專利名稱：修復角膜知覺的藥劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包括Rho蛋白抑制劑的角膜神經(jīng)突發(fā)生(neuritogenesis)的促進劑，和一種基于對角膜神經(jīng)突發(fā)生的促進，恢復或提高角膜敏感性或治療干眼癥的藥劑。
由于角膜神經(jīng)被角膜外科手術諸如屈光性激光角膜切削術(PRK)，激光輔助原位角膜切削術(LASIK)，角膜成形術等所切斷，據(jù)說角膜敏感性通常降低約3周到一年的時間。例如，已經(jīng)報道了在LASIK后，角膜神經(jīng)明顯被切斷(Tuuli U.Linna等.，Experimental Eye Research 66755-763，1998)，并且在角膜區(qū)域中角膜敏感性降低，其中在LASIK后，沒有觀察到神經(jīng)纖維分布圖或神經(jīng)束太短而不能產(chǎn)生連接(Tuuli U.Linna等，Investigative Ophthalmology & Visual Sciences，41393-397，2000)。
已經(jīng)證實了PRK和LASIK后的角膜低敏感性導致了較低的淚腺反應并減少了淚液(Ang，Robert T.等，Current Opinion in Ophthalmology 12318-322，2001)。作為角膜敏感性功能降低的結果，做過角膜外科手術的患者眨眼次數(shù)減少，有問題地顯示干眼癥的癥狀。在患有干眼癥的患者中，淚腺機能減退引起了角膜的低敏感性，其與另外的淚腺機能減退結合后，有問題地加劇了角膜表面的疾病狀況。
然而，目前角膜外科手術后角膜敏感性的恢復依賴于自發(fā)恢復，并且在干眼癥的治療中，沒有提供積極治療以恢復角膜敏感性。
此外，由疾病導致的角膜低敏感性伴隨角膜神經(jīng)變性，諸如神經(jīng)麻痹性角膜病變、角膜潰瘍、糖尿病性角膜病變等。
Rho蛋白是包括在Rho家族(包含Rho、Rac，Cdc42等)中的低分子量G蛋白，并已知涉及肌動蛋白細胞骨支架組織和神經(jīng)突收縮反應。
例如，已知C3酶，一種Rho蛋白質抑制劑，延伸了3T3成纖維細胞的細胞突出(Hirose，M.等，The Journal of Cell Biology，1411625-1636，1998)，并且公開了通過向患者施用有效量的Rho蛋白抑制劑來促進中樞神經(jīng)軸突生長的方法(JP-T-2001-515018和EP-1,011,330-A)。此外，已知作為Rho蛋白質效應分子之一的Rho激酶抑制劑具有視黃醛神經(jīng)節(jié)細胞的軸突延伸作用，并顯示對視覺神經(jīng)細胞的再生促進作用(WO 02/83175和EP-1,142,585-A)。WO 03/020281教導在外科手術，諸如LASIK等后，可以將能夠促進神經(jīng)再生或神經(jīng)突延伸的化合物用于治療由角膜神經(jīng)紊亂引起的疾病狀態(tài)。顯示了作為這類化合物的實例，neotrofin等，所述neotrofin是神經(jīng)營養(yǎng)因子刺激物質，但是既沒有發(fā)現(xiàn)關于Rho蛋白質抑制劑的描述，也沒有發(fā)現(xiàn)關于其的提示。
已經(jīng)報道，關于在大鼠三叉神經(jīng)組織培養(yǎng)物(在整個包埋培養(yǎng)物中的三叉神經(jīng)束)系統(tǒng)中的三叉神經(jīng)，神經(jīng)生長因子(NGF)等的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白誘導的神經(jīng)軸突的延伸為Rho激活劑(溶血磷脂酸)所抑制，并通過將顯性負調控Rho引入細胞得以促進(Ozdinler，P.Hande等，The Journal ofComparative Neurology，438377-387，2001)。同時，有描述指出在缺乏神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的情況下，Rho對三叉神經(jīng)束的神經(jīng)軸突延伸是否有影響尚不知道，并且Rho蛋白抑制劑對三叉神經(jīng)的影響尚未闡明。
另一方面，公開了由于具有Rho激活作用的化合物具有角膜上皮遷移作用并且作為Rho蛋白抑制劑的C3酶抑制其角膜上皮細胞的遷移，因此對于角膜疾病諸如角膜潰瘍、角膜上皮磨損、角膜炎等，具有Rho激活作用的化合物是有用的(JP2000-264847A和EP-1,142,585A)。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種藥物試劑，所述藥劑在具有角膜敏感性功能降低的患者，角膜外科手術諸如激光光折射角膜切開術(PRK)、激光輔助原位角膜磨削術(LASIK)、角膜移植術等之后的患者中顯示角膜敏感性功能恢復。
本發(fā)明人已經(jīng)出于提供一種新類型藥劑的目的進行了研究，所述藥劑恢復角膜外科手術后的角膜敏感性或改善干眼癥狀中的角膜敏感性狀況，并且本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)Rho蛋白抑制劑對三叉神經(jīng)(其后有時稱為角膜神經(jīng))細胞具有促神經(jīng)突發(fā)生的作用?；谶@些發(fā)現(xiàn)，他們另外研究并且完成了本發(fā)明，將Rho蛋白抑制劑用作恢復角膜敏感性等的藥物。
