專利名稱：從軟骨魚類分離的蛋白多糖及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從軟骨魚類分離的蛋白多糖及其制造方法。具體地說(shuō)，涉及一種維持健康、提高生活質(zhì)量而且在醫(yī)藥領(lǐng)域有用的蛋白多糖及其制造方法。
背景技術(shù)：
癌是苦惱人類的共同的疾病，其治療正在成為全世界的課題。在日本，主要的死亡原因正在從感染性疾病向生活習(xí)慣關(guān)聯(lián)性疾病移行，特別是癌已經(jīng)成為日本人死亡原因的第1位，作為疾病對(duì)策上的最重要課題，研究正在進(jìn)行之中。癌能夠在所有的臟器、組織中發(fā)生，所以因體質(zhì)、性別、年齡、地域和生活習(xí)慣不同而異。另外，以轉(zhuǎn)移或增殖能力為主的所有的性質(zhì)根據(jù)癌的種類而不同，所以至今還沒(méi)有確立具有決定性的治療方法。
癌細(xì)胞的特征是伴隨血管新生來(lái)確保營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)行無(wú)規(guī)則的自主性增殖、通過(guò)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)在身體的各部位產(chǎn)生新的癌組織。在此基礎(chǔ)上，癌性惡液質(zhì)會(huì)導(dǎo)致宿主衰弱至死。作為目前正在進(jìn)行的癌的治療方法，有切除或使用抗癌藥、免疫療法、溫?zé)岑煼?、放射線照射等，而療效因癌的種類而不同，或者因原發(fā)灶部位而不能利用，進(jìn)而宿主在副作用的作用下變得衰弱。因此，抑制固體癌中共通的血管新生或轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)的治療方法正受到注意(Folkman J.，Nat.Med.127-31，1995)。
已知在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移或浸潤(rùn)、血管新生時(shí)，為了破壞包圍細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)或基底膜，主要使用Matrix Metallo Protease(MMP)。以上述為基礎(chǔ)，作為目前癌治療的新目標(biāo)，使用通過(guò)阻礙MMP來(lái)阻礙癌的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)和血管新生以抑制癌的進(jìn)展的方法，還開(kāi)發(fā)有各種合成的MMP抑制劑(IkiK.等、Carcinogenesis，1999 Jul；20(7)1323-9、RasmussenA.H.等、International Business Communications(1997)、Naito K.等、Int J Cancer1994 Sep 1；58(5)730-5)。但是，作為副作用，報(bào)道有骨髓毒性、細(xì)胞毒性、關(guān)節(jié)痛，在實(shí)用中存在問(wèn)題。
另一方面，作為相對(duì)于天然物的最近的趨勢(shì)，在中藥或食品中發(fā)現(xiàn)有在各種疾病的預(yù)防、進(jìn)展中有效的成分，其中的一部分被厚生勞動(dòng)省確認(rèn)作為特定保健用食品而顯示出有效。即使在癌治療中，來(lái)源于食品的成分也被關(guān)注，各種食品中的成分的抑癌效果正在研究中。其中，由于沒(méi)有在軟骨組織中形成血管，所以認(rèn)為在軟骨組織中含有血管新生抑制活性物質(zhì)。事實(shí)上，在將軟骨提取物注入到腫瘤的周邊的實(shí)驗(yàn)中，可見(jiàn)抑制腫瘤的增殖或血管新生(Lee A.等、Science 1983Sep 16；221(4616)1185-7)。作為鯊魚軟骨的血管新生抑制功能之一，可以舉出MMP的抑制，有報(bào)道在活體外(in vitro)可見(jiàn)MMP的抑制(Moses，M.A.等、J.Cell.Biochem.47230-235，1991；Gingras D.等、Anticancer.Res.200119(1-2)83-6)，另外，即使在向動(dòng)物經(jīng)口投放的實(shí)驗(yàn)中亦可見(jiàn)血管新生的抑制(Davis PF.等、Microvasc Res 1997 Sep；54(2)178-82)。以這些觀點(diǎn)為基礎(chǔ)，鯊魚是軟骨魚類，可以比硬骨動(dòng)物更多地采集品質(zhì)良好的軟骨，所以鯊魚軟骨粉有希望推遲或抑制癌的進(jìn)展，癌患者經(jīng)口使用的替代療法和臨床研究正在進(jìn)行中(Ernst E.、Lancet 351298 1998)。但是，通過(guò)鯊魚軟骨的經(jīng)口攝取的體內(nèi)的鯊魚軟骨的腫瘤抑制效果的構(gòu)造幾乎不清楚，另外，也未能得出通過(guò)鯊魚軟骨的經(jīng)口攝取而鯊魚軟骨在組織中抑制MMP的觀點(diǎn)。
作為從鯊魚軟骨得到有效成分的方法，已知有使鯊魚軟骨成為微粉末狀而直接用作有效成分的方法(特開(kāi)2001-48795號(hào)公報(bào))或者粉碎鯊魚的軟骨而進(jìn)行水提取得到的凍結(jié)干燥物的制造方法(特表平9-512563號(hào)公報(bào)，美國(guó)專利第4473551號(hào)說(shuō)明書)。

發(fā)明內(nèi)容
但是，為了取得效果，在上述方法中得到的來(lái)源于鯊魚軟骨的成分必須通過(guò)過(guò)量攝取或者通過(guò)與其它有效成分并用，才能發(fā)揮抗腫瘤活性或抗炎癥活性，其效果的作用機(jī)制尚沒(méi)有得到證明。
因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種少量攝取即能發(fā)揮效果而且效果的作用機(jī)制明確的軟骨提取物和其制造方法。
本發(fā)明人等為了達(dá)到上述目的，對(duì)有效地從軟骨提取有效成分的條件和有效成分的特性進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)滿足下述條件的成分和其制造方法可以達(dá)到需要的目的，以至完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明的分離的蛋白多糖的特征在于，來(lái)源于軟骨魚類的軟骨的水提取物且主成分的分子量為500kDa以上。
上述蛋白多糖優(yōu)選不溶于醇。
上述蛋白多糖優(yōu)選葡糖氨基葡聚糖部分以硫酸軟骨素(chondroitinsulfate)C為主成分。
上述蛋白多糖優(yōu)選相對(duì)于Matrix Metallo Protease具有抑制活性。
在上述Matrix Metallo Protease為MMP-9的情況下，上述抑制活性優(yōu)選是使已攝取0.4重量％添加餌料的載癌動(dòng)物的血清中的MMP-9抑制活性的減少得到恢復(fù)的作用，或者使已攝取0.4重量％添加餌料的載癌動(dòng)物的血清中的MMP-9抑制活性至少增加5％的作用。
