專利名稱：包含ag013736的劑型的制作方法
本申請享有2003年4月3日提交的美國臨時申請?zhí)?0/460,695及2003年7月31日提交的美國專利臨時申請?zhí)?0/491,771的優(yōu)選權(quán)，兩者公開的內(nèi)容在此整體引入作為參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及可用于治療哺乳動物細胞異常增長如癌癥的VEGFR抑制劑。本發(fā)明也涉及一種使用這些化合物治療哺乳動物尤其是人細胞異常增長的方法，還涉及包含這些化合物的藥學組合物。
如式1所示的化合物6-[2-(甲基氨基甲?；?苯硫基]-3-E-[2-(吡啶-2-基)乙烯基]吲唑 為一種強效的選擇性VEGFR/PDGFR酪氨酸激酶抑制劑，在結(jié)腸、黑色素瘤、乳腺癌和肺癌的異種移植模型中具有廣泛的臨床前活性(Hu-Lowe D，Heller，D，Brekken J，F(xiàn)eeley R，Amundson K，Haines M，Troche G，Kim Y，Gonzalez D，Herrman M，Batugo M，Vekich S，Kania R，McTigue M，Gregory S，Bender S，Shalinsky D.，Pharmacological Activities of AG013736，a SmallMolecule Inhibitor of VEGFR/PDGFR Receptor Tyrosine Kinases；Proc.Am.Assoc.Cancer Res.2002abstract#5357)。使用動態(tài)對照增強MRI(dceMRl)評價的臨床前腫瘤血管反應(yīng)與腫瘤生長指數(shù)相吻合(Wilmes LJ，Hylton NM，Wang D，F(xiàn)leming LM Gibbs J，Kim Y，Dillon R，Brasch RC，Park JW，Li K-L，Henry RG，Partridge SC，Shalinsky DR，Hu-Lowe D，McShane TM和PallaviciniMG.，AG013736，a Novel VEGFR TK Inhibitor，Suppresses Tumor Growth andVascular Permeability in Human BT474 Breast Cancer Xenografts in NudeMice″；Proc.Am.Assoc.Cancer Res.2003Abstract #3772.)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了使用式1化合物的劑型和治療方法， 式1化合物可系統(tǒng)命名為6-[2-(甲基氨基甲?；?苯硫基]-3-E-[2-(吡啶-2-基)乙烯基]吲唑。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種對哺乳動物給藥的劑型，該劑型包含式1化合物或其可藥用鹽、溶劑合物、前藥或其混合物，給藥哺乳動物后，其量有效提供式1化合物或其活性代謝物的24小時AUC血漿值不超過4500ng·小時/mL。24小時AUC血漿值可用發(fā)明詳述中的方法確定。
在該實施方案的具體方面，24小時AUC血漿值的上限為不超過4000ng·小時/mL或不超過3000ng·小時/mL或不超過2500ng·小時/mL或不超過2000ng·小時/mL或不超過1500ng·小時/mL或不超過1000ng·小時/mL或不超過800ng·小時/mL或不超過700ng·小時/mL。優(yōu)選地，結(jié)合上述任一上限，24小時AUC血漿值為至少10ng·小時/mL或至少25ng·小時/mL或至少50ng·小時/mL或至少75ng小時/mL或至少100ng小時/mL或至少125ng·小時/mL。24小時AUC血漿值的范圍包括從上述任一下限至上述任一上限的范圍。優(yōu)選范圍的具體非限制實例包括25ng·小時/mL～4500ng·小時/mL、50ng·小時/mL～2500ng·小時/mL、75ng·小時/mL～1000ng-小時/m、100ng·小時/mL～800ng·小時/mL以及125ng·小時/mL～700ng·小時/mL。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種劑型，該劑型包含使用量不超過30mg的上述式1化合物或其可藥用鹽、溶劑合物、前藥或其混合物。應(yīng)當理解為，當劑型中的全部或部分化合物為鹽、溶劑合物或前藥時，其量為式1化合物的等效量，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于摩爾質(zhì)量很容易將其計算出來。
在該實施方案的具體方面，上述量的上限為不超過20mg或不超過15mg或不超過12mg或不超過10mg或不超過8mg或不超過7mg。優(yōu)選地，結(jié)合上述任一上限，上述量為至少0.5mg或至少1mg或至少1.5mg或至少2mg或至少2.5mg或至少3mg。范圍包括從上述任一下限至上述任一上限的范圍。優(yōu)選范圍的具體非限制實例包括0.5mg～30mg、1mg～20mg、1.5mg～15mg、2mg～10mg、2.5mg～8mg以及3mg～7mg。
本發(fā)明進一步提供了一種通過對哺乳動物給藥上述式1化合物或其可藥用鹽、溶劑合物、前藥或其混合物治療哺乳動物包括人的細胞異常生長的方法，給藥哺乳動物后，其量有效提供式1化合物或其活性代謝物的24小時AUC血漿值不超過4500ng·小時/mL的量。24小時AUC血漿值可用發(fā)明詳述中的方法確定。
在該實施方案的具體方面，24小時AUC血漿值的上限為不超過4000ng·小時/mL或不超過3000ng·小時/mL或不超過2500ng·小時/mL或不超過2000ng·小時/mL或不超過1500ng·小時/mL或不超過1000ng·小時/mL或不超過800ng·小時/mL或不超過700ng·小時/mL。優(yōu)選地，結(jié)合上述任一上限，24小時AUC血漿值為至少10ng·小時/mL或至少25ng·小時/mL或至少50ng·小時/mL或至少75ng·小時/mL或至少100ng小時/mL或至少125ng·小時/mL。24小時AUC血漿值的范圍包括從上述任一下限至上述任一上限的范圍。優(yōu)選范圍的具體非限制實例包括25ng·小時/mL～4500ng·小時/mL、50ng·小時/mL～2500ng·小時/mL、75ng·小時/mL～1000ng-小時/m、100ng·小時/mL～800ng·小時/mL以及125ng·小時/mL～700ng·小時/mL。
本發(fā)明通過以每次不超過30mg的劑量對哺乳動物施用上述式1化合物或其可藥用鹽、溶劑合物、前藥或其混合物，進一步提供了一種治療哺乳動物包括人的細胞異常生長的方法。應(yīng)當理解為，當劑型中的全部或部分化合物為鹽、溶劑合物或前藥時，其量為式1化合物的等效量，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于摩爾質(zhì)量很容易將其計算出來。
在該實施方案的具體方面，上述量的上限為不超過20mg或不超過15mg或不超過12mg或不超過10mg或不超過8mg或不超過7mg。優(yōu)選地，結(jié)合上述任一上限，上述量為至少0.5mg或至少1mg或至少1.5mg或至少2mg或至少2.5mg或至少3mg。范圍包括從上述任一下限至上述任一上限的范圍。優(yōu)選范圍的具體非限制實例包括0.5mg～30mg、1mg～20mg、1.5mg～15mg、2mg～10mg、2.5mg～8mg以及3mg～7mg。
此處所述的任一發(fā)明方法的具體實施方案中，細胞異常生長為癌癥，其包括，但不限于肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌癥、皮膚或眼內(nèi)黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區(qū)域的癌癥、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、脊錐瘤(spinal axis tumors)、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤，或一種或多種前述癌癥的組合。在所述方法的另一種實施方案中，細胞異常生長為一種良性的增殖性疾病，包括，但不限于牛皮癬、良性的前列腺肥大或血管再狹窄。
在另一個實施方案中，通過對哺乳動物施用治療可接受量的式1化合物，本發(fā)明提供了一種抑制哺乳動物PDGFR BB介導的癌細胞遷移的方法。
在另一個實施方案中，通過對哺乳動物給藥治療可接受量的式1化合物，本發(fā)明提供了一種抑制哺乳動物c-KIT活性的方法。
此處所述的任一發(fā)明方法的其它具體實施方案中，所述方法進一步包括對哺乳動物施用一定量的一或多種物質(zhì)，該物質(zhì)選自抗腫瘤藥物、抗血管生成藥物、信號轉(zhuǎn)導抑制劑和抗增殖藥物，其使用量一起可有效治療所述的細胞異常生長。這些物質(zhì)包括在PCT公開號WO00/38715、WO00/38716、WO00/38717、WO00/38718、WO00/38719、WO00/38730、WO00/38665、WO00/37107和WO00/38786中公開的那些物質(zhì)，其公開的內(nèi)容在此整體引入作為參考。
