專利名稱：純化穩(wěn)定的放射性碘偶聯(lián)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于放射性免疫檢測和放射性免疫治療的試劑的純化，尤其涉及在體內(nèi)具有增強了的穩(wěn)定性并且在腫瘤部位具有增強了的保留能力的放射性碘標記的偶聯(lián)物的純化。
背景技術(shù)：
放射性碘標記的單克隆抗體對于癌癥的診斷和治療來說是重要的，正如Goldenberg在Amer.J.Med.1993；94297-312中所歸納的。在過去三十年中業(yè)已開發(fā)了多種方法，用于通過化學(xué)方法將放射性碘導(dǎo)入單克隆和多克隆抗體用于上述目的。在上述用途中，碘優(yōu)選作為放射性標記使用，因為用于對蛋白進行放射性碘標記的化學(xué)方法是相對簡單的，放射性碘具有有用的物理衰變特性，并且碘的同位素可以通過商業(yè)渠道獲得。業(yè)已開發(fā)了各種化學(xué)方法，將碘連接在導(dǎo)向于癌細胞的抗體上。業(yè)已在以下文獻中對上述化學(xué)方法進行了綜述Wilbur，Bioconjugate Chemistry 1992；3433-70。最常見的連接方法是在原位制備親電子的放射性碘物質(zhì)，以便與抗體上的官能團反應(yīng)。業(yè)已將諸如氯胺-T和iodogen的試劑用于制備親電子的碘。蛋白上的酪氨酸基團通常是碘化位點。
Mabs的常規(guī)放射性碘標記需要用某些純化方法除去所使用的氧化劑和未結(jié)合的放射性碘標記物。當(dāng)使用諸如氯胺-T的緩沖液-可溶性氧化劑時，所述氧化劑和放射性碘標記物通常是通過大小排阻層析在大小排阻柱上除去的，如通過商業(yè)渠道獲得的PD10柱。
使用直接放射性碘標記方案的主要缺陷是體內(nèi)脫碘作用現(xiàn)象?？贵w內(nèi)化和體內(nèi)溶酶體處理的結(jié)果是，標記過的蛋白被降解成小的肽，并且它的放射性碘以碘酪氨酸形式從細胞中釋放或者作為連接于低分子肽片段的碘。上述發(fā)現(xiàn)業(yè)已披露在以下文獻中Geissler等，CancerResearch 1992；522907-2915和Shih等.，J.Nucl.Med.1994；35899-908。所述從靶細胞去除放射性碘的方法降低了腫瘤與非腫瘤的區(qū)別，這對于放射性診斷來說是重要的，并且還減少了放射性碘在靶細胞中的停留時間，它能顯著影響放射性治療效果。
為了克服體內(nèi)脫碘作用現(xiàn)象，業(yè)已設(shè)計了若干種方法，所述方法是通過在細胞內(nèi)保留的碘放射性標記的設(shè)計。所述標記被稱作“殘余標記”。在一種方法中，放射性碘連接于不可代謝的碳水化合物，而后者被首先激活，然后與抗體偶聯(lián)。該方法的例子是乳糖醇酪胺(LT)和二乳糖醇酪胺(Strobel等，Arch.Biochem.Biophys 1985；240635-45)和酪氨酸纖維素二糖(Ali等，Cancer Research 1990；50783s-88s)。在另一種方法中，使用了基于吡啶的部分″SIPC ″(Reist等，Cancer Research 1996；564970-4977)。業(yè)已探究了含有所有D氨基酸和多堿性氨基酸的五肽(Foulon等，Cancer Research2000；604453-4460)。在另一種方法中，含有DTPA-附加的，放射性碘標記的肽被成功地用作殘余標記(Govindan等，BioconjugateChemistry 1999；10231-240；Stein等，Cancer Research 2003；63111-118)。
當(dāng)放射性碘標記的小分子量材料與Mabs偶聯(lián)時(以下稱之為放射性碘標記的偶聯(lián)物)，正如在前面段落中的參考部分所披露的，還存在其他的要求，即同樣需要除去未偶聯(lián)的材料。這總是需要純化的其他柱方法。所述碳水化合物方法導(dǎo)致了低的總體產(chǎn)量和比活性，并且涉及在處理結(jié)束時的純化的柱方法。Reist等(同上)和Foulon等(同上)的方法涉及兩個柱純化步驟，一個是在放射性碘標記階段，另一個是在抗體偶聯(lián)階段。Govindan等(同上；還披露于Stein等(同上))的方法涉及在處理結(jié)束時進行的一個柱純化步驟，具有更高的總產(chǎn)量和比活性。
柱純化方法通常是煩瑣的，并且具有使人員接觸輻射(特別是在處理用于臨床規(guī)模的制劑時接觸數(shù)百mCi的I-131)和嚴量的柱破壞的其他缺陷。在基于iodogen的放射性碘標記中，所述氧化劑是不溶于水的，并且是通過簡單地注射或過濾掉放射性標記材料除去的。在所述情況下，需要除去的僅有的其他材料是未結(jié)合的放射性碘標記物。由于碘標記物與磷酸鹽或氫氧化物離子結(jié)合強的陰離子交換樹脂的相對高的親和力，業(yè)已證實了通過使用陰離子交換樹脂可以除去未結(jié)合的碘化物[Weadock等J Nuclear Medicine 1990；31508-511]；Behr TM等Nuklearmedizin 2002；4171-79]。還可以使用固定化的氯胺-T氧化劑，如可通過商業(yè)渠道獲得的″IODO-BEADS″與陰離子交換樹脂的組合。盡管通過所述組合實現(xiàn)了直接放射性碘標記的抗體的純化的某些簡化，放射性碘標記的偶聯(lián)物的使用仍然需要除去未偶聯(lián)的小分子量部分。由于這種純化通常是通過柱方法實現(xiàn)的，所述方法的現(xiàn)有缺陷造成了在純化用于臨床目的的幾百毫居的放射性制劑時產(chǎn)生了實際問題。
Li等業(yè)已披露了柱方法(Bioconjugate Chemistry 1994；5101-104)，用于從未標記的DOTA-肽中純化放射性金屬-螯合的DOTA-肽，這是通過二乙基氨基乙基纖維素陰離子交換柱，并且用若干部分的水洗脫而進行的。在這種情況下，放射性金屬-螯合的DOTA-肽具有中性電荷，并因此從柱中洗脫，同時，在螯合部分上帶有負電荷的未標記的材料被陰離子交換柱保留。這是純化放射性金屬-螯合的雙功能材料所必須的，所述材料隨后偶聯(lián)在抗體上，并且通過大小排阻柱方法純化所述產(chǎn)物。因此，Li等的方法(同上)涉及多個步驟的方法和兩個基于柱的純化步驟。同樣，所述基于柱的方法在用于小分子量部分的大規(guī)模放射性碘標記隨后并且導(dǎo)向劑偶聯(lián)時是不實用的。在后一種情況下，涉及數(shù)百毫居的放射性碘，因此需要更簡單的純化方法。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供放射性碘標記的偶聯(lián)物的純化方法解決了上述問題，所述偶聯(lián)物是通過放射性碘標記的氨基多羧酸-附加的肽與導(dǎo)向劑的共價連接而制備的。