因此，本發(fā)明涉及(1)一種促進角膜神經(jīng)突發(fā)生的藥劑，其包括Rho蛋白抑制劑，(2)一種促進角膜神經(jīng)軸突延伸的藥劑，其包括Rho蛋白抑制劑，(3)一種恢復角膜敏感性的藥劑，其包括Rho蛋白抑制劑，(4)一種用于干眼的治療劑，其包括Rho蛋白抑制劑，(5)一種促進角膜神經(jīng)突發(fā)生的藥物組合物，其包括Rho蛋白抑制劑，(6)一種促進角膜神經(jīng)軸突延伸的藥物組合物，其包括Rho蛋白抑制劑，(7)一種用于恢復角膜敏感性的藥物組合物，其包括Rho蛋白抑制劑，(8)一種用于治療干眼的藥物組合物，其包括Rho蛋白抑制劑，(9)Rho蛋白抑制劑用于制備促進角膜神經(jīng)突發(fā)生的藥物組合物的應用，(10)Rho蛋白抑制劑用于制備促進角膜神經(jīng)軸突延伸的藥物組合物的應用，(11)Rho蛋白抑制劑用于制備恢復角膜敏感性的藥物組合物的應用，(12)Rho蛋白抑制劑用于制備治療干眼的藥物組合物的應用，(13)一種促進角膜神經(jīng)突發(fā)生的方法，其包括向需要促進角膜神經(jīng)突發(fā)生的受試者施用有效量的Rho蛋白抑制劑，(14)一種促進角膜神經(jīng)軸突延伸的方法，其包括向需要促進角膜神經(jīng)軸突延伸的受試者施用有效量的Rho蛋白抑制劑，(15)一種恢復角膜敏感性的方法，其包括向需要恢復角膜敏感性的受試者施用有效量的Rho蛋白抑制劑，和(16)一種治療干眼的方法，其包括向被干眼侵襲的受試者施用有效量的Rho蛋白抑制劑。
附圖簡述

圖1是在實驗例1中的培養(yǎng)的兔三叉神經(jīng)細胞的熒光顯微圖像，其中A是在未添加C3酶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時的兔三叉神經(jīng)細胞，B顯示在含終濃度為2μg/mL的C3酶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時的細胞。
圖2顯示在實驗例1中神經(jīng)突發(fā)生細胞與總細胞數(shù)的比率(％)，其中垂直軸顯示神經(jīng)突發(fā)生細胞與總細胞的百分比，每個值都顯示3個實驗的平均值±標準誤差而*顯示相對于對照的顯著差異(p＜0.05)。
圖3是在實驗例2中的培養(yǎng)的兔三叉神經(jīng)細胞的熒光顯微圖像，其中A顯示在未添加試驗物質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞，B顯示在添加了化合物1(終濃度10μM)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞，C顯示在添加了化合物2(終濃度10μM)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞，D顯示顯示在添加了化合物3(終濃度1μM)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞，和E顯示在添加了化合物4(終濃度10μM)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時的細胞。
圖4是顯示在實驗例2中神經(jīng)突發(fā)生細胞與計數(shù)的總細胞數(shù)的比率(％)的圖，其中每個值都顯示3個實驗的平均值±標準誤差，*顯示相對于未添加組的顯著差異(p＜0.05)，**顯示相對于未添加組的顯著差異(p＜0.01)。
圖5顯示在實驗例3中兔角膜(C)和三叉神經(jīng)節(jié)(T)的ROCKI和ROCKII蛋白質印跡的結果。
發(fā)明詳述在本說明書中，“Rho蛋白抑制劑”包括任何抑制失活的GDP結合Rho蛋白被活化成活性GTP結合Rho蛋白的抑制劑，一種抗Rho蛋白或Rho蛋白片段的抗體等，以及任何抑制效應器分子作用的抑制劑，所述效應器分子轉導諸如Rho激酶(ROCK)等的Rho蛋白的作用。“角膜神經(jīng)”指在三叉神經(jīng)控制下于周圍角膜中形成的環(huán)狀神經(jīng)叢，其是在角膜基質中網(wǎng)狀分布的感覺神經(jīng)元、基質神經(jīng)叢，緊接在鮑曼氏膜下面形成的上皮下神經(jīng)叢，以及緊接在貫通的鮑曼氏膜之后形成的基底細胞神經(jīng)叢和神經(jīng)纖維。在本發(fā)明中，“神經(jīng)突”指來自神經(jīng)元(神經(jīng)細胞)細胞體的突起(樹突和軸突)，而“發(fā)生”指上述來自細胞體的神經(jīng)突的生長和/或延伸。對于本領域技術人員來說將何種水平的神經(jīng)突發(fā)生視為促進是清楚的。神經(jīng)突發(fā)生的促進可以通過，例如，熒光染色神經(jīng)細胞和利用熒光顯微鏡觀察細胞狀況來確認。此外，可以利用圖像分析軟件等對使用顯微鏡的觀察結果進行分析。而且，神經(jīng)突發(fā)生的狀態(tài)可以通過統(tǒng)計學處理所述結果進行數(shù)字表示。作為另一種方法，可以用一種抗體和與識別相同物的所述抗體反應的辣根過氧化物酶(HRP)-綴合抗體標記構成神經(jīng)細胞體和神經(jīng)突的物質，令HRP進行顯色并且神經(jīng)絲的量通過測量吸光度進行測定并將其用作神經(jīng)突發(fā)生的指征。
作為Rho蛋白質抑制劑，可以提及的，例如，外酶C3(在本說明書有時簡稱為C3酶)、毒素A、毒素B和Rho激酶抑制劑。
