)使用多聚酶鏈反應(yīng)從抗體生成細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)，可制備這些基因(Larrick等，MethodsA Companion to Methods in Enzymology，2106(1991))。
III.治療轉(zhuǎn)移性腫瘤和抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法。
本發(fā)明也包括治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法?！逯委熮D(zhuǎn)移性腫瘤″的意思是腫瘤的轉(zhuǎn)移被阻止、延緩或者抑制。轉(zhuǎn)移性腫瘤包括在原發(fā)部位具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤，以及在繼發(fā)部位的轉(zhuǎn)移腫瘤。這些轉(zhuǎn)移性腫瘤可以是肺、肝、腎、乳腺、上皮細(xì)胞、甲狀腺、白血病、胰臟、子宮內(nèi)膜、卵巢、頸、皮膚、結(jié)腸和淋巴樣組織的組織起源。被治療的受試者可以是除小鼠外的任何哺乳動(dòng)物受試者，包括人、狗、猴子、牛等。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了治療患者轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，此方法通過(guò)施與患者治療有效量的本發(fā)明的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制抗體。本發(fā)明的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制抗體已經(jīng)在前文進(jìn)行了描述。優(yōu)選的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制抗體包括那些選擇性地結(jié)合SIMA135或者其片段的抗體。
腫瘤轉(zhuǎn)移抑制抗體可以單獨(dú)給藥或者結(jié)合可藥用載體?？伤幱幂d體包括所有溶劑，例如脂肪、油類、水、鹽溶液、脂類、脂質(zhì)體、樹脂、粘合劑、充填劑、分散介質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)等，或者其組合，這些溶劑對(duì)受試者沒(méi)有毒性。
依照本發(fā)明，有效成分可以與載體以任何方便的和實(shí)際的方式進(jìn)行結(jié)合，例如通過(guò)溶解、懸浮、乳化、混合、膠囊化、吸附等，并且如果必需，可通過(guò)加工將組合的組合物制成丸劑或者片劑。這些操作對(duì)這些領(lǐng)域的技術(shù)人員是常規(guī)的。
抗體的治療有效量視疾病狀態(tài)和其它的臨床因素而定，例如患者的體重和狀態(tài)、患者對(duì)治療的反應(yīng)、制劑類型和給藥途徑。治療有效的化合物的精確劑量可由此研究領(lǐng)域的技術(shù)人員決定。作為一般的規(guī)則，抗體的治療有效量可以在每單位劑型約0.5μg到約2g的范圍內(nèi)。一個(gè)單位劑型指用于哺乳動(dòng)物治療中，物理上分離的適合作為單個(gè)劑量的單位每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性物質(zhì)，這些與任何所需藥用載體結(jié)合的活性物質(zhì)計(jì)劃產(chǎn)生預(yù)期的治療效果。本發(fā)明的方法考慮了單次及多次給藥，可以同時(shí)或者在一段長(zhǎng)時(shí)間階段給藥。
腫瘤轉(zhuǎn)移抑制抗體的給藥可以以任意方便的方式來(lái)完成，這些方式包括通過(guò)氣溶膠吸入、注射、口服、輸液、植入或者移植。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體通過(guò)皮下(s.c.)、腹膜內(nèi)(i.p.)、動(dòng)脈內(nèi)(i.a.)或者靜脈內(nèi)(i.v.)注射施與患者。
IV.診斷哺乳動(dòng)物癌癥的方法本發(fā)明也包括通過(guò)檢測(cè)SIMA135的表達(dá)來(lái)診斷受試者轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法。
轉(zhuǎn)移性腫瘤包括在原發(fā)部位具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤，以及在繼發(fā)部位的轉(zhuǎn)移腫瘤。這些轉(zhuǎn)移性腫瘤可以是肺、肝、腎、乳腺、上皮細(xì)胞、甲狀腺、白血病、胰臟、子宮內(nèi)膜、卵巢、頸、皮膚、結(jié)腸和淋巴組織的組織起源。
通過(guò)使用結(jié)合SIMA135或者SIMA135片段的抗體，可以檢測(cè)SIMA135的表達(dá)。多克隆抗體和單克隆抗體都可使用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品取自受試者，例如活組織檢測(cè)樣品取自于疑似有轉(zhuǎn)移性腫瘤的組織。通常在檢測(cè)進(jìn)行之前處理樣品。可用的測(cè)定方法包括ELISA、RIA、EIA、Western印跡分析、免疫組織染色等。根據(jù)所用的測(cè)定方法，抗原或者抗體可以被酶、熒光團(tuán)或者放射性同位素所標(biāo)記。參考例如，Coligan等，Current Protocols in Immunology，John Wiley &Sons Inc.，New York，N.Y.(1994)；Frye等，Oncogen，41153-1157，1987。
樣品的處理根據(jù)所使用的檢測(cè)SIMA135的測(cè)定方法而不同。例如，活體組織的細(xì)胞可進(jìn)行裂解，并且細(xì)胞裂解產(chǎn)物被用于例如Western印跡分析。對(duì)于例如Whole Cell ELISA測(cè)定方法的測(cè)定，細(xì)胞在測(cè)定前可先用如PBS漂洗，然后在含有0.25％戊二醛的PBS中固定。
比較通過(guò)使用前文所述的任意一種方法檢測(cè)到的SIMA135或者SIMA135片段的表達(dá)與組織的正常部分中同樣抗原的表達(dá)。當(dāng)抗原的表達(dá)水平比正常組織中的表達(dá)有實(shí)質(zhì)的增加，預(yù)示為轉(zhuǎn)移性腫瘤。實(shí)質(zhì)的增加意味著至少增加約20％，優(yōu)選地，至少增加約25％，更優(yōu)選地，至少增加約35％。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫組織化學(xué)可用于診斷生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移性腫瘤。在此實(shí)施方案中，樣品取自生物體，例如活組織檢測(cè)樣品取自于疑似有轉(zhuǎn)移性腫瘤的組織。樣品可被固定在載玻片上并且與此處所公開的抗體接觸，此處公開的是結(jié)合SIMA135的抗體?？贵w可以被酶、熒光團(tuán)或者放射性同位素標(biāo)記。參考例如，Coligan等，Current Protocols inimmunology，John Wiley & Sons Inc.，New。在抗體結(jié)合到SIMA135后，抗體的位置通過(guò)使用已知的技術(shù)確定。異種染色、整個(gè)組織樣品中SIMA135的廣泛表達(dá)、以及惡性腺體中的染色表明轉(zhuǎn)移性癌癥。
V.含有選擇性地結(jié)合SIMA135或者其片段的抗體和包裝材料的試劑盒本發(fā)明提供了含有選擇性地結(jié)合SIMA135的抗體和包裝材料的試劑盒。此類試劑盒對(duì)于運(yùn)輸和存儲(chǔ)用于治療和檢測(cè)癌癥的抗體是有用的。這些試劑盒尤其可被實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)藥工作者用于檢測(cè)取自生物體組織樣品中的轉(zhuǎn)移性癌癥。此外，這些試劑盒可用于醫(yī)藥工作者用來(lái)配制含有本發(fā)明抗體的藥物組合物。
包裝材料可以給抗體提供一個(gè)被保護(hù)的環(huán)境。例如，包裝材料可以防止抗體被污染。此外，包裝材料可以防止溶解的抗體變干。
可用作包裝材料的適合材料的實(shí)例包括玻璃、塑料、金屬等。這些材料可被硅烷化以避免抗體吸附到這些包裝材料上。
VI.包含選擇性地結(jié)合SIMA135或者SIMA135片段的抗體以及可藥用載體的藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物包括結(jié)合SIMA135的抗體，這些抗體制劑成藥物組合物并且給藥動(dòng)物宿主，例如人類患者，其有多種適合施用的被選擇途徑，例如口服或者腸胃外施用，通過(guò)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、局部或者皮下途徑。
因此，抗體可通過(guò)結(jié)合例如惰性稀釋劑或者可同化的可食載體在內(nèi)的可藥用載體而全身給藥，例如口服。它們可包封在硬殼的或軟殼的明膠膠囊中、可壓縮成片劑、或者可直接與患者的食物混合。對(duì)于經(jīng)口的治療性服用，這些抗體可與一種或者多種賦形劑結(jié)合，并且以可吸收的片劑、口腔含化片劑、含片劑、膠囊劑、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊劑等形式使用。這些組合物和制品應(yīng)該至少含有0.1％的抗體。組合物和制品的比例當(dāng)然可以是多樣的，并且方便地為給定單位劑型重量的約2％到約60％之間。在這些治療上有用的組合物中，一種或者多種抗體的量是可獲得有效劑量水平的量。當(dāng)口服給藥時(shí)，本發(fā)明的組合物可優(yōu)選地在明膠膠囊中給藥。
