專利名稱：支化水溶性聚合物及其綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及支化水溶性聚合物以及由這些支化聚合物形成的綴合物。
背景技術(shù)：
親水性聚合物，比如聚(乙二醇)(縮寫PEG，還稱為聚(環(huán)氧乙烷)，縮寫PEO)與分子和表面的綴合在生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域具有可觀的用途。根據(jù)其最通常的形式，PEG是在各末端用羥基終端的線形聚合物HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH其中n通常是大約3到大約4000。許多末端官能化衍生物在文獻(xiàn)中是已知的，并且可以市購。例如，參見Shearwater Polymers，Inc.“Polyethylene Glycol Derivatives”目錄。
在兩個末端的每一個具有不同基團(tuán)的PEG物質(zhì)是特別有效的化合物。例如，異雙官能PEG可用作交聯(lián)劑。而且，在一個末端例如用烷基“封端”(比如甲氧基)的PEG分子使分子的羥基末端被轉(zhuǎn)化為大量的反應(yīng)性有機(jī)官能團(tuán)的任何一個。
以下所示的環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的無規(guī)或嵌段共聚物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與PEG緊密相關(guān)，它們可以在PEG的許多應(yīng)用中代替PEG。
HO-CH2CHRO-(CH2CHRO)n-CH2CR-OH其中各R獨立地是H或CH3。
在治療活性物質(zhì)和水溶性聚合物之間的綴合物的形成已經(jīng)證明是用于改進(jìn)治療劑的藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)的頗富成效的策略。例如，參見Dunn和Ottenbrite，“Polymeric Drugs and Drug DeliverySystems”ACS Symposium Series 469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。例如，PEG用于衍生化肽治療劑的應(yīng)用已經(jīng)證實可減低肽的免疫原性并延長在循環(huán)中的清除時間。例如，US專利No.4,179,337(Davis等人)涉及偶聯(lián)于聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇的非免疫原性肽，比如酶和肽激素。每摩爾肽使用10-100摩爾聚合物，并保持至少15％的生理活性。
PEG-肽綴合物的許多其它實例在本領(lǐng)域中是已知的。PEG及其衍生物連接于肽的主要方式是通過肽氨基酸殘基的非特異結(jié)合。例如，US專利No.4,088,538公開了以共價鍵連接于PEG的酶的酶活性聚合物-酶綴合物。類似地，US專利No.4,496,689公開了α-1蛋白酶抑制劑與聚合物比如PEG或甲氧基聚(乙二醇)(“mPEG”)的共價鍵連接的復(fù)合物。Abuchowski等人(J.Biol.Chem.2523578(1977)披露了mPEG與牛血清白蛋白的胺基的共價連接。WO93/15189(Veronese等人)涉及通過將蛋白水解酶連接于大分子抑制劑來保持聚乙二醇改性的蛋白水解酶的活性的方法。該綴合物目的用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用。US專利No.4,414,147披露了通過將干擾素綴合于二羧酸的酸酐，比如聚(乙二醇丁二酸酐)而減低其疏水性的方法。PCT WO87/00056公開了PEG和聚(乙氧基化)多元醇綴合于諸如β-干擾素，白介素-2和免疫毒素之類的蛋白的方法。EP 154,316公開并要求了化學(xué)改性淋巴因子，比如含有直接鍵接于該淋巴因子的至少一個伯氨基的PEG的IL-2。US專利No.4,055,635公開了以共價鍵連接于聚合物質(zhì)比如多糖的蛋白水解酶的水溶性復(fù)合物的藥物組合物。
將PEG連接于肽的另一方式是通過在肽上的糖基殘基的非特異氧化。被氧化的糖用作將PEG結(jié)構(gòu)部分連接于肽的位點。例如，M′Timkulu(WO 94/05332)公開了肼-或氨基-PEG用于將PEG加成到糖蛋白的用途。糖基結(jié)構(gòu)部分被無規(guī)地氧化成相應(yīng)的醛，它們隨后偶聯(lián)于氨基-PEG。
在上述各方法中，聚(乙二醇)以無規(guī)、非特異的方式加成到肽骨架上的反應(yīng)性殘基。通常，用PEG衍生化導(dǎo)致了肽活性的損失，這直接歸因于用于綴合該水溶性聚合物的化學(xué)過程的非選擇性性質(zhì)。
與在水溶性聚合物和生物分子之間形成綴合物有關(guān)的另一難題是反應(yīng)性水溶性聚合物試劑在一個以上的位點標(biāo)記生物分子的能力。雖然通常希望每一綴合物包括一個以上的水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分，但生物分子活性的減低程度常常與鍵接于生物分子的聚合物結(jié)構(gòu)部分的數(shù)目成正比。因此，獲取每分子包含兩個或多個水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分的反應(yīng)性、支化物質(zhì)具有重要意義。通過使用支化分子，一個以上的水溶性聚合物能夠綴合于生物分子，而無需干擾生物分子上的一個以上的位點。
基于聚(乙二醇)的支化聚合物在本領(lǐng)域中是已知的。例如，Greenwald等人(WO 98/41562)公開了基于1，3-二氨基-2-丙醇核的支化PEG。Morpurgo及其同事在Appl.Biochem.Biotechnol.5659-72(1996)中論述了基于賴氨酸核的支化PEG的用途。類似的基于賴氨酸的支化PEG被Guiotto等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.12177-180(2002)所制備。Harris等人(US專利No.5,932,462)還制備了基于賴氨酸的支化PEG。Martinez等人(US專利No.5,643,575)描述了許多基于各種核結(jié)構(gòu)的支化PEG物質(zhì)以及這些物質(zhì)與生物活性材料的綴合物(US專利No.6,113,906)。
聚合物，比如聚(乙二醇)已知是作為雜分散群體存在的，其包括了一定范圍的聚合物鏈長和分子量。當(dāng)制備治療制劑時，很顯然，希望采用具有最小的雜分散性的聚合物來確保制劑之間的一致性和重現(xiàn)性。在本領(lǐng)域中已知幾乎沒有制備單分散PEG樣品的方法。Loiseau等人公開了定義明確的PEG分子的合成。該方法采用保護(hù)/去保護(hù)策略，這對于制備大量的基本單分散PEG來說不是最佳的。因此，除了支化聚(乙二醇)聚合物以外，制備單分散PEG和將該單分散材料引入到支化聚合物中的方法是特別理想的。
本發(fā)明回應(yīng)了對于支化水溶性聚合物和單分散PEG物質(zhì)的需求，打開了獲取新型治療綴合物，例如肽綴合物的途徑，并且解決了對于更穩(wěn)定且治療有效的治療物質(zhì)的需求。對于用改性基團(tuán)比如水溶性聚合物改性治療用生物分子的工業(yè)上實用的方法仍然存在著需求。特別有意義的是其中綴合物具有比未改性治療劑改進(jìn)的性能的方法。本發(fā)明滿足了這些和其它需求。
本發(fā)明的簡述本發(fā)明提供了基于多種結(jié)構(gòu)的核的支化水溶性聚合物。本發(fā)明的支化聚合物提供了通過單一連接位置將兩個或多個水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分連接于另一物質(zhì)的手段。本發(fā)明通過參考支化PEG分子來舉例說明。PEG作為代表性水溶性聚合物集中描述是為了說明清楚，不應(yīng)被認(rèn)為限制本發(fā)明。技術(shù)人員會認(rèn)識到，本文所述的支化物質(zhì)可以用基本上任何水溶性聚合物來制備。除了PEG以外，其它示例性水溶性聚合物包括聚(丙二醇)。
在第一個方面，本發(fā)明提供了具有以下通式的支化水溶性聚合物WSP-Y-Rx其中WSP是水溶性聚合物。符號Y表示連接基，例如鍵，或含有酰胺、羧酸酯、脲烷、硫醇、取代或未取代烷基等的結(jié)構(gòu)部分。示例性連接基包括鍵，(CH2)n，(CH2)mC(O)O(CH2)n，(CH2)mC(O)NH(CH2)n，(CH2)mOC(O)NH(CH2)n，(CH2)mO(CH2)n，(CH2)mNH(CH2)n，和(CH2)mS(CH2)n，其中m和n是獨立地選自0-6的整數(shù)。Rx是水溶性聚合物，連接于水溶性聚合物的取代或未取代烷基結(jié)構(gòu)部分；連接于水溶性聚合物的氨基酸或氨基酸的二聚體；或者連接于水溶性聚合物的糖或糖核苷酸。WSP和Rx的水溶性聚合物組分可以是相同的水溶性聚合物或不同的水溶性聚合物。
用于本發(fā)明的化合物的示例性水溶性聚合物包括m-PEG，PEG，m-PPG，PPG，聚唾液酸，聚谷氨酸，聚天冬氨酸，聚賴氨酸，聚乙烯亞胺，可生物降解的聚合物(例如聚交酯，聚甘油酯)，和官能化PEG，例如末端官能化PEG。