當然，作為Rho蛋白質抑制劑(其后有時稱為ROCK抑制劑)，可以提及的，例如，在JP61-227581A(USP 4,678,783)中所述的化合物諸如由FASUDIL鹽酸鹽等代表的異喹啉磺酰基行生物；在WO 00/57914和JP2000-44513A中所述的化合物諸如Rho激酶抑制劑(例如，利尿酸和4-[2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)丙烯酰]肉桂酸等)；在WO 02/076977(EP-1,370,552-A和1,370,553-A)中所述的化合物諸如Rho激酶抑制劑(例如，2-氯-6，7-二甲氧基-N-[5-1H-吲唑基]喹唑啉-4-胺等)；以及在WO02/100833中所述的化合物諸如Rho激酶抑制劑(例如，N-(1-芐基-4-哌啶基)-1H-吲唑-5-胺二鹽酸一水化物等)。
在下列說明中，用于本發(fā)明中的包含Rho蛋白質抑制劑的藥劑和組合物有時也統(tǒng)稱為“本發(fā)明的藥劑”。
本發(fā)明的藥劑可用于哺乳動物(例如，人、大鼠、小鼠、兔、牛、豬、狗、貓等)角膜敏感性功能疾病的恢復，其中角膜神經(jīng)受到損傷或切除或有缺陷。例如，它可用作恢復PRK、LASIK之后降低的角膜敏感性，伴隨角膜神經(jīng)變性的角膜敏感性降低，諸如神經(jīng)麻痹性角膜病變、角膜潰瘍、糖尿病性角膜病變等的治療藥物，或者用作具有降低的角膜敏感性的干眼癥的治療藥物。
對本發(fā)明的藥劑進行系統(tǒng)性或局部性給藥。系統(tǒng)性地，對它進行口服給藥，而腸胃外地，將它給藥為靜脈內注射、皮下注射、肌內注射等。局部性地，將它給藥到眼中。
作為本發(fā)明的藥劑的劑型，可以提及的有固體藥劑如粉末、顆粒、片劑、膠囊、栓劑等；液體諸如糖漿、注射劑、滴眼劑等等。
對于將本發(fā)明的藥劑生產(chǎn)為顆粒和片劑，可以通過使用，例如，賦形劑(乳糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，微晶體纖維素等)，潤滑劑(硬脂酸鎂，滑石，硬脂酸，硬脂酸鈣等)，崩解劑(淀粉，羧甲纖維素鈉，碳酸鈣等)，粘合劑(淀粉膏溶液，羥丙基纖維素溶液，羧甲基纖維素溶液，阿拉伯樹膠溶液，明膠溶液，海藻酸鈉溶液等)等。對于顆粒和片劑來說，可以利用合適的包被劑(明膠，蔗糖，阿拉伯樹膠，巴西棕櫚蠟等)，腸溶衣(例如，醋酞纖維素，甲基丙烯酸共聚物，羥丙纖維素鄰苯二甲酸酯，羧甲基乙基纖維素等)等形成包衣膜等。
對于將所述藥劑生產(chǎn)為膠囊，將提高流動性和滑動性的合適賦形劑如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石、輕硅酐等，提高在壓力下流動性的微晶體纖維、乳糖等，以及適當添加的上述崩解劑等均勻混合或顆?；?，包以適合的包被劑以形成膜和包裝于膠囊或封裝內，其用具有提高可塑性的膠囊基質塑成，它包含適合的膠囊基質(明膠等)、甘油或山梨糖醇等。這些膠囊可以包含著色劑、防腐劑[二氧化硫，對羥基苯甲酸酯類(對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸丙酯)]等作為必需品。所述膠囊可以是傳統(tǒng)的膠囊，一種腸包衣膠囊，一種胃包衣膠囊或一種緩釋膠囊。當生產(chǎn)腸衣膠囊時，將一種包以腸包衣劑或上述適合的賦形劑的化合物加至一種化合物中并包裝于傳統(tǒng)膠囊中或者膠囊本身可以用腸包衣劑進行包被，或者可以將腸聚合物用作塑模的基質。
對于將本發(fā)明的藥劑生產(chǎn)為栓劑，可以適當?shù)剡x用一種栓劑的基質(例如，可可脂，聚乙烯二醇等)。
對于所述將藥劑生產(chǎn)為糖漿，可以適當?shù)剡x用，例如，穩(wěn)定劑(乙二胺四乙酸鈉等)，混懸劑(阿拉伯樹膠，羧甲纖維素等)，矯味劑(單糖漿，葡萄糖等)，芳香劑等。
對于將本發(fā)明的藥劑生產(chǎn)為注射液或滴眼劑，可以通過將抑制劑溶解或分散在溶液中進行生產(chǎn)，所述溶液適當?shù)匕伤幱锰砑觿┤绲葷B劑(氯化鈉，氯化鉀，甘油，甘露糖醇，山梨糖醇，硼酸，硼砂，葡萄糖，丙二醇等)，緩沖液(磷酸鹽緩沖液，醋酸鹽緩沖液，硼酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，Tris緩沖液，谷氨酸鹽緩沖液，ε-氨基己酸鹽緩沖液等)，防腐劑(對氧基苯甲酸酯，氯代丁醇，苯甲醇，苯扎氯銨，脫氫醋酸鈉，依地酸鈉，硼酸，硼砂等)，增稠劑(羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，聚乙烯醇，聚乙二醇等)，穩(wěn)定劑(亞硫酸氫鈉，硫代硫酸鈉，乙二胺四乙酸鈉，檸檬酸鈉，維生素C，二丁基羥基甲苯等)，pH調節(jié)劑(鹽酸，氫氧化鈉，磷酸，乙酸等)等。
盡管用于上述糖漿、注射劑和滴眼劑的添加劑的量根據(jù)所用添加劑的種類、用途等而變化，它們可以以能夠實現(xiàn)添加劑的目的的濃度加入，等滲劑通常以約0.5至約5.0w/v％加入以使得滲透壓為約229-約343mOsm。此外，緩沖液以約0.01-約2.0w/v％加入，增稠劑以約0.01-約1.0w/v％加入，穩(wěn)定劑以約0.001-約1.0w/v％加入。適當?shù)丶尤雙H調節(jié)劑以通常獲得約3至約9、優(yōu)選約4至約8的pH。