抗腫瘤藥物的實例包括有絲分裂抑制劑，例如長春花生物堿衍生物，如長春花堿、異長春花堿、長春地辛和長春新堿；秋水仙堿別膽烷，半軟骨藻氨酸、N-苯甲?；谆?甲基醚秋水仙酸、多拉司他汀10、maystansine、rhizoxine、紫杉烷類如紫杉醇(TaxolTM)、多西紫杉醇(TaxotereTM)、2′-N-[3-(二甲氨基)丙基]glutaramate(TaxolTM衍生物)、thiocholchicine、三苯甲基半胱氨酸、替尼泊苷、氨甲喋呤、咪唑硫嘌呤、5-氟尿苷、阿糖胞苷、2′2′-二氟脫氧胞苷(吉西他濱)、阿霉素和mitamycin。烷基化藥物，例如順鉑、卡鉑、oxiplatin、異丙鉑、N-乙酰-DL-肌氨?；?L-亮氨酸的乙基酯(Asaley或Asalex)、1，4-環(huán)己二烯-1，4-二氨基甲酸、2，5-雙-(1-氮雜丙啶基)-3，6-二氧代，二乙基酯(地吖醌)，1，4-雙(甲磺酰氧基)丁烷(bisulfan or leucosulfan)、氯脲菌素、氯乙礬、氰基嗎啉多柔比星、cyclodisone、dianhydroglactitol、氟多潘、hepsulfam、絲裂霉素C、羥甲硫蒽酮絲裂霉素C、米托唑酰胺、1-(2-氯乙基)-4-(3-氯丙基)-哌嗪二鹽酸鹽、哌嗪二酮、哌泊溴烷、甲基絲裂霉素、spirohydantoin mustard、替羅昔隆、四鉑、硫替派、曲他胺、尿嘧啶氮芥、雙(3-甲磺酰丙基)胺鹽酸鹽、絲裂霉素、亞硝基脲藥劑如環(huán)己基-氯乙基亞硝基脲、甲基環(huán)己基-氯乙基亞硝基脲、1-(2-氯乙基)-3-(2，6-二氧代-3-哌啶基)-1-亞硝基-脲、雙(2-氯乙基)亞硝基脲、甲芐肼、甲嗪咪唑胺、氮芥相關(guān)的化合物如mechloroethamine、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、雌二醇氮芥鈉、strptozoin、替莫唑胺。DNA抗代謝物，例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、羥基脲、2-[(3-羥基-2-pyrinodinyl)亞甲基-肼硫代羥酸酰胺、脫氧氟尿嘧啶、5-羥基-2-甲酸吡啶縮氨基硫脲、α-2′-脫氧-6-硫烏嘌呤、aphidicolin glycinate、5-氮雜脫氧胞嘧啶、β-硫烏嘌呤脫氧核糖甙、安西他濱、胍唑、inosine glycodialdehyde、macbecin II、pyrazolimidazole、克拉屈濱、噴司他丁、硫烏嘌呤、巰基嘌呤、博來霉素、2-氯脫氧腺苷，胸腺嘧啶合成酶抑制劑如雷替曲塞和培美曲塞二鈉、氯苯吩嗪、氟尿苷和氟達拉濱。DNA/RNA抗代謝物，例如L-阿拉諾新、5-氮胞苷、阿西維辛、氨喋呤及其衍生物如N-[2-氯-5-[[(2，4-二氨基-5-甲基-6-喹唑啉基)甲基]氨基]苯甲?；鵠-L-天冬氨酸、N-[4-[[(2，4-二氨基-5-乙基-6-喹唑啉基)甲基]氨基]苯甲?；鵠-L-天冬氨酸、N-[2-氯-4-[[(2，4-二氨基蝶啶基)甲基]氨基]苯甲?；鵠-L-天冬氨酸、可溶的Baker’s antifol、二氯烯丙基散沫花素、布喹那、呋氟尿嘧啶、二氫-5-氮胞苷、氨甲喋呤、N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸四鈉鹽、吡唑并呋喃、三甲曲沙、plicanycin、放線菌素D、cryptophycin及類似物如cryptophycin-52或，例如，歐洲專利申請?zhí)?39362中公開的一種優(yōu)選的抗代謝物，如N-(5-[N-(3，4-二氫-2-甲基-4-氧代喹唑啉-6-基甲基)-N-甲基氨基]-2-噻酚甲?；?-L-谷氨酸；生長因子抑制劑；細胞周期抑制劑；嵌入(intercalating)抗生素，如多柔比星和博來霉素；蛋白質(zhì)，例如干擾素；以及抗-激素類，例如抗-雌激素類如NolvadexTM(他莫昔芬)，或例如抗-雄激素類如CasodexTM(4′-氰基-3-(4-氟苯基磺?；?-2-羥基-2-甲基-3′-(三氟甲基)丙酰苯胺)。這種結(jié)合治療可能通過對治療的各個成分同時、相繼或單獨給藥的方式達到。
抗血管生成藥物包括MMP-2(基質(zhì)-金屬蛋白酶2)抑制劑、MMP-9(基質(zhì)-金屬蛋白酶9)抑制劑及COX-II(環(huán)氧化酶II)抑制劑。可用的COX-II抑制劑實例包括CELEBREXTM(alecoxib)、伐地考昔和羅非考昔。可用的基質(zhì)-金屬蛋白酶抑制劑在WO96/33172(1996年10月24日公開)、WO96/27583(1996年3月7日公開)、歐洲專利申請?zhí)?7304971.1(1997年7月8日提交)、歐汌專利申請?zhí)?9308617.2(1999年10月29日提交)、WO98/07697(1998年2月26日公開)、WO98/03516(1998年1月29日公開)、WO98/34918(1998年8月13日公開)、WO98/34915(1998年8月13日公開)、WO98/33768(1998年8月6日公開)、WO98/30566(1998年7月16日公開)、歐洲專利公開號606,046(1994年7月13日公開)、歐洲專利公開號931,788(1999年7月28日公開)、WO90/05719(1990年5月331日公開)、WO99/52910(1999年10月21日公開)、WO99/52889(1999年10月21日公開)、WO99/29667(1999年6月17日公開)、PCT國際申請?zhí)朠CT/IB98/01113(1998年7月21日提交)、歐洲專利申請?zhí)?9302232.1(1999年3月25日提交)、英國專利申請?zhí)?912961.1(1999年6月3日提交)、美國專利申請?zhí)?0/148,464(1999年8月12日提交)、美國專利5,863,949(1999年1月26日授權(quán))、美國專利5,861,510(1999年1月19日授權(quán))以及歐洲專利公開780,386(1997年6月25日公開)中被描述，所有這些在此整體引入作為參考。優(yōu)選的MMP-2及MMP-9抑制劑為那些對MMP-1具有很小或無抑制活性的化合物。更優(yōu)選的為那些選擇性抑制MMP-2和/或MMP-9，相對于其它基質(zhì)-金屬蛋白酶(即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12及MMP-13)。
MMP抑制劑的實例包括AG-3340、RO 32-3555、RS 13-0830以及下列引用的化合物
3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；鵠-(1-羥基氨基甲酰基-環(huán)戊基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-8-氧雜-雙環(huán)「3.2.1]辛烷-3-羧酸羥基酰胺；(2R，3R)1-[4-(2-氯-4-氟-芐氧基)-苯磺?；鵠-3-羥基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羥基酰胺；4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-四氫-吡喃-4-羧酸羥基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；鵠-(1-羥基氨基甲?；?環(huán)丁基)-氨基]-丙酸；4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-四氫-吡喃-4-羧酸羥基酰胺；3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-四氫-吡喃-3-羧酸羥基酰胺；(2R，3R)-(4-氟-2-甲基-芐氧基)-苯磺?；鵠-3-羥基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羥基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羥基氨基甲?；?1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；鵠-(4-羥基氨基甲酰基-四氫-吡喃-4-基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰胺基]-8-氧雜-雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸羥基酰胺；3-內(nèi)-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-8-氧雜-雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸羥基酰胺；和3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-四氫-呋喃-3-羧酸羥基酰胺及其可藥用鹽、溶劑合物和前藥。
信號轉(zhuǎn)導抑制劑的實例包括抑制EGFR(表皮生長因子受體)反應(yīng)的藥物，如EGFR抗體、EGF抗體和EGFR抑制劑分子；VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)抑制劑；和erbB2受體抑制劑，如與erbB2受體結(jié)合的有機分子或抗體，例如HERCEPTINTM(Genentech，Inc.of South San Francisco，California，USA)。
EGFR抑制劑在例如WO95/19970(1995年7月27日公開)、WO98/14451(1998年4月9日公開)、WO98/02434(1998年1月22日公開)以及美國專利5,747,498(1998年5月5日授權(quán))中被描述。EGFR抑制藥劑包括，但不限于單克隆抗體C225和抗-EGFR 22Mab(ImClone Systems Co.ofNewyork，Newyork，USA)、化合物ZD-1839(AstraZeneca)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、MDX-447(Medarex Inc.of Annandale，NewJersy，USA)及OLX-103(Merck & Co.of Whitehouse Station，New Jersy，USA)、VRCTC-310(Ventech Research)以及EGF融合毒素(Seragen Inc.ofHopkinton，Massachusetts)。
VEGF抑制劑，例如SU-5416和SU-6668(Sugen Inc.of South SanFrancisco，Califomia，USA)，也可與式1化合物聯(lián)合用藥或同時給藥。VEGF抑制劑在例如WO99/24440(1999年5月20日公開)、PCT國際申請PCT/IB99/00797(1999年5月3日提交)、WO95/21613(1995年8月17日公開)、WO99/61422(1999年12月2日公開)、美國專利5,834,504(1998年11月10日授權(quán))、WO98/50356(1998年11月12公開)、美國專利5,883,113(1999年3月16日授權(quán))、美國專利5,886,020(1999年3月23日授權(quán))、美國專利5,792,783(1998年8月11日授權(quán))、WO99/10349(1999年3月4日公開)、WO97/32856(1997年9月12日公開)、WO97/22596(1997年6月26日公開)、WO98/54093(1998年12月3日公開)、WO98/02438(1998年1月22日公開)、WO99/16755(1999年4月8日公開)和WO98/02437(1998年1月22日公開)中被描述，所有這些在此整體引入作為參考。一些特異性VEGF抑制劑的其它實例為IM862(Cytran Inc.of Kirkland，Washington，USA)；抗-VEGF單克隆抗體貝伐單抗(Genentech，Inc.of South San Francisco，Califomia)；angiozymeTM，一種由Ribozyme(Boulder，Colorado)和Chiron(Emeryville，Califonia)公司合成的核酶。