本發(fā)明解決了對放射性碘標記的偶聯(lián)物的純化系統(tǒng)的需要，所述偶聯(lián)物來自多種放射性碘標記的，氨基多羧酸-附加的部分和導(dǎo)向劑。與本領(lǐng)域以前公知的方法相反，由于諸如抗體的導(dǎo)向劑的直接放射性碘標記，本發(fā)明涉及包括低分子量實體，如含有酪氨酸的雙功能肽的放射性碘標記，和使放射性碘標記的部分與抗體偶聯(lián)的方法。因此，本發(fā)明解決了通過純化除去未結(jié)合的放射性碘標記物和未偶聯(lián)的放射性碘標記的部分的需要。
本發(fā)明的方法提供了用殘余的碘標記物進行抗體標記的更高的效率。所述方法還提供了具有低的聚集物含量的更高質(zhì)量的穩(wěn)定的放射性碘偶聯(lián)物制劑。通過以下詳細說明可以理解其他優(yōu)點，如在一體化制備和純化方法所賦予的簡化和安全操作。
附圖簡述

圖1表示粗制(未純化的)產(chǎn)物(I-131-IMP-R4-hMN-14)的大小排阻(SEC)HPLC。主峰大約10分鐘的保留是由于標記的hMN-14產(chǎn)生的，而靠近14分鐘和18分鐘的峰分別表示未偶聯(lián)的I-131-IMPR4和I-131。
圖2表示純化的I-131-IMPR4-hMN14的SEC HPLC，并且證實了未偶聯(lián)的I-131-IMPR4和I-131是通過陰離子交換完全除去的。
圖-3表示純化的產(chǎn)物和癌胚抗原(CEA)復(fù)合的混合物的SECHPLC，并且該HPLC證實了所述產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性被完全保留，正如通過所述峰的完全偏移所證實的，所述峰的完全偏移是由于抗體-抗原復(fù)合物的更高分子量材料的標記過的抗體。
定義在以下說明中，廣泛采用了多種術(shù)語。為了有助于理解本發(fā)明，本文提供了定義。
導(dǎo)向劑?！鍖?dǎo)向劑″是能夠選擇性地結(jié)合靶細胞的分子部分。導(dǎo)向劑的例子包括蛋白分子，它能夠?qū)蛴诳乖蛴赡[瘤或感染病變表達的受體，或能夠?qū)蛴谀[瘤或病變上的特殊受體的低分子量部分，或?qū)蛴谀[瘤細胞或病變的合成核苷酸。優(yōu)選的導(dǎo)向劑包括抗體和肽。
抗體。術(shù)語″抗體″包括單克隆抗體，如鼠類，嵌合的，人源化的或人類抗體，以及抗原結(jié)合片段。所述片段包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab)2，和F(ab′)2，它缺少完整抗體的Fc片段。所述片段還包括輕鏈可變區(qū)的分離的片段，重鏈和輕鏈可變區(qū)的″Fv″片段，(sFv)2片段(例如，參見Tai等，Cancer Research Supplement，555983-5989，1995)，和重組的單鏈多肽分子，其中，輕鏈和重鏈可變區(qū)是通過肽接頭連接的。所說的″多價″抗體表示所述抗體能夠與一個以上的抗原結(jié)合，所述抗原可能同時具有相同或不同的結(jié)構(gòu)。″多特異性″抗體表示所述的抗體能夠同時與具有不同結(jié)構(gòu)的至少兩種抗原結(jié)合。
偶聯(lián)物。在本文中，偶聯(lián)物是包括來標記過的或放射性標記的氨基多羧酸-附加的肽的分子(又被稱作″低分子量部分″)，它是與諸如單克隆抗體的導(dǎo)向劑共價連接的。所述偶聯(lián)物保留了所述導(dǎo)向劑的生物特異性。例如，與和低分子量部分偶聯(lián)之前相比，所述抗體導(dǎo)向劑的免疫反應(yīng)性(結(jié)合抗原的能力)在偶聯(lián)之后是大致相同的，或者僅略有減弱。
氨基多羧酸-附加的肽。術(shù)語″氨基多羧酸-附加的肽″表示通過氨基多羧酸與肽的共價連接形成的化學(xué)部分。所述連接優(yōu)選是通過肽的氨基實現(xiàn)的。任何合適的氨基多羧酸都適合用于本發(fā)明。典型的氨基多羧酸包括亞氨基二乙酸，次氮基三乙酸，EDTA(乙二胺四乙酸)，DTPA(二乙三胺四乙酸)，TTHA(三乙四胺六乙酸)，DOTA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷N，N′，N″，N-四乙酸)，或它們的各種主鏈取代形式，例如，異硫氰基芐根-EDTA/DTPA/TTHA/DOTA，以及多種其他的氨基多羧酸和可以容易推斷的它們的衍生物。術(shù)語肽如下文所定義。
肽.在短語氨基多羧酸-附加的肽中所使用的術(shù)語″肽″表示由L或D-氨基酸組裝的任何肽，或L和D-氨基酸的組合。所述肽優(yōu)選是由2-40個氨基酸組裝的，更優(yōu)選由2-5個氨基酸組裝，并且最優(yōu)選由3-4個氨基酸組裝。所述肽任選具有至少一個D-酪氨酸，它們是與諸如L或D-賴氨酸的堿性氨基酸連接的，后者構(gòu)成了所述肽的羧基末端。該堿性氨基酸可以與氨基多羧酸結(jié)合。
溶液。在本文中，溶液表示含有抗體和放射性碘標記的氨基多羧酸，未結(jié)合的放射性碘標記物和未結(jié)合的放射性碘標記的氨基多羧酸的偶聯(lián)物。優(yōu)選的溶液是緩沖的水溶液。
未結(jié)合的放射性碘。在本文中，未結(jié)合的放射性碘表示沒有氧化成活性碘物質(zhì)的放射性碘物質(zhì)，并且包括未氧化的放射性碘標記物，它不能與所述肽結(jié)合。
陰離子交換樹脂。在本文中，″陰離子交換樹脂″表示通過商業(yè)渠道獲得的不溶性合成或天然的聚合物基質(zhì)，它含有質(zhì)子化的叔胺或四烷基銨官能團，其中，抗衡離子(陰離子)可以與測試底物的陰離子交換。
過濾器。在本文中，″過濾器″表示可以保留顆粒狀物質(zhì)的任何裝置，如大小為0.10μm-0.30μm的過濾器，更優(yōu)選大約0.22μm孔直徑大小的過濾器。