對于本發(fā)明的藥劑特別用作滴眼劑，將包含在本發(fā)明藥劑中的Rho蛋白抑制劑的濃度下限調整為通常約0.00001w/v％，優(yōu)選約0.00005w/v％或更加優(yōu)選為約0.0001w/v％，上限調節(jié)為約0.1w/v％，優(yōu)選約0.05w/v％，更加優(yōu)選約0.01w/v％，進一步優(yōu)選為約0.005w/v％或更加進一步優(yōu)選為約0.001w/v％。
盡管本發(fā)明的藥劑的劑量根據(jù)目標疾病、癥狀、施用受試者、Rho蛋白抑制劑的種類、給藥方法等而變化，當例如將它局部施用于PRK外科手術后的成人的眼睛作為恢復角膜敏感性的藥劑時，例如，將含有約0.001w/v％的C3酶或大約0.003w/v％的Rho蛋白抑制劑如N-(1-芐基-1-4-piperizinyl-1H-吲唑-5-胺·2鹽酸·1/2水合物的液體滴眼劑優(yōu)選滴入眼睛，1天數(shù)次，每劑量約20至約50μL。
此外，當在LASIK外科手術后將本發(fā)明的藥劑向成人口服給藥作為角膜敏感性恢復劑時，例如，優(yōu)選給藥包含大約10mg的Rho蛋白抑制劑，如4-[2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)丙烯酰]肉桂酸的片劑，一天一次或兩次。
實施例通過參考下列實驗例和實施例更詳細地解釋本發(fā)明，這些實驗例和實施例不應理解為是限制性的。
實驗例1在培養(yǎng)的兔三叉神經(jīng)細胞中對于神經(jīng)突發(fā)生的促進作用1)所用動物使用購自Fukusaki Rabbit Warren的日本白兔(2-3天齡)。
2)試驗物質
C3酶[由Upstate生產(chǎn)；外酶C3(在大腸桿菌中表達的重組酶)；目錄#13-118，Lot#23330]3)試驗方法細胞培養(yǎng)物根據(jù)Chan等(Chan，Kuan Y.和Haschke，Richard H.，Exp.Eye Res.，41687-699，1985)的報道分離三叉神經(jīng)細胞。具體地，在乙醚麻醉下，在用生理鹽水進行心臟灌注之后，移去三叉神經(jīng)節(jié)，利用神經(jīng)分散溶液(SUMITOMO BAKELITE Co.，Ltd.)進行分散，并將細胞接種于用聚賴氨酸包被的8孔培養(yǎng)板中(BECTON DICKINSON Co.，Ltd.)。細胞數(shù)目為大約3×103細胞/孔并在為5％CO2，95％空氣和100％濕度，37℃溫度條件下進行培養(yǎng)。對于細胞培養(yǎng)，使用添加了B27添加物(GIBCO；0.02mL/mL培養(yǎng)溶液)和L-谷氨酸(GIBCO；終濃度1mM)的神經(jīng)基(Neurobasal)培養(yǎng)基(GIBGO)，并在細胞接種之后將C3酶(2μg/mL的終濃度)立即加入到培養(yǎng)基中并將細胞培養(yǎng)24小時。
免疫染色培養(yǎng)24小時后，將所述細胞用4％的多聚甲醛于室溫固定2小時，使用抗-神經(jīng)絲200抗體(Sigma生產(chǎn))和與其具有反應性的熒光二抗(Molecular Probes生產(chǎn))對神經(jīng)細胞體和軸突進行熒光染色，所述抗神經(jīng)絲200抗體特異性地識別作為特異于神經(jīng)細胞的中間體絲的神經(jīng)絲。將染色的細胞作為圖像(一幅圖像1.83mm×1.36mm)從熒光顯微鏡輸入計算機中，并計算每幅圖像的整個細胞數(shù)量(t)。據(jù)此，使用圖像分析軟件(MacSCOPE，MITANI CO.生產(chǎn))測量細胞軸突的長度，并將軸突的長度不少于細胞體直徑兩倍的細胞作為神經(jīng)突發(fā)生細胞(a)。輸入多個圖像直到在各個圖像中的總細胞數(shù)(t1+t2+...+tn＝∑t)到達約不少于100。然后計算總神經(jīng)突發(fā)生細胞數(shù)(a1+a2+...+an＝∑a)與總細胞數(shù)(∑t)的比率(％)。為了比較C3酶添加組和非添加組(對照組)的這種比率，進行了t-檢驗并將少于5％的臨界比率作為顯著。
4)試驗結果圖1顯示培養(yǎng)的兔三叉神經(jīng)細胞的熒光顯微圖像，其中A表示在C3酶非添加培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時的對照組細胞，而B顯示在包含終濃度為2μg/mL的C3酶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時的細胞，圖2顯示每組中神經(jīng)突發(fā)生細胞的數(shù)量對細胞總數(shù)的比率。
在對照組中，神經(jīng)突發(fā)生細胞的比率約為細胞總數(shù)的21％，而在C3酶添加組中約為細胞總數(shù)的46％。添加C3酶明顯增加了細胞的數(shù)量，顯示了神經(jīng)突生長(圖2)。
從前述來看，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有Rho抑制劑活性的C3酶促進了三叉神經(jīng)神經(jīng)細胞的神經(jīng)突生長。
實驗例2在培養(yǎng)的兔三叉神經(jīng)細胞中的軸突生長促進作用1)使用的動物使用購自KITAYAMALABES Co.，Ltd的日本白兔(2-3天齡)。
2)試驗物質作為ROCK抑制劑，使用2-氯-6，7-二甲氧基-N-[5-1H-吲唑基]喹唑啉-4-胺，N-(1-芐基-4-哌啶基)-1H-吲引唑-5-胺二鹽酸鹽，4-[2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)丙烯酰]肉桂酸和鹽酸法舒地爾。