片劑、含片劑、丸劑、膠囊劑等也可含有如下組分粘合劑，例如西黃芪樹膠、阿卡膠、玉米淀粉或者明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂；甜化劑，例如蔗糖、果糖、乳糖或者天冬甜精；或者調(diào)味劑，例如薄荷、冬綠樹油，或者櫻桃調(diào)味料，這些組分可被添加。當(dāng)單位劑型是膠囊劑時(shí)，除上述種類的材料之外，其可含有液體載體，例如植物油或者聚乙二醇。多種其他材料可作為包衣或者改進(jìn)固體單位劑型的物理形狀。例如，片劑、丸劑或者膠囊劑可包衣有明膠、蠟、蟲膠或者糖等。糖漿或者酏劑可含有一種抗體或者多種抗體、作為甜化劑的蔗糖或者果糖、作為防腐劑的羥苯甲酸甲酯和羥苯甲酸丙酯、染料以及調(diào)味劑例如櫻桃和橙色香料。用于制備任何單位劑型的材料當(dāng)然應(yīng)該是可藥用的并且所使用的量基本上沒(méi)有毒性。此外，一種抗體或者多種抗體可摻入到持續(xù)釋放制劑和設(shè)備中。
本發(fā)明的一種或者多種抗體可以通過(guò)灌輸或者注射，由靜脈內(nèi)或者腹膜內(nèi)給藥。一種或者多種抗體的溶液可用水制備，任選地混合無(wú)毒性表面活性劑。也可以在甘油、液體聚乙二醇、甘油醋酸脂和其混合物以及在油中制備分散劑。在存儲(chǔ)和使用的通常條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。
用于注射或者灌輸?shù)暮线m的藥物劑型包括含有一種或者多種抗體的無(wú)菌水溶液、分散劑、無(wú)菌干粉，這些干粉適用于無(wú)菌可注射的、可灌輸?shù)娜芤夯蛘叻稚┑呐R時(shí)制備，其任選地被包囊在脂質(zhì)體中。在所有情況下，最終的劑型在制造和存儲(chǔ)的條件下應(yīng)該是無(wú)菌的、液體的和穩(wěn)定的。液態(tài)載體可以是溶劑或者液態(tài)分散介質(zhì)，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液態(tài)的聚乙二醇等)、植物油、無(wú)毒性的甘油脂類和其合適的混合物。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以被維持，例如，通過(guò)形成脂質(zhì)體、在分散劑的情況下通過(guò)維持所需的顆粒大小、或通過(guò)使用表面活性劑。防止微生物的活性可通過(guò)多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑產(chǎn)生，例如，羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫汞柳酸鈉等。在許多情況下，藥物劑型優(yōu)選地含有等滲劑，例如糖、緩沖劑或者氯化鈉。可注射組合物的延長(zhǎng)吸收可以通過(guò)在組合物中使用延緩吸收的試劑例如單硬脂酸鉛和明膠而產(chǎn)生。
通過(guò)將所需量的一種或者多種抗體與多種上述列舉的其它成分混合到適當(dāng)?shù)娜軇┲锌芍苽錈o(wú)菌可注射溶液，并根據(jù)需要進(jìn)行過(guò)濾滅菌。
VII.鑒定調(diào)控細(xì)胞SIMA135產(chǎn)生的試劑的方法本發(fā)明提供了鑒定增加或者減少細(xì)胞SIMA135產(chǎn)生的試劑的方法。一般來(lái)講，該方法包括將候選試劑與試驗(yàn)細(xì)胞接觸，并且確定試驗(yàn)細(xì)胞相對(duì)于未接觸候選試劑的對(duì)照細(xì)胞，其SIMA135的產(chǎn)生是否增加或者減少。
試驗(yàn)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生的SIMA135可通過(guò)使用許多領(lǐng)域公認(rèn)的方法來(lái)檢測(cè)。這些方法已被通過(guò)包括放射免疫測(cè)定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、使用熒光標(biāo)記的抗體等在內(nèi)的免疫學(xué)方法例證過(guò)。
候選試劑的許多樣品可按照官方的United States Pharmacopeia、官方的National Formulary以及它們附錄中所描述的方法進(jìn)行篩選。簡(jiǎn)要地說(shuō)，候選試劑的例子包括碳?xì)浠衔?、環(huán)狀有機(jī)分子、二環(huán)有機(jī)分子、芳香基有機(jī)分子、烷基有機(jī)分子等。Merck Manual，Merck ResearchLaboratories，Whitehouse Station，N.J.第17版，Beers和Berkow，1999，Merck Index，Merck Research Laboratories，Whitehouse Station，N.J.第13版，2001。
例如下面章節(jié)里舉例說(shuō)明的轉(zhuǎn)移性HEp3細(xì)胞可用做本發(fā)明方法中的試驗(yàn)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞。然而，該方法也可在正常產(chǎn)生SIMA135的細(xì)胞中實(shí)行，或者通過(guò)重組的方法。例如，提供用來(lái)生產(chǎn)SIMA135的表達(dá)構(gòu)建體可導(dǎo)入這樣的細(xì)胞，所述細(xì)胞為在導(dǎo)入所述表達(dá)盒之前不產(chǎn)生SIMA135的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞然后可用于本發(fā)明方法中用來(lái)鑒定調(diào)控SIMA135產(chǎn)生的試劑。利用此細(xì)胞系統(tǒng)，上文所述的檢測(cè)SIMA135存在和數(shù)量的診斷方法可用于測(cè)定試驗(yàn)和對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生的SIMA135。
本發(fā)明的方法也可在體內(nèi)實(shí)行。在下面章節(jié)的例證中，候選試劑可被施與試驗(yàn)動(dòng)物。組織樣品可取自試驗(yàn)動(dòng)物，比較該組織樣品中細(xì)胞產(chǎn)生的SIMA135和取自對(duì)照動(dòng)物組織樣品中細(xì)胞產(chǎn)生的SIMA135。與對(duì)照動(dòng)物相比，試驗(yàn)動(dòng)物SIMA135產(chǎn)生增加說(shuō)明候選試劑增加SIMA135產(chǎn)生。與對(duì)照動(dòng)物相比，試驗(yàn)動(dòng)物SIMA135產(chǎn)生減少說(shuō)明候選試劑減少SIMA135產(chǎn)生。SIMA135的測(cè)定可通過(guò)上文診斷章節(jié)提供的任意一種分析方法來(lái)測(cè)定。許多種動(dòng)物都可用于本發(fā)明的方法。這些動(dòng)物的實(shí)例包括兔子、大鼠、小鼠、猴子等。
本發(fā)明的方法可在體外實(shí)行。例如試驗(yàn)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞可在組織培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。這就允許候選試劑在體外與試驗(yàn)細(xì)胞接觸。試驗(yàn)細(xì)胞產(chǎn)生的SIMA135然后可與上文描述的對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生的SIMA135比較，以確定候選試劑是否增加或者減少細(xì)胞的SIMA135產(chǎn)生。
體外和體內(nèi)方法將確定試驗(yàn)試劑促進(jìn)和降低或阻止轉(zhuǎn)移的能力。促進(jìn)作用的測(cè)定可鑒定該試劑為致癌劑或者增強(qiáng)劑。此測(cè)定實(shí)際應(yīng)用于快速致癌試劑的鑒定。降低或者阻止作用的測(cè)定可鑒定該試劑為癌癥抑制劑。此測(cè)定實(shí)際應(yīng)用于抗癌劑的鑒定。
實(shí)施例I細(xì)胞系和雜交瘤人頸腺癌HeLa、纖維肉瘤HT1080、結(jié)腸腺癌DLD-1和SW480、乳腺癌MCF7、前列腺癌PC-3、前列腺癌淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移瘤LNCaP、肺癌A549和桿狀腎癌G401細(xì)胞獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection(Rockville，MD))。人肝癌HuH7和HLE、胃癌MKN45和STKM-1細(xì)胞由Peter Vogt博士(The Scripps Research Institute，LaJolla，CA)提供；乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞由Liliana Ossowski博士(MountSinai School of Medicine，NY)提供。人鱗狀細(xì)胞癌HEp3細(xì)胞獲自在雞胚胎的尿囊絨膜(CAM)連續(xù)傳代的實(shí)體瘤(Testa，1992；Brooks等，1993)。HEp3細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性變種，M+HEp3，使用前培養(yǎng)時(shí)間要少于20天。低轉(zhuǎn)移性變種，M-HEp3，使用前至少在培養(yǎng)基上培養(yǎng)80天。人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HEC)和皮成纖維細(xì)胞(HDF)獲自Clonetics(San Diego，CA)，并且分別用EGM-2MV和FGM-2培養(yǎng)基(Clonetics)培養(yǎng)。癌細(xì)胞系作為單細(xì)胞層培養(yǎng)在添加10％FBS(HyClone，Logan，UT)、丙酮酸鈉、青霉素/鏈霉素和非必需氨基酸(Invitrogen)的DMED(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培養(yǎng)，并且在增濕的、5％CO2環(huán)境下、37℃生長(zhǎng)。產(chǎn)生MoAb41-2的雜交瘤通過(guò)前文描述的消減免疫途徑產(chǎn)生(Brooks等，1993)。雜交瘤培養(yǎng)和mAbs純化由The Scripps Research Institute的Protein and NucleicAcids Core Facility使用標(biāo)準(zhǔn)程序完成。