ErbB2受體抑制劑，如GW-282974(Glaxo Wellcome plc)、單克隆抗體AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.of The Woodlands，Texas，USA)及2B-1(Chiron)可與式1化合物聯(lián)合給藥。這些ErbB2抑制劑包括在WO98/02434(1998年1月22日公開)、WO99/35146(1999年7月15日公開)、WO99/35132(1999年7月15日公開)、WO98/02437(1998年1月22日公開)、WO97/13760(1997年4月17日公開)、WO95/19970(1995年7月27日公開)、美國專利5,587,458(1996年12月24日授權(quán))及美國專利5,877,305(1999年3月2日授權(quán))中描述的那些抑制劑，所有這些在此整體引入作為參考。可用于本發(fā)明的ErbB2受體抑制劑也在1999年1月27日提交的美國臨時申請?zhí)?0/117,341和1999年1月27日提交的美國臨時申請?zhí)?0/117,346中被描述，二者在此整體引入作為參考。
其它可用的抗增殖藥物包括法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑和酪氨酸激酶受體PDGFr抑制劑，包括在下列美國專利申請中公開和要求專利保護的化合物09/221946(1998年12月28日提交)；09/454058(1999年12月2日提交)；09/501163(2000年2月9日提交)；09/539930(2000年3月31日提交)；09/202796(1997年5月22日提交)；09/384339(1999年8月26日提交)；09/383755(1999年8月26日提交)；以及在下列美國臨時專利申請中公開和要求專利保護的化合物60/168207(1999年11月30日提交)；60/170119(1999年12月10日提交)；60/177718(2000年1月21日提交)；60/168217(1999年11月30日提交)；以及60/200834(2000年5月1日提交)。前述各專利申請和臨時專利申請在此整體引入作為參考。
式1化合物也可聯(lián)用其它藥物用于治療細胞異常生長或癌癥，這些藥物包括，但不限于能增強抗腫瘤免疫反應(yīng)的藥物，如CTLA4(細胞毒性淋巴球抗原4)抗體，和其它能阻滯CTLA4的藥物；以及抗增殖藥物如其它法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑。能用于本發(fā)明的特異性CTLA4抗體包括在美國臨時申請60/113,647(1998年12月23日提交)中描述的那些抗體，該專利在此整體引入作為參考。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥用組合物，包括式1化合物或其可藥用鹽、溶劑合物或前期藥，以及治療有效量的多西紫杉醇。
在另一實施方案中，本發(fā)明通過對哺乳動物施用式1化合物或其可藥用鹽、溶劑合物或前藥以及治療有效量的多西紫杉醇，提供了一種治療哺乳動物包括人的細胞異常生長的方法。式1化合物和多西紫杉醇可分開使用或在同一組合物中使用，還可根據(jù)需要，以相同或不同給藥方案使用。
定義此處所用的“細胞異常生長”，除非另外說明，指不受正常調(diào)節(jié)機制調(diào)控(例如，失去接觸抑制)的細胞生長。它包括以下的異常生長(1)通過表達突變的酪氨酸激酶或超量表達受體酪氨酸激酶增殖的腫瘤細胞(腫瘤)；(2)其他增殖性疾病的良性和惡性細胞，其中出現(xiàn)異常酪氨酸激酶激活；以及(4)通過受體酪氨酸激酶增殖的任何腫瘤。
此處所用的術(shù)語“治療”，除非另外說明，指逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制此術(shù)語應(yīng)用的疾病或狀態(tài)，或該疾病或狀態(tài)的一或多種癥狀的進展，或預(yù)防該疾病或狀態(tài)。此處所用的術(shù)語“治療”，除非另外說明，指緊接上述“治療”所指的治療行為。
此處所用的術(shù)語“可藥用鹽”，除非另外說明，包括可存在于化合物的酸性或堿性基團的鹽。本質(zhì)上堿性化合物可與各種無機和有機酸形成各種鹽。可用于制備這些堿性化合物的可藥用酸性加成鹽的酸為可形成無毒酸性加成鹽的那些酸，所述的鹽即，包含可藥用陰離子的鹽，如乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、硼酸鹽、溴化物、依地酸鈣、右旋樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、克拉維酸鹽、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、依地酸鹽、edislyate、丙酸酯月桂硫酸鹽(estolate)、乙磺酸鹽、乙基琥珀酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、醣酵對氨基苯胂酸鹽(glycolylarsanilate)、hexylresorcinate、海蔥次苷、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸、isothionate、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、粘液酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽(恩波酸鹽)、棕櫚酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、堿式乙酸鹽、琥珀酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽(teoclate)、對甲苯磺酸鹽、triethiodode和戊酸鹽。
此處所用的術(shù)語“前藥”，除非另外說明，指藥物的前體化合物，其給藥后，通過一些化學或生理過程在體內(nèi)釋放出藥物(例如，一旦被帶到生理pH值，前藥就轉(zhuǎn)變成所需要的藥物形式)。
本發(fā)明還包含同位素標記的化合物，其與式1中列舉的那些化合物相同，除一個或多個原子被原子量或質(zhì)量數(shù)不同于自然界中常見的原子量或質(zhì)量數(shù)的原子取代。引入本發(fā)明化合物的同位素實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分別如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31p、32p、35S、18F和36Cl。本發(fā)明化合物及其前藥，及包含前述同位素和/或其它原子同位素的所述化合物或所述前藥的可藥用鹽和溶劑合物，都在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明中一些同位素標記的化合物，例如，引入了放射性同位素如3H和14C的那些化合物，可用于藥物和/或底物在組織中的分布實驗。特別優(yōu)選氚，即3H和C-14，即14C同位素，由于其易于制備和測定。此外，以較重的同位素如氘，即2H取代可產(chǎn)生一些更好的治療優(yōu)點，該優(yōu)點源于更大的代謝穩(wěn)定性，例如體內(nèi)半衰期增加或所需劑量減少，從而使其在一些情況下被優(yōu)選。本發(fā)明中同位素標記的式1化合物及其前藥通常以上述制備未標記化合物的方法制備，以易得的同位素標記試劑取代非同位素標記試劑。
附圖概述

圖1表示在狗口服單劑14C標記的化合物后確定的式1化合物的代謝物。
圖2表示在小鼠口服單劑14C標記的化合物后確定的式1化合物的代謝物。
發(fā)明詳述式1化合物可以美國專利號6,531,491和6,534,524(分別于2003年3月11日和2003年3月18日授權(quán))描述的方法制備，兩者在此整體引入作為參考?？砂幢绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法制備一些原料及作一些合成上的修改。
式1化合物可與各種無機或有機酸形成各種不同的鹽。盡管給藥哺乳動物的這些鹽必須可藥用，在實踐中，通常仍然需要首先將式1化合物以不可藥用鹽從反應(yīng)混合物中分離，然后以堿性試劑處理簡單地將后者再轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x堿化合物，然后將游離堿轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N可藥用酸的加成鹽。本發(fā)明的堿性化合物的酸加成鹽化合物很易制備，即在含水溶性介質(zhì)或合適的有機溶劑如甲醇或乙醇中，以基本等當量的精選無機酸或有機酸處理堿性化合物。小心地濃縮溶劑，很易制備所需的固體鹽。通過向溶于有機溶劑的游離堿溶液加入合適的無機酸或有機酸，所需的酸加成鹽也可從溶液中沉淀出來。
式1化合物的給藥受任何可使化合物遞送到作用部位的方法影響。這些方法包括口腔途徑、十二指腸內(nèi)途徑、腸胃外注射(包括靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、血管內(nèi)或輸注)、局部以及直腸使用。
例如，化合物可制成適于口腔給藥的形式如片劑、膠囊，丸劑、粉劑、緩釋制劑、溶液、懸液，或適于腸胃外注射給藥的形式如無菌溶液、懸液或乳劑，或適于局部給藥的形式如軟膏或乳膏，或適于直腸給藥的形式如栓劑。化合物可制成適于單次精確給藥的單位劑型。優(yōu)選地，劑型包括常規(guī)的藥學載體或輔料及式1化合物作為活性成分。此外，劑型可包括其它醫(yī)用或藥用試劑、載體、佐劑等。
腸胃外給藥形式的例子包括溶液或無菌水懸液，例如，丙二醇或葡萄糖溶液。必要時，這些劑型進行適當?shù)木彌_。
合適的藥學載體包括惰性稀釋劑或填料、水和各種有機溶劑。必要時，藥學組合物可包含其它成分，如調(diào)味劑、粘合劑、輔料等。因此，口服給藥的包含各種成分如檸檬酸的片劑，可與各種崩解劑如淀粉、藻酸及一些復(fù)合硅酸鹽以及粘合劑如蔗糖、凝膠和阿拉伯膠同時給藥。此外，諸如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉和滑石粉的潤滑劑常用于片劑制備。類似的固體組合物也可用于填充軟或硬明膠膠囊。因此，優(yōu)選的材料包括乳糖或奶糖和高分子量聚乙二醇。當水懸液或酏劑需要經(jīng)口給藥時，其中活性化合物可與各種增甜劑或調(diào)味劑、色素以及，必要時，乳化劑或懸浮劑、稀釋劑如水、乙醇、丙二醇、丙三醇或其組合物聯(lián)合給藥。