上述蛋白多糖優(yōu)選通過(guò)有效量的生體內(nèi)攝取而具有使相對(duì)于組織蛋白酶B的抑制活性上升的作用。
上述蛋白多糖優(yōu)選通過(guò)有效量的生體內(nèi)攝取而具有使血清中的結(jié)合珠蛋白量增大的活性。
本發(fā)明的組合物的特征在于，含有上述蛋白多糖。
上述組合物優(yōu)選用于提高生活質(zhì)量。
本發(fā)明的藥物組合物的特征在于，含有上述蛋白多糖作為有效成分。
本發(fā)明的蛋白多糖的制造方法的特征在于，包括將來(lái)源于軟骨魚類的軟骨粉碎為平均粒徑在100μm以下的粉碎物的工序、向上述粉碎物中添加水來(lái)提取水溶性成分的工序、分離含有上述被提取的水溶性成分的水相的工序、以及向上述水相中添加醇得到沉淀物的工序。


圖1是表示在實(shí)施例1中得到的鯊魚軟骨水提取物的組成的圖。
圖2是表示利用實(shí)施例1的凝膠過(guò)濾HPLC得到的MMP-9抑制活性區(qū)域的氨基酸組成圖。
圖3是表示在實(shí)施例1中得到的鯊魚軟骨水提取物的MMP-2和MMP-9抑制活性的圖。
圖4是表示通過(guò)等電點(diǎn)電泳的各區(qū)域的pH與MMP-9抑制活性的相關(guān)的圖。
圖5是表示凝膠過(guò)濾(Superdex(注冊(cè)商標(biāo))75)的流程圖。
圖6是表示檢測(cè)通過(guò)凝膠過(guò)濾(Superdex(注冊(cè)商標(biāo))75)的各區(qū)域的MMP-9抑制活性的電泳圖。
圖7是表示醋酸纖維素膜電泳的結(jié)果的圖。
圖8是表示凝膠過(guò)濾(Superdex(注冊(cè)商標(biāo))200)的流程圖。圖8B是表示Superdex(注冊(cè)商標(biāo))200的洗脫時(shí)間與分子量之間的關(guān)系的圖。圖8C是表示通過(guò)Superdex(注冊(cè)商標(biāo))200的各區(qū)域的MMP-9抑制活性的圖。
圖9是表示比較本發(fā)明品與硫酸軟骨素C和市售鯊魚軟骨的MMP-9抑制活性的圖。表示向10μl的活性型MMP-9中加入樣品水溶液5μl而在37℃下反應(yīng)24小時(shí)時(shí)的MMP-9的殘存活性。
圖10是表示在實(shí)施例1中的化學(xué)致癌倉(cāng)鼠的抑癌效果的圖。表示用基礎(chǔ)食或?qū)嶒?yàn)食飼育50天時(shí)的腫瘤數(shù)量?！飌＜0.05。
圖11是表示在實(shí)施例3中的胰癌患者的血清中的MMP-9抑制活性的圖。
圖12是表示對(duì)在實(shí)施例3中的胰癌患者的血清中的IV型膠原片段進(jìn)行定量的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的分離的蛋白多糖來(lái)源于軟骨魚類的軟骨的水提取物，主要成分的分子量500kDa以上。
對(duì)成為上述蛋白多糖的原料的軟骨魚類沒(méi)有特別限定，可以包括板鰓類和全頭類，例如作為板鰓類，可以舉出鯊魚、魟魚等，作為全頭類可以舉出銀鮫等。
在本發(fā)明中作為原料的軟骨只要來(lái)源于上述軟骨魚類，就沒(méi)有特別限定，可以使用。
“主成分”是指利用凝膠過(guò)濾親和層析在具有500kDa以上的分子量的區(qū)域中產(chǎn)生主要峰值。
因而，“500kDa以上的分子量”是指通過(guò)凝膠過(guò)濾親和層析估計(jì)的分子量，具體地說(shuō)是使用Superdex(注冊(cè)商標(biāo))200進(jìn)行測(cè)量的500kDa直到排除極限1300kDa為止的分子量。
本發(fā)明的蛋白多糖優(yōu)選不溶于醇。作為上述醇，優(yōu)選甲醇、乙醇、異丙醇等低級(jí)醇。
即，本發(fā)明的蛋白多糖優(yōu)選為如上所述的高分子化合物，對(duì)醇為不溶性。
在這里，蛋白多糖是指葡糖氨基葡聚糖與蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合化合物。上述葡糖氨基葡聚糖部分優(yōu)選以硫酸軟骨素C為主成分。上述蛋白質(zhì)部分優(yōu)選具有如在后述的實(shí)施例1和圖2中記載的氨基酸組成。
本發(fā)明的蛋白多糖優(yōu)選相對(duì)于Matrix Metallo Protease(MMP)具有抑制活性。該蛋白多糖優(yōu)選具有通過(guò)有效量的生體內(nèi)攝取使相對(duì)于MatrixMetallo Protease(MMP)的抑制活性上升的作用。
作為MMP，只要來(lái)源于動(dòng)物就沒(méi)有特別限定，作為上述動(dòng)物，可以舉出小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠等嚙齒類，雞、兔、牛、羊、豬、馬等家畜類或人等。作為MMP的種類，可以舉出MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-12、MMP-13等誘導(dǎo)型MMP，MMP-2、MMP-14等常在型MMP，從涉及腫瘤的血管新生的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選作為對(duì)構(gòu)成襯托血管的基底膜的IV型膠原或V型膠原的明膠酶組進(jìn)行分解的MMP-2或MMP-9。
在本發(fā)明中，“有效量”是指在動(dòng)物活體內(nèi)足以發(fā)揮MMP抑制活性的上升作用、組織蛋白酶B抑制活性的上升作用或血清中的結(jié)合珠蛋白量的增大活性的量，根據(jù)動(dòng)物的種類、年齡、性別、體重等個(gè)體差別而不同，為了使倉(cāng)鼠體內(nèi)的MMP抑制活性上升，例示每天1～50mg左右。為了使人體內(nèi)的MMP抑制活性上升，例示每天1～15g左右。
當(dāng)上述MMP為MMP-9時(shí)，MMP-9的抑制活性的增加優(yōu)選是使攝取了已添加0.4％重量的蛋白多糖的餌料的載癌動(dòng)物的血清中的MMP-9抑制活性的減少得到恢復(fù)的作用，或者使攝取了已添加0.4％重量的蛋白多糖的餌料的載癌動(dòng)物的血清中的MMP-9抑制活性至少增加5％的作用。上述MMP-9的抑制活性的增加更優(yōu)選為20％以上。這樣，可以有效地抑制癌的成長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。
血清中的MMP-9的抑制能力可以由本發(fā)明人等預(yù)先測(cè)量，在規(guī)定量的V型膠原和MMP-9中混合血清并用SDS-PAGE和Western印跡進(jìn)行分析之后，利用光密度分析法(densitometry)對(duì)V型膠原的量進(jìn)行定量，由此可以來(lái)測(cè)量。將MMP-9的活性定義為將在37℃下且24小時(shí)的反應(yīng)下使V型膠原分解10％的活性作為1mU。因而，可以將血清中的MMP-9的抑制活性定義為將抑制1mU的MMP-9的活性的活性作為1mU。
本發(fā)明的蛋白多糖優(yōu)選具有通過(guò)有效量的生體內(nèi)攝取而使相對(duì)于組織蛋白酶B的抑制活性上升的作用?？梢酝ㄟ^(guò)相對(duì)于組織蛋白酶B的抑制作用，發(fā)揮抗癌作用。作為組織蛋白酶B的種類，可以舉出與上述MMP相同的動(dòng)物種來(lái)源。