實(shí)施例II試劑蛋白酶抑制劑、正常的小鼠IgG、抗FLAG M2 mAb、DAB試劑和Gill蘇木精購(gòu)自Sigma(St.Louis，MO)。反轉(zhuǎn)錄、PCR試劑和pCR-II Topo載體購(gòu)自Invitrogen。PP2購(gòu)自Calbiochem(La Jolla，CA)。
實(shí)施例III蛋白質(zhì)純化、肽測(cè)序和蛋白質(zhì)分析免疫共沉淀作用在未標(biāo)記或者35S標(biāo)記的HEp3細(xì)胞(5×107)細(xì)胞裂解物上進(jìn)行。代謝標(biāo)記在含有Tran35S標(biāo)記(100μCi/ml；ICN，Costa Mesa，CA)的無(wú)甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM中過(guò)夜實(shí)施。細(xì)胞徹底地用PBS漂洗，然后溶解在含有0.1M Tris(pH8.0)、0.1％Triton X-100、150mMNaCl、5mM EDTA、10μM反式環(huán)氧琥珀酰-L亮氨酰酰氨基(4-胍基)丁烷、20μg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑和25μg/ml抑酶肽的緩沖液中。細(xì)胞裂解物用蛋白質(zhì)G-Sepharose(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)在4℃預(yù)先清潔30分鐘，然后與20μg的mAb 41-2或者nmIgG在4℃孵育過(guò)夜。免疫復(fù)合體用蛋白質(zhì)G-Sepharose沉淀出，在聚丙烯酰胺凝膠電泳前，復(fù)合體在還原性SDS上樣緩沖液中煮沸變性。對(duì)于35S標(biāo)記的蛋白質(zhì)，將凝膠干燥并且在-80℃曝光于膠片?；蛘?，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore，Bedford，MA)。切下明顯的考馬斯染色的135kDa條帶，然后用胰蛋白酶消化。所得的肽通過(guò)高壓液相色譜法來(lái)分離，并且用Procise 494蛋白質(zhì)測(cè)序儀(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行測(cè)序。胰蛋白酶消化和肽段測(cè)序由The Scripps Research Institute的Proteinand Nucleic Acids Core Facility完成。肽段序列通過(guò)使用可自NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)網(wǎng)站獲得的算法檢索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。使用Prosite數(shù)據(jù)庫(kù)(Blom等，1999)、SMART算法(Schultz等，1998)、PSORT算法(Nakai和Kanehisa，1992)和NetPhos 2.0算法(Blom等，1999)分析完整的SIMA135蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)區(qū)、細(xì)胞加工信號(hào)和共有的翻譯后修飾基序。
實(shí)施例IV表達(dá)構(gòu)建體和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在真核表達(dá)載體pME18S-FL3中的SIMA135 cDNA(GenBank登錄號(hào)AK026622)作為日本NEDO人類cDNA測(cè)序計(jì)劃的一部分而完成，并且由Hiroko Hata博士(Dept.of Virology，Institute of Medical Science，University of Tokyo)友情提供。SIMA135 FLAGin構(gòu)建體是通過(guò)PCR在親本構(gòu)建體的終止密碼子前放置編碼FLAG表位(DYKDDDDK)的序列完成的。對(duì)這兩種構(gòu)建體測(cè)序。使用Superfect reagent(Qiagen，Valencia，CA)，根據(jù)廠商所述將SIMA135或者SIMA135 FLAGin表達(dá)構(gòu)建體瞬時(shí)傳染HeLa細(xì)胞(4×105)。細(xì)胞在含有10mM Tris(pH8.0)、150mM NaCl、1％TritonX-100、5mM EDTA和lx Complete mini EDTA-無(wú)蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Indianapolis，IN)的冰冷緩沖液中裂解。不溶物通過(guò)14000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘除去。
實(shí)施例V克隆HEp3細(xì)胞的SIMA135cDNA總RNA利用RNeasy試劑盒(Qiagen)分離，并且在利用Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，取2μg作為模板。PCR用1μl所得的cDNA為模板、使用引物TCCCCACCGTCGTTTTCC(SEQ ID NO2)和GGTTAGGAACACGGACGGGTG(SEQ ID NO3)(依據(jù)GenBank登錄號(hào)AK026622設(shè)計(jì)的)，以及校正酶Platinum Pfx DNA聚合酶來(lái)實(shí)施。PCR的循環(huán)條件是94℃，3分鐘，94℃，30秒、55℃，30秒、72℃，150秒，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。凝膠純化PCR產(chǎn)物(Qiagen)，使用Platinum Taq DNA聚合酶加腺嘌呤尾，然后克隆到pCR-II Topo載體并測(cè)序。
實(shí)施例VII免疫熒光用SIMA135 FLAGin表達(dá)構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞，HEp3細(xì)胞平鋪在蓋玻片上。37℃孵育48小時(shí)后，用PBS清洗細(xì)胞，然后在2％甲醛中固定。用于和抗FLAG mAb孵育的HeLa細(xì)胞未被透化或者通過(guò)在含有0.5％TritonX-100的PBS中室溫孵育5分鐘被透化。兩種細(xì)胞類型都在含有5％BSA的PBS中封閉。接著與mAb 41-2(5μg/ml)或者抗FLAG M2mAb(4μg/ml)在封閉液中4℃孵育過(guò)夜，用PBS清洗細(xì)胞，然后與連接有Alexa Fluor 546的山羊抗小鼠IgG(2μg/ml)(Molecular Probes)孵育。標(biāo)記的細(xì)胞用BioRad 1024MRC2掃描共聚焦成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和照相。
實(shí)施例VIINorthern印跡分析人12泳道多組織Northern印跡(Clontech)用[α-32P]dCTP標(biāo)記的(Ambion)SIMA135 cDNA的EcoRI/Hind III DNA插入片段，在UltraHyb溶液(Ambion)中68℃雜交過(guò)夜。印跡用最終的嚴(yán)格度0.1x SSC，0.1％SDS，68℃漂洗，然后在-80℃曝光于膠片。印跡用β-肌動(dòng)蛋白cDNA再次探測(cè)以確定每個(gè)泳道RNA上樣的一致性。
實(shí)施例VIIIWestern印跡分析細(xì)胞裂解產(chǎn)物、無(wú)血清培養(yǎng)基和免疫沉淀的蛋白質(zhì)通過(guò)8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Millipore)。膜在含有5％脫脂奶粉的PBS中封閉，然后與mAb 41-2(2μg/ml)，抗FLAG M2 mAb(0.8μg/ml)或者抗磷酸酪氨酸mAb(1μg/ml，Upstate Biotechnology，LakePlacid，NY)在4℃孵育過(guò)夜。在充分漂洗后，膜與山羊抗小鼠IgG(0.16μg/ml，Pierce，Rockford，I1)在室溫孵育2小時(shí)，免疫反應(yīng)性帶通過(guò)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(Pierce)來(lái)檢測(cè)。
實(shí)施例IX生物化學(xué)表征方法為了切除N連接的聚糖，M+HEp3細(xì)胞和SIMA135FLAGin表達(dá)構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞裂解物(50μl)，在0.5％SDS、1％β-巰基乙醇中100℃10分鐘以變性和還原，然后用PNGase F(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)37℃孵育45分鐘。為分析SIMA135酪氨酸磷酸化的基態(tài)水平，亞匯合培養(yǎng)的HEp3和HeLa(作為陰性對(duì)照)細(xì)胞在含有50mMNaF和1mM Na3VO4的無(wú)血清DMEM中37℃孵育30分鐘，然后用冷PBS漂洗。為了抑制Src激酶家族磷酸化，HEp3細(xì)胞與PP2(50μm)在不含NaF和Na3VO4的無(wú)血清DMEM中37℃孵育30分鐘。然后細(xì)胞在含有50mMTris(pH7.4)、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mM苯甲基磺酰氟、1mM苯甲咪、25μg/ml抑酶肽、25μg/ml亮胰蛋白酶肽、50mM NaF和1mMNa3VO4的冰冷緩沖液中裂解。不溶物通過(guò)14000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘去除。免疫沉淀是按照前文所述的方法實(shí)施，對(duì)300μg的細(xì)胞溶解物使用1μgmAb 41-2或者nmIgG(作為陰性對(duì)照)。為了測(cè)定溶解的SIMA135的存在，接近匯合的HEp3細(xì)胞用PBS清洗三次，然后在無(wú)血清的條件培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)。收集培養(yǎng)基并且在4℃，10,000g離心，然后用截留分子量為30,000kDa的微米離心過(guò)濾器(Millipore)將其濃縮10倍。細(xì)胞裂解物按照上文所述方法收集。