氧化劑。在本文中，″氧化劑″表示用于將放射性碘氧化成有活性的放射性碘一氯化物分子的任何氧化劑，所述分子在放射性碘標記反應(yīng)中是放射性碘標記物質(zhì)，正如所披露的(同上)。
Iodogen方法。該術(shù)語表示涉及使用iodogen作氧化劑的放射性碘標記程序。Iodogen(1，3，4，6-四氯-3□，6□-二苯基甘脲)是水不溶性材料，它在接觸放射性碘標記物的溶液時能產(chǎn)生有活性的放射性碘標記物質(zhì)，正如所披露的(同上)。
氯胺-T方法。該術(shù)語表示將氯胺-T(N-氯甲苯磺胺鈉)用作不溶于水的氧化劑，它在與放射性碘標記物溶液混合時能產(chǎn)生有活性的放射性碘標記物質(zhì)，正如Wilbur所披露的(同上)。
連接部分。連接部分是能夠與導(dǎo)向劑形成共價鍵的官能團，選自下組馬來酰亞胺，氯乙酰胺，溴乙酰胺，碘乙酰胺，乙烯砜，N-羥基琥珀酰亞胺酯，N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯，酰胺化酯，異氰酸酯，或異硫氰酸酯。采用均雙官能或雜雙官能交聯(lián)分子將所述連接部分導(dǎo)入氨基多羧酸-附加的肽。將純雙官能和雜雙官能劑用作交聯(lián)劑為本領(lǐng)域所公知(Wong，S.S.，1991；Chemistry of protein conjugation andcross-linking；CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L；pp 1-48)。
本發(fā)明的詳細說明出乎意料地，本發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)，與陰離子-交換樹脂的短暫接觸能有效除去未偶聯(lián)的低分子量部分。通過從陰離子交換樹脂中過濾而分離純化的產(chǎn)物。為了從偶聯(lián)物中過濾樹脂，以及通過所述樹脂除去的未反應(yīng)的碘化物和碘化氨基多羧酸-附加的肽，任何能夠截留顆粒狀物質(zhì)的過濾裝置都可以使用。優(yōu)選0.22μm的過濾裝置。通過用陰離子交換樹脂攪拌除去未偶聯(lián)的低分子量材料的方法特別適合本發(fā)明的氨基多羧酸部分，如DTPA。
業(yè)已意外地發(fā)現(xiàn)了通過簡單的一鍋純化方法能有效除去未偶聯(lián)的多羧酸部分，該方法避免了純化的煩瑣的柱方法。根據(jù)陰離子交換樹脂的抗衡離子的選擇性，人們無法預(yù)測與陰離子交換樹脂的短時間接觸能夠有效除去未偶聯(lián)的低分子量部分，如多羧酸。例如，氫氧化物被認為對陰離子交換樹脂具有弱結(jié)合能力，并且，乙酸基團的結(jié)合僅僅略微好于氫氧化物。乙酸基團與本發(fā)明的氨基多羧酸的相關(guān)性在于，氨基多羧酸包括位于氮原子上的乙酸殘基，并且這些乙酸殘基在pH＞6的緩沖液中是作為乙酸完全離子化的。例如，根據(jù)生產(chǎn)商的產(chǎn)物文獻(AG1andAG 2 Strong anion-exchange resin Instruction Manual，BioRadCorporation)，碘化物在AG 1陰離子交換樹脂上的選擇性是氫氧化物(可任意設(shè)定為1)的175倍，而乙酸只比氫氧化物高3.2倍。另外，樹脂是以磷酸酯形式使用的，它具有的相對選擇性為5(與氫氧化物的1相比)，這種選擇性略好于乙酸。碘化物結(jié)合陰離子交換樹脂的較高的選擇性，僅僅預(yù)示了通過離子交換方法成功地除去了碘化物。不過，盡管乙酸與磷酸離子相比結(jié)合陰離子交換樹脂具有較低的選擇性，本發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)了離子交換方法能有效除去含有氨基多羧酸的小分子材料，它不能夠根據(jù)陰離子交換樹脂結(jié)合選擇性而預(yù)測。盡管不希望受任何理論的約束，本發(fā)明人認為，這種改進的選擇性是由于多個乙酸基團在相同分子上的存在，正如通過小分子量部分的氨基多羧酸亞結(jié)構(gòu)所推測的。因此，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，通過將氨基多羧酸部分摻入小分子量材料，未偶聯(lián)的放射性碘標記的材料能夠通過用陰離子交換樹脂的懸浮液簡單地攪拌幾分鐘并且過濾掉產(chǎn)物而有效地除去。本發(fā)明的簡化方法在操作上是獨特的，并且比Li等的方法(同上)更好，其優(yōu)點在于，完全避免了純化的柱方法。
陰離子交換樹脂對所述實驗來說，使用了通過商業(yè)渠道獲得的強堿性陰離子交換樹脂，它包括與苯乙烯二乙烯基苯共聚物晶格連接的季銨基團。該樹脂具有8％的交聯(lián)，相當(dāng)于分子量排阻極限為1000Da的孔徑，以及100-200的中等目大小(150-75μm顆粒直徑)。
不過，本發(fā)明不局限于上述特殊的陰離子交換樹脂特征，但是包括上述強堿性陰離子交換樹脂和弱堿性陰離子交換樹脂，如通過商業(yè)渠道獲得的二乙基氨基乙基纖維素。另外，在所述樹脂上使用的交聯(lián)程度是沒有限制的。在強堿性陰離子交換樹脂的特殊例子中，所述交聯(lián)可以為2％(孔徑的分子量排阻極限為2700Da)-12％(孔徑的分子量排阻極限為400Da)，并且樹脂的粒度可以為20目-400目，相當(dāng)于850μm-38μm顆粒直徑范圍。
偶聯(lián)物本發(fā)明涉及不可代謝的和放射性碘標記的肽的用途，它被用于標記抗體，以便所述放射性活性殘留在體內(nèi)。所述專門設(shè)計的肽包括2-40個氨基酸，優(yōu)選2-5個氨基酸，優(yōu)選包括D-氨基酸。D-氨基酸優(yōu)選使用在肽與抗體的連接位點和與酪氨酸或酪胺結(jié)合的放射性碘之間的肽上。最優(yōu)選的是，在該區(qū)域內(nèi)，沒有兩個相鄰的氨基酸是L-氨基酸。在這種場合下的甘氨酸是L-氨基酸。通過以這種方式使用D-氨基酸，將放射性碘連接于抗體的肽鍵不能在溶菌體中水解。另外，附加在所述肽上的一個或多個氨基多羧酸部分，以及N-末端和/或側(cè)鏈氨基與具有用于與抗體共價結(jié)合的官能團的交聯(lián)劑連接。所述共價抗體結(jié)合基團可以是氨基殘基(用于與Mabs的氧化的Fc部分碳水化合物進行位點特異性結(jié)合)，imidate或異硫氰酸酯(可以與蛋白的賴氨酸基團連接)，馬來酰亞胺，溴-或碘乙酰胺殘基(對Mabs上的硫醇具有特異性)等。