在一個示例性實施方案中，Y是取代烷基，以及本發(fā)明提供了具有以下通式的支化水溶性聚合物 其中X和Y是獨立地選自O(shè)R1，NR2R3，SR4，COOR5，CONR6R7，OCONR6R7，取代和未取代的烷基，以及取代和未取代的芳基中的成員。Z1是選自O(shè)R1′，NR2′R3′，SR4′，COOR5′，CONR6′R7′，取代和未取代烷基，以及取代和未取代芳基中的成員。符號R1，R4和R5代表水溶性聚合物。R2，R3，R6和R7是獨立地選自H，取代和未取代烷基，取代和未取代芳基，取代和未取代雜芳基，取代和未取代雜環(huán)烷基，反應(yīng)性官能團(tuán)，以及水溶性聚合物中的成員，前提是選擇這些基團(tuán)，使得根據(jù)通式I的化合物包含至少兩個水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分。符號R1′，R2′，R3′，R4′，R5′，R6′和R7′表示獨立地選自H，取代和未取代烷基，取代和未取代芳基，取代和未取代雜芳基，取代和未取代雜環(huán)烷基，反應(yīng)性官能團(tuán)，載體分子和水溶性聚合物中的基團(tuán)。
在另一個示例性實施方案中，Z1包括糖基(saccharyl)結(jié)構(gòu)部分。糖基結(jié)構(gòu)部分可以是活化糖基結(jié)構(gòu)部分，例如核苷酸糖。此外，Z1能夠包括直接連接于肽的氨基酸的糖基結(jié)構(gòu)部分，或者通過其與連接于氨基酸的糖基殘基的綴合而間接連接于肽的氨基酸的糖基結(jié)構(gòu)部分。
本發(fā)明還提供了基于氨基酸或寡聚氨基酸(例如二肽，三肽，四肽)的支化聚合物。示例性氨基酸型支化聚合物具有選自下列之中的通式
和 其中R11，R11′，R12，R12′，R13和R13′獨立地選自H，取代或未取代烷基和水溶性聚合物，前提是選擇這些基團(tuán)，使得上述化合物包括至少兩個水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分。R14是選自O(shè)H，反應(yīng)性官能團(tuán)，含糖結(jié)構(gòu)部分的基團(tuán)或連接于載體分子的基團(tuán)中的一種。A是選自NH，O和S中的一種。下標(biāo)“s”表示1-5的整數(shù)。
在以上通式中所述的各化合物可用于其它物質(zhì)(例如核酸，肽，糖等)的化學(xué)PEG化。形成PEG(和含有PEG的物質(zhì))之間的綴合物的方法通常在本領(lǐng)域中是已知的。例如，參見Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in ChemistrySeries，Vol.198，American Chemical Society，Washing ton，D.C.，1982。
在另一個示例性實施方案中，R14包括糖基結(jié)構(gòu)部分。該糖基結(jié)構(gòu)部分可以是活化糖基結(jié)構(gòu)部分，例如核苷酸糖。此外，R14能夠包括直接連接于肽的氨基酸的糖基結(jié)構(gòu)部分，或者通過其與連接于氨基酸的糖基殘基的綴合而間接連接于肽的氨基酸的糖基結(jié)構(gòu)部分。
在又一個方面，本發(fā)明提供了基于糖核(“支型核”)的支化水溶性聚合物。技術(shù)人員清楚，糖核可以具有任何結(jié)構(gòu)。用于本發(fā)明的這方面的示例性糖包括GlcNAc，Gal，Sia，F(xiàn)uc，Glc，GalNAc，GalNH2，GlcNH2等。
本發(fā)明的示例性化合物具有以下通式糖-O-(L-WSP)2
其中L是連接基和WSP是水溶性聚合物。
在另一個示例性實施方案中，本發(fā)明的糖基支化水溶性聚合物具有以下通式核苷酸-糖-O-(L-WSP)2根據(jù)本發(fā)明的該方面的另一示例性化合物(基于唾液酸核)具有以下通式 其中R16和R16′是選自H，乙?；屯ㄊ?I)中的成員 以及R17，R18，R19和R19′是獨立地選自H，OH，NH2，NHAc和根據(jù)通式I的結(jié)構(gòu)部分中的成員。在通式I中，Z2是選自O(shè)，S，CH2和S中的一種。R11如上所述，以及下標(biāo)“a”表示0-20的整數(shù)，前提是R16，R16′，R17，R18，和R19的至少兩個具有根據(jù)通式I的結(jié)構(gòu)。R11還可以是連接于載體分子的基團(tuán)或鍵接于載體分子的鍵。R15是選自H和活化基團(tuán)，例如磷酸核苷酸中的一員。
在另一個方面，該支化聚合物基于半乳糖或N-乙?；肴樘牵渚哂幸韵峦ㄊ?
其中R15-R19如上所述，R15-R19的至少兩個是根據(jù)通式I的結(jié)構(gòu)部分。
具有如上所示的通式的其它示例性糖衍生的結(jié)構(gòu)是甘露糖和基于葡萄糖的支化水溶性聚合物。
此外，R15可以包括連接于肽的氨基酸的鍵，或連接于糖基結(jié)構(gòu)部分的鍵，該糖基結(jié)構(gòu)部分直接鍵合于肽的氨基酸，或通過綴合于連接氨基酸的糖基殘基而間接鍵合于肽的氨基酸。
本發(fā)明還提供了制備聚(乙二醇)分子的基本單分散群體的方法。該方法包括讓具有明確的分子量的PEG分子，例如PEG200與至少2當(dāng)量的也具有明確分子量的雙官能活化PEG，例如PEG200接觸，從而產(chǎn)生PEG的單分散樣品，例如PEG600 G是離去基團(tuán)，比如磺酸酯或tresylate酯。PEG600的單分散樣品然后可以與雙官能活化PEG200接觸，形成單分散PPEG100?；蛘撸瑔畏稚EG600可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的雙官能化衍生物，再與至少2當(dāng)量的單分散二羥基-PEG600反應(yīng)，產(chǎn)生單分散PEG1800。重復(fù)本發(fā)明的方法，直到獲得所需大小的單分散PEG為止?？梢栽O(shè)計該合成，使得在起始原料和產(chǎn)物之間的分子量差允許通過尺寸排阻色譜法而分離任何未反應(yīng)或部分反應(yīng)的材料。
而且，作為對制備改性水溶性聚合物，比如聚(乙二醇)的改進(jìn)方法的需求的回應(yīng)，本發(fā)明提供了化學(xué)活化和延長聚合物骨架的方法。單活化PEG分子可用于將PEG綴合于各種物質(zhì)，例如靶向結(jié)構(gòu)部分，治療用結(jié)構(gòu)部分，抗腫瘤藥物，細(xì)胞毒素，放射劑，氨基酸類，糖等。
因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了活化水溶性聚合物，尤其聚(乙二醇)及其結(jié)構(gòu)類似物的分步組裝的方法。該方法提供了獲得單官能化和雙官能化PEG分子的方便途徑。
因此，在一個示例性實施方案中，本發(fā)明提供了制備聚(乙二醇)的方法。下面概述了該方法 a.R-Y/(酸或堿)；b.活化，例如甲苯磺?；?，鹵-去羥基化，例如HX或SOX2，以及與PEGm反應(yīng)；c.活化(R′)，例如用氯甲酸對硝基苯基酯。
其中，下標(biāo)m和n獨立地表示1-100,000。
在步驟a中，起始二醇與活化基團(tuán)(R-Y)接觸，該活化基團(tuán)與二醇的羥基結(jié)構(gòu)部分反應(yīng)。Y通常是離去基團(tuán)，使R安放在PEG分子的羥基結(jié)構(gòu)部分之一上。在步驟b中，所得加合物的游離羥基通過其轉(zhuǎn)化為磺酸酯類的基團(tuán)來活化?；罨腜EG物質(zhì)與作為起始PEG(“PEGm”)的相同或不同聚合度的另一PEG結(jié)構(gòu)部分接觸。為了使其連接于另一物質(zhì)，RO-PEG(n+m)任選在游離羥基結(jié)構(gòu)部分處活化。
本發(fā)明的化合物可用于通過一個或多個可獲得的反應(yīng)性殘基在治療劑上的直接化學(xué)PEG化，形成底物比如治療劑，例如肽，脂類，糖脂的水溶性聚合物綴合物。本發(fā)明的化合物也容易引入到可以在底物，例如治療劑的酶介導(dǎo)的糖-PEG化中采用的活化的糖綴合物中。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的一個或多個支化水溶性聚合物綴合于其上的治療劑的藥物制劑。還提供了治療疾病的方法，這些疾病通過給予治療劑和本發(fā)明的支化水溶性聚合物之間的綴合物來改善或治愈。
本發(fā)明的其它方面、優(yōu)點和目的可以從以下的詳細(xì)說明中了解到。
附圖
簡述本發(fā)明的詳細(xì)說明縮寫PEG，聚(乙二醇)；m-PEG，甲氧基-聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；m-PPG，甲氧基-聚(丙二醇)；Fuc，巖藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰氨基半乳糖基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰氨基葡糖基；Man，氨基甘露糖基；ManAc，氨基甘露糖基乙酸酯；Sia，唾液酸；和NeuAc，N-乙?；窠?jīng)胺基(N-acetylneuraminyl)。