實(shí)施例X免疫組織化學(xué)取自三個(gè)患者的紀(jì)錄為人腺癌結(jié)腸組織樣品的低溫切片(6μm)在鋅-福爾馬林中固定15分鐘，用PBS簡(jiǎn)短漂洗，然后非特異結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)在含有3％BSA的PBS中孵育而封閉。使用mAb 41-2(5μg/ml)且4℃過(guò)夜。特異性抗體結(jié)合通過(guò)添加連接有生物素的抗小鼠抗體(Pierce)，接著通過(guò)添加能用DAB試劑顯色的連接有辣根過(guò)氧化酶的中性親和素(neutravidin)(Pierce)被檢測(cè)到。切片用Gill蘇木精復(fù)染。
實(shí)施例XImAb 41-2識(shí)別在高轉(zhuǎn)移性人瘤HEp3細(xì)胞中以升高水平表達(dá)的135kDa抗原被抗體mAb 41-2識(shí)別的抗原已被鑒定和表征。作為確定被抗體mAb41-2識(shí)別的抗原重要性的最初步驟，用mAb 41-2對(duì)細(xì)胞裂解物(20μg)實(shí)施Western印跡分析，其中所述細(xì)胞裂解物制備自高轉(zhuǎn)移(M+)和低轉(zhuǎn)移(M-)HEp3細(xì)胞，且在非還原條件下電泳。在兩種細(xì)胞型中通過(guò)消減免疫產(chǎn)生的單克隆抗體41-2(mAb)都檢測(cè)到了大約135kDa的單一條帶。與用來(lái)產(chǎn)生mAb 41-2的消減免疫途徑相一致的是，免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)在M+HEp3細(xì)胞的表達(dá)水平高于M-HEp3細(xì)胞。用高轉(zhuǎn)移(M+)和低轉(zhuǎn)移(M-)HEp3細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解物進(jìn)行的平行考馬斯染色的凝膠表明，M+HEp3和M-HEp3細(xì)胞提取物的總蛋白質(zhì)圖型和含量是無(wú)差別的。mAb41-2在免疫反應(yīng)性上的差異表明，兩種細(xì)胞系間的關(guān)聯(lián)抗原在表達(dá)水平上有顯著的差異。
實(shí)施例XII鑒定mAb 41-2識(shí)別的來(lái)自轉(zhuǎn)移性HEp3細(xì)胞的抗原將純化的mAb 41-2用于免疫沉淀實(shí)施例XI中M+HEp3細(xì)胞的抗原。用mAb 41-2或者正常小鼠IgG從M+HEp3細(xì)胞中免疫沉淀的35S標(biāo)記的蛋白質(zhì)于還原條件下在SDS-PAGE上分析。干燥凝膠且在-80℃過(guò)夜曝光于膠片。從放射性標(biāo)記的HEp3細(xì)胞免疫沉淀的主要蛋白質(zhì)的分子量約135kDa。這與實(shí)施例XI中檢測(cè)到的抗原的分子量一致。在用未標(biāo)記HEp3細(xì)胞進(jìn)行的平行實(shí)驗(yàn)中，免疫沉淀的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將135kDa的蛋白質(zhì)帶切下來(lái)，進(jìn)行胰蛋白酶消化，并且對(duì)分離的片斷從N端測(cè)序。獲得了3個(gè)主要的肽序列。檢索GenBank無(wú)重復(fù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)表明，每個(gè)肽段序列與一個(gè)未公布的登錄號(hào)為BAB15511的理論序列完全或者幾乎完全匹配，此蛋白質(zhì)序列翻譯自登錄號(hào)為AK026622的未公布cDNA。
肽1FEIALPRESQITVLG(I)KXGTSEQ ID No4BAB15511 FEIALPRESNITVLIKXGT SEQ ID No5肽2XXXXIPGSTTNPE SEQ ID No6BAB15511 VEYYIPGSTTNPE SEQ ID No7肽3XYXLQVPSDILH SEQ ID No8BAB15511 SYSLQVPSDILH SEQ ID No9鑒定的蛋白質(zhì)被命名為消減免疫的M+HEp3相關(guān)的135kDa蛋白質(zhì)(subtractiveimmunizationM+HEp3associated135kDa protein；SIMA135)，其完整序列在圖1中顯示。為了證實(shí)SIMA135和由mAb 41-2特異識(shí)別的蛋白質(zhì)是同一蛋白質(zhì)，用HEp3細(xì)胞、未轉(zhuǎn)化的HeLa細(xì)胞和用SIMA135 cDNA瞬時(shí)傳染的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western印跡。使用mAb 41-2探測(cè)，Western印跡分析非還原條件下電泳的總細(xì)胞裂解物(25μg)，這些細(xì)胞裂解物來(lái)自HEp3細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞和用SIMA135 cDNA瞬時(shí)傳染的HeLa細(xì)胞。mAb 41-2與HEp3細(xì)胞和用SIMA135 cDNA瞬時(shí)傳染的HeLa細(xì)胞中存在的同樣的135kDa蛋白質(zhì)帶發(fā)生反應(yīng)，但是在未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中沒(méi)有此帶。為了提供其它的證明，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR，從HEp3細(xì)胞克隆SIMA135 mRNA的蛋白質(zhì)編碼區(qū)。DNA序列分析由此方法產(chǎn)生的兩個(gè)克隆，證明了SIMA135 mRNA是由這些細(xì)胞表達(dá)的。在GenBank登錄號(hào)為AK026622和來(lái)自HEp3細(xì)胞的SIMA135序列之間，鑒定出四個(gè)核苷酸差異核苷酸1684G→A、1847T→C、2236G→A和2590G→A。第二個(gè)轉(zhuǎn)換是沉默的，其余的轉(zhuǎn)換導(dǎo)致氨基酸分別地改變525Arg→Gln、709Gly→Asp和827Ser→Asn。
實(shí)施例XIII
SIMA135的結(jié)構(gòu)特征SIMA135蛋白質(zhì)序列包括863個(gè)氨基酸(SEQ ID No.1-圖1)，且其推算的分子量為92.9kDa。序列分析鑒定有以下結(jié)構(gòu)特征。一個(gè)推斷的切割氨基末端信號(hào)肽預(yù)測(cè)出現(xiàn)在Ala29后。此特征與肽1的序列一致，表明成熟的SIMA135起始于Phe30，其推測(cè)的分子量是90.1kDa。一個(gè)可能的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(Hartmann等，1989)定向SIMA135的羧基端位于細(xì)胞內(nèi)，此跨膜結(jié)構(gòu)域跨距666到686位殘基(圖1方框所示)。12個(gè)共有的N糖基化基序在圖1中指出。一個(gè)共有的I型十六烷基化基序(IICCV)(Hansen等，1999)位于687到691位殘基。存在5個(gè)PXXP基序(圖1)，PXXP基序在其他蛋白質(zhì)中被表明介導(dǎo)結(jié)合至Src同源區(qū)(SH)3(Pawson，1995；Mayer，2001)。5個(gè)酪氨酸殘基(圖1中圓圈所示)可能是磷酸化位點(diǎn)。兩個(gè)鄰近位置的酪氨酸殘基(Tyr734和Tyr743)出現(xiàn)在結(jié)合SH2結(jié)構(gòu)域(Songyang等，1993)的共有序列(YXXL/I)中。SIMA135與GenBank無(wú)重疊數(shù)據(jù)庫(kù)中其他被證實(shí)的蛋白質(zhì)缺少同源性。然而，SIMA135確實(shí)與推斷的蛋白質(zhì)CDCP1有很高的同源性，CDCP1通過(guò)翻譯報(bào)道的核苷酸序列(Scherl-Mostageer等，2001)而確定。此外，SIMA135蛋白質(zhì)的跨距221到348殘基和417到544殘基的兩個(gè)區(qū)域被鑒定為與CUB(補(bǔ)體蛋白亞組分Clr/Cls、urchin胚生長(zhǎng)因子和骨(bone)形態(tài)發(fā)生蛋白)結(jié)構(gòu)域有低同源性(Bock和Beckmann，1993)。這些結(jié)構(gòu)域據(jù)報(bào)道參與介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Chen和Wallis，2001；Sieron等，2000)。由Scherl-Mostageer和其合作者描述的第三個(gè)推測(cè)的CUB結(jié)構(gòu)域跨越545到660位殘基(Scherl-Mostageer等，2001)，其在我們用以檢索SIMA135氨基酸序列和CDCP1推測(cè)的氨基酸序列所使用的檢索算法的同源性檢出閾值之下。