僅隨最后一個D-酪氨酸單位并且被用于導(dǎo)入抗體-結(jié)合交聯(lián)劑量的氨基酸可以是天然L-氨基酸。所述氨基多羧酸單位可以是亞氨基二乙酸，次氮基三乙酸，EDTA(乙二胺四乙酸)，DTPA(二乙三胺四乙酸)，TTHA(三乙四胺六乙酸)，DOTA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷N，N′，N″，N-四乙酸)，NOTA(1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，N′，N″-三乙酸)或它的各種主鏈取代形式，例如，1-[(p-異硫氰基)芐基]-EDTA(芐基-EDTA)，1-[(p-異硫氰基)芐基]-DTPA(芐基-DTPA)，1-[(p-異硫氰基)芐基]-TTHA(芐基TTHA)，1-[(p-異硫氰基)芐基]-DOTA(芐基-DOTA)，1-[(p-異硫氰基)芐基]-NOTA(芐基-NOTA)，還包括多種其他氨基多羧酸，并且可以方便地推斷它們的衍生物。
在其他實施方案中，所述雙功能可碘化的氨基多羧酸是通過將酪胺基和抗體結(jié)合基團連接于氨基多羧酸而衍生的。在所述結(jié)構(gòu)中不包括易受蛋白酶水解的鍵。另外，氨基多羧酸，即用抗體結(jié)合單位取代的主鏈被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的雙酸酐，它然后與D-酪氨酸反應(yīng)，以便獲得包括兩個D-酪氨酸殘基的實體。由于雙功能氨基多羧酸和D-酪氨酸之間的酰胺鍵不能被蛋白酶識別，它們構(gòu)成了不同形式的殘留的碘標記。
碘化D-酪氨酸部分耐受脫碘酶這一事實是可用于本發(fā)明的有利特性。這種可能性披露于以下文獻中Dumas等，Biochem.Biophys.Acta 1973；29336-47。
用于對抗體進行放射性碘標記的氨基多羧酸-附加的肽的例子選自下組X-Gly-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；X-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys(DTPA)；[X-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys(1/2DTPA)]2；X-Lys(X)-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys((1-(p-NH)芐基)DTPA)-OH；X-Lys(X)-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；X-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；X-Lys(X)-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；X-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；和X-Lys(X)-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；其中X是交聯(lián)劑，它包括用于與導(dǎo)向載體共價連接的官能團，包括諸如單克隆抗體，它的片段和構(gòu)建體的蛋白。
在本發(fā)明范圍內(nèi)合適的放射性碘的例子有I-123，I-124，I-125或I-131。
抗體在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用了諸如MAbs，多價抗體和多特異性抗體的抗體，這些抗體能夠識別或結(jié)合標記物或腫瘤相關(guān)的抗原，這些抗原是以高水平在靶細胞上表達的，并且主要或者只能在相對正常組織為病變的細胞上表達，以及與某些正常細胞和需要消除的組織，如骨髓細胞和異位組織，如甲狀旁腺，脾和子宮內(nèi)膜相關(guān)的抗原，并且使用了能夠迅速內(nèi)化的抗體。所說的″多價″抗體表示能夠結(jié)合一個以上抗原的抗體，所述抗原可以同時具有相同或不同的結(jié)構(gòu)。所說的″多特異性″抗體表示所述抗體能夠同時結(jié)合至少兩個具有不同結(jié)構(gòu)的抗原。例如，具有兩種不同特異性的抗體被視為多價和多特異性的，因為它能夠同時結(jié)合兩種結(jié)構(gòu)上不同的靶。另一方面，具有兩種或兩種以上特異性的抗體能結(jié)合相同的靶，但沒有其他特異性，它就是多價而不是多特異性。多種多特異性和/或多價抗體可以通過分子工程生產(chǎn)。例如，雙特異性融合蛋白可以是一價的，例如，由scFv組成，它具有結(jié)合單個抗原的結(jié)合位點，和Fab片段，它具有結(jié)合第二個抗原的單個結(jié)合位點。雙特異性抗體還可以是二價的，例如，由IgG組成，它具有結(jié)合一種抗原的兩個結(jié)合位點，和具有結(jié)合第二種抗原的兩個結(jié)合位點的兩個scFv。
可用于本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體包括具有上述特性的mAbs，并且涉及但不局限于以下mAbs的用途LL1(抗-CD74)，LL2(抗-CD22)，RS7(抗-上皮糖蛋白-1(EGP-1))，PAM-4(抗-MUCl)，MN-14(抗-癌胚抗原)，Mu-9(抗-結(jié)腸-特異性抗原-p)，AFP(抗甲胎蛋白)，抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)，如J591，和G250(抗-碳酸酐酶IX)?？梢杂盟雠悸?lián)物導(dǎo)向的其他有用的抗原包括HER-2/neu，CD19，CD20，VEGF，EGF受體，堿性磷酸酶，前列腺酸磷酸酶，腱生蛋白，胎盤生長因子(P1GF)，胰島素樣生長因子(ILGF)，和神經(jīng)節(jié)苷脂。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案中，所使用的抗體能迅速內(nèi)化，然后重新表達，加工并且呈遞到細胞表面上，使得細胞能夠連續(xù)攝入并且增加循環(huán)免疫偶聯(lián)物。最優(yōu)選的抗體/抗原對的例子是LL1，即一種抗-CD74mAb(恒定鏈，II類特異性侶伴蛋白，Ii)。CD74抗原是在B細胞淋巴瘤，某些T細胞淋巴瘤，黑素瘤和某些其他癌上高水平表達的(Ong等，Immunology 1999；98296-302)。