定義除非另有規(guī)定，否則本文所使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語通常具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的一般理解相同的含義。通常，在本文和細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機(jī)化學(xué)以及核酸化學(xué)和交叉學(xué)科的實驗工序中使用的命名法是眾所周知和本領(lǐng)域常用的那些。核酸和肽合成采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。該技術(shù)和工序一般按照本領(lǐng)域的普通方法和各種一般參考文獻(xiàn)來進(jìn)行(一般參見，Sambrook等人，MOLECULAR CLONING；A LABORATORY MANUAL，2d ed.(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，該文獻(xiàn)引入本文供參考)，它們在整個文件中被提供。在本文和分析化學(xué)的實驗工序以及下述有機(jī)合成中采用的命名法是本領(lǐng)域眾所周知和常用的那些?；瘜W(xué)合成和化學(xué)分析采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或它們的改進(jìn)。
本文所使用的術(shù)語“糖綴合(glycoconjugation)”是指改性糖物質(zhì)與肽的氨基酸或糖殘基的酶介導(dǎo)的綴合。“糖綴合”的亞屬是“糖-PEG化”，其中改性糖的改性基團(tuán)是聚(乙二醇)，以及它的烷基衍生物(例如m-PEG)或反應(yīng)性衍生物(例如H2N-PEG，HOOC-PEG)。
術(shù)語“唾液酸”是指九碳羧基化糖的家族的任何成員。唾液酸家族的最常見的成員是N-乙?；?神經(jīng)氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-D-甘油-D-半乳糖壬酮糖吡喃糖-1-酸(galactononulopyranos-1-onic acid)，常縮寫為Neu5Ac，NeuAc或NANA)。該家族的第二個成員是N-羥乙?；?神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙?；涣u基化。第三個唾液酸家族成員是2-酮-3-脫氧-壬酮糖酸(nonulosonic acid)(KDN)(Nadano等人(1986)，J.Biol.Chem.26111550-11557；Kanamori等人，J.Biol.Chem.26521811-21819(1990))。還包括了9-取代的唾液酸比如9-O-C1-C6?；?Neu5Ac如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙?；?Neu5Ac，9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac。關(guān)于唾液酸家族的評述，例如參見Varki，Glycobiology 225-40(1992)；Sialic AcidsChemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer-Verlag，New York(1992))。唾液酸化合物在唾液酸化工序中的合成和用途公開在1992年10月1日出版的國際申請WO92/16640中。
“肽”是指聚合物，其中單體是氨基酸并通過酰胺鍵連接在一起，或者稱之為多肽。另外，非天然氨基酸，例如β-丙氨酸，苯基甘氨酸和高精氨酸也被包括。非基因編碼的氨基酸也可以在本發(fā)明中采用。此外，已經(jīng)被改性成包含反應(yīng)性基團(tuán)，糖基化位點，聚合物，治療用結(jié)構(gòu)部分，生物分子等的氨基酸也可以在本發(fā)明中采用。在本發(fā)明中使用的所有氨基酸可以是D-或L-異構(gòu)體。L-異構(gòu)體一般是優(yōu)選的。另外，其它擬肽(peptidomimetics)也可用于本發(fā)明。本文所使用的“肽”是指糖基化肽和非糖基化肽。還包括了被表示肽的體系不完全糖基化的肽。關(guān)于一般評述，參見Spatola，A.F.，CHEMISTRY ANDBIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。
術(shù)語“肽綴合物”是指本發(fā)明的物質(zhì)，其中肽與如本文所述的改性糖進(jìn)行糖綴合。作為代表性實例，該肽是具有不存在于野生型肽中的O-連接的糖基化位點的突變肽。
術(shù)語“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及氨基酸類似物和以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的擬氨基酸。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼所編碼的那些氨基酸，以及后來改性的那些氨基酸，例如羥基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，以及O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即，具有鍵接于氫，羧基，氨基和R基團(tuán)的α碳，例如高絲氨酸，正亮氨酸，蛋氨酸亞砜，蛋氨酸甲基锍。這些類似物具有改性R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或改性肽骨架，但保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。擬氨基酸是指具有不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，但以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的化合物。
如本文所使用的術(shù)語“改性糖”是指天然存在或非天然存在的碳水化合物，用本發(fā)明的支化水溶性聚合物改性，可以酶促加成到肽、脂類、糖脂等的氨基酸或糖基殘基上。改性糖選自許多酶底物，包括、但不限于糖核苷酸(一磷酸酯，二磷酸酯和三磷酸酯)，活化糖(例如鹵化糖，糖基甲磺酸酯)和既未活化也未核苷酸化的糖類?！案男蕴恰庇谩案男曰鶊F(tuán)”(它是本發(fā)明的支化聚合物)共價官能化。選擇用改性基團(tuán)官能化的位置，使得它不阻礙“改性糖”酶促加成到肽或其它底物上。
術(shù)語“水溶性”是指在水中具有可檢測到的溶解度的結(jié)構(gòu)部分。檢測和/或定量水溶性的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。示例性水溶性聚合物包括肽，糖類，聚(醚)，聚(胺)，聚(羧酸)等。肽可以具有由單一氨基酸組成的混合序列，例如聚(賴氨酸)。示例性多糖是聚(唾液酸)。示例性聚(醚)是聚(乙二醇)，例如m-PEG。聚(乙烯亞胺)是示例性聚胺，以及聚(丙烯酸)是代表性聚(羧酸)。
術(shù)語“聚(乙二醇)”，“PEG”，“聚(丙二醇)”和“PPG”以它們的一般意義使用，它們還包括了該母體化合物的衍生物，例如單烷基物質(zhì)，例如m-PEG，m-PPG，反應(yīng)性物質(zhì)，N-羥基丁二酰亞胺，對硝基苯基碳酸酯(p-NP)，HOBT衍生物，和胺類。還包括在這些術(shù)語范圍內(nèi)的是包含兩個或多個改性的物質(zhì)，例如p-NP-PEG-OMe等。
本文所使用的術(shù)語“糖基連接基”是指糖基殘基，作用劑(例如水溶性聚合物，治療用結(jié)構(gòu)部分，生物分子)以共價鍵連接于它。在本發(fā)明的方法中，“糖基連接基”以共價鍵連接于糖基化或非糖基化肽，從而將作用劑連接于肽上的氨基酸和/或糖基殘基上?！疤腔B接基”一般通過“改性糖”與肽的氨基酸和/或糖基殘基的酶促連接而由“改性糖”產(chǎn)生?！巴暾奶腔B接基”是指由糖基結(jié)構(gòu)部分衍生的連接基，其中連接綴合物的各糖單體不被降解，例如不被氧化，例如不被偏高碘酸鈉所氧化。本發(fā)明的“完整糖基連接基”可以通過從母體糖結(jié)構(gòu)中增加糖基單元或除去一個或多個糖基單元而由天然存在的寡糖產(chǎn)生。
本文所使用的“藥學(xué)可接受的載體”包括任何材料，當(dāng)與綴合物結(jié)合時，保持了綴合物的活性，并且不與患者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。實例包括、但不限于標(biāo)準(zhǔn)藥物載體的任何一種，比如磷酸鹽緩沖的鹽水溶液，水，乳液比如油/水乳液，以及各種類型的潤濕劑。其他載體還可以包括消毒液，片劑，包括包衣片劑和膠囊。典型地，這些載體含有賦型劑比如淀粉，牛奶，糖，某些類型的粘土，明膠，硬脂酸或它的鹽，硬脂酸鎂或硬脂酸鈣，滑石，植物脂肪或油，樹膠，二醇類，或其它已知的賦型劑。此類載體還可以包括香味劑和顏色添加劑或其它成分。包括此類載體的組合物通過公知的普通方法來配制。
本文所使用的“給藥”是指口服給藥，作為栓劑給藥，局部接觸，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，損傷區(qū)，或皮下給藥，吸入給藥，或植入患者體內(nèi)的緩釋設(shè)備，例如微滲透泵。給藥可通過任何途徑，包括非腸道和透過粘膜方式(例如口服，經(jīng)鼻，經(jīng)陰道，經(jīng)直腸或透皮)，尤其通過吸入。非腸道給藥包括例如靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，小動脈內(nèi)，真皮內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)，心室內(nèi)，和顱內(nèi)。而且，如果注射用于治療腫瘤，例如，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，可以直接給藥給腫瘤和/或腫瘤周圍的組織。其它輸送方式包括、但不限于使用脂質(zhì)體配制劑，靜脈內(nèi)輸入，透皮貼劑等。