組織蛋白酶B的抑制活性可以使用生體內(nèi)攝取的動(dòng)物的血清并按照Methods of Enzymology 1981；80卷、p.535-561中記載的方法測(cè)量。上述活性以與本發(fā)明的蛋白多糖攝取前的血清相比而在攝取后的血清中顯著增大作為指標(biāo)。
另外，本發(fā)明的蛋白多糖優(yōu)選通過(guò)有效量的生體內(nèi)攝取具有使血清中的結(jié)合珠蛋白量增大的活性。通過(guò)使血清中的結(jié)合珠蛋白量增大，可以通過(guò)相對(duì)于上述組織蛋白酶B的抑制作用發(fā)揮抗癌作用。作為結(jié)合珠蛋白的種類，可以舉出與上述MMP相同的源自于動(dòng)物種的結(jié)合珠蛋白。
血清中的結(jié)合珠蛋白量是通過(guò)將生體內(nèi)攝取的動(dòng)物的血清提供到SDS-PAGE進(jìn)行染色并利用光密度計(jì)(densitometer)進(jìn)行定量。上述活性以與本發(fā)明的蛋白多糖攝取前的血清相比，在攝取后的血清中顯著增大作為指標(biāo)。
本發(fā)明提供含有上述蛋白多糖的組合物。本組合物中含有的蛋白多糖的比例可以根據(jù)目的適宜設(shè)定，通常為0.001～99.9重量％。
本組合物中含有的其它成分可以根據(jù)目的適宜選擇。例如，當(dāng)組合物為食品時(shí)，可以在通常的食品的原材料中混合一定量本發(fā)明的蛋白多糖作為食品。另外，在組合物為輔助食品(即補(bǔ)充品)時(shí)，可以根據(jù)需要使本發(fā)明的蛋白多糖與淀粉等增添劑、葡萄糖、砂糖、糖漿等甜味料，香料或水等混合，成為易于食用的形狀例如片劑、膠囊、液體。在上述組合物中也可以含有來(lái)源于軟骨魚類的軟骨的任意成分，例如軟骨粉碎物(含有勻漿)本身、來(lái)源于軟骨水提取物的其它成分(分子量不到500kDa的蛋白多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、膠原、礦物質(zhì)等)，或蜂王漿、牡蠣提取物、維生素類、氨基葡萄糖、殼多糖殼聚糖、酵母等不是來(lái)源于軟骨魚類的軟骨的成分而對(duì)健康有好處的成分。
上述組合物由于含有通過(guò)生體內(nèi)攝取而發(fā)揮特定功能的蛋白多糖，所以優(yōu)選用于提高包括維持、提高健康狀態(tài)或者改善不健康的狀態(tài)(包括罹患疾病的狀態(tài))的生活質(zhì)量。
本發(fā)明提供一種含有上述蛋白多糖作為有效成分的藥物組合物。成為本發(fā)明的藥物組合物的對(duì)象的疾病是，伴隨血管新生或脈管形成的疾病，例如可以舉出癌的生長(zhǎng)、癌的轉(zhuǎn)移、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、血管新生青光眼、干癬和伴隨血管構(gòu)成成分的炎癥疾病，但不限于這些。
本發(fā)明的藥物組合物可以為上述蛋白多糖本身，也可以與自身公知的藥學(xué)中可以使用的載體(包括賦形劑、增添劑、結(jié)合劑、潤(rùn)滑劑等)或常用的添加劑等混合而調(diào)制。該藥物組合物可以根據(jù)調(diào)制的形態(tài)(片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、糖漿劑等經(jīng)口給藥劑或注射劑，點(diǎn)滴劑、外用劑、栓劑等非經(jīng)口給藥劑)等經(jīng)口給藥或非經(jīng)口給藥。另外，給藥量根據(jù)有效成分的含量、給藥途經(jīng)、給藥對(duì)象或患者的年齡、體重、癥狀等而不同，不能一概而論，通常作為1天的給藥用量，可以1天1～數(shù)次給藥數(shù)mg～20g左右。
本發(fā)明提供上述蛋白多糖的制造方法。該制造方法的特征在于，包括將來(lái)源于軟骨魚類的軟骨粉碎成平均粒徑為100μm以下的粉碎物的工序、向上述粉碎物中添加水來(lái)提取水溶性成分的工序、
分離含有上述被提取的水溶性成分的水相的工序、以及向上述水相中添加醇得到沉淀物的工序。
下面對(duì)包括上述工序的本發(fā)明的制造工序進(jìn)行說(shuō)明。
(1)原料及其前處理成為原料的軟骨只要來(lái)源于上述軟骨魚類就沒(méi)有特別限定，可以使用。最好預(yù)先除去附著在軟骨周圍的肉、皮等沒(méi)有用的部分。對(duì)軟骨的部位沒(méi)有特別限定，可以舉出中骨、鰭、頭部軟骨等。軟骨可以使用生軟骨、干燥軟骨和它們的冷凍品中的任意1種，而從易于供應(yīng)原料的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選干燥軟骨或其冷凍品。軟骨的干燥可以通過(guò)曬干或利用60℃左右的干燥機(jī)。
(2)將軟骨粉碎成平均粒徑為100μm以下的粉碎物的工序?yàn)榱擞行У剡M(jìn)行下述提取工序，粉碎上述軟骨。作為粉碎方法，可以舉出干式粉碎或濕式粉碎。干式粉碎可以使用干燥軟骨或其冷凍品進(jìn)行。濕式粉碎可以單獨(dú)使用生軟骨進(jìn)行或在生軟骨或干燥軟骨中添加水進(jìn)行。從控制粉碎物粒徑的容易度出發(fā)，優(yōu)選干式粉碎。
作為用于干式粉碎的裝置，可以舉出冷凍粉碎機(jī)、噴射研磨機(jī)等。
作為用于濕式粉碎的裝置，可以舉出勻漿器、濕式介質(zhì)研磨劑等。
粉碎物的平均粒徑為0.1～100μm，優(yōu)選為1～50μm。如果不到0.1μm，則生產(chǎn)效率有降低的趨勢(shì)，如果超過(guò)100μm，則提取效率有降低的趨勢(shì)。
在這里，平均粒徑是指體積與體積基準(zhǔn)分布為中央值(相對(duì)于累積分布的50％的粒徑)的顆粒相同的球的直徑，可以通過(guò)激光衍射法、離心沉淀法等粒度分布測(cè)量裝置進(jìn)行測(cè)量。
為了提高生產(chǎn)效率，可以在預(yù)先粗粉碎軟骨之后，進(jìn)行上述粉碎。對(duì)粗粉碎的方法和裝置沒(méi)有特別限定，例如可以使用錘擊式粉碎機(jī)等粗粉碎機(jī)進(jìn)行。只要將粉碎物的平均粒徑粗粉碎為0.5～10mm左右即可。
(3)向上述粉碎物中添加水來(lái)提取水溶性成分的工序向上述粉碎物中添加水。對(duì)添加的水沒(méi)有特別限定，可以舉出自來(lái)水離子交換水或蒸餾水等。對(duì)水的溫度也沒(méi)有特別限定，另外，對(duì)水的pH也沒(méi)有特別限定，可以不用特別調(diào)整pH而使用。
水的添加量通常相對(duì)于粉碎物的重量為1～10倍的量。
提取條件是一邊攪拌粉碎物和水，一邊通常進(jìn)行1分～24小時(shí)左右。如果不到1分鐘則不能進(jìn)行充分提取，如果為24小時(shí)以上則生產(chǎn)效率有降低的趨勢(shì)。另外，提取次數(shù)可以為1次、也可以為多次，但為了使得到的水相的容量在一定的范圍內(nèi)，可以設(shè)定水的添加量和提取次數(shù)。
(4)分離含有上述已提取的水溶性成分的水相的工序提取工序結(jié)束之后，從懸濁提取液中分離含有已提取的水溶性成分的水相。分離方法也可以進(jìn)行通常的固液分離。例如，可以舉出離心分離、過(guò)濾、傾析(decantation)等。