例如，用抗-CD74抗體治療的疾病包括，但不局限于非何杰金氏淋巴瘤，黑素瘤和多發(fā)性骨髓瘤。CD74抗原在靶細胞表面上短時間連續(xù)表達，然后進行抗原的內(nèi)化，并且再次表達所述抗原，使得導(dǎo)向性LL1抗體與它作為″有效負載″所攜帶的任何治療部分一起內(nèi)化。這使得可以在所述細胞內(nèi)積累高的治療濃度的LL1-治療性免疫偶聯(lián)物。內(nèi)化的LL1免疫偶聯(lián)物是通過溶酶體和核內(nèi)體循環(huán)的，并且殘余的放射性部分因此保留在靶細胞內(nèi)。
在優(yōu)選實施方案中，用于治療人類疾病的抗體是人類的或人源化(cdr-嫁接的)形式的抗體；不過，可以使用鼠類和嵌合形式的抗體。對于獸醫(yī)用途來說，相同物種的IgG可能是最有效的載體，不過跨物種的IgGs也保持可以使用。相同物種的IgG分子作為輸送劑，對于減弱免疫反應(yīng)來說是最優(yōu)選的。在考慮重復(fù)治療時，這是特別重要的。對于人類來說，人或人源化的IgG抗體不太可能由患者產(chǎn)生抗-IgG免疫反應(yīng)。導(dǎo)向于內(nèi)化抗原，諸如hLL1和hLL2的抗體在與靶細胞結(jié)合之后能夠迅速內(nèi)化，這意味著，被攜帶的放射性碘標記的抗體偶聯(lián)物被迅速內(nèi)化到細胞中。
所述Mab是鼠類抗體，嵌合抗體，人源化抗體，或人類抗體，并且可以是完整的，它的片段或各種工程改造的形式。在特別優(yōu)選的實施方案中，MAb是衍生化的或二硫化物-還原成具有硫醇基。
抗體靶抗體可用于治療各種病變組織，細胞和器官，如心血管病變(例如，血凝塊，栓塞物，動脈粥樣硬化斑)，淀粉樣沉積物(例如，淀粉樣變性病和阿爾茨海默病)，傳染性生物(例如，細菌，真菌，立克次體，病毒，寄生蟲)，炎癥(例如，III類自身免疫病，如免疫介導(dǎo)的血小板減少，如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜和慢性特發(fā)性性血小板減少性紫癜，皮肌炎，干燥綜合征，多發(fā)性硬化，西登哈姆舞蹈病，重癥肌無力，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，狼瘡腎炎，風(fēng)濕熱，多腺體綜合征，大皰性類天皰瘡，糖尿病，過敏性紫癜，鏈球菌感染后腎炎，結(jié)節(jié)性紅斑，高安動脈炎，阿狄森氏病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，結(jié)節(jié)病，潰病性結(jié)腸炎，多形性紅斑，IgA腎病，結(jié)節(jié)性多動脈炎，強直性脊柱炎，肺出血腎炎綜合征，thromboangitis ubiterans，干燥綜合征，原發(fā)性膽汁性肝硬化，橋本甲狀腺炎，甲狀腺毒癥，硬皮病，慢性活動性肝炎，多肌炎/皮肌炎，多軟骨炎，尋常天疤瘡，韋格納氏肉芽腫，膜性腎病，肌萎縮性側(cè)索硬化，脊髓癆，巨細胞動脈炎/多肌痛，惡性貧血，急進性腎小球腎炎和纖維化肺泡炎等)，移位或異位正常組織(例如，甲狀旁腺，子宮內(nèi)膜，脾，胸腺)，和癌(液體(例如，白血病和淋巴瘤)和實體(例如，癌，肉瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，黑素瘤)。
下面將結(jié)合實施例說明本發(fā)明，這些實施例并不限定本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1用于用放射性碘標記的IMP-R4標記二硫化物還原的抗-CEA MAb，hMN-14的簡化的一鍋制備和純化方法下面用IMP-R4作為小分子量材料說明該方法，它是放射性碘標記的，并且與二硫化物-還原的抗-CEA MAb，hMN-14偶聯(lián)。IMP-R4具有以下結(jié)構(gòu)MCC-Lys(MCC)-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH，其中，MCC是4-(N-馬來酰亞氨基甲基)-環(huán)己烷-1-羰基。IMP-R4是申請日為2000年10月26日的美國專利申請?zhí)?9/696,740的主題的一部分。
將從供應(yīng)商處購買的I-131碘化鈉用7倍體積的pH 7.4的0.5M的磷酸鈉緩沖，并且，利用另外的1.4mL的40mM pH7.4的磷酸鈉轉(zhuǎn)移到iodogen包被的管形瓶中，該管形瓶中放有攪棒，并且裝有IMP-R4(0.13μmol/100mCi的I-131)。攪拌該溶液8-15分鐘，并且用過量的4-羥基苯乙酸對未結(jié)合的放射性碘進行淬火。放射性碘標記的IMP-R4與二硫化物-還原的hMN-14偶聯(lián)(在一種實驗中IgG-SH-與IMP-R4的比例為0.6)30分鐘，并且用連四硫酸鈉對未使用的硫醇基封端。最后，添加磷酸鹽形式的2-3mL的20％w/v陰離子交換樹脂AGlX8(100-200目)的懸浮液，并且攪拌5分鐘。然后將放射性標記材料過濾到無菌薄膜密封的容器中，使用Milli-FilDGS 0.22μm過濾單位(Millipore Corporation)。任選將人血清白蛋白添加到所述產(chǎn)物中，使最終濃度為l％-2.5％。
典型的回收如下從57.4mCi的I-131開始，最終產(chǎn)物包括40mCi(69.9％)，而在一輪中涉及123mCi的I-131，最終的產(chǎn)物包括63mCi(51％)。在使用40mCu-123mCi的I-131進行放射性標記(n＝9)時，通過HPLC分析測定的總體結(jié)合范圍為61％-75％，而回收率在50％-70％范圍內(nèi)。通過與CEA復(fù)合并且通過HPLC分析判斷的免疫反應(yīng)性＞95％。通過HPLC分析判斷最終產(chǎn)物的純度＞95％，聚焦物＜5％，比活性在5mCi/mg-6mCi/mg范圍內(nèi)。