術(shù)語“分離的”是指大體上或基本上不含用于生產(chǎn)該材料的組分的材料。對于本發(fā)明的肽綴合物，術(shù)語“分離的”是指大體上或基本上不含正常在用于制備肽綴合物的混合物中該材料所伴有的組分的材料?！胺蛛x的”和“純”可以互換使用。典型地，本發(fā)明的分離的肽綴合物具有優(yōu)選按范圍表示的一定純度。肽綴合物純度范圍的下限是大約60％，大約70％或大約80％，而純度范圍的上限是大約70％，大約80％，大約90％或超過大約90％。
當(dāng)肽綴合物超過大約90％純度時，它們的純度也優(yōu)選按范圍表示。純度范圍的下限是大約90％，大約92％，大約94％，大約96％，或大約98％。純度范圍的上限是大約92％，大約94％，大約96％，大約98％或大約100％純度。
純度通過任何技術(shù)公認(rèn)的分析方法來測定(例如，在銀染色的凝膠上的譜帶強(qiáng)度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，HPLC或類似方式)。
本文所使用的“群體的基本上各成員”描述了本發(fā)明的肽綴合物的群體的特性，其中將選擇的百分率的加到多肽上的改性糖加到肽上的多個相同的受體位點上?！叭后w的基本上各成員”說到了在綴合于改性糖的肽的位點的“均勻性”，是指至少大約80％，優(yōu)選至少大約90％和更優(yōu)選至少大約95％均勻的本發(fā)明的綴合物。
“均勻性”是指改性糖綴合于其上的受體結(jié)構(gòu)部分的群體的結(jié)構(gòu)一致性。因此，在其中各改性糖結(jié)構(gòu)部分綴合于結(jié)構(gòu)與每個其他改性糖所綴合的受體位點相同的受體位點的本發(fā)明的肽綴合物中，該肽綴合物被說成是大約100％均勻的。均勻性通常按范圍來表示。肽綴合物的均勻性范圍的下限是大約60％，大約70％，或大約80％，而純度范圍的上限是大約70％，大約80％，大約90％，或超過大約90％。
當(dāng)肽綴合物超過或等于大約90％均勻性時，它們的均勻性也優(yōu)選按范圍表示。均勻性的范圍的下限是大約90％，大約92％，大約94％，大約96％或大約98％。純度范圍的上限是大約92％，大約94％，大約96％，大約98％或大約100％均勻性。肽綴合物的純度一般通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種方法，例如液相色譜法一質(zhì)譜法(LC-MS)，基質(zhì)輔助激光解吸時間飛行質(zhì)譜(MALDITOF)，毛細(xì)管電泳等。
當(dāng)提到糖肽物質(zhì)時，“基本均勻的糖形”或“基本均勻的糖基化形式”是指被所研究的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)糖基化的受體結(jié)構(gòu)部分的百分率。例如，在α1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的情況下，如果在本發(fā)明的肽綴合物中基本上所有(如以下所定義)的Ga1B1，4-G1cNAc-R及其唾液酸基化類似物被巖藻糖基化，則具有基本均勻的巖藻糖基化形式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚，起始原料可以含有糖基化受體結(jié)構(gòu)部分(例如巖藻糖基化Ga1β1，4-G1cNAc-R結(jié)構(gòu)部分)。因此，計算的糖基化百分率包括用本發(fā)明的方法糖基化的受體結(jié)構(gòu)部分，以及已經(jīng)在起始原料中糖基化的那些受體結(jié)構(gòu)部分。
在“基本均勻”的以上定義中的術(shù)語“基本”一般是指特定糖基轉(zhuǎn)移酶的至少大約40％，至少大約70％，至少大約80％，或更優(yōu)選至少大約90％，還更優(yōu)選至少大約95％的受體結(jié)構(gòu)部分被糖基化。
術(shù)語“大規(guī)?！焙汀肮I(yè)規(guī)?！笨苫Q使用，是指在一個反應(yīng)周期結(jié)束時產(chǎn)生了至少大約250mg，優(yōu)選至少大約500mg和更優(yōu)選至少大約1g的糖綴合物的反應(yīng)周期。
不論是用作鍵還是顯示與鍵垂直，符號 表示所顯示的結(jié)構(gòu)部分連接于分子的剩余部分，固體載體等的位置。
本發(fā)明的某些化合物可以以非溶劑化形式以及溶劑化形式存在，包括水合形式。一般，溶劑化形式等同于非溶劑化形式，并包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的某些化合物可以以多種結(jié)晶或非晶形式存在。一般，對于由本發(fā)明所設(shè)想的應(yīng)用，所有物理形式是等效的，并且是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的某些化合物具有非對稱碳原子(光學(xué)中心)或雙鍵；外消旋體、非對映異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體和單一異構(gòu)體包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的化合物可以作為單一異構(gòu)體(例如對映體，順-反式，位置，非對映異構(gòu)體)或作為異構(gòu)體的混合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，化合物作為基本上單一異構(gòu)體制備。制備基本上異構(gòu)純化合物的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，富含對映體的混合物和純對映體化合物可以通過使用純對映體的合成中間體與保持手性中心的立體化學(xué)不變或?qū)е缕渫耆D(zhuǎn)換的反應(yīng)來制備。或者，最終產(chǎn)物或合成途徑中的中間體可以被解析為單一立體異構(gòu)體。轉(zhuǎn)換或保持特定立體中心不變的技術(shù)以及用于解析立體異構(gòu)體的混合物的那些技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的，并且明顯是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ糜谔囟ㄇ闆r的能力范圍內(nèi)。通常，可參見Furniss等人(eds.)，VOGEL′SENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5THED.，LongmanScientific and Technical Ltd.，Essex，1991，pp.809-816；和Heller，Acc.Chem.Res.23128(1990)。
本發(fā)明的化合物還可以在構(gòu)成此類化合物的一個或多個原子處含有非自然比例的原子同位素。例如，這些化合物可以用放射性同位素，例如氚(3H)，碘-125(125I)或碳-14(14C)標(biāo)記。不論是否具有放射性，本發(fā)明的化合物的所有同位素變型意圖包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如果取代基用從左到右書寫的它們的普通化學(xué)式來表示，它們同樣包括了由從右到左書寫結(jié)構(gòu)式所獲得的化學(xué)相同的取代基，例如-CH2O-還可以書寫為-OCH2-。
除非另有規(guī)定，否則本身或作為另一取代基的一部分的術(shù)語“烷基”是指直鏈或支鏈，或環(huán)狀烴基，或者它們的結(jié)合物，其可以是全飽和的、單或多不飽和的，可以包括二價(“亞烷基”)和多價基團(tuán)，具有指定的碳原子數(shù)(即C1-C10是指1-10個碳原子)。飽和烴基的實例包括、但不限于諸如以下之類的基團(tuán)甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，叔丁基，異丁基，仲丁基，環(huán)己基，(環(huán)己基)甲基，環(huán)丙基甲基，類似物和異構(gòu)體，例如正戊基，正己基，正庚基，正辛基等的類似物和異構(gòu)體。不飽和烷基是具有一個或多個雙鍵或三鍵的烷基。不飽和烷基的實例包括、但不限于乙烯基，2-丙烯基，巴豆基，2-異戊烯基，2-(丁二烯基)，2，4-戊二烯基，3-(1，4-戊二烯基)，乙炔基，1-和3-丙炔基，3-丁炔基，以及高級類似物和異構(gòu)體。除非另有規(guī)定，否則術(shù)語“烷基”還意圖包括在以下更詳細(xì)定義的烷基的那些衍生物，比如“雜烷基”。限于烴基的烷基被稱為“同烷基(homoalkyl)”。
用于本發(fā)明的示例性烷基含有大約1到大約25個碳原子(例如甲基，乙基等)。具有≤8個碳原子的直鏈、支化或環(huán)狀烴鏈將在本文稱為“低級烷基”。另外，本文所使用的術(shù)語“烷基”進(jìn)一步包括在烴鏈片段的一個或多個碳原子上的一個或多個取代基。