(4’)濃縮工序可以根據(jù)需要濃縮在工序(4)中得到的水相。對(duì)濃縮方法沒(méi)有特別限定，可以舉出加熱濃縮、凍結(jié)濃縮、利用超濾膜的濃縮等。濃縮的程度可以根據(jù)得到的水相的容量適宜設(shè)定，但通常濃縮至原來(lái)的容量的75％以下。
(5)在上述水相中添加醇得到沉淀物的工序向在工序(4)或(4’)中得到的水相中添加醇，使不溶于醇的成分析出，得到沉淀物。
添加的醇可以舉出甲醇、乙醇、異丙醇，而在食品用途中優(yōu)選使用乙醇。醇的添加量只要添加到可以目視到不溶成分析出的程度即可，而通常相對(duì)于水1為1～3倍容量。對(duì)析出條件沒(méi)有特別限定，只要在0～60℃下靜置1分鐘～24小時(shí)左右即可。
(6)回收沉淀物的工序通過(guò)離心分離、過(guò)濾等回收在工序(5)中得到的沉淀物。為了除去醇和水分，最好使回收的沉淀物干燥。干燥方法可以舉出風(fēng)干或凍結(jié)干燥等。
(7)對(duì)沉淀物進(jìn)行制粒的工序?yàn)榱耸沟玫降某恋砦锏谋４嫘院吞幚硇愿茫詈眠M(jìn)一步除去水分而粉末化。干燥水分值只要為容易保存的程度即可。進(jìn)而，也可以根據(jù)用途進(jìn)行粉碎、造粒等。
(8)分取分子量為500kDa以上的區(qū)域的工序在工序(6)中回收的沉淀物實(shí)際上由本發(fā)明的蛋白多糖構(gòu)成?？梢愿鶕?jù)用途利用凝膠過(guò)濾進(jìn)一步純化工序(6)的沉淀物。純化方法可以通過(guò)使用分取用凝膠過(guò)濾親和層析(例如Superdex(注冊(cè)商標(biāo))200)分取500kDa以上的區(qū)域而進(jìn)行。另外，也可以通過(guò)在濃縮工序中進(jìn)行去除量為500kDa以上的膜濾過(guò)，來(lái)代替工序(8)。
(9)通過(guò)等電點(diǎn)電泳分取pI為5.5以下的區(qū)域的工序在工序(6)中回收的沉淀物或在工序(8)中純化的純化物，實(shí)際上由本發(fā)明的蛋白多糖構(gòu)成。根據(jù)用途不同，可以通過(guò)等電點(diǎn)電泳進(jìn)一步純化工序(6)的沉淀物或工序(8)的純化物。純化方法可以通過(guò)使用分取用等電點(diǎn)電泳裝置(例如Rotofor、Bio-Rad Laboratories公司制)分取pI為5.5以下的區(qū)域來(lái)進(jìn)行。分取的區(qū)域優(yōu)選pI為5.0以下，更優(yōu)選為2～3。
通過(guò)工序(8)或工序(9)分取的區(qū)域可以在除去溶媒之后，提供到工序(7)的制粒工序中。
如此得到的本發(fā)明的蛋白多糖可以單獨(dú)使用，或作為食品或藥品的有效成分利用。本發(fā)明的蛋白多糖，如果攝取有效量到動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)MMP抑制活性的上升作用、組織蛋白酶B抑制活性的上升作用、結(jié)合珠蛋白的表達(dá)亢進(jìn)作用，可以有助于提高包括疾病預(yù)防、治療在內(nèi)的生活質(zhì)量(QOL)。
實(shí)施例下面對(duì)具體地顯示本發(fā)明的構(gòu)成和效果的實(shí)施例等進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例等的任何限制。
實(shí)施例1來(lái)源于鯊魚軟骨的蛋白多糖的分離(1)鯊魚軟骨提取物的調(diào)制利用粗粉碎機(jī)(細(xì)川密克朗(株)制、FM-1)將曬干干燥的鯊魚軟骨(藍(lán)鯊魚的軟骨)粗粉碎成平均粒徑為5mm左右。利用冷凍粉碎機(jī)(細(xì)川密克朗(株)制、LX-1)將得到的粗粉碎物連同液氮一起粉碎，得到平均粒徑為25μm的微粉末。平均粒徑是使用Microtrac 9320HRA(Leedsand Northrup公司制)測(cè)量的。向得到的微粉末3kg中加入蒸餾水15kg，在室溫下攪拌20分鐘之后進(jìn)行離心分離(5分鐘、3000rpm)得到上清。向殘余的殘?jiān)羞M(jìn)一步加入10kg的蒸餾水，在室溫下攪拌20分鐘之后，與上述同樣地進(jìn)行離心分離得到上清。將上述得到的上清合在一起，通過(guò)超濾膜(區(qū)域分子量6kDa、SIP-1053、ID1.4mm、旭化成制)將其濃縮至約為65％的容量。向得到的濃縮液中加入3倍容量的乙醇，在室溫下靜置2個(gè)小時(shí)，析出沉淀物。通過(guò)離心分離(5分鐘、3000rpm)回收析出的沉淀物，在40℃下干燥。利用咖啡粉碎機(jī)粉碎已干燥的鯊魚軟骨提取物，用于下述實(shí)驗(yàn)中。
(2)水分量測(cè)量通過(guò)常壓加熱干燥法算出水分含量。測(cè)量已充分干燥的坩鍋的皮重，正確地在其中稱量在上述(1)中得到的樣品1g。利用120℃的樣品干燥機(jī)干燥1個(gè)小時(shí)，自然冷卻后稱量。反復(fù)進(jìn)行直至重量一定，然后，從重量的減少量算出各樣品中的水分含量(圖1)。
(3)灰分量測(cè)量測(cè)量坩鍋的皮重，在其中稱量在上述(1)中得到的樣品0.2g。利用燃燒器燒坩鍋，直至煙不出來(lái)時(shí)?；?，放入到干燥器中，置于設(shè)定為500℃的電爐內(nèi)。放置24小時(shí)之后，自然冷卻，稱量，從重量變化算出灰分量(圖1)。
(4)氨基酸分析將在上述(1)中得到的樣品的水溶液(200μg/ml)100μl和標(biāo)準(zhǔn)品30μl(氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液H型為10μl、2.5μmol/ml Hyp為10μl、2.5μmol/ml Hyl為10μl)加入各自不同的干凈小試管(6mm×5cm)中，離心真空干固。然后，加入到具備mininert閥的15ml反應(yīng)瓶(reactive vial)中，與300μl的6N HCL一起在減壓下(0.1-0.2Torr)且在150℃下水解1個(gè)小時(shí)。接著，為了除去HCL而進(jìn)行真空干固。
添加已調(diào)制成甲醇∶三乙胺∶蒸餾水＝7∶2∶1的混合液各10μl，進(jìn)行真空干固。接著，添加由甲醇∶三乙胺∶蒸餾水∶苯基異氰酸酯＝7∶1∶1∶1構(gòu)成的誘導(dǎo)化液各20μl，在室溫下誘導(dǎo)化20分鐘之后，真空干固。然后，將含有10％乙腈的5mM磷酸緩沖液(pH7.4、Waters公司制、Pico-Tag樣品稀釋液)500μl添加到標(biāo)準(zhǔn)品中，200μl添加到樣品中。接著，用Parafilm密封試管，利用超聲波破壞苯基異氰酸酯的結(jié)晶，用0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾后，進(jìn)行離心分離(12000rpm、3分鐘)，利用反相HPLC分析上清(標(biāo)準(zhǔn)品為10μl、樣品為20μl)。柱使用Superspher 100PR-18(e)(Merck公司制)，洗脫液使用含有A液含有5％乙腈的150mM醋酸銨緩沖液(pH6.0)、B液60％乙腈。梯度構(gòu)成中，洗脫液B為0-2分鐘；0％、2-20分鐘；10-47.5％、20-25分鐘；47.5-100％、25-37分鐘；100％、37-50分鐘；0％，檢測(cè)為254nm，流速為0.8ml/min，柱溫度為40℃。結(jié)果顯示于圖1中。