實(shí)施例XIVSIM135在正常和惡性細(xì)胞和組織中的表達(dá)模式來(lái)自12個(gè)正常人組織的polyA+RNA(每個(gè)泳道1μg)的Northern印跡分析通過(guò)用α32P標(biāo)記的SIMA135 cDNA探針進(jìn)行探測(cè)來(lái)完成。β-肌動(dòng)蛋白mRNA的水平作為上樣量被顯示。12個(gè)正常人組織中SIMA135的表達(dá)模式通過(guò)Northern印跡分析檢測(cè)，Northern印跡分析使用α32P標(biāo)記的2.8kb SIMA135 cDNA探針進(jìn)行雜交。一條大約6.0kb的條帶在骨骼肌和結(jié)腸以最高水平檢測(cè)到，其在腎、小腸、胎盤和肺中以較低水平表達(dá)。在外周血白細(xì)胞也出現(xiàn)了一條6.0kb的幾乎不能檢測(cè)到的信號(hào)。此外，一個(gè)相當(dāng)弱的、約3.3kb的信號(hào)出現(xiàn)在骨骼肌、結(jié)腸、胎盤和肺中。SIMA135mRNA在腦、心、胸腺、脾或者肝中沒(méi)有檢測(cè)到。根據(jù)SIMA135和CDCP1cDNA7和基因組的序列對(duì)比(數(shù)據(jù)未顯示)表明，通過(guò)Northern印跡分析檢測(cè)到的兩個(gè)SIMA135轉(zhuǎn)錄物非?？赡苁怯墒褂肧IMA-1353’UTR中備選的多聚腺苷酸化信號(hào)產(chǎn)生。較長(zhǎng)的且較高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物被認(rèn)為由使用一個(gè)更靠近3’的共有多聚腺苷酸化信號(hào)(核苷酸59507)產(chǎn)生，然而較短的且較低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物很有可能由使用一個(gè)位于核苷酸31867的低效率多聚腺苷酸化信號(hào)的變體產(chǎn)生。這些不同的轉(zhuǎn)錄物也有可能由SIMA135前體mRNA的備選剪接產(chǎn)生。
在16個(gè)人細(xì)胞系、14個(gè)人癌細(xì)胞系和2個(gè)正常人細(xì)胞系中，用mAb41-2探測(cè)的SIMA135蛋白質(zhì)表達(dá)通過(guò)非還原條件下的Western印跡分析分析，其中每個(gè)細(xì)胞系等量的細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)(20μg)被電泳。SIMA135在轉(zhuǎn)移性HEp3細(xì)胞中的表達(dá)最高，前列腺癌細(xì)胞系PC3和結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD-1也顯示出高的表達(dá)水平。中等水平的抗原在纖維肉瘤細(xì)胞系HT1080、胃癌細(xì)胞系MKN45和STKM-1、結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和非轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞系LNCaP中被檢測(cè)到。低水平的SIMA135在2個(gè)肝癌細(xì)胞系、兩個(gè)乳腺癌細(xì)胞系、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和腎桿狀瘤細(xì)胞系G401中被檢測(cè)到。SIMA135在正常人微血管內(nèi)皮細(xì)胞和皮成纖維細(xì)胞中沒(méi)有被檢測(cè)到。在許多人癌細(xì)胞系中表達(dá)不同水平的SIMA135蛋白質(zhì)，然而兩個(gè)正常人細(xì)胞類型中沒(méi)有表達(dá)該蛋白質(zhì)。
實(shí)施例XVSIMA135是一種細(xì)胞表面的磷酸化的糖蛋白免疫組織化學(xué)被用來(lái)鑒定HEp3細(xì)胞以及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SIMA135表達(dá)構(gòu)建體的HeLa細(xì)胞中SIMA135的細(xì)胞定位。該表達(dá)構(gòu)建體含有一個(gè)在蛋白質(zhì)SIMA135C末端融合的FLAG表位。HEp3細(xì)胞和mAb41-2孵育在質(zhì)膜上顯出強(qiáng)烈的染色。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染FLAG標(biāo)記的SIMA135的HeLa細(xì)胞中，當(dāng)和mAb41-2孵育也在膜上顯出同樣強(qiáng)烈的染色。此外，SIMA135的C末端被確定是細(xì)胞內(nèi)的，因?yàn)楫?dāng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞用0.5％TritonX-100透化處理可允許抗體進(jìn)入到FLAG標(biāo)簽定位的細(xì)胞內(nèi)，并且當(dāng)與抗FLAG表位的mAb孵育時(shí)，與抗FLAG mAb孵育的細(xì)胞顯出了強(qiáng)烈的細(xì)胞膜染色，然而與抗FLAG mAb孵育的未透化細(xì)胞顯出低或者接近背景的染色。未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞與mAb 41-2或者抗FLAG表位mAb孵育時(shí)，其基本上無(wú)染色。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了推斷的細(xì)胞表面定位和SIMA135的I型定位。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SIMA135 FLAG標(biāo)簽表達(dá)構(gòu)建體的HeLa細(xì)胞中，用mAb 41-2和抗FLAG mAb染色觀察到了一致結(jié)果，更加證實(shí)了SIMA135是mAb 41-2的靶抗原。
成熟的SIMA135理論上的分子量是90.1kDa。然而，用mAb 41-2檢測(cè)到的該蛋白質(zhì)的表觀分子量是135kDa。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SIMA135 FLAG標(biāo)簽表達(dá)構(gòu)建體的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞裂解物在酶活性優(yōu)化的條件下，用N糖苷酶F進(jìn)行處理以確定分子量上的差異是否應(yīng)歸于N糖基化。蛋白質(zhì)在還原條件下通過(guò)Western印跡分析檢測(cè)，其使用未處理的(-)和N糖苷酶F(PNGaseF)處理的(+)來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SIMA135 FLAGin表達(dá)構(gòu)建體的HeLa細(xì)胞裂解物與抗FLAG表位mAb反應(yīng)。屬于SIMA135的條帶被標(biāo)明。一條非特異的交叉反應(yīng)帶在表觀上位于80kDa。N糖苷酶F處理導(dǎo)致SIMA135在135kDa處的條帶消失，取而代之的是一條位于約95到105kDa寬的較低分子量條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。M+HEp3細(xì)胞的細(xì)胞裂解物也用mAb 41-2進(jìn)行免疫共沉淀，并且用N糖苷酶F處理。按照此方法檢測(cè)到的蛋白質(zhì)也顯示出相似的減小的分子量。因此，SIMA135表觀分子量中多達(dá)30到40kDa應(yīng)歸于N糖基化，這與該蛋白質(zhì)胞外區(qū)域中大量共有的糖基化位點(diǎn)相一致(圖1，SEQ ID No.1)。
SIMA135的細(xì)胞內(nèi)區(qū)含有5個(gè)酪氨酸殘基(圖1)。在還原條件下，用抗磷酸酪氨酸抗體對(duì)來(lái)自HEp3細(xì)胞裂解物與mAb 41-2免疫沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western印跡分析，以確定這些殘基每個(gè)是否都被磷酸化。免疫沉淀用來(lái)自HEp3和HeLa(陰性對(duì)照)細(xì)胞裂解物與正常小鼠IgG(nmIgG)或者mAb 41-2反應(yīng)。免疫沉淀的蛋白質(zhì)用抗磷酸酪氨酸抗體(Anti-P-Tyr)和mAb 41-2探測(cè)，以分別標(biāo)明磷酸化的蛋白質(zhì)和全長(zhǎng)SIMA135的存在。細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)與mAb 41-2免疫沉淀。細(xì)胞裂解物制備自未處理的(-)或者用PP2(50μM)在37℃孵育30分鐘的(+)HEp3細(xì)胞?？沽姿崂野彼峥贵w檢測(cè)到了來(lái)自HEp3細(xì)胞與mAb 41-2免疫沉淀的135kDa蛋白質(zhì)。當(dāng)免疫沉淀的蛋白質(zhì)用mAb 41-2探測(cè)時(shí)，同樣的蛋白質(zhì)條帶也被檢測(cè)到。Western印跡分析也對(duì)來(lái)自HeLa細(xì)胞的裂解物與mAb 41-2免疫沉淀的蛋白質(zhì)，以及作為對(duì)照的HEp3細(xì)胞裂解物與正常小鼠IgG免疫沉淀的蛋白質(zhì)實(shí)施。
當(dāng)用抗磷酸酪氨酸抗體或mAb 41-2探測(cè)時(shí)，兩種免疫沉淀都是無(wú)免疫反應(yīng)性的，這證明了用HEp3細(xì)胞所觀察到的免疫反應(yīng)的特異性。參與SIMA135酪氨酸磷酸化的Src激酶家族成員用PP2進(jìn)行檢測(cè)，PP2是一種Src家族選擇性酪氨酸激酶抑制劑(Hanke等，1996)。用抗磷酸酪氨酸抗體對(duì)來(lái)自HEp3細(xì)胞裂解物與mAb 41-2免疫沉淀的蛋白質(zhì)所進(jìn)行的Western印跡分析表明，用PP2處理30分鐘的HEp3細(xì)胞與未處理的HEp3細(xì)胞相比，其SIMA135酪氨酸磷酸化的水平有明顯的降低(約75％)。用mAb41-2對(duì)同樣免疫沉淀的蛋白質(zhì)所進(jìn)行的Western印跡分析表明，大約等量的SIMA135蛋白質(zhì)存在于膜上的兩個(gè)泳道。這些數(shù)據(jù)表明，在HEp3細(xì)胞SIMA135酪氨酸磷酸化過(guò)程中，Src激酶家族成員參與其中。