實施例2在緩沖液中和對血清侵襲的體外穩(wěn)定性濃度為0.9mCi/mL的純化的實施例1產(chǎn)物(62.9mCi的總放射性)和濃度為0.2mg/mL的抗體存在于含有2.5％HAS的磷酸緩沖液中，在室溫下放置20小時，并且通過大小排阻HPLC分析。典型的磷酸緩沖液是0.1M磷酸鈉水溶液，將pH調(diào)整到6.0-7.5之間。這證實了所述產(chǎn)物實際上是沒有變化的。與20倍摩爾過量的CEA抗原復(fù)合，揭示了免疫反應(yīng)性的保留。
在第二種實施方案中，所述產(chǎn)物在人血清中稀釋33.3倍，并且在37℃下溫育20小時。在此時進行的分析證實了標記物的可以忽略的損失，并且所述材料仍然與CEA復(fù)合，表明了免疫反應(yīng)性的保留。
實施例3在較低pH下標記和純化根據(jù)實施例1的方法，改變?nèi)缦翴-131碘化鈉的緩沖是用7倍體積的pH 6的0.3M磷酸鈉進行的，然后使用1.4mL pH6的0.03M磷酸鈉將緩沖過的I-131轉(zhuǎn)移到iodogen管形瓶中。在放射性碘標記之后，與二硫化物-還原的hMN-14偶聯(lián)，并且通過與AG1X8陰離子交換樹脂攪拌進行純化，從56.5mCi的I-131碘化鈉起始，獲得了純化I-131-IMP-R4-hMN-14的39mCi(69％)的回收率。在另一種實驗中，使用相同的方法，從109.8mCi的I-131碘化鈉獲得了69.3mCi的純化的產(chǎn)物(63.1％)。另外，在上述兩種實驗中，通過與CEA復(fù)合證明了免疫反應(yīng)性的完全保留。
實施例4使用固定化的氯胺-T作為氧化劑進行放射性碘標記，然后進行偶聯(lián)和陰離子交換純化。
在本實驗中，用通過商業(yè)渠道獲得的固定化氯胺-T(IODO-BEADS)取代iodogen。將一個或多個珠用于放射性碘標記管形瓶中。另外，操作與實施例1所述相同。這樣，在陰離子交換純化，并且通過簡單的過濾分離產(chǎn)物之后獲得了純化的I-131-IMP-R4-hMN-14。
在本申請中所提到的所有文獻，包括專利，專利申請和期刊的內(nèi)容被以整體形式收作本文參考。
權(quán)利要求
1.一種制備和純化放射性碘標記的氨基多羧酸-附加的肽和導(dǎo)向劑的偶聯(lián)物的方法，包括(A)提供一種溶液，它含有(i)未結(jié)合的放射性碘(ii)沒有與導(dǎo)向劑偶聯(lián)的放射性碘標記的氨基多羧酸-附加的肽(iii)和與導(dǎo)向劑偶聯(lián)的放射性碘標記的氨基多羧酸-附加的肽；(B)讓所述溶液與陰離子交換樹脂接觸；和(C)讓所述陰離子交換樹脂和溶液一起通過能夠截留陰離子交換樹脂顆粒的過濾器；以便獲得所述放射性碘標記的氨基多羧酸-附加的肽和導(dǎo)向劑的偶聯(lián)物。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，溶液(A)是通過對氨基多羧酸-附加的肽進行放射性碘標記，以便形成放射性碘標記的肽而制備的；和讓所述放射性碘標記的氨基多羧酸-附加的肽與導(dǎo)向劑偶聯(lián)，以便形成放射性碘標記的氨基多羧酸-附加的肽的偶聯(lián)物。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述肽的放射性碘標記是用氧化劑進行的，以便由放射性碘化鈉產(chǎn)生放射性碘，它能夠結(jié)合所述肽。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述氧化劑是iodogen或氯胺-T。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述氧化劑是氯胺-T，并且所述放射性碘標記是在存在固定化的，不溶性的，球形的氯胺-T的條件下進行的。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述過濾器的孔的直徑為0.1μm-0.3μm。
7.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述陰離子交換樹脂由聚合物晶格上的季銨官能團組成，并且，在所述聚合物上的交聯(lián)程度大約為2％-12％。
8.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述陰離子交換樹脂由聚合物晶格上的叔胺官能團組成。
9.如權(quán)利要求7或8的方法，其中，所述樹脂的粒度為20目-400目(顆粒直徑為850μm-38μm)。
10.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述偶聯(lián)物的純化的溶液包括低于10％的組合的未偶聯(lián)的放射性碘和未偶聯(lián)的放射性碘標記的肽，它們是在接觸所述陰離子交換樹脂之前最初存在于所述溶液中的。
11.如權(quán)利要求1的方法，還包括一起攪拌所述樹脂和所述溶液。
12.如權(quán)利要求1的方法，還包括讓所述溶液通過裝有陰離子交換樹脂的柱。
13.如權(quán)利要求1的方法，其中，權(quán)利要求1的氨基多羧酸-附加的肽選自下組X-Gly-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；X-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys(DTPA)；[x-D-Ala-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys(1/2DTPA)]2；X-Lys(X)-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-D-Tyr-D-Tyr-D-Lys((1-(p-NH)芐基)DTPA)-OH；X-Lys(X)-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；X-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；X-Lys(MCC)-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；X-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；和X-Lys(X)-Asp-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH；其中，X是交聯(lián)劑，它包括能夠與所述導(dǎo)向劑形成共價連接的連接部分。