在本發(fā)明劑型的優(yōu)選實施方案中，劑型為口服劑型，更優(yōu)選為片劑或膠囊。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，式1化合物口服給藥，如，例如此處所述的口服劑型。
本發(fā)明的方法包括給藥任何所需劑量的式1化合物。在一個具體的實施方案中，化合物每日一次(quaque die，或QD)，優(yōu)選每日2次(bis in die，或BD)，盡管本發(fā)明范圍包括更多次或更少次的給藥?；衔锟捎糜诓溉閯游?，包括人，優(yōu)選在禁飲食狀態(tài)(在用藥前后2小時內(nèi)不進食或者飲料)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，給藥方式為每日兩次、禁飲食。
對本領(lǐng)域研究人員而言，制備一定量的式1化合物的各種劑型的方法已知或很明顯。例如，見Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easter，Pa.，15th Edition(1975)。
AUC血漿值可通過直接測定式1化合物或其活性代謝物在不同時間間隔的血漿濃度，例如通過液相-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)，并計算血漿濃度與時間的曲線下面積而測得。計算AUC的合適方法在本領(lǐng)域眾所周知，如，例如給藥梯形近似法AUC(0-i)=Σi=0n-1ti+1-ti2(Ci+Ci+1)]]>
其中n為數(shù)據(jù)點數(shù)，t1和c1為第i個數(shù)據(jù)點的時間和濃度(x和y值)。24小時AUC值可根據(jù)給藥方案校正測得的血漿濃度確定。亞硫酸氫鈉作為穩(wěn)定劑加入重建的溶液中用于制備濃度標準。
式1化合物具有與調(diào)節(jié)和/或抑制激酶活性相關(guān)的有利特性，該激酶活性與VEGF-R、FGF-R、CDK復(fù)合物、CHK1、CSF-R和/或LCK相關(guān)。
如下述實施例所示，式1化合物在體外可誘導HUVEC凋亡，抑制HUVEC中VEGF介導的Akt和eNOS磷酸化，證實停用化合物后在HUVEC中對VEGFR-2的持久抑制作用，并抑制PDGF BB誘導的在基質(zhì)蛋白質(zhì)纖連蛋白上的癌細胞遷移。式1化合物通過抑制腫瘤的遷移和侵襲，從而具有阻止PDGFR誘導的腫瘤進程的活性。
當與TaxolTM，更優(yōu)選多西紫杉醇聯(lián)合時，式1化合物還顯示了更有效的腫瘤生長抑制活性。在聯(lián)合治療中觀察到比藥物單用時更顯著的腫瘤消退。
本發(fā)明通過使用式1化合物，進一步涉及例如在哺乳動物組織中調(diào)節(jié)或抑制蛋白激酶活性的方法。本發(fā)明化合物作為蛋白激酶活性如激酶活性的調(diào)節(jié)劑的活性，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已有的任何方法測定，包括體內(nèi)和/或體外實驗。適于測定活性的的實驗的實例包括在Parast C.等，BioChemistry，37，16788-16801(1998)；Jeffrey等，Nature，376，313-320(1995)；WIPO國際公開號WO97/34876和WIPO國際公開號WO96/14843中所述的那些實例。這些特性可被評價，例如，通過使用一或多種下述實施例中的生物學實驗方法。
下述實施例和制備進一步闡明和例證了本發(fā)明的劑型和方法。應(yīng)當理解為，本發(fā)明的范圍不受下述實施例范圍的限制。
實施例1式1化合物被用于測定(1)數(shù)種方案的體內(nèi)效力sid，周末不給藥及間歇給藥；(2)在異種移植模型中與多西紫杉醇聯(lián)合給藥時的效力；(3)體外內(nèi)皮細胞的eNOS和Akt磷酸化；(4)細胞物中及體內(nèi)一氧化氮及相關(guān)產(chǎn)物的濃度以及(5)將全血細胞中的c-Kit信號作為該化合物的潛在的生物標志物。
生物學測試；酶實驗由生長因子如VEFG、FGF及其它因子刺激的細胞增殖依賴于各自相應(yīng)受體酪氨酸激酶自身磷酸化的誘導。因此，蛋白激酶抑制劑阻斷這些因子誘導細胞增殖的能力與其阻斷受體自身磷酸化的能力直接相關(guān)。為測定化合物的蛋白激酶抑制活性，設(shè)計了下述構(gòu)造構(gòu)建體。
供測定的VEGF-R2構(gòu)建體該構(gòu)建體測定受試化合物抑制酪氨酸激酶活性的能力。將人血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGF-R2)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的一個構(gòu)建體(VEGF-R2Δ50)在桿狀病毒/昆蟲細胞系統(tǒng)中表達，其缺乏激酶插入結(jié)構(gòu)域68個殘基中的50個位于中央的殘基。在VEGF-R2全長的1356個殘基中，VEGF-R2Δ50包含806-939、990-1171殘基以及激酶插入結(jié)構(gòu)域中相對于野生型VEGF-R2的一個點突變(E990V)。純化的構(gòu)建體在3mM ATP和40mM MgCl2的條件下，4μM濃度的酶在含5％甘油、5mMDTT、pH 7.5的100mM HEPES中4℃溫育2小時，完成自身磷酸化。自身磷酸化后，該構(gòu)建體顯示出催化活性，其活性基本相當于自身磷酸化的野生型激酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體。參見Parast等，Biochemistry，37，16788-16801(1998)。
供測定的FGF-R1構(gòu)建體以桿狀病毒載體表達系統(tǒng)表達人FGF-R1的細胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，包括內(nèi)源的蛋氨酸殘基456至谷氨酸766，殘基按照Mohammadi等，Mol Cell.BioL，16，977-989(1996)的殘基編號系統(tǒng)進行編號。此外，該構(gòu)建體還具有下列3個氨基酸取代L457V、C488A和C584S。
供測定的LCK構(gòu)建體在昆蟲細胞中將LCK酪氨酸激酶表達為N-端刪除，包括氨基酸殘基223至該蛋白質(zhì)末端殘基509，在N-端具有下列2個氨基酸取代P233M和C224D。
供測定的CHK-1構(gòu)建體以桿狀病毒/昆蟲細胞系統(tǒng)表達C-端His標記的人全長CHK-1(FL-CHK-1)。在由476個氨基酸組成的人CHK-1的C-末端含有6個組氨酸殘基(6×His-標記)。該蛋白質(zhì)以常規(guī)的層析技術(shù)純化。
供測定的CDK2/細胞周期素A構(gòu)建體以公開的方法(Rosenblatt等，J.Mol.Biol.，230，1317-1319(1993))將CDK2自感染了桿狀病毒表達載體的昆蟲細胞中純化。細胞周期素A從表達全長的重組細胞周期素A的E.coli細胞中純化，并且截短的細胞周期素A構(gòu)建體通過限制性的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生，并以前述方法(Jeffrey等，Nature，376，313-320(1995))純化。
供測定的CDK4/細胞周期素D構(gòu)建體人CDK4與細胞周期素D3的復(fù)合物，或細胞周期素D1與CDK4和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白(GST-CDK4)的復(fù)合物，以常規(guī)的生物化學層析技術(shù)自共感染了相應(yīng)的桿狀病毒表達載體的昆蟲細胞中純化。
VEGF-R2測定偶聯(lián)的分光光度(FLVK-P)測定使用磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)及一個具有丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)的系統(tǒng)，將伴有磷?；D(zhuǎn)移的ATP生成ADP與NADH氧化相偶聯(lián)。NADH的氧化利用Beckman DU 650分光光度計在340nm(e340＝6.22cm-1mM-1)處吸光度的減少測定。磷酸化的VEGF-R2Δ50(下述表格中表示為FLVK-P)的測定條件如下pH為7.5的200mM HEPES含1mM PEP、250μM NADH、50單位LDH/mL、20單位PK/mL、5mM DTT、5.1mM poly(E4Y1)、1mM ATP以及25mM MgCl2。未磷酸化的VEGF-R2Δ50(表格中表示為FLVK)的測定條件如下pH為7.5的200mM HEPES含1mM PEP、250μMNADH、50單位LDH/mL、20單位PK/mL、5mM DTT、20mM poly(E4Y1)、3mM ATP、60mM MgCl2以及2mM MnCl2。測定以5～40nM酶引發(fā)。K1值通過測定不同濃度的受試化合物存在下的酶活性確定。數(shù)據(jù)以EnzymeKinetic and Kaleidagraph軟件分析。
ELISA測定磷酸胃泌素的形成以生物素化的胃泌素肽(1-17)作為底物監(jiān)測。生物素化的磷酸胃泌素以鏈親和素包被的96孔微量滴定板固定，隨后以偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗-磷酸酪氨酸-抗體測定。辣根過氧化物酶的活性以2，2′-連氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6)]二銨鹽(ABTS)測定。典型的測定液包括pH為7.5的200mMHEPES含2μM生物素化的胃泌素肽、5mMDTT、20μM ATP、26mM MgCl2以及2mM MnCl2。實驗以0.8nM磷酸化的VEGF-R2Δ50引發(fā)。辣根過氧化物酶活性以10mM ABTS測定。加酸(H2SO4)終止辣根過氧化物酶反應(yīng)，然后讀405nm下的吸光度。K1值通過測定不同濃度受試化合物下的酶活性確定。數(shù)據(jù)以Enzyme Kinetic and Kaleidagraph軟件分析。
FGF-R測定分光光度測定以上述VEGF-R2的方法進行，僅有下述濃度變化FGF-R＝50nM，ATP＝2mM以及poly(E4Y1)＝15mM。
LCK測定分光光度測定以上述VEGF-R2的方法進行，僅有下述濃度變化LCK＝60nM，MgCl2＝0mM，poly(E4Y1)＝20mM.