許多整合的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)例如c-met(Wajih等，2002)和CD44(Goebeler等，1996)也以可溶性分子形式產(chǎn)生。用mAb 41-2探測(cè)進(jìn)行的Western印跡分析用來(lái)檢驗(yàn)HEp3細(xì)胞是否產(chǎn)生可溶形式的SIMA135。HEp3細(xì)胞培養(yǎng)物用PBS充分漂洗，然后用無(wú)血清(SF)培養(yǎng)基孵育20小時(shí)。條件培養(yǎng)基(CM)被收集并且細(xì)胞物質(zhì)通過(guò)離心被除去，培養(yǎng)基然后濃縮10倍?？贵wmAb 41-2在HEp3 SFCM中，檢測(cè)到了一條約110kDa的免疫反應(yīng)條帶。來(lái)自HEp3細(xì)胞裂解物的細(xì)胞相關(guān)SIMA135在135kDa處被檢測(cè)到。相反地，不產(chǎn)生SIMA135的未轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，在細(xì)胞裂解物和濃縮的SFCM中都沒(méi)有產(chǎn)生免疫反應(yīng)條帶。這些數(shù)據(jù)表明，HEp3細(xì)胞釋放可溶形式的SIMA135并且可溶形式呈現(xiàn)為低分子量免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。
實(shí)施例XVI正常和患癌結(jié)腸中SIMA135的表達(dá)免疫組織化學(xué)分析被用來(lái)確定正常和患癌結(jié)腸中SIMA135的體內(nèi)定位。用mAb 41-2作為一級(jí)抗體對(duì)切片(6μm)進(jìn)行染色。典型的正常結(jié)腸粘膜表明SIMA135的上皮表達(dá)(彩色照片中的棕紅色，未顯示)。結(jié)腸癌顯示SIMA135異質(zhì)的和廣泛的表達(dá)。SIMA135由在結(jié)腸絨膜的侵入惡性腺體里的細(xì)胞表達(dá)。SIMA135由在結(jié)腸微絨膜的引流血管腔里的惡性上皮細(xì)胞表達(dá)。在正常結(jié)腸粘膜中，SIMA135由上皮細(xì)胞專有地表達(dá)，并且其均勻地出現(xiàn)在結(jié)腸腔襯細(xì)胞的腔和基底表面以及腺體隱窩襯細(xì)胞的頂端表面(數(shù)據(jù)未顯示)。在隱窩的杯狀細(xì)胞內(nèi)含物和腺體腔內(nèi)粘液中存在強(qiáng)烈的染色，這也證實(shí)了可溶形式的SIMA135是由結(jié)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的想法。在結(jié)腸癌樣品中，SIMA135廣泛的和異質(zhì)的表達(dá)，同時(shí)在惡性腺內(nèi)的粘液中局部增強(qiáng)。許多侵入的癌細(xì)胞團(tuán)被深度染色，這表明SIMA135存在于基部、頂生和側(cè)生膜以及腺體粘液內(nèi)。一個(gè)明顯的趨勢(shì)是癌細(xì)胞在結(jié)腸微絨毛深層更惡性的、侵入腺體處強(qiáng)烈的染色以及在引流血管中經(jīng)常出現(xiàn)的強(qiáng)烈的SIMA135抗原陽(yáng)性有聯(lián)系。用二級(jí)抗體而不是一級(jí)抗體孵育的對(duì)照切片是無(wú)染色的。
實(shí)施例XVII遵循上文敘述的HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，7個(gè)不同的細(xì)胞系被用于研究和監(jiān)視SIMA135 mRNA的表達(dá)。在這些細(xì)胞系中，克隆3號(hào)產(chǎn)生顯著的和合適的堿基對(duì)信號(hào)。
這些細(xì)胞系在體外研究中的輸送能力、在SCID小鼠中轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生瘤的能力以及在SCIP小鼠中寄居次生器官的能力也被研究?？寺?號(hào)被確定為能夠從疏松的膜和體內(nèi)脫離和移行，并且寄居次生器官。這些結(jié)果證明了SIMA135是一種操縱轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵的和中樞的因子。轉(zhuǎn)化的克隆3號(hào)細(xì)胞作為鑒定促進(jìn)或者抑制/減少惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移的試劑的細(xì)胞系統(tǒng)也是有用的。
按照上文的傳染方法，7個(gè)不同的細(xì)胞系被用來(lái)研究SIMA135表達(dá)的效果。這些細(xì)胞系在圖8中得到圖解。遵循上文所述的SIMA135 mRNA檢測(cè)的分析方法，這7個(gè)細(xì)胞系得到分析。圖7表明監(jiān)視SIMA135 mRNA的這7個(gè)細(xì)胞系RT-PCR分析的結(jié)果。對(duì)照和無(wú)關(guān)的RT-PCR數(shù)據(jù)在圖1的左手部分。圖的右手部分顯示了一條用SIMA135特異引物產(chǎn)生的600bp擴(kuò)增信號(hào)。未轉(zhuǎn)化的HeLa細(xì)胞無(wú)信號(hào)得到，HeLa 4號(hào)也無(wú)信號(hào)得到，現(xiàn)在被稱為克隆3號(hào)的Eff(2)3號(hào)產(chǎn)生一條實(shí)質(zhì)的600bp信號(hào)。這些數(shù)據(jù)表明克隆3號(hào)細(xì)胞有升高水平的SIMA135 mRNA。
這7個(gè)細(xì)胞系的樣品被裂解，并且細(xì)胞內(nèi)含物按照標(biāo)準(zhǔn)Western印跡方法，通過(guò)與MoAb 41-2結(jié)合進(jìn)行分析以確定SIMA135的存在。Western印跡的裂解物制備自7個(gè)不同細(xì)胞系，并用MoAb 41-2探測(cè)。結(jié)果表明克隆3號(hào)(Eff(2)3號(hào))產(chǎn)生大量水平的SIMA135免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。此克隆的細(xì)胞系比我們的高轉(zhuǎn)移性HEp-3細(xì)胞系M+產(chǎn)生更多的SIMA135蛋白質(zhì)?？寺?號(hào)和親本HeLa細(xì)胞不產(chǎn)生可檢測(cè)的SIMA135蛋白質(zhì)。
一旦確定SIMA135陰性細(xì)胞和SIMA135過(guò)表達(dá)細(xì)胞已獲得，這些細(xì)胞被用于試驗(yàn)它們的惡性潛力，即在SCID小鼠中生長(zhǎng)和形成瘤的能力以及在SCID小鼠中寄居次生器官的能力。表I是兩個(gè)單獨(dú)試驗(yàn)類型的總結(jié)表格A顯示實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移性測(cè)定法的結(jié)果，其中目的細(xì)胞被直接接種(i.v.)到鼠的尾部靜脈。幾星期以后，被接種小鼠的所選器官被用來(lái)與分析人細(xì)胞(人DNA)在總器官(小鼠DNA)背景中的存在。分析用實(shí)時(shí)PCR完成，其所用的人特異性引物依據(jù)下列參考文獻(xiàn)所述的alu重復(fù)序列(A.Zijlstra等，Cancer Research，2002)。表格A顯示的結(jié)果表明克隆3號(hào)細(xì)胞在小鼠的肺和骨髓中寄居和/或生長(zhǎng)，其水平大量地超過(guò)相似地接種克隆4號(hào)細(xì)胞的小鼠的水平?？寺?號(hào)顯然不遍及蔓延所接種的小鼠，因?yàn)樵诖怂@示的另外一個(gè)器官即胰腺僅含有接近背景水平的克隆3號(hào)和克隆4號(hào)細(xì)胞。
表1的表格B包括標(biāo)準(zhǔn)的自發(fā)轉(zhuǎn)移測(cè)定法的結(jié)果，其中所用的細(xì)胞被皮下地接種到SCID小鼠側(cè)腹，瘤允許發(fā)展到100mg，然后所選的器官(通常是肺)被用來(lái)分析次生轉(zhuǎn)移沉著物。次生轉(zhuǎn)移通過(guò)同樣的對(duì)人DNA特異的實(shí)時(shí)aluPCR方法測(cè)量。結(jié)果表明克隆3號(hào)和克隆4號(hào)形成大約相等尺寸的初生瘤(毫克重量-mg)。然而，克隆3號(hào)顯示轉(zhuǎn)移到肺的水平至少多于克隆4號(hào)10倍。其或許超過(guò)10倍，因?yàn)榭寺?號(hào)肺中的細(xì)胞水平接近背景(50-100個(gè)細(xì)胞)，即幾乎不能檢測(cè)到的水平。
結(jié)果表明，導(dǎo)入或者表達(dá)SIMA135蛋白質(zhì)到正常地不產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞可賦予這些細(xì)胞惡性特性。為了表征這兩個(gè)克隆的特性，這可能表明為什么它們獲得惡性潛力，我們對(duì)這些克隆進(jìn)行了一些細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖試驗(yàn)在按照上文所述方法通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)施。這兩種克隆的體外生長(zhǎng)是相似的，并且也與親代的HeLa細(xì)胞相似。然而，單獨(dú)的增殖速率不是它們有差別的惡性潛力的原因。
也進(jìn)行了跨孔遷移試驗(yàn)，其中目的細(xì)胞被強(qiáng)制地遷移通過(guò)一個(gè)插入在兩個(gè)室之間的孔過(guò)濾器得到完成。試驗(yàn)用培養(yǎng)基進(jìn)行。結(jié)果在圖10顯示。上室包含培養(yǎng)基中的細(xì)胞，而下室包括含有胎牛血清(FCS)的濃縮培養(yǎng)基以吸引上室的遷移細(xì)胞。結(jié)果表明克隆3號(hào)細(xì)胞比克隆4號(hào)遷移性大。這可能是SIMA135過(guò)表達(dá)細(xì)胞獲得的特性之一，這在它們的惡性潛力中幫助了它們。初步的數(shù)據(jù)也表明，克隆3號(hào)細(xì)胞顯得比克隆4號(hào)細(xì)胞對(duì)用化合物ara C化學(xué)誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡有更強(qiáng)的抵抗力。
表I兩個(gè)HeLa克隆的體內(nèi)惡性；克隆4號(hào)(SIMA-135陰性)和克隆3號(hào)(SIMA135過(guò)表達(dá))接種到SCID小鼠
*基于對(duì)提取自靜脈內(nèi)接種2周和皮下接種4周后的離體器官的總DNA實(shí)施的實(shí)時(shí)alu PCR參考文獻(xiàn)Adham IM，KlemmU，Maier WM和Engel W.，(1990)，Hum.Genet.，84125-128.