按照參考實施例1合成所用的2-氯-6，7-二甲氧基N-[5-1H-吲唑基]喹唑啉-4-胺(其后稱為化合物1)。按照參考實施例2合成所用的N-(1-芐基-4-哌啶基)-1H-吲唑-5-胺二鹽酸·1/2水合物(其后稱為化合物2)。按照參考實施例3合成所用的4-[2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)丙烯酰]肉桂酸(其后稱為化合物3)。使用的鹽酸法舒地爾(其后稱為化合物4)是商購的鹽酸法舒地爾水合物注射劑“Eril Injection 30mg”(Asahi Kasei Corporation生產(chǎn))。
3)細胞培養(yǎng)以與實驗例1相同的方式分離兔三叉神經(jīng)細胞。對于細胞培養(yǎng)，使用通過向神經(jīng)基培養(yǎng)基(GIBCO生產(chǎn))添加B27添加物(GIBCO生產(chǎn)；終濃度2％v/v)和L-谷氨酰胺(GIBCO生產(chǎn)；濃度1mM)而獲得的培養(yǎng)基。將圓的蓋玻片(直徑12mm；SUMITOMO BAKELITE生產(chǎn))在聚賴氨酸/層粘連蛋白包被之后置于24孔板的每個孔中，并將細胞以約3×103細胞/孔接種到載玻片上。在細胞粘附于蓋玻片后(約2小時)，將上述的培養(yǎng)基轉變?yōu)榘糠N測試物質的培養(yǎng)基(化合物1，終濃度10μM；化合物2，終濃度10μM；化合物3，終濃度1μM；化合物4，終濃度10μM)，并將所述細胞培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)條件是5％CO2，95％空氣，濕度100％，37℃。
4)免疫染色培養(yǎng)48小時后，將所述細胞用4％的多聚甲醛于室溫固定2小時。
使用抗-神經(jīng)絲200抗體(Sigma生產(chǎn))和與其具有反應性的熒光二抗(Molecular Probes生產(chǎn))對固定的標本進行熒光染色，所述抗神經(jīng)絲200抗體特異性地識別作為特異于神經(jīng)細胞的中間體絲的神經(jīng)絲。將染色的圖像輸入到計算機中，一幅圖像1.83mm×1.36mm。計算每幅圖像的整個細胞數(shù)量(t)。據(jù)此，使用圖像分析軟件(MacSCOPE，MITANI CO.生產(chǎn))測量細胞軸突的長度和細胞體的直徑，并將軸突的長度不少于細胞體直徑兩倍的細胞作為神經(jīng)突發(fā)生細胞(a)。然后計算總神經(jīng)突發(fā)生細胞數(shù)(a1+a2+...+an＝∑a)與總細胞數(shù)(∑t)的比率(％)。
5)數(shù)據(jù)處理通過Dunnet’s多重檢驗，比較非添加組(對照)和測試物質添加組的神經(jīng)突發(fā)生細胞的比率，并將少于5％的臨界比率作為顯著。
6)測試結果圖3顯示培養(yǎng)的兔三叉神經(jīng)細胞的熒光顯微圖像。
圖3A顯示在未添加測試物質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時的細胞，圖3B顯示在添加化合物1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時的細胞，圖3C顯示在添加化合物2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時的細胞，圖3D顯示在添加化合物3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時的細胞，并且圖3E顯示在添加化合物4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時的細胞。
圖4顯示相對于總細胞數(shù)，非-添加組和相關測試物質添加組中的神經(jīng)突發(fā)生細胞的數(shù)量的比率。對于非添加組，神經(jīng)突發(fā)生細胞對總細胞的比率約為31％，對于化合物1添加組，神經(jīng)突發(fā)生細胞對總細胞的比率約為41％，對于化合物2添加組，神經(jīng)突發(fā)生細胞對總細胞的比率約為57％，對于化合物3添加組，神經(jīng)突發(fā)生細胞對總細胞的比率約為51％，對于化合物4添加組，神經(jīng)突發(fā)生細胞對總細胞的比率約為70％，測試物質添加組顯示了神經(jīng)突發(fā)生細胞比率的明顯的增加或增加的趨勢。
從上述結果來看，已經(jīng)闡明ROCK抑制劑顯示對三叉神經(jīng)細胞的神經(jīng)突發(fā)生促進作用。
參考實施例12-氯-6，7-二甲氧基N-[5-1H-吲唑基]喹唑啉-4-胺的合成(WO 02/076977，實施例1)將2，4-二氯-6，7-二甲氧基喹唑啉(8.6g，64.58mmol)、5-氨基吲唑(4.8g，36.04mmol)和醋酸鉀(7.351g，74.91mmol)加入四氫呋喃/純化水(138mL/62mL)中，并將所述混合物于室溫攪拌過夜。將純水(130mL)加入所述混和物中以使晶體沉淀。用純水洗滌沉淀的晶體并從DMF-H2O中再結晶以得到淺黃色粉末形式的目標產(chǎn)物2-氯-6，7-二甲氧基-N-[5-1H-吲唑基]喹唑啉-4-胺。
mp 278.7-283.8℃.