CHK-1測定通過丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)的作用，以磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)將ATP生成ADP，該過程伴有磷?；D(zhuǎn)移至合成底物肽Syntide-2(PLARTLSVAGLPGKK)，與NADH氧化相偶聯(lián)。NADH氧化通過下述HP8452分光光度計在340nm(∈340＝6.22cm-1mM-1)吸光度的減少測定。典型的檢測液包括pH為7.5的50mM TRIS包括4m NPEP、0.15mM NADH、28單位LDH/mL、16單位PK/mL、3mM DTT、0.125mM Syntide-2、0.15mMATP、25mM MgCl2以及400mM NaCl。測定以10nM FL-CHK-1引發(fā)。K1值通過測定不同濃度受試化合物下的酶活性確定。數(shù)據(jù)以Enzyme Kineticand Kaleidagraph軟件分析。
HUVEC增殖測定本測定確定受試化合物抑制生長因子刺激人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(″HUVEC″)增殖的能力。將HUVEC細胞(3-4代，Clonetics，Corp.)于T75培養(yǎng)瓶中的EGM2培養(yǎng)基(Clonetics Corp)中解凍。24小時后向培養(yǎng)瓶中加入新鮮的EGM2培養(yǎng)基。4～5天后，將細胞置于另一種培養(yǎng)基中(補加10％胎牛血清(FBS)、60μg/mL內(nèi)皮細胞生長添加劑(ECGS)及10μg/m肝素的F12K培養(yǎng)基)。然后將指數(shù)生長的HUVEC細胞用于后述實驗。將1～1.2萬個HUVEC細胞置于裝有100μL營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基(上述)的96孔板中。細胞在培養(yǎng)基中貼壁24小時。然后吸取去除培養(yǎng)基，并向每孔加入115μL饑餓培養(yǎng)基(F12K+1％FBS)。18小時后，將溶解受試藥物的15μL含1％ DMSO的饑餓培養(yǎng)基或單一饑餓培養(yǎng)基加入至每個處理孔中；DMSO的終濃度為0.1％。1小時后，將20μl含150ng/mL hrVEGF165的饑餓培養(yǎng)基加入所有孔中，除未處理的對照組以外；VEGF的終濃度為20ng/mL。72小時后，以MTT染料還原對細胞增殖量化，處理時，將細胞置于MTT(Promega Corp.)中4-5小時。加入終止溶液(Promega Corp.)終止Dye還原，自96-孔分光光度計平板讀數(shù)器確定570和630nm的吸光度。
癌細胞增殖(MV522)測定為確定蛋白激酶抑制劑在治療癌癥時是否有效阻斷血管生成時，證實該抑制劑在不表達激酶受體的細胞中并不是非特異地阻斷細胞增殖是至關(guān)重要的。其通過癌細胞的增殖測定完成。評價癌細胞增殖的方法與評價HUVEC細胞增殖的方法相似。將2000個肺癌細胞(MV522細胞系，從UCSD獲得)接種于生長培養(yǎng)基(補加2mM谷氨酰胺和10％ FBS的RPM11640培養(yǎng)基)中。細胞貼壁1天后加入受試藥物和/或溶媒。
同時以在HUVEC測定中使用的相同受試藥物處理細胞。接觸受試藥物72小時后用MTT染料還原量化細胞增殖。
C-Kit強度測定使用NCI-H526(ATCC)細胞測定抑制劑抗c-Kit的強度。細胞生長至接近融合時，將其于饑餓培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時。加入抑制劑，將細胞置于存在2.3％白蛋白和1mM Na3VO4(Sigma)的條件下37℃溫育45分鐘。將SCF，即c-Kit生長因子以50ng/mL的終濃度加入培養(yǎng)基中。5分鐘后，以預(yù)冷的PBS沖洗2次，再用裂解緩沖液(50mM Tris、150mM NaCl、1mM PMSF、1％ NP40、1mM Na3VO4及蛋白酶抑制劑的混合物)裂解。免疫沉淀以1mg的每種裂解物總蛋白與4μg/mL CD117ab-3(K45，Neomarkers)在4℃溫育過夜完成。次日早上將抗體復(fù)合物與蛋白A珠狀物連接。SDS PAGE及Western Blot分析，使用磷酸化受體的抗磷酸酪氨酸抗體4G10(Upstate Biotechnology)或抗-c-Kit受體的抗體sc-1493(C-14，SantaCruz)完成，濃度為1∶1000。印跡以化學發(fā)光試劑ECL Plus顯色。phosphorimager(Storm846，Molecular Dynamics)用于對印跡中的信號定量。
動物和哺乳動物總外周血細胞中的c-kit陽性細胞數(shù)減少可作為式1化合物活性的一種生物標志物。
eNOS和Akt磷酸化測定HUVEC(Clonetics)用于測定抑制劑抑制eNOS和Akt的效力。細胞生長至接近融合時，將其于饑餓培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時。加入抑制劑，細胞于存在2.3％白蛋白和1mM Na3VO4(Sigma)的條件下37℃溫育45分鐘。將VEGF加入培養(yǎng)物中，濃度為50ng/mL。5分鐘后，以預(yù)冷的PBS沖洗2次，再以裂解緩沖液(50mM Tris，150mM NaCl、1mM PMSF、1％ NP40、1mM Na3VO4及蛋白酶抑制劑的混合物)裂解。以Western方法分析30-40μg總蛋白。eNOS和Akt的磷酸化通過使用磷酸-eNOS(Ser1177)#9571或磷酸-Akt(Ser473)#9271抗體(均來自Cell signaling)評價。蛋白質(zhì)檢測通過使用NOS3(C-20)sc-654(Santa Cruz)或Akt抗體#9272(Cell Signaling)完成。所有測定都需要連接了第二抗體的抗兔HRP，濃度為1∶3000。印跡以化學發(fā)光底物Super Signal West Dura(Pierce)顯色。AlphaInnotech公司的Alpha Imager8800用于對印跡中的信號定量。
小鼠PK測定藥物在小鼠中的藥代動力學(例如，吸收和排泄)用下述實驗進行分析。將受試化合物在0.5％ CMC溶媒中制成懸液或在30∶70(PEG400∶酸化的H2O)溶媒中制成溶液。該懸液或溶液通過口服(p.o.)或腹膜內(nèi)注射(i.p.)于C3H雌小鼠(n＝4)。在時間點0小時(給藥前)、給藥后0.5小時、1.0小時、2.0小時及4.0小時通過眼窩放血收集血樣本。以2500rpm離心5分鐘，自每個樣本中獲得血漿。以有機蛋白沉淀方法自血漿中提取受試化合物。將每次放血得到的50μL血漿與1.0mL乙腈混合，渦旋2分鐘，然后4000rpm離心15分鐘沉淀蛋白質(zhì)，萃取受試化合物。然后，乙腈上清液(包含受試化合物的萃取液)倒入新試管中，于25℃熱板上以N2蒸發(fā)。向含有干燥受試化合物的萃取物試管中加入125μl流動相(60∶40，0.025MNH4H2PO4+2.5mL/L TEA∶乙腈)。受試化合物通過渦旋重新懸浮于流動相中，4000rpm離心5分鐘再除去更多蛋白質(zhì)。將各樣本倒入HPLC小管中，在具有UV檢測的Hewlett Packard1100系列HPLC上作受試化合物分析。從各樣本中取95μL注入150×3.2mm的Phenomenex-Prodigy反相C-18柱上，并以45-50％乙腈梯度洗脫10分鐘。血漿中受試化合物的濃度(ug/mL)通過與標準曲線(峰面積vs.濃度ug/mL)比較確定，該曲線以上述方法從血漿樣本中提取的受試化合物的已知濃度繪制。與標準及未知一起，進行了三組質(zhì)控(0.25ug/mL、1.5ug/mL及7.5ug/mL)(n＝4)以確保分析的一致性。標準曲線的R2＞0.99，所有質(zhì)控組均在其期望值的10％以內(nèi)。定量的測試樣本以Kaleidagraph軟件繪圖顯示，其藥代動力學參數(shù)以WIN NONLIN軟件確定。