Bajorath J.，(2000).，Proteins，39103-111.
BlomN，Gammeltoft S和Brunak S.，(1999).J.Mol.Biol.，2941351-1362.
Bork P和Beckmann G.，(1993)，J.Mol. Biol.，231539-545.
Briner TJ，Kuo MC，Keating KM，Rogers BL和Greenstein JL.，(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907608-7612.
Brooks PC，Lin JM，F(xiàn)rench DL和Quigley JP.，(1993)，J.Cell Biol.，1221351-1359.
Chen CB和Wallis R.，(2001)，J.Biol.Chem.，27625894-25902.
Falquet L，Pagni M，B ucher P，Hulo N，Sigrist C J，Hofmann K和Bairoch A.，(2002)，Nucleic Acids Res.，30235-238.
Goebeler M，Kaufmann D，Brocker EB和Klein CE.，(1996)，J.CellSci.，109(Pt 7)1957-1964.
Gorelik E，Galili U和Raz A.，(2001)，Cancer Metastasis Rev.，20245-277.
Grogan MJ，Pratt MR，Marcaurelle LA和Bertozzi CR.，(2002)，Annu.Rev.Biochem.，71593-634.
Hanke JH，Gardner JP，Dow RL，Changelian PS，BrissetteWH，Weringer EJ，Pollok BA和Connelly PA.，(1996)，J.Biol.Chem.，271695-701.
Hansen SG，Grosenbach DW和Hruby DE.，(1999)，Virology，254124-137.
Hartmann E，Rapoport TA和Lodish HF.，(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，865786-90.
Hooper JD，Clements JA，Quigley JP和Antalis TM.，(2001)，J.Biol.Chem.，276857-60.
King SW和Morrow KJ，Jr.，(1988)，Biotechniques，6856-861.
Martin GS.，(2001)，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，2467-475.
Maruo Y，Gochi A，KaiharaA，Shimamura H，Yamada T，TanakaN和Orita K.，(2002)，Int.J Cancer，100486-490.
Matthew WD和Patterson PH.，(1983)，ColdSpring Harb.Symp.Quant.Biol.，48Pt 2625-631.
Mayer BJ，(2001)，J.Cell Sci.，1141253-1263.
Nakai K和Kanehisa M.，(1992)，Geizoiizics，14897-911.
Nielsen-Preiss，SM和Quigley JP.，(1993)，J Cell Biochem 51219-235.
Ossowski L和Reich E.，(1983)，Cell，33323-333.
Pawson T，(1995)，Nature，373573-580.
Resh MD，(1994)，Cell，76411-413.
Riggott MJ和Matthew WD.，(1996)，J.Neu rosci.Methods，68235-245.
Rye PD和McGuckin MA.，(2001)，Tumour.Biol.，22269-272.
Scherl-Mostageer M，Sommergruber W，Abseher R，Hauptmann R，Ambros P和Schweifer N.，(2001)，Oncogene，204402-4408.
Schultz J，Milpetz F，Bork P和Ponting C P.，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，955857-5864.
Sieron AL，Tretiakova A，Jameson BA，Segall ML，Lund-Katz S，Khan MT，Li S和Stocker.，(2000)，Biochemistry，393231-3239.
Sleister HM和Rao AG，(2002)，J.Immunol.Methods，261213-220.
Songyang Z，Shoelson SE，Chaudhuri M，Gish G，Pawson T，HaserWG，King F，Roberts T，Ratnofsky S，Lechleider RJ，Neel BG，BirgeRB，F(xiàn)ajardo JE，Chou MM，Hanafusa H，Schaffhausen B和Cantley LC.，(1993)，Cell，72767-778.
Soos G，Jones RF，Haas GP，Wang CY.，(1997)，Anticancer Res.，174253-4258.
Stocker JW和Nossal GJ.，(1976)，Contemp.Top.Immnunobiol.，5191-210.
Testa JE.，(1992)，Cancer Res.，525597-5603.
Testa JE，Brooks PC，Lin JM和Quigley JP.，(1999)，Cancer Res.，593812-3820.
Wajih N，Walter J和Sane DC.，(2002)，Circ.Res.，9046-52.
Williams CV，Stechmann CL和McLoon SC.，(1992)，Biotechniques，12842-847.
Yammani RR，Seetharam S和Seetharam B.，(2001)，J.Biol.Chem.，27644777-44784.
Zhang W，Trible RP和Samelson LE.，(1998)，Immunity，9239-246.
美國(guó)專利號(hào)6,245,898.
A.Zijlstra等，Cancer Research，2002.
所有刊物、專利和專利申請(qǐng)此處引用作為參考。雖然在上述的說(shuō)明書中，已描述的本發(fā)明涉及其優(yōu)選的實(shí)施方案，給出的許多詳情是用于闡明目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白的，本發(fā)明可有其它的實(shí)施方案，并且此處描述的某一詳情可在沒(méi)有脫離本發(fā)明基本原則的基礎(chǔ)上被相當(dāng)大的改動(dòng)。
序列表<110>諾瓦提斯公司<120>在人轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的糖蛋白抗原SIMA135<130>4-33290<160>9<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>836<212>PRT<213>人<400>1Met Ala Gly Leu Asn Cys Gly Val Ser Ile Ala Leu Leu Gly Val Leu1 5 10 15Leu Leu Gly Ala Ala Arg Leu Pro Arg Gly Ala Glu Ala Phe Glu Ile20 25 30Ala Leu Pro Arg Glu Ser Asn Ile Thr Val Leu Ile Lys Leu Gly Thr35 40 45Pro Thr Leu Leu Ala Lys Pro Cys Tyr Ile Val Ile Ser Lys Arg His50 55 60Ile Thr Met Leu Ser Ile Lys Ser Gly Glu Arg Ile Val Phe Thr Phe65 70 75 80Ser Cys Gln Ser Pro Glu Asn His Phe Val Ile Glu Ile Gln Lys Asn85 90 95
Ile Asp Cys Met Ser Gly Pro Cys Pro Phe Gly Glu Val Gln Leu Gln100 105 110Pro Ser Thr Ser Leu Leu Pro Thr Leu Asn Arg Thr Phe Ile Trp Asp115 120 125Val Lys Ala His Lys Ser Ile Gly Leu Glu Leu Gln Phe Ser Ile Pro130 135 140Arg Leu Arg Gln Ile Gly Pro Gly Glu Ser Cys Pro Asp Gly Val Thr145 150 155 160His Ser Ile Ser Gly Arg Ile Asp Ala Thr Val Val Arg Ile Gly Thr165 170 175Phe Cys Ser Asn Gly Thr Val Ser Arg Ile Lys Met Gln Glu Gly Val180 185 190Lys Met Ala Leu His Leu Pro Trp Phe His Pro Arg Asn Val Ser Gly195 200 205Phe Ser Ile Ala Asn Arg Ser Ser Ile Lys Arg Leu Cys Ile Ile Glu210 215 220Ser Val Phe Glu Gly Glu Gly Ser Ala Thr Leu Met Ser Ala Asn Tyr225 230 235 240Pro Glu Gly Phe Pro Glu Asp Glu Leu Met Thr Trp Gln Phe Val Val245 250 255Pro Ala His Leu Arg Ala Ser Val Ser Phe Leu Asn Phe Asn Leu Ser260 265 270
Asn Cys Glu Arg Lys Glu Glu Arg Val Glu Tyr Tyr Ile Pro Gly Ser275 280 285Thr Thr Asn Pro Glu Val Phe Lys Leu Glu Asp Lys Gln Pro Gly Asn290 295 300Met Ala Gly Asn Phe Asn Leu Ser Leu Gln Gly Cys Asp Gln Asp Ala305 310 315 320Gln Ser Pro Gly Ile Leu Arg Leu Gln Phe Gln Val Leu Val Gln His325 330 335Pro Gln Asn Glu Ser Asn Lys Ile Tyr Val Val Asp Leu Ser Asn Glu340 345 350Arg Ala Met Ser Leu Thr Ile Glu Pro Arg Pro Val Lys Gln Ser Arg355 360 365Lys Phe Val Pro Gly Cys Phe Val Cys Leu Glu Ser Arg Thr Cys Ser370 375 380Ser Asn Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Lys His Lys Ile Ser Phe Leu385 390 395 400Cys Asp Asp Leu Thr Arg Leu Trp Met Asn Val Glu Lys Thr Ile Ser405 410 415Cys Thr Asp His Arg Tyr Cys Gln Arg Lys Ser Tyr Ser Leu Gln Val420 425 430Pro Ser Asp Ile Leu His Leu Pro Val Glu Leu His Asp Phe Ser Trp435 440 445