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ3.93(s，3H)，3.96(s，3H)，7.16(s，1H)，7.60(m，2H)，7.90(s，1H)，8.03(s，1H)，8.12(s，1H)，9.94(s，1H)，13.13(brs，1H).
理論值C17H15N5O2Cl·1/2H2OC，55.97，H，4.14，N，19.20.實測值C，56.05，H，4.46，N，19.22。
參考實施例2N-(1-芐基-4-哌啶基)-1H-吲唑-5-胺二鹽酸鹽1/2水合物(WO 02/100833，
mp 150.1-152.2℃。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.39(m，2H)，1.94(m，2H)，2.08(t，2H，J＝10.8)，2.79(d，2H，J＝11.4)，3.19(m，1H)，3.47(s，3H)，5.11(d，1H，J＝7.8)，6.68(br s，1H)，6.83(dd，1H，J＝8.9，1.7)，7.20-7.37(m，6H)，12.58(br s，1H)。
理論值C19H22N4C，74.48，H，7.24，N，18.29.實測值C，74.42，H，7.27，N，18.37
于室溫向獲得的N-(1-芐基-4-哌啶基)-1H-吲唑-5-胺(6.0g，19.58mmol)的四氫呋喃(60mL)溶液中加入1N-鹽酸/乙醚溶液(38mL)和4N-鹽酸/乙酸乙酯溶液(13mL)，并將所述混合物于室溫攪拌30分鐘。通過對沉淀的固體進行過濾和從甲醇中再結晶來得到N-(1-芐基-4-哌啶基)-1H-吲唑-5-胺二鹽酸鹽1/2水合物(4.32g，56％)。
mp 193.0-194.6℃.
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ2.18(m，1.75H)，2.51(m，0.25H)，2.98(m，1.5H)，3.17(m，0.5H)，3.41(m，2H)，3.68(m，0.75H)，3.90(m，0.25H)，4.25(m，1.5H)，4.46(m，0.5H)，7.40-7.64(m，6H)，7.59(m，1H)，7.70(m，1H)，7.92(m，1H)，8.20(s，1H)，11.02(br s，0.75H)，11.53(br s，0.25H)。
理論值C19H22N42HCl 1/2H2OC，58.76，H，6.49，N，14.43.實測值C，58.49，H，6.48，N，14.45。
參考實施例34-[2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)丙烯酰]肉桂酸的合成(JP2000-44513A，
步驟2向4-甲酰苯甲酸(20g，0.133mol)的吡啶(138ml)溶液中加入丙二酸乙酯一鉀鹽(46g，0.270mol)、對-甲苯磺酸一水合物(50g，0.263mol)和哌啶(2.0mL)，并將所述混合物逐漸加熱。將所述混合物于120℃攪拌1.5小時。在冰冷卻下，將反應混合物用2N鹽酸進行酸化，并收集沉淀物以得到晶體形式的4-羧基肉桂酸乙酯(26.58g，91％)。
步驟3
在氮氣氛下，向4-羧基肉桂酸乙酯(5.0g，22.7mmol)的三氯甲烷(15mL)溶液中逐滴加入亞硫酰二氯(8.4mL)，加入二甲基甲酰胺(1滴)并將所述混合物在回流下加熱30分鐘。將反應混合物在減壓下濃縮以得到?；?。
在氮氣氛下，向在步驟1中獲得的(2，3，4，5，6-五氟苯基)乙酸叔-丁酯(6.35g，23.5mmol)的四氫呋喃(100mL)溶液中逐滴加入1M二(三甲基甲硅烷基)酰胺鋰的甲苯(26mL)溶液，同時用干冰冷卻。5分鐘后，逐滴加入步驟2中獲得的?；鹊乃臍溥秽?100mL)溶液。在逐滴加入完成后的20分鐘，將所述混合物于室溫攪拌1.5小時。將5％的檸檬酸水溶液(120mL)加入反應混合物中，并將所述混合物用乙醚抽提。用水和飽和的鹽水洗滌有機層，在無水硫酸鎂上干燥并在減壓下進行濃縮。用硅膠柱層析對獲得的殘余物進行純化以得到晶體形式的4-[(2RS)-2-(叔-丁氧基羰基)-2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)乙酰基]肉桂酸乙酯(4.83g，44％)。
步驟4將在二噁烷(24ml)中的于步驟3中獲得的4-[(2RS)-2-(叔-丁氧基羰基)-2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)乙?；鵠肉桂酸乙酯(5.6g，11.6mmol)溶液置于抗壓試管中，并加入濃縮的鹽酸(24ml)。將所述反應混合物攪拌4小時，并同時加熱到130℃。用冰冷卻所述反應混合物并將所述沉淀物通過過濾收集以得到晶體形式的4-[(2，3，4，5，6-五氟苯基)乙?；鵠肉桂酸(3.7g，90％)。將4-[(2，3，4，5，6-五氟苯基)乙?；鵠肉桂酸(2.03g，5.7mmol)的二噁烷(115mL)溶液置于抗壓試管中，加入低聚甲醛(0.7g)、二甲基胺鹽酸(1.86g，22.8mmol)、乙酸(10滴)和無水硫酸鎂(8g)，并將所述混合物攪拌過夜，同時加熱到130℃。在冰冷卻下，將反應混合物用0.1N的鹽酸酸化并用乙酸乙酯抽提。用飽和的鹽水洗滌有機層，在無水硫酸鎂上干燥并在減壓下進行濃縮。通過過濾收集沉淀物以得到晶體形式的標題化合物(1.46g，93％)。
mp 214.0-217.0℃.