人肝臟微粒體(HLM)測定人肝臟微粒體中化合物的代謝以下述LC-MS分析測定方法檢測。首先，將肝臟微粒體(HLM)解凍并用預(yù)冷的100mM磷酸鉀(KPO4)緩沖液稀釋至5mg/mL。將適量KPO4緩沖液、NADPH-再生溶液(含B-NADP，葡萄糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及MgCl2)以及HLM置于13×100mm玻璃管中37℃預(yù)溫育10分鐘(每種受試化合物3管-3重)。將受試化合物(終濃度為5μM)加入各管中啟動反應(yīng)，以溫和的渦旋攪拌，然后于37℃溫育。在t＝0和2h時，從各溫育管中取出250μL樣本至不同的12×75mm玻璃管中，管中含有1mL冰冷的乙腈，包含0.05μM利血平。將樣本在4000rpm離心20分鐘以沉淀蛋白質(zhì)及鹽(Beckman Allegra 6KR，S/N ALK98D06，#634)。將上清液轉(zhuǎn)移至新的12×75mm玻璃管中，以Speed-Vac旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀濃縮。將樣本重新置于200μL 0.1％甲酸/乙腈(90/10)中并劇烈渦旋至溶解。然后將樣本轉(zhuǎn)移至不同的聚丙烯微型離心管中，在14000×g下離心10分鐘(Fisher Micro14，S/NM0017580)。對于各個時間點(0和2h)的重復(fù)實驗樣品(#1-3)，將各受試化合物可分量的樣本合并入一個HPLC管中(共6個樣本)中用于LC-MS分析，如下所述。
將合并的化合物樣本注入LC-MS系統(tǒng)，該系統(tǒng)由Hewlett-PackardHP 1100二極管陣列HPLC和一個Micromass Quattro II triple quadruple質(zhì)譜儀組成，該質(zhì)譜儀以正電噴霧SIR模式運行，該模式特定用于掃描各種受試化合物分子的離子。將各受試化合物在各個時間點的峰集中。對各化合物各個時間點(n＝3)的峰面積求平均數(shù)，2h處的平均峰面積除以0h處的平均峰面積得受試化合物在2h處的剩余百分數(shù)。
體外HUVEC凋亡測定用ELISA對凋亡定量HUVEC細胞凋亡用Cell Death Detection ElisaPLUS(catalog # 1775425，Roche Biochemicals，曼海姆，德國)測定，其定量細胞裂解物中與組蛋白相連的胞質(zhì)內(nèi)DNA片段。該步驟對操作說明書稍作修改。簡言之，饑餓的HUVEC細胞以含有VEGF(20ng/mL)的不同濃度化合物A處理。在不同時間點收集細胞的胞質(zhì)成分，在夾心的ELISA中將其作為抗原，ELISA具有包被于微量滴定板上的抗組蛋白mAb第一抗體及與過氧化物酶連接的抗DNA mAb第二抗體。凋亡細胞數(shù)通過加入顯色過氧化物酶底物后，以分光光度計測定405nm(參考波長490nm)處的吸光度確定。
用TUNEL對凋亡成像凋亡細胞的原位檢測用TdT-介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)技術(shù)完成。簡言之，將生長于8孔Lab-Tek chamber slides的HUVEC細胞饑餓O/N，然后用不同濃度的化合物A處理6h。再將細胞固定于4％多聚甲醛中，以Triton X-100透化處理，然后按照操作說明書以末端轉(zhuǎn)移酶和核苷酸的混合物溫育1h，該核苷酸包括熒光素-dUTP(Deadend Fluorometric TUNEL system，Promega，catalog # G3250)。細胞以碘化丙錠(PI)溶液復(fù)染。被熒光素染色和PI標記的陽性細胞用熒光顯微鏡成像和拍照。
PDGF介導的細胞遷移測定本測定使用U87MG細胞。將包含0.5ng/mL纖連蛋白的6孔板預(yù)溫育過夜。次日將U87MG細胞植入每孔，直至融合。將細胞以含有0.1％ FBS的饑餓培養(yǎng)基溫育過夜。以移液槍吸頭劃一個約1cm的劃痕，用饑餓培養(yǎng)基洗滌細胞。然后將培養(yǎng)板以0.5ng/mL纖連蛋白培養(yǎng)1小時，再次洗滌。加入含有100ng/Ll rhPDGF BB的實驗培養(yǎng)基和化合物A的饑餓培養(yǎng)基。在0～15小時間對細胞拍照，將遷移成像。
細胞內(nèi)VEGFR-2及下游分子磷酸化測定HUVEC(Clonetics)培養(yǎng)接近至融合時，將其于饑餓培養(yǎng)基(F12K加0.1％ FBS)中培養(yǎng)18h。向置于2.3％白蛋白和1mM Na3VO4(Sigma)中的細胞加入化合物A。45分鐘后，向培養(yǎng)基中加入終濃度為50ng/mL的VEGF。5分鐘后，以預(yù)冷的PBS沖洗，再以裂解緩沖液(50mM Tris，150mM NaCl，1mM PMSF，1％ NP40，1mM Na3VO4及蛋白酶抑制劑的混合物)裂解。使用抗-Flk-1C-1158(Santa Cruz)將1mg裂解物總蛋白免疫沉淀。將抗體復(fù)合體與蛋白質(zhì)A珠狀物偶聯(lián)，作SDS PAGE/Westem分析。磷酸化的VEGFR-2和蛋白質(zhì)分別用抗磷酸酪氨酸抗體4G10(Upstate Biotechnology)和抗-Flk-1C-20(Santa Cruz)測定。對于eNOS和Akt，處理細胞的方法同上述。以總量為30-40μg的蛋白質(zhì)完成Westem分析。eNOS和Akt磷酸化以磷酸-eNOS(Ser1177，# 9571)或磷酸-Akt(Ser 473，# 9271)抗體(Cell Signaling)探查。蛋白質(zhì)以NOS3C-20(sc-654，Santa Cruz)或Akt抗體# 9272(Cell Signaling)評價。HRP連接的抗-兔IgG用作第二抗體。所有印跡用化學發(fā)光試劑Super Signal West Dura(Pierce)顯色。用AlphaInnotech的Aipha Imager 8800對信號定量。
褪色實驗以上述方法處理HUVEC細胞。以化合物A(10nM)培養(yǎng)45分鐘后，再以VEGF(50ng/mL)刺激5分鐘，去除上清，洗滌，以含有VEGF和Na3VO4的饑餓培養(yǎng)基替換。在裂解細胞及以免疫沉淀、Westem作磷酸化的總VEGFR-2分析(見上述)之前，將細胞再溫育所需的時間。另一實驗中，在全部時間里如上述以VEGF處理細胞，同樣地，在所需時間點評價總VEGFR-2。褪色時的信號以光密度分析法定量。相互矯正各測定的最大刺激(5分鐘)雖度，比較兩次實驗各時間點的磷酸-VEGFR-2強度，這兩個實驗可確定VEGFR-2磷酸化恢復(fù)情況，恢復(fù)是相對于僅以VEGF刺激處理的細胞。
腫瘤模型對于人MV522(結(jié)腸癌)和MDA-MB-231(乳腺癌)無胸腺小鼠模型(n＝8-12)，植入5×106個細胞/部位(s.c.)；對于鼠科Lewis肺癌模型，以套針將腫瘤碎片(1-2mm2)植入B6D2F1小鼠的右側(cè)。通常從第7天(MV522)或當腫瘤平均大小達到150-200mm3(MDA-MB-231)時開始給藥。
將式1化合物以0.5％ CMC/H2O制備，口服、每日兩次。多西紫杉醇以7％EtOH/3％聚山梨醇酯/90％H2O制備，每周一次靜脈內(nèi)給藥。治療通常持續(xù)3-4周。腫瘤的幾何長度和寬度以電子尺每周測量3次。腫瘤體積為0.4×[長度×(寬度)2]。數(shù)據(jù)記錄為平均值±SEM。研究結(jié)束時，將腫瘤和組織切除、稱量和收集用于分析。收集血漿用于藥物濃度分析。
結(jié)果見表1-3。
表1.化合物1的強度與選擇性
a通過細胞增殖測定檢測；b在2.3％白蛋白的存在條件下以IP/IB測定；nd未測定。
其它已篩選但Ki值超出上述范圍的有cMet、LCK、c-Src、FAK、Pyk2、IRL、BTK、CDK1、CDK2、CDK4、PKA、PKC、PLK及Chk1。
表2 在MDA-MB-231人乳腺癌模型中同時給藥化合物1與多西紫杉醇的研究設(shè)計
a口服，每日兩次；b靜脈注射，每周一次表3 在MDA-MB-231異種移植模型中多西紫杉醇與化合物1的聯(lián)合治療產(chǎn)生更大的抗腫瘤活性
a口服，每日兩次；b靜脈注射，每周一次聯(lián)合給藥組證實腫瘤全部及局部消退的發(fā)生率增加。當藥物聯(lián)合給藥時，腫瘤生長率更大程度地降低。聯(lián)合治療與單一藥物單獨使用具有同等耐受性。