(5)利用咔唑硫酸法的硫酸軟骨素量的測(cè)量將在上述(1)中得到的樣品的水溶液(200μg/ml)0.25ml置于試管中，一邊用冰水冷卻攪拌一邊滴下1.5ml的硫酸溶液(將四硼酸鈉10水合物0.95g溶于100ml的濃硫酸中)，加入0.05ml的0.125％咔唑溶液(將12.5mg的咔唑溶于10ml的乙醇中)，充分混合之后，用玻璃球蓋上，在沸騰水中加熱20分鐘。在室溫下冷卻后，利用分光光度計(jì)(SPECTROPHOTOMETER DU640，BECKMAN公司制)測(cè)量530nm的吸光度(T.Bitter，H.M.Muir，Anal.Biochem.，4，330，1962)。在標(biāo)準(zhǔn)品中使用硫酸軟骨素C(20、40、100、200μg/ml)，進(jìn)行同樣的操作。
如圖1所示，在上述(1)中得到的鯊魚軟骨水提取物的組成如下以蛋白質(zhì)和硫酸軟骨素為主成分(分別為30.8％和44.2％)，水分為5.8％，灰分為19.2％。另外，在鯊魚軟骨提取物中含有的蛋白質(zhì)的氨基酸組成為含有大量Gly，含有膠原特有的羥基脯氨酸(Hyp)和羥基賴氨酸(Hyl)。該組成與鯊魚軟骨II型膠原的組成大致一致。與II型膠原一起富含Ser等，所以表明含有蛋白多糖的蛋白質(zhì)成分。
接著，利用與上述(4)相同的方法對(duì)用后述的凝膠過(guò)濾純化得到的MMP-9抑制活性的區(qū)域進(jìn)行氨基酸分析。將結(jié)果顯示于圖2中。從圖2可知，由于幾乎不含有羥基脯氨酸，所以上述區(qū)域以該蛋白質(zhì)成分為主來(lái)源于蛋白多糖。
(6)鯊魚軟骨水提取物的MMP-2或者M(jìn)MP-9抑制活性向0.6ml微管中加入含有400mM NaCl、20mM CaCl2、0.1％Brij35(ICI公司制)的100mM Tris-HCl緩沖液(pH7.86)10μl，0.1％V型膠原(來(lái)源于牛胎盤的胃蛋白酶分解、株式會(huì)社YAGAI制)溶液10μl，在上述(1)中得到的樣品(調(diào)制成0.01～2.0％水溶液)5μl，MMP-2溶液或MMP-9溶液10μl；在37℃下催化反應(yīng)24小時(shí)。其中，作為陰性對(duì)照(NC)，使用除了樣品和MMP-9以外的物質(zhì)，作為陽(yáng)性對(duì)照(PC)，使用除了樣品以外的物質(zhì)，加入50mM Tris-HCl緩沖液并使其為相同量來(lái)代替之。反應(yīng)后，分別加入0.5M乙二胺四乙酸(pH7.5)20μl、10％十二烷基硫酸鈉5μl和0.1％溴酚藍(lán)5μl，用熱水加熱。將其中10μl提供到SDS-PAGE中，接著利用Western印跡法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，利用POD Immunostain Set(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社制)分離、鑒定V型膠原及其分解產(chǎn)物的帶。利用光密度計(jì)測(cè)量各帶濃度，求得相對(duì)于V型膠原的α1、α2鏈的分解產(chǎn)物的帶鏈(α1’、α2’鏈)的豐度比(Int OD％S’)。分解抑制率是通過(guò)從100減去將陽(yáng)性對(duì)照(PC)分解產(chǎn)物的豐度比(PC’)設(shè)為100時(shí)的比，來(lái)求得抑制率(圖3)。
從圖3可知，在上述(1)中得到的鯊魚軟骨提取物濃度依賴性地抑制MMP-2活性和MMP-9活性，以2％的濃度大約抑制90％。
(7)通過(guò)等電點(diǎn)電泳的分區(qū)將在上述(1)中得到的鯊魚軟骨提取物0.5g溶解于50ml的蒸餾水中，利用等電點(diǎn)電泳裝置Rotofor(Bio-Rad Laboratories公司制)，12W泳動(dòng)120分鐘。對(duì)各片段進(jìn)行pH測(cè)量，通過(guò)與上述(6)相同的方法檢測(cè)MMP-9抑制活性(圖4)。
從圖4可知，MMP-9抑制活性在等電點(diǎn)為酸性的區(qū)域高，特別是在pH 2.0～3.0的區(qū)域的MMP-9抑制活性高。
(8)利用Superdex(注冊(cè)商標(biāo))75凝膠過(guò)濾HPLC的分區(qū)對(duì)在上述(7)的等電點(diǎn)電泳中MMP-9抑制活性高的區(qū)域進(jìn)行離心分離(12000rpm、30分鐘)，通過(guò)0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾其上清，然后通過(guò)凝膠過(guò)濾HPLC對(duì)200μl進(jìn)行分區(qū)。分離條件為洗脫液使用含有200mM NaCl、10mM CaCl2的50mM Tris-HCl(PH7.86)，柱使用Suerdex(注冊(cè)商標(biāo))75(Amersham Biosceinces公司制)。流速為0.5ml/min，在波長(zhǎng)為230nm處進(jìn)行檢測(cè)(圖5)。在產(chǎn)生峰值之前10分鐘，每1分鐘利用FRACTION CORECTORE(Bio-Rad Laboratories公司制)分取，通過(guò)與上述(6)相同的方法檢測(cè)MMP-9抑制活性(圖6)。
從圖5和圖6可知，MMP-9的抑制活性存在于分子量為100kDa以上的高分子區(qū)域(圖中、用※表示)。
(9)醋酸纖維素膜電泳向MMP-9抑制活性區(qū)域中添加30倍容量的0.5N NaOH，在4℃下反應(yīng)24小時(shí)。然后利用1N HCl進(jìn)行中和，添加4.5ml的鏈霉蛋白酶緩沖液，使其熱變性(100℃、10分鐘)。冷卻到50℃后加入百里酚(thymol)。然后，在50℃下反應(yīng)48小時(shí)。為了除去蛋白，加入4.5ml的30％三氯醋酸溶液，在4℃下反應(yīng)1個(gè)小時(shí)。將上述溶液離心分離(8000×g、15分鐘)，相對(duì)于蒸餾水透析該上清，凍結(jié)干燥。對(duì)于該干燥物，進(jìn)行使用了醋酸纖維素膜的電泳。作為電泳用緩沖液，使用含有0.1M吡啶、0.47M甲酸的吡啶-甲酸緩沖液。作為標(biāo)記物，使用硫酸軟骨素C、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)和透明質(zhì)酸(圖7)。
從圖7可知，具有MMP-9抑制活性的高分子區(qū)域在鏈霉蛋白酶處理前，作為寬帶被檢測(cè)出，而通過(guò)鏈霉蛋白酶處理在與硫酸軟骨素C(CSC)相同的位置被檢測(cè)出。因而，表明具有MMP-9抑制活性的酸性且親水性的高分子區(qū)域含有硫酸軟骨素C，并且與蛋白質(zhì)結(jié)合。