術(shù)語“烷氧基”，“烷基氨基”或“烷硫基”(或硫代烷氧基)以它們的通常意義使用，是指分別經(jīng)由氧原子、氨基或硫原子連接于分子的剩余部分的那些烷基。
除非另有規(guī)定，本身或與另一術(shù)語結(jié)合的術(shù)語“雜烷基”是指直鏈或支鏈，或者環(huán)狀含碳基團(tuán)，或者它們的結(jié)合物，由所述數(shù)目的碳原子和選自O(shè)、N、Si、P和S中的至少一個雜原子組成，其中氮、磷和硫原子任選被氧化，以及氮雜原子任選被季化。雜原子O、N、P、S和Si可以位于雜烷基的任何內(nèi)部位置或者烷基連接于分子的剩余部分的位置。實例包括、但不限于-CH2-CH2-O-CH3，-CH2-CH2-NH-CH3，-CH2-CH2-N(CH3)-CH3，-CH2-S-CH2-CH3，-CH2-CH2-S(O)-CH3，-CH2-CH2-S(O)2-CH3，-CH＝CH-O-CH3，-Si(CH3)3，-CH2-CH＝N-OCH3，和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多兩個雜原子可以是連續(xù)的，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。類似地，本身或作為另一取代基的一部分的術(shù)語“亞雜烷基”是指由雜烷基衍生的二價基團(tuán)，例如、但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對于亞雜烷基，雜原子還可以占據(jù)鏈末端的一個或兩個(例如亞烷氧基，亞烷基二氧基，亞烷基氨基，亞烷基二氨基等)。此外，對于亞烷基和亞雜烷基連接基，連接基的無取向用其中連接基的化學(xué)式書寫的方向來表示。例如化學(xué)式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-和-R′C(O)2-。
除非另有規(guī)定，本身或與其它術(shù)語結(jié)合的術(shù)語“環(huán)烷基”和“雜環(huán)烷基”分別表示“烷基”和“雜烷基”的環(huán)狀變型。另外，對于雜環(huán)烷基，雜原子可以占據(jù)雜環(huán)連接于分子的剩余部分的位置。環(huán)烷基的實例包括、但不限于環(huán)戊基，環(huán)己基，1-環(huán)己烯基，3-環(huán)己烯基，環(huán)庚基等。雜環(huán)烷基的實例包括、但不限于1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)，1-哌啶基，2-哌啶基，3-哌啶基，4-嗎啉基，3-嗎啉基，四氫呋喃-2-基，四氫呋喃-3-基，四氫噻吩-2-基，四氫噻吩-3-基，1-哌嗪基，2-哌嗪基等。
除非另有規(guī)定，術(shù)語“芳基”是指多不飽和芳族結(jié)構(gòu)部分，其可以是單環(huán)或多環(huán)(優(yōu)選1-3個環(huán))，稠合在一起或共價鍵連接。術(shù)語“雜芳基”是指含有選自N、O和S中的1-4個雜原子的芳基(或環(huán))，其中氮和硫原子任選被氧化，以及氮原子任選被季化。雜芳基可以通過雜原子連接于分子的剩余部分。芳基和雜芳基的非限制性實例包括苯基，1-萘基，2-萘基，4-聯(lián)苯基，1-吡咯基，2-吡咯基，3-吡咯基，3-吡唑基，2-咪唑基，4-咪唑基，吡嗪基，2-噁唑基，4-噁唑基，2-苯基-4-噁唑基，5-噁唑基，3-異噁唑基，4-異噁唑基，5-異噁唑基，2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-嘧啶基，4-嘧啶基，5-苯并噻唑基，嘌呤基，2-苯并咪唑基，5-吲哚基，1-異喹啉基，5-異喹啉基，2-喹喔啉基，5-喹喔啉基，3-喹啉基，四唑基，苯并[b]呋喃基，苯并[b]噻吩基，2，3-二氫苯并[1，4]二噁嗪-6-基，苯并[1，3]-間二氧雜環(huán)戊烯-5-基和6-喹啉基。上述芳基和雜芳基環(huán)體系各自的取代基選自下述可接受的取代基。
為了簡便起見，當(dāng)與其它術(shù)語結(jié)合使用時(例如芳氧基，芳硫氧基(arylthioxyl)，芳烷基)，術(shù)語“芳基”包括如以上定義的芳基和雜芳基。因此，術(shù)語“芳烷基”包括其中芳基連接于烷基的那些基團(tuán)(例如芐基，苯乙基，吡啶基甲基等)，包括所述烷基中碳原子(例如亞甲基)被例如氧原子置換的那些烷基(例如苯氧基甲基，2-吡啶氧基甲基，3-(1-萘氧基)丙基等)。
以上各術(shù)語(例如“烷基”，“雜烷基”，“芳基”和“雜芳基”)包括所述基團(tuán)的取代和未取代形式。以下提供了各類基團(tuán)的優(yōu)選的取代基。
烷基和雜烷基(包括常常稱為亞烷基、鏈烯基、亞雜烷基、雜鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基)的取代基一般被稱為“烷基取代基”，它們可以是選自、但不限于以下基團(tuán)中的各種基團(tuán)的一個或多個-OR′，＝O，＝NR′，＝N-OR′，-NR′R″，-SR′，-鹵素，-SiR′R″R，-OC(O)R′，-C(O)R′，-CO2R′，-CONR′R″，-OC(O)NR′R″，-NR″C(O)R′，-NR′-C(O)NR″R，-NR″C(O)2R′，-NR-C(NR′R″R)＝NR″″，-NR-C(NR′R″)＝NR，-S(O)R′，-S(O)2R′，-S(O)2NR′R″，-NRSO2R′，-CN和-NO2，數(shù)目是0到(2m′+1)，其中m′是在這種基團(tuán)中的碳原子的總數(shù)。R′，R″，R和R″″各自優(yōu)選獨立表示氫，取代或未取代雜烷基，取代或未取代芳基，例如被1-3個鹵素取代的芳基，取代或未取代烷基，烷氧基或硫代烷氧基，或芳烷基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包括一個以上的R基團(tuán)時，例如，當(dāng)存在一個以上的這些基團(tuán)時，各R基團(tuán)獨立地選擇，各R′，R″，R和R″″基團(tuán)同樣獨立地選擇。當(dāng)R′和R″連接于同一個氮原子時，它們可以與該氮原子結(jié)合，形成5、6或7元環(huán)。例如，-NR′R″意圖包括、但不限于1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從取代基的以上論述可以看出，本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚，術(shù)語“烷基”意圖包括含有鍵接于非氫基的基團(tuán)的基團(tuán)，比如鹵代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和?；?例如，-C(O)CH3，-C(O)CF3，-C(O)CH2OCH3等)。
與對于烷基所述的取代基類似，芳基和雜芳基的取代基一般被稱為“芳基取代基”。這些取代基例如選自鹵素，-OR′，＝O，＝NR′，＝N-OR′，-NR′R″，-SR′，-鹵素，-SiR′R″R，-OC(O)R′，-C(O)R′，-CO2R′，-CONR′R″，-OC(O)NR′R″，-NR″C(O)R′，-NR′-C(O)NR″R，-NR″C(O)2R′，-NR-C(NR′R″R)＝NR″″，-NR-C(NR′R″)＝NR，-S(O)R′，-S(O)2R′，-S(O)2NR′R″，-NRSO2R′，-CN和-NO2，-R′，-N3，-CH(Ph)2，氟(C1-C4)烷氧基，和氟(C1-C4)烷基，數(shù)目是0到在芳環(huán)體系上的開放化合價的總數(shù)；其中R′，R″，R和R″″優(yōu)先獨立地選自氫，取代或未取代烷基，取代或未取代雜烷基，取代或未取代芳基和取代或未取代雜芳基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包括一個以上的R基團(tuán)時，例如，當(dāng)存在一個以上的這些基團(tuán)時，各R基團(tuán)獨立地選擇，各R′，R″，R和R″″基團(tuán)同樣獨立地選擇。在以下的路線圖中，符號X表示如上所述的“R”。
在芳基或雜芳基的相鄰原子上的兩個取代基可以任選被化學(xué)式-T-C(O)-(CRR′)q-U-的取代基代替，其中T和U獨立地是-NR-，-O-，-CRR′-或單鍵，以及q是0-3的整數(shù)?；蛘?，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可以任選被化學(xué)式-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中A和B獨立地是-CRR′-，-O-，-NR-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2NR′-或單鍵，以及r是1-4的整數(shù)。這樣形成的新環(huán)的單鍵之一可以任選被雙鍵代替。或者，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可以任選被化學(xué)式(CRR′)s-X-(CR″R)d-的取代基代替，其中s和d獨立地是0-3的整數(shù)，以及X是-O-，-NR′-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-或-S(O)2NR′-。取代基R，R′，R″和R優(yōu)選獨立地選自氫或取代或未取代(C1-C6)烷基。
本文所使用的術(shù)語“雜原子”包括氧(O)，氮(N)，硫(S)，磷(P)和硅(Si)。