實施例2式1化合物，6-[2-(甲基氨基甲?；?苯硫基]-3-E-[2-(吡啶-2-基)乙烯基]吲唑，以不同劑量給藥于實體瘤患者。以BD或QD給藥，30個患者(13個男性，17個女性)口服式1化合物片劑治療。每個周期為28天。具體的診斷的腫瘤為乳腺癌(11)、甲狀腺癌(5)、腎細胞癌(5)、肺癌(4)及其它癌癥(5)。藥代動力學數(shù)據(jù)以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-MS/MS)測定。在周期的第15天，于用藥后1/2小時、1小時、2小時、4小時、8小時和12小時取血樣本。
藥代動力學結(jié)果(第15天的平均值)如表4所示?；颊卟唤常碛兴?。括號中的數(shù)字為以百分比表示的變異系數(shù)。表中，Cmax為觀察到的式1化合物的最大血漿濃度，AUC(0-24)為24小時的AUC血漿濃度，并且T1/2為由濃度時間曲線確定的半衰期?！?具有PK的患者”項表示獲得藥代動力學數(shù)據(jù)的患者數(shù)。
表4
此外，第一組(n＝6)患者接受了10mg QD至30mg BD(PK未表示)的個體化的劑量。與進食狀態(tài)相比，禁食狀態(tài)下血漿濃度較高(約49％)，患者間變異程度減小。此時，在BD禁食狀態(tài)下的最大耐受劑量(MTD)測定為5mg。在大于MTD劑量時的劑量限制性毒性(DLTs)為高血壓(HTN)、抽搐、肝功能測試升高、胰腺炎、呼吸暫停以及口腔炎。此外，2個對NSCLC有反應(yīng)的患者有嚴重咳血，一個發(fā)生于停藥3周后。還觀察到非劑量限制性的蛋白尿。在劑量少于或等于MTD時，DLT僅為1個患者發(fā)生2級口腔炎。在7/14個患者中觀察到非劑量限制性HTN，用常規(guī)高血壓藥物控制。根據(jù)RECIST標準，在經(jīng)過大量預(yù)處理的5個患者中觀察到2個患者產(chǎn)生持久局部反應(yīng)(在renal call及上頜竇腺樣囊性腫瘤)和持續(xù)超過或等于4個月(4-13+個月的范圍)的穩(wěn)定疾病。使用dceMRI，初步分析了化合物1對21個患者的基線及第2、28、56天時誘導的血管效果。對各索引腫瘤(n＝1-4每個患者)，計算其平均Ktrans的百分比變化(P.S.Tofts，G.Brix，D.L.Buckle，J.L.Evelhoch，E.Henderson，M.V.Knopp，H.B.W.Larsson，T.Lee，N.A.Mayr，G.J.M.Parker，R.E.Port，J.Taylor和R.M.Weisskoff，Estimating KineticParameters from Dynamic Contrast-EnhancedTi-Weighted MRI of a DiffusableTracerStandardized Quantities and Symbols，Journal of Magnetic ResonanceImaging，10223-232(1999))以及對照強度×時間曲線下的起始面積(IAUC)。至第2天時，腫瘤血管反應(yīng)以大于或等于50％基線參數(shù)值確定。在6/18個可評價的患者中觀察到腫瘤血管反應(yīng)的急劇(第2天)下降(Ktrans和IAUC減少量大于或等于50％)，且證實11/18個患者Ktrans和IAUC減少量同時大于或等于40％。由于掃描儀的技術(shù)問題，3/21圖像值不可利用。本實施例表明，通過臨床反應(yīng)和急劇的腫瘤血管變化證實式1化合物為一種具有高度活性的藥物。
實施例3下述將30mg游離堿/kg劑量[14C]-標記的式1化合物通過口服給藥完整或膽管插入導管的比格犬中，觀察各種代謝。生物轉(zhuǎn)化途徑包括氧化(單或雙)、葡萄糖醛酸化(glucuronidation)、葡糖基化以及硫酸鹽化或葡糖基化后的氧化。圖1表示已確定的代謝物。在血漿中，M12(一種N-氧化物)為唯一的可測定代謝物。在尿液中，M5(一種脫吡啶基的羧酸)為主要的代謝物。膽汁中的主要代謝物包括M8(一種硫酸鹽)及M12。排泄物中的主要代謝物M1的化學結(jié)構(gòu)未知。
比格犬口服單劑量化合物后[14C]衍生的放射性排泄模式在雌雄個體中相似，放射性主要通過糞便排泄。其在完整雄性個體糞便及尿液中的平均回收率分別為85.5％和5.3％，而在完整雌性個體糞便和尿液中的回收率分別為80.9％和7.0％。膽管插入導管的雄犬膽汁中分泌相對較小的放射性(回收率為8.3％)，其它放射性在糞便(52.7％)和尿液(11.3％)中回收。膽管插入導管的犬尿液和膽汁中的放射性總量表明，約20％的放射性經(jīng)過胃腸吸收。完整雄性、雌雄個體及膽管插入導管的雄性個體的所有樣本總平均回收率分別為92.4％、92.6％和89.6％。所有代謝物的定性及結(jié)構(gòu)解析以配有放射-HPLC的檢測器(β-RAM)、陽極或陰極模式具有電噴霧(ESI)和大氣壓化學電離源(APCI)的MS檢測完成。
實施例4CD-1小鼠口服單劑量[14C]標記的式1化合物經(jīng)過了各種代謝。在尿液和糞便中回收到低百分比的原形藥物，并觀察到各種I相及II相代謝物。生物轉(zhuǎn)化途徑包括氧化(單或雙)、葡萄糖醛酸化、葡糖基化以及氧化后的葡萄糖醛酸化或葡糖基化。這些確定的代謝物如圖2所示。在血漿中，原形藥物及M12(一種N-氧化物)為兩種主要成分。M7(一種葡萄糖醛酸甙)為尿液及糞便中的最重要代謝物。
雄性CD-1小鼠單次口服50mg游離堿/kg劑量的[14C]AG-013736后，在糞便中回收到大部分[14C]放射性1。給藥后48小時，糞便和尿液中放射性(％劑量)的平均(n＝2)回收率分別為65.8％和12.7％。排泄物中放射性排泄迅速，給藥后24小時內(nèi)回收到約72％的劑量。代謝物的定性和結(jié)構(gòu)解析以LC-RAM-MS方法完成。
除圖1和2中表示的代謝物外，其它已知的代謝物包括式1a所示的活性去甲基代謝物。
實施例5血管生成使用免疫組織化學測定腫瘤微血管密度(MVD)評價。將冷凍的腫瘤部分的血管表面標志物CD-31染色，手工計數(shù)該組織切片的數(shù)個視野內(nèi)的血管數(shù)。研究證實，與對照腫瘤相比，每日兩次口服式1化合物2～3周后，經(jīng)治療的腫瘤中的血管數(shù)減少了70％。包括LLC、MV522及M24met的所有腫瘤模型中治療后觀察到微血管密度減小。當在LLC腫瘤模型中使用Alzet滲透泵連續(xù)遞送時，式1化合物產(chǎn)生顯著的生長抑制。3項研究數(shù)據(jù)表明，該藥物在LLC模型中可達到78％的最大腫瘤生長抑制。在血漿濃度低至55±17ng/mL(N＝3)時，最大生長抑制可達到90％。該濃度被定為生物活性濃度(BAC)。28±11ng/mL(N＝3)的血漿濃度產(chǎn)生50％最大生長抑制。該濃度被定為最小有效濃度(MEC)。在一個研究組中，通過連續(xù)輸注化合物形成574ng·小時/mL的AUC(0-24)產(chǎn)生70％的MGI，然而在同一個研究中，每日口服兩次后形成720ng·小時/mL的AUG(0-24)產(chǎn)生40％最大生長抑制(MGI。這些結(jié)果表明，在該模型中觀察到槽形的化合物濃度-抗腫瘤效力，在小鼠中，連續(xù)低濃度的化合物可能足夠產(chǎn)生最大抗腫瘤效力。
在人乳腺癌異種移植模型MDA-MB-231中，式1化合物單一使用有效。為準備式1化合物與多西紫杉醇在此模型中聯(lián)合使用的有效性研究，在裸小鼠中進行了初步研究以確定潛在的藥物-藥物相互作用對PK和耐受性的影響。每周一次，共3周靜脈注射使用15或30mg/kg多西紫杉醇后，確定多西紫杉醇處理動物的體重比對照降低(分別為7％和11％)。多西紫杉醇單獨處理和多西紫杉醇聯(lián)合式1化合物(30mg/kg/天，共16天；口服)聯(lián)合處理的動物在體重方面無差異。使用多西紫杉醇不影響式1化合物的AUC，然而，與單獨使用式1化合物相比，聯(lián)合組中AG-013736的Cmax值顯著減小。
選定組織(肝臟、腎臟、心臟、脾、胃、小腸、大腸、卵巢、胸骨、關(guān)節(jié))的組織學檢驗顯示，在本研究中，單用式1化合物處理小鼠無靶器官效應(yīng)。在多西紫杉醇處理小鼠中觀察到的變化包括卵巢的卵泡壞死及最小或輕微的骨髓細胞減少。式1化合物與多西紫杉醇聯(lián)合治療不會加劇多西紫杉醇對卵巢的作用，但式1化合物/多西紫杉醇聯(lián)合處理的動物骨髓細胞減少強度增加(最小或中等)。此外，在聯(lián)合處理動物中觀察到骨髓出血，很可能是細胞減少強度增加的次級效應(yīng)。