(10)利用Superdex(注冊(cè)商標(biāo))200凝膠過(guò)濾HPLC的分區(qū)將在上述(1)中得到的鯊魚軟骨提取物溶解于蒸餾水中成為1mg/ml，進(jìn)行離心分離(12000rpm、30分鐘)，通過(guò)0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾其上清，然后通過(guò)凝膠過(guò)濾HPLC對(duì)200μl進(jìn)行分區(qū)。分離條件為洗脫液使用含有200mM NaCl、10mM CaCl2的50mM Tris-HCl(PH7.86)，柱使用Suerdex(注冊(cè)商標(biāo))200(Amersham Biosceinces公司制)。流速為0.5ml/min，在波長(zhǎng)為230nm處檢測(cè)(圖8)。利用FRACTION COLLECTOR(Bio-Rad Laboratories公司制)在每1分鐘進(jìn)行分取，通過(guò)與上述(6)相同的方法檢測(cè)MMP-9抑制活性。
從圖8可知，MMP-9的抑制活性存在于分子量為500kDa以上的高分子區(qū)域。
比較例1利用實(shí)施例1(6)中記載的方法，檢測(cè)在實(shí)施例1(8)中得到的酸性且親水性的高分子區(qū)域(本發(fā)明品)、硫酸軟骨素C和市售的鯊魚軟骨的MMP-9抑制活性。將其結(jié)果顯示于圖9中。
從圖9可知，硫酸軟骨素C和市售的鯊魚軟骨幾乎不具有MMP-9抑制活性。為了比較本發(fā)明品與市售的鯊魚軟骨的成分，檢測(cè)各自的硫酸軟骨素量和氨基酸量。結(jié)果，硫酸軟骨素量沒(méi)有顯著差異，而氨基酸量在本發(fā)明品中絕對(duì)多。硫酸軟骨素C單獨(dú)存在時(shí)幾乎沒(méi)有MMP-9抑制活性，所以表示與糖鏈相比，MMP-9抑制活性更存在于蛋白質(zhì)部分中。
實(shí)施例2相對(duì)于載癌倉(cāng)鼠的鯊魚軟骨提取物攝取的效果(1)實(shí)驗(yàn)食的調(diào)制作為基礎(chǔ)食，使用從日本CLEA株式會(huì)社買入的CE-2粉末，作為實(shí)驗(yàn)食，使用的是在基礎(chǔ)食中添加0.2重量％或0.4重量％的在實(shí)施例1(1)中調(diào)制的鯊魚軟骨提取物(下面有時(shí)將重量％簡(jiǎn)寫為％)。下述倉(cāng)鼠可以自由攝食上述基礎(chǔ)食和實(shí)驗(yàn)食。水也可以自由攝取。檢測(cè)攝取了實(shí)驗(yàn)食的各倉(cāng)鼠的體重和餌的攝取量。在相同組之中未見(jiàn)明顯的體重差以及餌的攝取量的差異。
(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從日本SLC株式會(huì)社買入敘利亞金黃倉(cāng)鼠(6周齡)。在調(diào)節(jié)為室溫24±1℃、濕度60±5％的12小時(shí)明暗周期的飼育室中將每4～5只倉(cāng)鼠放入1個(gè)塑料籠中飼育。為了順應(yīng)環(huán)境，從動(dòng)物搬入開(kāi)始進(jìn)行1周非實(shí)驗(yàn)飼育。另外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是在奈良縣立醫(yī)科大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中，遵守相同設(shè)施的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)定進(jìn)行的。
(3)利用N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺(BOP)的胰管癌誘發(fā)倉(cāng)鼠向全部動(dòng)物每1kg體重皮下注射50mg的BOP，伴隨著短期胰癌發(fā)生系(Mizumoto K.等、J.Natl.Cancer Inst.801546-57，1988)，投入缺膽堿食物，反復(fù)進(jìn)行2次由每1kg體重腹腔內(nèi)給500mg的乙基硫氨酸、每1kg體重腹腔內(nèi)給800mg的蛋氨酸以及每1kg體重皮下給20mg的BOP構(gòu)成的一系列操作，制作出胰管癌誘發(fā)倉(cāng)鼠。從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始算起，從第50至第100天為止，投入上述實(shí)驗(yàn)食(村田奈保牛和鯊魚軟骨水提取物對(duì)倉(cāng)鼠胰管癌發(fā)生的影響奈良醫(yī)學(xué)雜志53(5、6)241-52 2002)。
實(shí)驗(yàn)期間的體重在各組之間沒(méi)有見(jiàn)到差異，在最終體重、胰和肝的重量和餌的攝取量方面也沒(méi)有看到顯著差異。除外在被實(shí)驗(yàn)物質(zhì)開(kāi)始之后在0.4％鯊魚軟骨食組馬上有1只死亡以外，在實(shí)驗(yàn)期間沒(méi)有見(jiàn)到動(dòng)物的死亡。另外，0.4％組與其它組相比，毛光澤等動(dòng)物的一般狀態(tài)良好。
圖10是表示對(duì)攝取實(shí)驗(yàn)食50天且生存100天的所有動(dòng)物進(jìn)行屠殺剖檢時(shí)的胰癌病變和胰管癌的數(shù)目。可見(jiàn)每1只動(dòng)物的胰管上皮增生和異型性增生的發(fā)生數(shù)目為0.2％，在0.4％組中有減少傾向，而與基礎(chǔ)食組比較，沒(méi)有見(jiàn)到顯著差異。胰管癌的發(fā)生數(shù)目在基礎(chǔ)食組中為3.1±2.0個(gè)，在0.2％組中為2.6±2.1個(gè)，在0.4％組中為1.4±0.9個(gè)，可見(jiàn)與鯊魚軟骨提取物的用量相關(guān)，有減少的傾向。0.4％組與基礎(chǔ)食(0％)組相比，胰管癌的發(fā)生數(shù)目?jī)?yōu)先減少(圖中★表示P＜0.05)。
(4)胰癌組織移植倉(cāng)鼠對(duì)向倉(cāng)鼠的后背部左右2處傳代移植N-亞硝基雙(2-羥基丙基)胺(BHP)誘發(fā)胰癌組織的部位進(jìn)行細(xì)區(qū)分，使用金屬制套針(trocar)進(jìn)行移植。在投入實(shí)驗(yàn)食時(shí)，不是觀察移植癌的存活抑制效果而是為了觀察腫瘤的增大抑制效果而設(shè)置1個(gè)星期的癌存活延遲期間。隨后3周投入實(shí)驗(yàn)食。作為觀察腫瘤增大的計(jì)算方法，由于與橢圓形近似而從測(cè)量的長(zhǎng)徑和短徑并通過(guò)4/3×π×(長(zhǎng)徑/2)×(短徑/2)2求得體積，進(jìn)行比較。將一部分倉(cāng)鼠作為非載癌倉(cāng)鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)食投入。
結(jié)果，癌存活后經(jīng)過(guò)3周，實(shí)驗(yàn)食組與基礎(chǔ)食組相比更抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