術(shù)語“氨基”或“胺基”是指基團(tuán)-NR′R″(或-N+RR′R″)，其中R，R′和R″獨立地選自氫，烷基，取代烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，取代芳烷基，雜芳基和取代雜芳基。取代的胺是其中R′或R″不是氫的胺基。在伯氨基中，R′和R″均是氫，而在仲氨基中，R′或R″的任何一個(但不是兩個)是氫。另外，術(shù)語“胺”和“氨基”可以包括氮的質(zhì)子化和季化變型，包括基團(tuán)-N+RR′R″和它的生物學(xué)相容性陰離子抗衡離子。
除非另有規(guī)定，本身或作為另一取代基的一部分的術(shù)語“鹵代”或“鹵素”是指氟，氯，溴或碘原子。另外術(shù)語比如“鹵代烷基”意圖包括單鹵代烷基和多鹵代烷基。例如，術(shù)語“鹵代(C1-C4)烷基意圖包括、但不限于三氟甲基，2，2，2-三氟乙基，4-氯丁基，3-溴丙基等。
本文所使用的術(shù)語“連接基”或“L”是指包括了選自C、N、O、S和P中的1-20個非氫原子的單一共價鍵或系列穩(wěn)定的共價鍵，以共價鍵將水溶性聚合物或支化水溶性聚合物連接于另一結(jié)構(gòu)部分比如化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)或綴合物質(zhì)，包括生物和非生物物質(zhì)。示例性連接部分包括含有-C(O)NH-，-C(O)O-，-NH-，-S-，-O-等的結(jié)構(gòu)部分?！翱闪呀獾倪B接基”是具有可被反應(yīng)的結(jié)果或條件所斷裂的一個或多個可裂解基團(tuán)的連接基。術(shù)語“可裂解的基團(tuán)”是指通過裂解連接所要脫去的結(jié)構(gòu)部分與綴合物的剩余部分的鍵而使綴合物的一部分例如水溶性聚合物從綴合物的剩余部分脫去的結(jié)構(gòu)部分。這種裂解是化學(xué)性質(zhì)的，或酶介導(dǎo)的。示例性酶促裂解基團(tuán)包括天然氨基酸或用天然氨基酸終端的肽序列。
除了酶促裂解基團(tuán)以外，包含一個或多個可被非酶作用劑的作用所裂解的位點。示例性非酶促裂解劑包括、但不限于酸，堿，光(例如硝基芐基衍生物，苯甲酰甲基，苯偶姻酯)和熱。許多可裂解基團(tuán)在本領(lǐng)域中是已知的。例如參見Jung等人，Biochem.Biophys.Acta，761152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.，26514518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.，124913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.，155141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.，261205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.，1431859-1867(1989)。而且，多種可裂解的雙官能(同雙官能和異雙官能)間隔臂(spacer arm)可以市購。
示例性可裂解基團(tuán)酯是可以通過試劑例如氫氧化鈉裂解的可裂解基團(tuán)，獲得了含羧酸酯的片段和含羥基的產(chǎn)物。
該連接基可以用來將該化合物連接于綴合物的另一組分，比如導(dǎo)向結(jié)構(gòu)部分(例如抗體，配體，非共價蛋白結(jié)合基團(tuán)等)，分析物，生物分子，藥物等。
“非共價蛋白結(jié)合基團(tuán)”是與完整或變性多肽以聯(lián)合方式相互作用的結(jié)構(gòu)部分。該相互作用在生物環(huán)境中可以是可逆或不可逆的。將“非共價蛋白結(jié)合基團(tuán)”引入到本發(fā)明的熒光化合物中提供了具有以非共價方式與多肽相互作用的能力的化合物。示例性非共價相互作用包括疏水-疏水和靜電相互作用。示例性“非共價蛋白結(jié)合基團(tuán)”包括陰離子基團(tuán)，例如磷酸根，硫代磷酸根，膦酸根，羧酸根，硼酸根，硫酸根，砜，硫代硫酸根，和硫代磺酸根。
本文所使用的“核酸”是指DNA，RNA，單鏈，雙鏈或更高度聚集的雜交基序，以及它們的任何化學(xué)變體。變體包括、但不限于提供了將附加電荷、極化性、氫鍵鍵合、靜電相互作用和立體易變性(fluxionality)引入到核酸配體主體或整個核酸配體的化學(xué)基團(tuán)的那些。此類變體包括、但不限于肽核酸(PNA)，磷酸二酯變體(例如硫代磷酸酯，甲基膦酸酯)，2′-位糖變體，5-位嘧啶變體，8-位嘌呤變體，環(huán)外胺變體，4-硫尿核苷的取代，5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；骨架修飾，甲基化，非正常的堿基配對組合比如isobase，異胞苷和異胍等。核酸還可以包括非天然堿基，例如硝基吲哚。變體還可以包括3′和5′變體比如用猝滅劑，熒光團(tuán)或其它結(jié)構(gòu)部分封端。
本文所使用的術(shù)語“反應(yīng)性基團(tuán)”是指能與其它化學(xué)基團(tuán)起反應(yīng)以形成共價鍵的基團(tuán)，即，在適合的反應(yīng)條件下可共價反應(yīng)的基團(tuán)，并且通常構(gòu)成了其它物質(zhì)的連接位置。該反應(yīng)性基團(tuán)是在本發(fā)明的化合物上的可與在不同化合物上的官能團(tuán)反應(yīng)以形成共價鍵，獲得熒光或熒光標(biāo)記組分的結(jié)構(gòu)部分，比如羧酸或丁二酰亞胺酯。反應(yīng)性基團(tuán)通常包括親核體，親電體和光活化基團(tuán)。
示例性反應(yīng)性基團(tuán)包括、但不限于烯烴，炔烴，醇，酚，醚，氧化物，鹵化物，醛，酮，羧酸，酯，酰胺，氰酸酯，異氰酸酯，硫氰酸酯，異硫氰酸酯，胺，肼，腙，酰肼，重氮，重氮鹽，硝基，腈，硫醇，硫化物，二硫化物，亞砜，砜，磺酸，亞磺酸，縮醛，酮縮醇，酸酐，硫酸酯，次磺酸，異腈，脒，酰亞胺，亞氨酸酯，硝酮，羥胺，肟，異羥肟酸，硫代異羥肟酸，丙二烯類，原酸酯，亞硫酸酯，烯胺，炔胺，脲類，假脲類，氨基脲，碳化二亞胺類，氨基甲酸酯，亞胺，疊氮化物，偶氮化合物，氧化偶氮化合物，以及亞硝基化合物。反應(yīng)性官能團(tuán)還包括用于制備生物綴合物的那些，例如N-羥基丁二酰亞胺酯，馬來酰亞胺等。制備這些官能團(tuán)的每一種的方法在本領(lǐng)域中是公知的。它們用于特定目的的應(yīng)用或為了特定目的而做出的改變是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)(例如參見Sandler和Karo，eds.ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS，Academic Press，SanDiego，1989)。
術(shù)語“靶向基團(tuán)”是指(1)能夠主動地將它所連接的實體(例如熒光結(jié)構(gòu)部分)引向目標(biāo)區(qū)域，例如細(xì)胞；或(2)優(yōu)選被動地被目標(biāo)區(qū)域吸附或在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)夾帶的結(jié)構(gòu)部分。靶向基團(tuán)可以是小分子，預(yù)期包括非肽和肽。靶向基團(tuán)還可以是高分子，包括、但不限于糖類，凝集素，受體，受體的配體，蛋白比如BSA，抗體，聚(醚)，樹枝狀大分子，聚(氨基酸)等。
本文所使用的“載體分子”是指連接本發(fā)明的化合物的任何分子。代表性載體分子不帶限制地包括蛋白(例如酶，抗體)，糖蛋白，肽，糖(例如單糖，寡糖和多糖)，激素，受體，抗原，底物，代謝物，過渡態(tài)類似物，輔助因子，抑制劑，藥物，染料，營養(yǎng)物，生長因子等。“載體分子”還表示可能不被認(rèn)為在“分子”的經(jīng)典定義范圍內(nèi)的物質(zhì)，例如固體載體(例如合成載體，色譜載體，膜)，病毒和微生物。
序言本發(fā)明提供了支化水溶性聚合物和支化水溶性聚合物的綴合物。該綴合物在本發(fā)明的支化水溶性聚合物和包含該支化水溶性聚合物可以綴合于其上的反應(yīng)性基團(tuán)的物質(zhì)之間形成。用于本發(fā)明的水溶性聚合物的示例性綴合物配對物包括肽，糖肽，脂類和糖脂。示例性綴合物是其中攜帶本發(fā)明的支化水溶性聚合物的改性糖直接或間接(例如通過介入糖基殘基)連接于肽的糖基化位點上。還提供了生產(chǎn)本發(fā)明的綴合物的方法。
本發(fā)明的綴合物和形成綴合物的方法這里參考肽和糖肽綴合物來舉例說明。論述的焦點是為了清楚說明，不應(yīng)被認(rèn)為將本文所公開的支化水溶性聚合物的用途限制在形成這種綴合物的用途上。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，本發(fā)明的支化水溶性聚合物可用于形成各種支化水溶性聚合物綴合物。
如在前面的部分中所述，共價PEG化的本領(lǐng)域公認(rèn)的化學(xué)方法依靠通過氨基酸或碳水化合物上的反應(yīng)性基團(tuán)的化學(xué)綴合。通過仔細(xì)設(shè)計綴合物和反應(yīng)條件，已經(jīng)使用化學(xué)介導(dǎo)的綴合策略制備了有效的綴合物。聚合物與蛋白或糖蛋白的化學(xué)綴合的主要缺點是活化聚合物的選擇性的缺乏，這常常導(dǎo)致聚合物在影響蛋白或糖蛋白生物活性在位點上連接。已經(jīng)開發(fā)了幾種方法來解決位點選擇性綴合化學(xué)，然而，僅僅開發(fā)出了適合于各種重組蛋白的一種通用的方法。