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.25(s，1H)，6.30(s，1H)，6.46(d，1H，J＝16.2)，7.57(d，2H，J＝8.4)，7.64(d，1H，J＝15.9)，7.78(d，2H，J＝8.4)
參考實施例3ROCK I、ROCK II在兔三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)和角膜組織中的蛋白質表達1)所用的動物使用購自KITAYAMA LABES Co.，Ltd.的雄性日本白兔。
2)組織可溶性蛋白的制備對所述動物進行無痛致死并移去三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)和角膜。將移去的組織置于冰冷的磷酸緩沖鹽(Invitrogen生產(chǎn))溶液中，在包含0.1％TritonX-100(Pharmacia Biotech生產(chǎn))和1片劑/10ml的蛋白酶抑制劑混合物(complete，Mini；Roche生產(chǎn))的冰冷的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)中洗滌和放置并用超聲波破碎。將通過超聲波破碎獲得的每種組織的細胞粗裂解溶液進行離心(10,000g，15min，4°)，并回收上清液以得到組織可溶性蛋白溶液。用BCA Protein Assay Reagent(PIERCE生產(chǎn))對蛋白的量進行定量。
3)使用蛋白質印跡法檢測ROCKI和ROCKII通過蛋白質印跡法檢測制備的組織可溶性蛋白中包含的ROCK I和ROCK II。制備的溶液中包含25μg的使用8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(TEFCO生產(chǎn))電泳分離的蛋白，并將在凝膠中分離的蛋白電轉移到PVDF膜上(Immobilon-P；Millipore)。用5％的去脂牛奶封閉具有轉移蛋白質的膜，使其與山羊抗ROCK I抗體或山羊抗OCK II抗體(二者都是SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY生產(chǎn))反應，并用與抗-山羊IgG抗體偶聯(lián)的堿性磷酸酶(AP)(Bio-Rad，Richmond，CA生產(chǎn))再次標記。使用AP染色試劑盒(Bio-Rad，Richmond，CA生產(chǎn))對所述抗原進行免疫檢測。
4)測試結果蛋白質印跡的結果顯示于圖5中。其證實了ROCK I和ROCK II都在兔三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)和角膜組織的可溶性蛋白中以蛋白質水平進行了表達。
實施例1片劑C3酶10mg乳糖80mg淀粉17mg硬脂酸鎂3mg
微晶纖維素10mg使用以上組分作為一種片劑的材料，按照常規(guī)方法形成片劑。根據(jù)需要可以用常規(guī)的腸溶包衣(例如羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯等)，或糖包衣或薄膜(例如乙基纖維素)包被片劑?？梢詫⒅饕巹?，C3酶轉變?yōu)榛衔?、2、3或4。通過改變添加劑的混合比率，可以制備包含20mg、5mg、1mg、0.5mg或0.1mg/片劑的主要藥劑的片劑。
實施例2膠囊C3酶50mg甘露糖醇75mg淀粉17mg硬脂酸鈣3mg使用以上組分作為一種膠囊的材料，將它們均勻混合，按照常規(guī)方法成粒，并包裝在硬膠囊中。在包裝前，根據(jù)需要用常規(guī)的腸溶包衣(例如羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯)，或糖包衣或薄膜(例如乙基纖維素)包被顆粒?？梢詫⒅饕巹?，C3酶轉變?yōu)榛衔?、2、3或4。通過改變添加劑的混合比率，可以制備包含20mg、10mg、5mg、1mg、0.5mg或0.1mg/膠囊的主要藥劑的膠囊。
實施例3注射劑C3酶750mg羧甲基纖維素鈉 500mg注射用水總量100mL按照常規(guī)方法將以上組分無菌混合以提供注射劑?？梢詫⒅饕巹珻3酶轉變?yōu)榛衔?、2、3或4。通過改變添加劑的混合比率，可以制備包含1000mg、500mg、200mg、或100mg/100mL的主要藥劑的注射劑。
實施例4滴眼劑C3酶5mg硼酸700mg硼砂適量(pH7.0)氯化鈉 500mg羥甲基纖維素0.5g