(5)血清與組織提取實(shí)驗(yàn)期間結(jié)束后，在乙醚麻醉的基礎(chǔ)上，從倉(cāng)鼠的腹部主動(dòng)脈采集全部血液，對(duì)通過(guò)常溫靜置后分離出的上清進(jìn)行離心分離(20分鐘、3000rpm)，得到血清。根據(jù)需要還采集腫瘤和非腫瘤組織，凍存于-80℃。作為從組織的MMP提取法，相對(duì)于組織10mg添加含有1％Tween和300mM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液500μl，在微管內(nèi)進(jìn)行均質(zhì)化，在冰中孵育15分鐘。然后以3000rpm進(jìn)行離心分離30分鐘，將得到的上清作為組織提取液。實(shí)驗(yàn)是通過(guò)全部滅菌操作進(jìn)行的。
(6)攝取了鯊魚軟骨提取物的非載癌或載癌倉(cāng)鼠血清的MMP-9抑制活性測(cè)量制作含有400mM NaCl、20mM CaCl2、0.1％Brij35的100mM Tris-HCl緩沖液(pH7.86)和將其2倍稀釋的50mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液，使用該50mM緩沖液將血清稀釋為適當(dāng)?shù)臐舛?5～20倍)，提供到MMP抑制活性測(cè)量。
向0.6ml微管中加入含有400mM NaCl、20mM CaCl2、0.1％Brij35的100mM Tris-HCl緩沖液(pH7.86)10μl、0.1％V型膠原(來(lái)源于牛胎盤胃蛋白酶分解株式會(huì)社ャガィ制)溶液10μl、血清樣品5μl、MMP-9溶液10μl，在37℃下催化反應(yīng)24小時(shí)。其中，作為陰性對(duì)照(NC)使用除了血清、MMP-9以外的物質(zhì)，作為陽(yáng)性對(duì)照(PC)使用除了血清以外的物質(zhì)，代替以加入50mM Tris-HCl緩沖液并成為相同量。反應(yīng)后，分別加入0.5M乙二胺四乙酸(pH7.5)20μl，10％SDS 5μl和0.1％BPB 5μl，用熱水加熱。進(jìn)行SDS-PAGE隨后通過(guò)Western印跡法將其中10μl轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，利用POD Immunostain Set(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社制)分離、鑒定V型膠原及其分解產(chǎn)物的帶。利用光密度計(jì)測(cè)量各帶濃度，求得相對(duì)于V型膠原的α1、α2鏈的分解產(chǎn)物的帶鏈的豐度比(IntOD％S’)。分解抑制率是通過(guò)從100減去將陽(yáng)性對(duì)照(PC)分解產(chǎn)物的豐度比(PC’)作為100時(shí)的比而求得抑制率的，進(jìn)而從稀釋倍率(D’)和供應(yīng)量(A’)表示血清1ml中的抑制活性。
非載癌倉(cāng)鼠攝取2周實(shí)驗(yàn)食(0.4％)或基礎(chǔ)食時(shí)的血清中的MMP-9的V型膠原分解抑制活性(U/ml)，在實(shí)驗(yàn)食組中為4.95±0.06，基礎(chǔ)食組為4.13±0.59。通過(guò)攝取鯊魚軟骨提取物，可見(jiàn)針對(duì)MMP-9的抑制活性有增加的傾向。
載癌倉(cāng)鼠攝取3周實(shí)驗(yàn)食(0.4％)或基礎(chǔ)食時(shí)的血清中的MMP-9的V型膠原分解抑制活性(U/ml)，在實(shí)驗(yàn)食組中為4.1±0.3，基礎(chǔ)食組為3.2±0.7。
從這些結(jié)果可知，在倉(cāng)鼠中，通過(guò)致癌使MMP-9的抑制活性從4.1U/ml到3.2U/ml大約降低20％，而通過(guò)攝取鯊魚軟骨提取物，與載癌倉(cāng)鼠一起顯著恢復(fù)。另外，即使在健康的非載癌倉(cāng)鼠中，也可知通過(guò)攝取鯊魚軟骨提取物，MMP-9抑制活性大約增加20％。
實(shí)施例3倉(cāng)鼠血清中的結(jié)合珠蛋白量利用SDS-PAGE分離非載癌倉(cāng)鼠攝取2周鯊魚軟骨提取物時(shí)的血清，進(jìn)行CBB染色。結(jié)果，與基礎(chǔ)食組相比，在實(shí)驗(yàn)食組大約80kDa的帶增加。切下上述80kDa的帶，進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析(蛋白測(cè)序PPSQ21、島津制作所制)，可知為倉(cāng)鼠內(nèi)源性結(jié)合珠蛋白(α鏈VDLSNDAMDTADDS(序列號(hào)1)、β鏈IIGGSLDAKGSFPW(序列號(hào)2))。
結(jié)合珠蛋白具有結(jié)合通過(guò)溶血產(chǎn)生氧化血紅蛋白、中和氧化性血管障礙毒性等功能，以溶血為代表，最近正在成為癌的惡性度等很多疾病的指標(biāo)蛋白(Pathol Oncol Res.1998；4(4)271-6、Br J Cancer.1991 Aug；64(2)386-90)。另外，還有報(bào)道針對(duì)提示與癌的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)有關(guān)聯(lián)的組織蛋白酶B(Chin Med J(Engl).1998Sep；111(9)784-8、FEBS Lett.1999Jul 23；455(3)286-90)的抑制活性能(Can J Biochem.1982 Jun；60(6)631-7)或結(jié)合珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合體誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡(ScandJ Clin Lab Invest.1995 Oct；55(6)529-35)。目前，對(duì)于結(jié)合珠蛋白難以解釋，而作為解釋之一，通過(guò)攝取鯊魚軟骨提取物可以使血清中的結(jié)合珠蛋白增加，可以看出有保持肝功能良好的可能性。
實(shí)施例4針對(duì)癌患者的攝取鯊魚軟骨提取物的效果對(duì)于患有胰癌的男性志愿者(50～60歲)，每日經(jīng)口攝取2g在實(shí)施例1(1)中調(diào)制的鯊魚軟骨提取物并經(jīng)過(guò)4個(gè)月，對(duì)攝取前和攝取后的血清進(jìn)行分析。由于如果向該患者投入其它抗癌藥，副作用的影響會(huì)很大，所以不進(jìn)行。
(1)攝取了鯊魚軟骨提取物的載癌人血清的MMP-9抑制活性測(cè)量將該患者血清稀釋成20倍，用與實(shí)施例2(6)相同的手法檢測(cè)MMP-9的抑制活性。將其結(jié)果顯示于圖11。
如果比較NC(Negative Control＝只有V型膠原基質(zhì)溶液的陰性對(duì)照)和PC(Positive Control＝將MMP-9加入到V型膠原基質(zhì)溶液中進(jìn)行孵育的陽(yáng)性對(duì)照)，在PC中可見(jiàn)通過(guò)MMP-9分解的低分子量的V型膠原。
(圖中用箭頭表示)在Before(攝取鯊魚軟骨提取物前的患者的血清)可見(jiàn)與PC相同的分解產(chǎn)物，在After(攝取鯊魚軟骨提取物4個(gè)月之后)分解物明顯減少，可以確認(rèn)通過(guò)攝取鯊魚軟骨提取物，即使在患者中對(duì)MMP-9的抑制活性也增加。