與本領(lǐng)域公認(rèn)的方法相反，本發(fā)明提供了支化水溶性聚合物的高度選擇性位點定向的糖綴合，例如糖-PEG化的新型手段。在本發(fā)明的示例性實施方案中，支化水溶性聚合物的位點定向連接通過特異性肽序列的體外酶促糖基化來完成。糖綴合可以采用能夠?qū)⑽镔|(zhì)支化水溶性聚合物-糖基，例如PEG-唾液酸轉(zhuǎn)移到糖基化位點的糖基轉(zhuǎn)移酶，例如唾液酸基轉(zhuǎn)移酶通過酶促法進(jìn)行(“糖-PEG化”)。
支化水溶性聚合物在第一個方面，本發(fā)明提供了具有以下通式的支化水溶性聚合物WSP-Y-Rx其中WSP是水溶性聚合物。符號Y表示連接基，例如鍵，或含有酰胺、羧酸酯、脲烷、硫醇、取代或未取代烷基等的結(jié)構(gòu)部分。示例性連接基包括鍵，(CH2)n，(CH2)mC(O)O(CH2)n，(CH2)mC(O)NH(CH2)n，(CH2)mOC(O)NH(CH2)n，(CH2)mO(CH2)n，(CH2)mNH(CH2)n，和(CH2)mS(CH2)n，其中m和n是獨立地選自0-6的整數(shù)。Rx是連接于水溶性聚合物的取代或未取代烷基結(jié)構(gòu)部分；連接于水溶性聚合物的氨基酸或氨基酸的二聚體；或者連接于水溶性聚合物的糖或糖核苷酸。WSP和Rx的水溶性聚合物組分可以是相同的水溶性聚合物或不同的水溶性聚合物。
用于本發(fā)明的化合物的示例性水溶性聚合物包括m-PEG，PEG，m-PPG，PPG，聚唾液酸，聚谷氨酸，聚天冬氨酸，聚賴氨酸，聚乙烯亞胺，聚交酯，聚甘油酯，和官能化PEG，例如末端官能化PEG。
在一個示例性實施方案中，Y是取代烷基，以及本發(fā)明提供了具有以下通式的支化水溶性聚合物 其中X和Y是獨立地選自O(shè)R1，NR2R3，SR4，COOR5，CONR6R7，OCONR6R7，取代和未取代的烷基，以及取代和未取代的芳基中的成員。Z1是選自O(shè)R1′，NR2′R3′，SR4′，COOR5′，CONR6′R7′，取代和未取代烷基，以及取代和未取代芳基中的成員。符號R1，R4和R5代表水溶性聚合物。R2，R3，R6和R7是獨立地選自H，取代和未取代烷基，取代和未取代芳基，取代和未取代雜芳基，取代和未取代雜環(huán)烷基，反應(yīng)性官能團(tuán)，以及水溶性聚合物中成員，前提是選擇這些基團(tuán)，使得根據(jù)通式I的化合物包含至少兩個水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分。符號R1′，R2′，R3′，R4′，R5′，R6′和R7′表示獨立地選自H，取代和未取代烷基，取代和未取代芳基，取代和未取代雜芳基，取代和未取代雜環(huán)烷基，反應(yīng)性官能團(tuán)，載體分子和水溶性聚合物中的基團(tuán)。
在另一個示例性實施方案中，Z1包括糖基(saccharyl)結(jié)構(gòu)部分。糖基結(jié)構(gòu)部分可以是活化糖基結(jié)構(gòu)部分，例如核苷酸糖。此外，Z1能夠包括直接連接于肽的氨基酸的糖基結(jié)構(gòu)部分，或者通過其與連接于氨基酸的糖基殘基的綴合而間接連接于肽的氨基酸的糖基結(jié)構(gòu)部分。
以下給出了根據(jù)通式I的本發(fā)明的示例性化合物

和

其中R14是OH或反應(yīng)性官能團(tuán)。示例性反應(yīng)性官能團(tuán)是C(O)Q′，其中選擇Q′，使得C(O)Q′是反應(yīng)性官能團(tuán)。Q′還可以包括載體分子(“配體”)。Q′的示例性物質(zhì)包括鹵素，NHS，五氟苯基，HOBT，HOAt，和對硝基苯基。下標(biāo)“m”和下標(biāo)“n”是獨立選自1-20,000中的整數(shù)。
上述化合物以及本發(fā)明的其它化合物可容易地由諸如以下之類的起始原料來制備

和

以下給出了獲取本發(fā)明的化合物的示例性途徑


以下給出了獲取本發(fā)明的化合物的另一示例性途徑 本發(fā)明還提供了基于氨基酸或寡聚氨基酸(例如二肽，三肽，四肽)的支化聚合物。示例性氨基酸型支化聚合物具有選自下列之中的通式 和 其中R11，R11′，R12，R12′，R13和R13′獨立地選自H，取代或未取代烷基和水溶性聚合物，前提是選擇這些基團(tuán)，使得上述化合物包括至少兩個水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分。R14是選自O(shè)H，反應(yīng)性官能團(tuán)，含糖結(jié)構(gòu)部分的基團(tuán)或連接于載體分子的基團(tuán)中的一種。A是選自NH，O和S中的一種。下標(biāo)“s”表示1-5的整數(shù)。A是選自NH、O和S中的一員。
在以上通式中所述的各化合物可用于其它物質(zhì)(例如核酸，肽，糖等)的化學(xué)PEG化。形成PEG(和含有PEG的物質(zhì))之間的綴合物的方法通常在本領(lǐng)域中是已知的。例如，參見Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in ChemistrySeries，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
在另一個示例性實施方案中，R14包括糖基結(jié)構(gòu)部分。該糖基結(jié)構(gòu)部分可以是活化糖基結(jié)構(gòu)部分，例如核苷酸糖。此外，R14能夠包括直接連接于肽的氨基酸的糖基結(jié)構(gòu)部分，或者通過其與連接于氨基酸的糖基殘基的綴合而間接連接于肽的氨基酸的糖基結(jié)構(gòu)部分。
本發(fā)明的示例性組合物包括 比如 其中“m”，“n”和“t”是獨立地選自1-20,000中的整數(shù)；和R14如上所述。
其它示例性化合物包括
比如 在下表中給出了基于氨基酸結(jié)構(gòu)的其它組合物 在上表中給出的圖中，符號a和b獨立地表示1-10的數(shù)值。符號m和o獨立地表示1-10,000的數(shù)值。符號X表示OH，H，Q(活化基團(tuán))以及生物結(jié)構(gòu)部分，比如蛋白，糖，脂類，或核苷酸。
在另一個示例性實施方案中，R14包括糖基結(jié)構(gòu)部分。該糖基結(jié)構(gòu)部分可以是活化糖基結(jié)構(gòu)部分，例如核苷酸糖。此外，R14可以包括直接連接于肽的氨基酸的糖基結(jié)構(gòu)部分，或者通過其與連接于氨基酸的糖基殘基的綴合而間接連接于肽的氨基酸的糖基結(jié)構(gòu)部分。
在又一個方面，本發(fā)明提供了基于糖核(“支型核”)的支化水溶性聚合物。技術(shù)人員清楚，糖核可以具有任何結(jié)構(gòu)。用于本發(fā)明的這方面的示例性糖包括GlcNAc，Gal，Sia，F(xiàn)uc，Glc，GalNAc，GalNH2，GlcNH2等。
本發(fā)明的示例性化合物具有以下通式糖-O-(L-WSP)2其中L是連接基和WSP是水溶性聚合物。
本發(fā)明的其它示例性化合物具有以下通式(C6H10O4)-(OC(O)-L-WSP)2其中C6H10O4是糖支型芯，其中兩個糖OH結(jié)構(gòu)部分被轉(zhuǎn)化為OC(O)-連接基-WSP。
本發(fā)明的又一示例性化合物具有以下通式核苷酸-糖-O-(L-WSP)2在另一示例性實施方案中，本發(fā)明的糖基支化水溶性聚合物具有以下通式Nu-O-(C6H9O3)-(OC(O)-L-WSP)2其中Nu是核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的該方面的另一示例性化合物(基于唾液酸核)具有以下通式 其中R16和R16′是選自H，乙?；屯ㄊ?I)中的成員
以及R17，R18，R19和R19′是獨立地選自H，OH，NH2，NHAc和根據(jù)通式I的結(jié)構(gòu)部分中的成員。在通式I中，Z2是選自O(shè)，S，CH2和S中的一種。R11如上所述，以及下標(biāo)“a”表示0-20的整數(shù)，前提是R16，R16′，R17，R18，和R19的至少兩個具有根據(jù)通式I的結(jié)構(gòu)。R11還可以是連接于載體分子的基團(tuán)或鍵接于載體分子的鍵。R15是選自H和活化基團(tuán)，例如磷酸核苷酸中的一員。
在另一個示例性實施方案中，通式I的連接基具有以下結(jié)構(gòu)式 在又一個示例性實施方案中，通式I的連接基具有以下結(jié)構(gòu)式 其中Z3是選自NH，O和S中的一員。
在一個示例性實施方案中，Z2是NH。
在再一個示例性實施方案中，本發(fā)明提供了具有以下結(jié)構(gòu)的化合物
其中L是如本文所定義的連接基。
在另一個方面，支化聚合物基于半乳糖或N-乙酰基半乳糖，其具有以下通式 其中R15-R19如上所述，R15-R19的至少兩個是根據(jù)通式I的結(jié)構(gòu)部分。
此外，R15可以包括連接于肽的氨基酸的鍵，或連接于糖基結(jié)構(gòu)部分的鍵，該糖基結(jié)構(gòu)部分直接鍵合于肽的氨基酸，或通過綴合于連接氨基酸的糖基殘基而間接鍵合于肽的氨基酸。
以下提供了制備本發(fā)明的支化糖芯水溶性聚合物的示例性方案
以下給出了制備本發(fā)明的糖芯支化水溶性聚合物的另一示例性方案