14.如權(quán)利要求1或13的方法，其中，所述導(dǎo)向劑是通過連接部分與所述氨基多羧酸-附加的肽偶聯(lián)的，連接部分包括馬來酰亞胺，氯乙酰胺，溴乙酰胺，碘乙酰胺，乙烯砜，N-羥基琥珀酰亞胺酯，N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯，酰胺化酯，異氰酸酯，或異硫氰酸酯。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述馬來酰亞胺連接部分是4-(N-馬來酰亞氨基甲基)-環(huán)己烷-1-羰基部分。
16.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述馬來酰亞胺連接部分是2-(N-馬來酰亞氨基)乙酰部分。
17.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述氨基多羧酸是EDTA，DTPA，芐基-EDTA，芐基-DTPA，芐基-DOTA，TTHA(三乙四胺六乙酸)，NOTA，或芐基-NOTA。
18.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述肽是IMP-R4，它是MCC-Lys(MCC)-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-D-Tyr-D-Lys((1-(p-CSNH)芐基)DTPA)-OH，并且其中MCC是4-(N-馬來酰亞氨基甲基)-環(huán)己烷-1-羰基部分。
19.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述導(dǎo)向劑是單克隆抗體(MAb)。
20.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體是與惡性疾病相關(guān)的。
21.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體是與心血管病相關(guān)的。
22.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體是與自身免疫病相關(guān)的。
23.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述自身免疫病是III類自身免疫病。
24.如權(quán)利要求23的方法，其中，所述III類自身免疫病選自下組免疫介導(dǎo)的血小板減少，皮肌炎，干燥綜合征，多發(fā)性硬化，西登哈姆舞蹈病，重癥肌無力，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，狼瘡腎炎，風(fēng)濕熱，多腺體綜合征，大皰性類天皰瘡，糖尿病，過敏性紫瘢，鏈球菌感染后腎炎，結(jié)節(jié)性紅斑，高安動脈炎，阿狄森氏病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，結(jié)節(jié)病，潰瘍性結(jié)腸炎，多形性紅斑，IgA腎病，結(jié)節(jié)性多動脈炎，強直性脊柱炎，肺出血腎炎綜合征，thromboangitis ubiterans，干燥綜合征，原發(fā)性膽汁性肝硬化，橋本甲狀腺炎，甲狀腺毒癥，硬皮病，慢性活動性肝炎，多肌炎/皮肌炎，多軟骨炎，尋常天皰瘡，韋格納氏肉芽腫，膜性腎病，肌萎縮性側(cè)索硬化，脊髓癆，巨細胞動脈炎/多肌痛，惡性貧血，急進性腎小球腎炎和纖維化肺泡炎。
25.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體與阿爾茨海默病相關(guān)。
26.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體與傳染性生物相關(guān)。
27.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體是內(nèi)化抗體。
28.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體是抗-CEA MAb，MN-14；抗-EGP-1MAb；抗-CD22MAb；抗-CD20MAb；抗-結(jié)腸-特異性抗原-p MAb；抗-CD74 MAb；抗-MUC1 MAb；抗-AFP MAb；抗前列腺特異性膜抗原；或抗-碳酸酐酶IX Mab。
29.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體是鼠類抗體，嵌合抗體，人源化抗體，或人類抗體，并且可以是完整的，它們的片段或各種工程改造形式。
30.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體是衍生化的或二硫化物-還原成具有硫醇基。
31.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述放射性碘是I-123，I-124，I-125或I-131。
32.如權(quán)利要求1的方法，其中，由導(dǎo)向載體導(dǎo)向的抗原包括HER-2/neu，CD19，CD20，VEGF，EGF受體，堿性磷酸酶，前列腺酸磷酸酶，腱生蛋白，胎盤生長因子(P1GF)，胰島素樣生長因子(ILGF)和神經(jīng)節(jié)苷脂。
33.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體能夠?qū)蛴谛难懿∽?，淀粉樣沉積物，傳染性生物，炎癥，自身免疫病，移位或異位的正常組織，和流體癌或?qū)嶓w癌。
34.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體能夠?qū)蛴谘龎K，栓塞物，動脈粥樣硬化斑，淀粉樣變性，細菌，真菌，立克次體，病毒，寄生蟲，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，多發(fā)性硬化，移位或異位的甲狀旁腺組織，移位或異位的子宮內(nèi)膜組織，移位或異位的脾組織，移位或異位的胸腺組織，白血病，淋巴瘤，癌，肉瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，或黑素瘤。