(2)通過(guò)ELISA法的胰癌患者的IV型膠原分解物量的測(cè)量在患者中，如果MMP-9、2的活性高，則IV型膠原被分解，其片段在血清中增加。所以，通過(guò)使用作為ELISA法檢測(cè)試劑盒的Panassay IV-C(第一Fine chemical株式會(huì)社制)，檢測(cè)血清中的IV型膠原的片段量，評(píng)價(jià)MMP-9的活性。
采集鯊魚軟骨提取物攝取前和攝取后的患者的血清和作為對(duì)照的3名健康人的血清。在加入了稀釋成20倍的血清50μl和酶標(biāo)抗體液300μl的試管中，放入抗體結(jié)合珠，混合后靜置1小時(shí)。靜置后，反復(fù)進(jìn)行4次將清洗液加到試管中并用吸氣器吸引除去反應(yīng)液的工序。在殘余的珠上加入顯色液300μl，進(jìn)而加入100μl基質(zhì)液，混合后，靜置30分鐘。靜置后，加入1mL終止液，將水作為對(duì)照在波長(zhǎng)450nm下測(cè)量吸光度。以預(yù)先準(zhǔn)備的校準(zhǔn)線為基礎(chǔ)，從吸光度求得血清中的IV型膠原片段量。將結(jié)果顯示于圖12中。(“正常人”是指3名健康人的平均值)與正常人相比，鯊魚軟骨提取物的攝取前的胰癌患者的血清IV型膠原量為相當(dāng)高的值。所以，可以推測(cè)IV型膠原受到分解，產(chǎn)生癌的轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)、增殖。其在鯊魚軟骨提取物的攝取后確實(shí)減少了。從這些可知，鯊魚軟骨提取物的攝取具有抑制MMP的活性的效果。
工業(yè)上的可利用性與從前報(bào)道的MMP合成抑制劑的OPB-3206中的胰致癌抑制實(shí)驗(yàn)(Carcinogenesis.1999 Jul；20(7)1323-9)相比，本發(fā)明的蛋白多糖的胰致癌抑制實(shí)驗(yàn)顯示出與合成抑制劑相匹敵的抑癌效果。此外，由于沒(méi)有見(jiàn)到被實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重減少或運(yùn)動(dòng)能力降低等MMP合成抑制劑特有的明顯的副作用，所以來(lái)源于鯊魚軟骨的本發(fā)明品可以作為來(lái)源于天然物的癌進(jìn)展抑制物質(zhì)。另外，本發(fā)明的蛋白多糖的制造方法，可以容易地制造具有這樣的特性且作用機(jī)制明確的蛋白多糖。
序列表<110>細(xì)川密克朗集團(tuán)<120>從軟骨魚類分離的蛋白多糖及其制造方法<130>PGT0410HM<150>JP/2003/77778<151>2003-03-20<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>14<212>PRT<213>倉(cāng)鼠<400>1Val Asp Leu Ser Asn Asp Ala Met Asp Thr Ala Asp Asp Ser1 5 10<210>2<211>14<212>PRT<213>倉(cāng)鼠<400>2Ile Ile Gly Gly Ser Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp1 5 10
權(quán)利要求
1.一種蛋白多糖，其特征在于，是從軟骨魚類的軟骨的水提取物分離出來(lái)的，且主成分具有500kDa以上的分子量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白多糖，其特征在于，不溶于醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的蛋白多糖，其特征在于，葡糖氨基葡聚糖部分以硫酸軟骨素C為主成分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖，其特征在于，具有針對(duì)Matrix Metallo Protease的抑制活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白多糖，其特征在于，所述Matrix Metallo Protease為MMP-9，所述抑制活性是使已攝取0.4重量％添加餌料的載癌動(dòng)物的血清中的MMP-9抑制活性的減少得到恢復(fù)的作用，或者使已攝取0.4重量％添加餌料的載癌動(dòng)物的血清中的MMP-9抑制活性至少增加5％的作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖，其特征在于，通過(guò)有效量的生體內(nèi)攝取而具有使相對(duì)組織蛋白酶B的抑制活性上升的作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖，其特征在于，通過(guò)有效量的生體內(nèi)攝取而具有使血清中的結(jié)合珠蛋白量增大的活性。
8.一種組合物，其特征在于，含有根據(jù)權(quán)利要求1～7中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，用于提高生活質(zhì)量。
10.一種藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1～7中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖作為有效成分。
11.一種權(quán)利要求1～7中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖的制造方法，其特征在于，包括將來(lái)源于軟骨魚類的軟骨粉碎成平均粒徑為100μm以下的粉碎物的工序、向所述粉碎物中添加水來(lái)提取水溶性成分的工序、分離含有所述被提取的水溶性成分的水相的工序、以及向所述水相中添加醇得到沉淀物的工序。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蛋白多糖，它來(lái)源于軟骨魚類的軟骨的水提取物且主成分具有500kDa以上的分子量；還提供含有上述蛋白多糖的組合物；還提供含有上述蛋白多糖作為有效成分的藥物組合物；以及還提供蛋白多糖的制造方法，包括將來(lái)源于軟骨魚類的軟骨粉碎成平均粒徑為100μm以下的粉碎物的工序、向上述粉碎物中添加水來(lái)提取水溶性成分的工序、分離含有上述被提取的水溶性成分的水相的工序以及向上述水相中添加醇得到沉淀物的工序。由此本發(fā)明提供即使攝取少量也能夠發(fā)揮效果且效果的作用機(jī)制明確的軟骨提取物及其制造方法。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1761686SQ200480007528
公開(kāi)日2006年4月19日 申請(qǐng)日期2004年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月20日
發(fā)明者佐藤健司, 堤雅弘, 野村義宏, 村田奈保, 近藤直幸 申請(qǐng)人:細(xì)川密克朗集團(tuán)