乙二胺四乙酸鈉0.05mg苯扎氯銨 0.005mg無菌純化水總量100mL將無菌純化水(80mL)加熱至約80℃，加入羥甲基纖維素，攪拌混合物直至液體溫度達到室溫。將C3酶、氯化鈉、硼酸、乙二胺四乙酸鈉和苯扎氯銨加入該溶液使其溶解。加入適量硼砂調節(jié)pH至7。加入無菌純化水以達到100mL?？梢詫⒅饕巹珻3酶轉變?yōu)榛衔?、2、3或4。通過改變添加劑的混合比率，可以制備包含1w/v％、0.5w/v％、0.3w/v％，0.1w/v％、0.05w/v％、0.03w/v％、0.01w/v％、0.003w/v％和0.001w/v％的主要藥劑的滴眼劑。
實施例5滴眼劑C3酶10mgD-甘露糖醇 4.5g磷酸二氫鈉 0.1g氫氧化鈉適量(pH7.0)無菌純化水 總量100mL將C3酶、D-甘露糖醇和磷酸二氫鈉加入無菌純化水(80mL)使其溶解。加入適量氫氧化鈉來調節(jié)pH至5.0。加入無菌純化水以達到100mL。用膜濾器將制備的滴眼劑無菌過濾并裝入一次性(單位劑量)容器和密封?？梢詫⒅饕巹珻3酶轉變?yōu)榛衔?、2、3或4。通過改變添加劑的混合比率，可以制備包含1w/v％、0.5w/v％、0.3w/v％、0.1w/v％、0.05w/v％、0.03w/v％、0.005w/v％、0.003w/v％和0.001w/v％的主要藥劑的滴眼劑。
工業(yè)適用性由于含有Rho蛋白抑制劑的本發(fā)明的藥劑對三叉神經(jīng)細胞具有促神經(jīng)突發(fā)生作用，因此對于改善與角膜神經(jīng)損傷等有關的角膜敏感性的功能降低和與角膜敏感性功能降低有關的干眼癥狀，其是有效的。具體地，期望Rho蛋白抑制劑的應用提供對如下的改善效果白內障外科手術或LASIK外科手術后角膜敏感性降低，與角膜神經(jīng)變性諸如神經(jīng)性麻痹角膜病變、角膜潰瘍、糖尿病性角膜病變等有關的角膜敏感性降低和干眼。
盡管以上已經(jīng)詳細描述了本發(fā)明的一些實施方案，然而，對于本領域的普通技術人員顯而易見的是可以在實質上不背離本發(fā)明新的教導和優(yōu)勢的情形下對所示特定實施方案進行各種改進和變化。因此，這些改進和變化包含在后附權利要求中闡明的本發(fā)明的精神和范圍內。
本申請是基于在日本提交的專利申請?zhí)?14819/2003和273177/2003，其內容特此結合作為參考。
權利要求
1.一種角膜神經(jīng)突發(fā)生促進劑，其包括Rho蛋白抑制劑。
2.一種角膜神經(jīng)軸突延伸促進劑，其包括Rho蛋白抑制劑。
3.一種角膜敏感性恢復劑，其包括Rho蛋白抑制劑。
4.一種干眼治療劑，其包括Rho蛋白抑制劑。
5.一種促進角膜神經(jīng)突發(fā)生的藥物組合物，其包括Rho蛋白抑制劑。
6.一種促進角膜神經(jīng)軸突延伸的藥物組合物，其包括Rho蛋白抑制劑。
7.一種恢復角膜敏感性的藥物組合物，其包括Rho蛋白抑制劑。
8.一種治療干眼的藥物組合物，其包括Rho蛋白抑制劑。
9.Rho蛋白抑制劑用于制備促進角膜神經(jīng)突發(fā)生的藥物組合物的應用。
10.Rho蛋白抑制劑用于制備促進角膜神經(jīng)軸突延伸的藥物組合物的應用。
11.Rho蛋白抑制劑用于制備恢復角膜敏感性的藥物組合物的應用。
12.Rho蛋白抑制劑用于制備治療干眼的藥物組合物的應用。
13.一種促經(jīng)角膜神經(jīng)突發(fā)生的方法，其包括向需要促進角膜神經(jīng)突發(fā)生的受試者施用有效量的Rho蛋白抑制劑。
14.一種促進角膜神經(jīng)軸突延伸的方法，其包括向需要促進角膜神經(jīng)軸突的受試者施用有效量的Rho蛋白抑制劑。
15.一種恢復角膜敏感性的方法，其包括向需要恢復角膜敏感性的受試者施用有效量的Rho蛋白抑制劑。
16.一種治療干眼的方法，其包括向患有干眼的受試者施用有效量的Rho蛋白抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在角膜外科手術后恢復角膜敏感性和改善干眼癥狀的新的藥劑。由于所述藥劑包含Rho蛋白抑制劑，對于改善與角膜神經(jīng)變性諸如白內障手術后、LASIK手術后、PRK手術后、和角膜成形術后、神經(jīng)麻痹性角膜病變、角膜潰瘍、糖尿病性角膜病變等關聯(lián)的角膜敏感性降低以及干眼，其是有效的。
文檔編號A61K31/517GK1777445SQ20048001047
公開日2006年5月24日 申請日期2004年4月16日 優(yōu)先權日2003年4月18日
發(fā)明者高山美子, 中村義邦, 井上淳, 東光佳 申請人:千壽制藥株式會社