在MDA-MB-231腫瘤模型中，式1化合物與多西紫杉醇聯(lián)合用于效力評價。式1化合物(25、5及1mg/kg，口服，BD，給藥3周)單獨產(chǎn)生劑量依賴性的腫瘤生長抑制。20、10mg/kg而不是2mg/kg的多西紫杉醇(IV，每周)單獨使用也有效。似乎在式1化合物與多西紫杉醇之間可能具有一種有益的治療相互作用。當以高劑量或中等劑量聯(lián)合用藥時，這種增益更加明顯。在相同劑量下，高劑量或中等劑量的聯(lián)合使用引起腫瘤局部消退(腫瘤體積減小16％～97％)和完全消退的發(fā)生率遠遠大于藥物單獨使用時的發(fā)生率。由于測定組數(shù)有限且研究時間相對較短，故此發(fā)現(xiàn)還不確切。式1化合物在所有劑量下均具有很好的耐受性。在高劑量聯(lián)合組(25mg/kg化合物1及20mg/kg多西紫杉醇)中，化學治療藥物給藥3次后，與其它所有組相比，平均體重下降3％～7％。藥代動力學分析證實，式1化合物的AUC值在多西紫杉醇存在時不受影響，但與單獨使用式1化合物組相比，聯(lián)合組中的Cmax值顯著減小。
在LLC模型中研究了式1化合物與多西紫杉醇聯(lián)合時的抗腫瘤效力。LLC模型對多西紫杉醇高度耐藥。在報道的MTD(30mg/kg的劑量，每周一次，iv)下，在細胞毒藥物中沒有觀察到腫瘤生長延遲(TGD)(TGD＝3.2天)。由于大的原發(fā)性腫瘤，所有小鼠在測定的28天內(nèi)被實施安樂死。相反，單用式1化合物產(chǎn)生劑量依賴性的、具有統(tǒng)計學意義的TGD(在10mg/kg下為13.4天，在30mg/kg下為15.4天，每日口服兩次)。然而，藥物僅延遲但不會阻止腫瘤向肺部的轉(zhuǎn)移。高劑量聯(lián)合組(TGD＝20.4天)而非低劑量聯(lián)合組(TGD＝15.2天)與各單用組的具有統(tǒng)計學差異(分別為P＝0.0079和P＝0.254)。在高劑量聯(lián)合組而非低劑量聯(lián)合組中，更多動物(3/10)生存到實驗終點?？傊?，式1化合物與多西紫杉醇的高劑量聯(lián)合可比兩者單用時在更大程度上延遲原發(fā)性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，但不能完全治愈。
一項MV522腫瘤模型的研究證實，每日口服一次(QD)60mg/kg式1化合物產(chǎn)生了與每日口服兩次30mg/kg時相似的腫瘤生長抑制效果(p＝0.154)。此外，與每日口服兩次30mg/kg相比，連續(xù)5天每日口服兩次相同劑量之后停藥2天的抗腫瘤效力似乎不受影響(p＝0.223)。這些結(jié)果表明，在這種非臨床模型中，也許可能將式1化合物可以每日一次或某種間歇給藥方式給藥，并可達到顯著的抗腫瘤效力。
在MV522異種移植模型中研究了受體抑制時間，及產(chǎn)生抗腫瘤效力所需的式1化合物的濃度。結(jié)果顯示，口服給藥(每日一次或每日兩次)，每天約24小時超過EC50(5ng/mL)濃度對于達到或大于50％的抗腫瘤效力而言是必需的。為達到90％的腫瘤生長抑制，每天至少4小時血漿濃度在40-60ng/mL是必需的。超過上述范圍的使用并不產(chǎn)生額外的效力。在每日兩次或每日一次組，均有相似的體重減少；兩組均在5％以下。因此，如果劑量、使用時間適當，每日一次可能與每日兩次方法同效。
還證實，與規(guī)則的定期給藥相比，通過Alzet泵連續(xù)給藥式1化合物產(chǎn)生更大的抗腫瘤效力。Alzet泵以10mg/mL遞送，產(chǎn)生30ng/mL的恒定全身平均濃度，從而使腫瘤停滯。相反地，飽和給藥(每日口服兩次)式1化合物的血漿濃度超過上述計劃的EC90，僅可使腫瘤生長延遲。因此，在腫瘤治療中，式1化合物連續(xù)全身給藥似乎比每天兩次口服給藥更有效。
還研究了間歇給藥時式1化合物的抗腫瘤效力。治療組如下每日給藥、間歇給藥、每日給藥30mg/kg(每日兩次)、間歇給藥30mg/kg。間歇給藥方案如下第1周期(第12-18天給藥，第19-28停止給藥)，第2周期(第29-36給藥，第37-44停止給藥)。當腫瘤平均大小為250mm3時開始給藥；所有的均給藥AG-013736(每日口服兩次)。總體而言，間歇給藥與每日兩次連續(xù)給藥之間具有顯著差異，連續(xù)每日給藥對生長延遲更有效。對于間歇給藥組，在停止給藥后3-4天內(nèi)，腫瘤恢復(fù)正常的生長率。然而，在第2周期給藥的2天內(nèi)，腫瘤生長抑制重新開始。正如預(yù)期，各組中均未見消退。
根據(jù)具體的和優(yōu)選的實施方案已詳述本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解為，通過本發(fā)明的常規(guī)實驗和實踐，可對本發(fā)明進行變動和修改。因而，本發(fā)明不受前述說明書的限制，但被后述權(quán)利要求及其等同物限定。
權(quán)利要求
1.一種給藥哺乳動物的劑型，該劑型包括式1化合物、其可藥用鹽或溶劑合物、或其混合物 在給藥哺乳動物后，其給藥量有效提供式1化合物或其活性代謝物的24小時AUC血漿值25～4500ng·小時/mL。
2.權(quán)利要求1的劑型，其中24小時AUC血漿值為100～800ng·小時/mL。
3.權(quán)利要求1的劑型，其中劑型為口服劑型。
4.包括式1化合物、其可藥用鹽或溶劑合物、或其混合物的劑型 其量為0.5～30mg。
5.權(quán)利要求4的劑型，其中量為2～10mg。
6.權(quán)利要求4的劑型，其中劑型為口服劑型。
7.一種治療哺乳動物細胞異常生長的方法，所述方法包括向哺乳動物給藥權(quán)利要求1-6任何一項所述的劑型。
8.權(quán)利要求7的方法，其中劑型被口服給藥。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述劑型的給藥頻率至少每日一次。
10.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述劑型的給藥頻率至少每日兩次。
11.權(quán)利要求7-10任何一項所述的方法，其中哺乳動物在給藥步驟前禁食至少2小時，給藥步驟后禁食至少2小時或在給藥步驟前后均禁食至少2小時。
12.權(quán)利要求7-11任何一項所述的方法，其中細胞異常生長為癌癥。
13.權(quán)利要求12的方法，其中癌癥選自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌癥、皮膚或眼內(nèi)黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區(qū)域的癌癥、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、脊錐瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤，或其組合。
14.權(quán)利要求7-13任何一項所述的方法，其中該方法進一步包括同時給藥選自有絲分裂抑制劑、烷化劑、抗代謝藥物、嵌入抗生素、生長因子抑制劑、細胞周期抑制劑、酶、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、生物反應(yīng)修飾劑、抗體、細胞毒藥物、抗激素藥、抗雄激素藥及其混合物的抗腫瘤藥物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中抗腫瘤藥物為多西紫杉醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了式(1)化合物或其可藥用鹽、溶劑合物或前藥的劑型。本發(fā)明進一步提供了通過對哺乳動物使用這些劑型治療細胞異常生長如癌癥的方法。
文檔編號A61P35/00GK1832743SQ200480008794
公開日2006年9月13日 申請日期2004年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月3日
發(fā)明者詹姆斯·L·弗雷多, 達納·休－洛夫, 亞茲迪·K·皮撒瓦拉, 海迪·M·斯坦菲爾德 申請人:美國輝瑞有限公司