35.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述導(dǎo)向劑是多價抗體或多價、多特異性抗體。
36.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述多價抗體或多價、多特異性抗體與惡性疾病相關(guān)。
37.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述多價抗體或多價、多特異性抗體與心血管病相關(guān)。
38.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述多價抗體或多價、多特異性抗體與自身免疫病相關(guān)。
39.如權(quán)利要求38的方法，其中，所述自身免疫病是III類自身免疫病。
40.如權(quán)利要求39的方法，其中，所述III類自身免疫病選自下組免疫介導(dǎo)的血小板減少，皮肌炎，干燥綜合征，多發(fā)性硬化，西登哈姆舞蹈病，重癥肌無力，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，狼瘡腎炎，風(fēng)濕熱，多腺體綜合征，大皰性類天皰瘡，糖尿病，過敏性紫瘢，鏈球菌感染后腎炎，結(jié)節(jié)性紅斑，高安動脈炎，阿狄森氏病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，結(jié)節(jié)病，潰瘍性結(jié)腸炎，多形性紅斑，IgA腎病，結(jié)節(jié)性多動脈炎，強直性脊柱炎，肺出血腎炎綜合征，thromboangitis ubiterans，干燥綜合征，原發(fā)性膽汁性肝硬化，橋本甲狀腺炎，甲狀腺毒癥，硬皮病，慢性活動性肝炎，多肌炎/皮肌炎，多軟骨炎，尋常天皰瘡，韋格納氏肉芽腫，膜性腎病，肌萎縮性側(cè)索硬化，脊髓癆，巨細胞動脈炎/多肌痛，惡性貧血，急進性腎小球腎炎和纖維化肺泡炎。
41.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述多價抗體或多價、多特異性抗體與阿爾茨海默病相關(guān)。
42.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述多價抗體或多價、多特異性抗體與傳染性生物相關(guān)。
43.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述多價抗體或多價、多特異性抗體是內(nèi)化抗體。
44.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述多價抗體或多價、多特異性抗體是衍生化的或二硫化物-還原成具有硫醇基。
45.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述多價抗體或多價，多特異性抗體能夠?qū)蛴谛难懿∽?，淀粉樣沉積物，傳染性生物，炎癥，自身免疫病，移位或異位的正常組織，和流體癌或?qū)嶓w癌。
46.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述多價抗體或多價、多特異性抗體包括以下物質(zhì)的結(jié)合位點CD74，CD22，上皮糖蛋白-1，MUC1，癌胚抗原，結(jié)腸-特異性抗原-p，甲胎蛋白，前列腺特異性膜抗原，碳酸酐酶IX，HER-2/neu，CD19，CD20，VEGF，EGF受體，堿性磷酸酶，前列腺酸磷酸酶，腱生蛋白，胎盤生長因子(P1GF)，胰島素樣生長因子(ILGF)，和神經(jīng)節(jié)苷脂。
47.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述多價抗體或多價、多特異性抗體能夠?qū)蛴谘龎K，栓塞物，動脈粥樣硬化斑，淀粉樣變性，細菌，真菌，立克次體，病毒，寄生蟲，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，多發(fā)性硬化，移位或異位的甲狀旁腺組織，移位或異位的子宮內(nèi)膜組織，移位或異位的脾組織，移位或異位的胸腺組織，白血病，淋巴瘤，癌，肉瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，或黑素瘤。
48.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述免疫介導(dǎo)的血小板減少是急性特發(fā)性血小板減少性紫?；蚵蕴匕l(fā)性性血小板減少性紫瘢。
49.如權(quán)利要求40的方法，其中，所述免疫介導(dǎo)的血小板減少是急性特發(fā)性血小板減少性紫?；蚵蕴匕l(fā)性性血小板減少性紫瘢。
50.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述單克隆抗體選自下組MN-14，RS7，LL2，1F5，A20，Mu9，LL1，PAM-4，Immu31，J591和G250。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備和純化放射性碘標記的氨基多羧酸－附加的肽和導(dǎo)向劑的偶聯(lián)物的方法。該方法包括(A)提供一種溶液，它含有(i)未結(jié)合的放射性碘(ii)沒有與導(dǎo)向劑偶聯(lián)的放射性碘標記的氨基多羧酸－附加的肽(iii)和與導(dǎo)向劑偶聯(lián)的放射性碘標記的氨基多羧酸－附加的肽；(B)讓所述溶液與陰離子交換樹脂接觸；和(C)讓所述陰離子交換樹脂和溶液一起通過能夠截留陰離子交換樹脂顆粒的過濾器。
文檔編號A61K51/08GK1768266SQ200480009173
公開日2006年5月3日 申請日期2004年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月6日
發(fā)明者S·V·戈文丹 申請人:免疫醫(yī)療公司