Lys Leu Leu Val Pro Lys Asp Arg Leu Ser Leu Val Leu Val Pro Ala450 455 460Gln Lys Leu Gln Gln His Thr His Glu Lys Pro Cys Asn Thr Ser Phe465 470 475 480Ser Tyr Leu Val Ala Ser Ala Ile Pro Ser Gln Asp Leu Tyr Phe Gly485 490 495Ser Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Lys Gln Ile Gln Val Lys Gln Asn500 505 510Ile Ser Val Thr Leu Arg Thr Phe Ala Pro Ser Phe Arg Gln Glu Ala515 520 525Ser Arg Gln Gly Leu Thr Val Ser Phe Ile Pro Tyr Phe Lys Glu Glu530 535 540Gly Val Phe Thr Val Thr Pro Asp Thr Lys Ser Lys Val Tyr Leu Arg545 550 555 560Thr Pro Asn Trp Asp Arg Gly Leu Pro Ser Leu Thr Ser Val Ser Trp565 570 575Asn Ile Ser Val Pro Arg Asp Gln Val Ala Cys Leu Thr Phe Phe Lys580 585 590Glu Arg Ser Gly Val Val Cys Gln Thr Gly Arg Ala Phe Met Ile Ile595 600 605Gln Glu Gln Arg Thr Arg Ala Glu Glu Ile Phe Ser Leu Asp Glu Asp610 615 620
Val Leu Pro Lys Pro Ser Phe His His His Ser Phe Trp Val Asn Ile625 630 635 640Ser Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gly Lys Gln Leu Asp Leu Leu Phe Ser645 650 655Val Thr Leu Thr Pro Arg Thr Val Asp Leu Thr Val Ile Leu Ile Ala660 665 670Ala Val Gly Gly Gly Val Leu Leu Leu Ser Ala Leu Gly Leu Ile Ile675 680 685Cys Cys Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Asn Lys Gly Pro Ala Val690 695 700Gly Ile Tyr Asn Gly Asn Ile Asn Thr Glu Met Pro Arg Gln Pro Lys705 710 715 720Lys Phe Gln Lys Gly Arg Lys Asp Asn Asp Ser His Val Tyr Ala Val725 730 735Ile Glu Asp Thr Met ValTyr Gly His Leu Leu Gln Asp Ser Ser Gly740745 750Ser Phe Leu Gln Pro Glu Val Asp Thr Tyr Arg Pro Phe Gln Gly Thr755 760 765Met Gly Val Cys Pro Pro Ser Pro Pro Thr Ile Cys Ser Arg Ala Pro770 775 780Thr Ala Lys Leu Ala Thr Glu Glu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Glu785 790 795 800
Ser Glu Ser Glu Pro Tyr Thr Phe Ser His Pro Asn Asn Gly Asp Val805 810 815Ser Ser Lys Asp Thr Asp Ile Pro Leu Leu Ser Thr Gln Glu Pro Met820 825 830Glu Pro Ala Glu835<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2tccccaccgt cgttttcc 18<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3ggttaggaac acggacgggtg 21<210>4<211>20<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)<223>Xaa可為任一天然存在的氨基酸<400>4Phe Glu Ile Ala Leu Pro Arg Glu Ser Gln Ile Thr Val Leu Gly Ile1 5 10 15Lys Xaa Gly Thr20<210>5<211>19<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>Xaa可為任一天然存在的氨基酸<400>5Phe Glu Ile Ala Leu Pro Arg Glu Ser Asn Ile Thr Val Leu Ile Lys1 5 10 15Xaa Gly Thr<210>6<211>13<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(4)<223>Xaa可為任一天然存在的氨基酸
<400>6Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Pro Gly Ser Thr Thr Asn Pro Glu1 5 10<210>7<211>13<212>PRT<213>人<400>7Val Glu Tyr Tyr Ile Pro Gly Ser Thr Thr Asn Pro Glu1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa可為任一天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>Xaa可為任一天然存在的氨基酸<400>8Xaa Tyr Xaa Leu Gln Val Pro Ser Asp Ile Leu His1 5 10<210>9<211>12<212>PRT<213>人
權(quán)利要求
1.具有SEQ ID NO1的蛋白質(zhì)，其為糖基化的或者非糖基化的。
2.糖基化的或者非糖基化的SEQ ID NO1的片段，其中所述片段含有525位氨基酸和/或827位氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SEQ ID NO1的蛋白質(zhì)的變體，其中所述的變體中525位氨基酸是精氨酸和/或827位氨基酸是絲氨酸。
4.特異地結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的抗體，其中所述的抗體不是mAb 41-2。
5.特異地結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求2所述的片段的抗體，其中所述的抗體不是mAb 41-2。
6.特異地結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求3所述的變體的抗體，其中所述的抗體不是mAb 41-2。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體，其中所述的抗體是單克隆或者多克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體，其用于治療性治療人和動(dòng)物體。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體，其用于制備抑制哺乳動(dòng)物中癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體，其中的癌細(xì)胞是鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、纖維肉瘤、胃癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和腎桿狀癌細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體，其中的癌細(xì)胞是Hep3細(xì)胞。
12.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體以及可藥用載體。
13.試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體以及包裝材料。
14.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體用于癌癥的診斷方法，其包括(a)將根據(jù)權(quán)利要求5到8中任意一項(xiàng)所述的抗體與獲自哺乳動(dòng)物的試驗(yàn)樣品接觸，以及；(b)確定抗體與試驗(yàn)樣品的結(jié)合是否比抗體與非癌組織的對(duì)照樣品的結(jié)合程度更大。
15.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體用于癌癥的診斷方法，其包括(a)觀察根據(jù)任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體與組織切片的結(jié)合并且(b)確定是否所述抗體導(dǎo)致組織樣品的異種染色，是否所述抗體表明SIMA135的廣泛表達(dá)遍及組織樣品，或者是否所述抗體染色結(jié)腸漿膜的惡性腺體。
16.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體用于確定試驗(yàn)樣品是否含有轉(zhuǎn)移性細(xì)胞，其包括(a)將試驗(yàn)樣品與根據(jù)權(quán)利要求5到8中任意一項(xiàng)所述的抗體接觸，并且，(b)將抗體與試驗(yàn)樣品的結(jié)合以及抗體與含有非轉(zhuǎn)移性Hep3細(xì)胞的對(duì)照樣品的結(jié)合進(jìn)行比較，其中與抗體與對(duì)照樣品的結(jié)合相比較，抗體與試驗(yàn)樣品的結(jié)合增強(qiáng)表明試驗(yàn)樣品含有轉(zhuǎn)移性HEp3細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體用于確定試劑的癌轉(zhuǎn)移調(diào)控能力，其包括該試劑與表達(dá)SIMA-135的細(xì)胞組合以產(chǎn)生受試細(xì)胞，確定自受試細(xì)胞的SIMA-135表達(dá)是否大于或者小于該細(xì)胞與此試劑組合前細(xì)胞表達(dá)的量。
18.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體用于確定候選試劑是否調(diào)控細(xì)胞產(chǎn)生SIMA-135，其包括(a)將試驗(yàn)細(xì)胞與候選試劑接觸，并且(b)確定相對(duì)于對(duì)照的SIMA135產(chǎn)生，試驗(yàn)細(xì)胞的SIMA135產(chǎn)生是否增加或者減少。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種這樣的蛋白質(zhì)，其為一種腫瘤標(biāo)記蛋白質(zhì)。此蛋白質(zhì)可用于制備結(jié)合此腫瘤標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體。這些抗體可用于減少或者消除產(chǎn)生此腫瘤標(biāo)記蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。此外，本發(fā)明提供了可用于診斷癌癥和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1761750SQ200480007463
公開日2006年4月19日 申請(qǐng)日期2004年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月19日
發(fā)明者J·P·奎格利, J·D·霍珀, J·E·泰斯塔 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司, 斯克里普斯研究所