單分散聚(乙二醇)本發(fā)明還提供了單分散高分子量PEG和制備聚(乙二醇)分子的基本單分散群體的方法。該方法包括讓具有明確分子量的PEG分子例如PEG200與至少2當(dāng)量的也具有明確分子量的雙官能活化PEG，例如PEG200接觸，從而產(chǎn)生PEG的單分散樣品，例如PEG600 G是離去基團(tuán)，比如磺酸酯或tresylat e酯。PEG600的單分散樣品然后可以與雙官能活化PEG200接觸，形成單分散PPEG100?；蛘?，單分散PEG600可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的雙官能化衍生物，再與至少2當(dāng)量的單分散二羥基-PEG600反應(yīng)，產(chǎn)生單分散PEG1800。重復(fù)本發(fā)明的方法，直到獲得所需大小的單分散PEG為止?？梢栽O(shè)計該合成，使得在起始原料和產(chǎn)物之間的分子量差允許通過尺寸排阻色譜法而分離任何未反應(yīng)或部分反應(yīng)的材料。
而且，作為對制備改性水溶性聚合物，比如聚(乙二醇)的改進(jìn)方法的需求的回應(yīng)，本發(fā)明提供了化學(xué)活化和延長聚合物骨架的方法。單活化PEG分子可用于將PEG綴合于各種物質(zhì)，例如靶向結(jié)構(gòu)部分，治療用結(jié)構(gòu)部分，抗腫瘤藥物，細(xì)胞毒素，放射劑，氨基酸類，糖等。
因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了活化水溶性聚合物，尤其聚(乙二醇)及其結(jié)構(gòu)類似物的分步組裝的方法。該方法提供了獲得單官能化和雙官能化PEG分子的便捷途徑。
在步驟a中，起始二醇與活化基團(tuán)(R-Y)接觸，該活化基團(tuán)與二醇的羥基結(jié)構(gòu)部分反應(yīng)。Y通常是離去基團(tuán)，使R安放在PEG分子的羥基結(jié)構(gòu)部分之一上。在步驟b中，所得加合物的游離羥基通過其轉(zhuǎn)化為磺酸酯類的基團(tuán)來活化?；罨腜EG物質(zhì)與作為起始PEG(“PEGm”)的相同或不同聚合度的另一PEG結(jié)構(gòu)部分接觸。為了使且其連接于另一物質(zhì)，RO-PEG(n+m)任選在游離羥基結(jié)構(gòu)部分處活化。
本發(fā)明的單分散PEG容易通過本領(lǐng)域公認(rèn)的方法來活化，活化的衍生物可以用來形成綴合物?；蛘撸搯畏稚EG被引入到用來形成綴合物的本發(fā)明的支化PEG中。
水溶性聚合物選擇的肽的親水性通過與極性分子比如含胺、酯、羥基和多羥基的分子綴合來提高。代表性實例包括、但不限于聚賴氨酸，聚乙烯亞胺，和聚醚，例如聚(乙二醇)，m-聚(乙二醇)，聚(丙二醇)，m-聚(丙二醇)，和其它O-烷基聚(亞烷基二醇)結(jié)構(gòu)部分。優(yōu)選的水溶性聚合物基本上是非熒光的，或者發(fā)出最小量的熒光而不適合在分析中用在熒光標(biāo)記劑。而且，通常優(yōu)選使用不屬于天然存在的糖的聚合物。該優(yōu)選的例外情況是使用通過共價連接另一實體(例如聚(乙二醇)，聚(丙二醇)，生物分子，治療用結(jié)構(gòu)部分，診斷用結(jié)構(gòu)部分等)改性的天然存在的糖。在另一個示例性實施方案中，治療用糖結(jié)構(gòu)部分綴合于連接臂，以及糖-連接臂盒(cassette)隨后用本發(fā)明的方法綴合于肽。
用于活化水溶性聚合物和糖的方法和化學(xué)過程以及用于將糖和聚合物綴合于各種物質(zhì)的方法在文獻(xiàn)中有述。通常使用的活化聚合物的方法包括官能團(tuán)用溴化氰，高碘酸鹽，戊二醛，雙環(huán)氧化物，表氯醇，二乙烯基砜，碳化二亞胺，磺酰鹵，三氯三嗪等的活化(參見R.F.Taylor，(1991)，PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTALS ANDAPPLICATIONS，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，CHEMISTRYOF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等人，(1993)，IMMOBILIZED AFFINITY LIGANDTECHNIQUES，Academic Pres s，N.Y.等人，Eds.POLYMERIC DRUGS ANDDRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，AmericanChemical Society，Washington，D.C.1991)。
許多水溶性聚合物是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的，并且可用于實施本發(fā)明。術(shù)語水溶性聚合物包括諸如以下之類的物質(zhì)糖(例如右旋糖苷，直鏈淀粉，透明質(zhì)酸，聚(唾液酸)，乙酰肝素，肝素等；聚(氨基酸)；核酸；合成聚合物(例如聚(丙烯酸)，聚(醚)，例如聚(乙二醇)；肽，蛋白等。本發(fā)明可以用任何水溶性聚合物實施，唯一的限制是該聚合物必須包含可以連接綴合物的剩余部分的位點。
用于活化聚合物的方法還可以在WO 94/17039，US專利No.5,324,844，WO 94/18247，WO 94/04193，US專利No.5,219,564，US專利No.5,122,614，WO 90/13540，US專利No.5,281,698和WO93/15189中找到，以及為了綴合活化聚合物和肽，例如凝血因子VIII(WO 94/15625)，血紅蛋白(WO 94/09027)，攜氧分子(US專利No.4,412,989)，核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11141-45(1985))。
優(yōu)選的水溶性聚合物是其中在聚合物的樣品中大部分聚合物分子具有大約相同的分子量的那些；這些聚合物是“單分散”的。
本發(fā)明進(jìn)一步參考聚(乙二醇)或單甲氧基-聚(乙二醇)(m-PEG)綴合物來舉例說明?？梢垣@得關(guān)于PEG的官能化和綴合的幾篇評論和專論。例如，參見Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology13530-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)；和Bhadra等人，Pharmazie，575-29(2002)。
可用于形成本發(fā)明的綴合物的聚(乙二醇)是線性或支化的。任何分子量，例如5Kd，10Kd，20Kd和30Kd的PEG結(jié)構(gòu)部分可用于本發(fā)明。
反應(yīng)性官能團(tuán)PEG(或其它連接基)的反應(yīng)性衍生物用于將一個或多個肽結(jié)構(gòu)部分連接于該連接基的用途在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明不受反應(yīng)性PEG類似物的身份來限制。聚(乙二醇)的許多活化衍生物可以市購，并且在文獻(xiàn)中有述。選擇和如果需要合成可用來制備可用于本發(fā)明的底物的適當(dāng)?shù)幕罨疨EG衍生物完全是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。參見Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)；Abuchowski等人，J.Biol.Chem.，2523582-3586(1977)；Jackson等人，Anal.Biochem.，165114-127(1987)；Koide等人，Biochem Biophys.Res.Commun.，111659-667(1983))，tresylate(Nilsson等人，Methods Enzymol.，10456-69(1984)；Delgado等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，12119-128(1990))；N-羥基丁二酰亞胺衍生的活性酯(Buckmann等人，Makromol.Chem.，1821379-1384(1981)；Joppich等人，Makromol.Chem.，1801381-1384(1979)；Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7175-185(1984)；Katre等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，841487-1491(1987)；Kitamura等人，Cancer Res.，514310-4315(1991)；Boccu等人，Z.Naturforsch.，38C94-99(1983)，碳酸酯(Zalipsky等人，POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRYBIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS，Harris，Ed.，Plenum Press，New York，1992，pp.347-370；Zalipsky等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，15100-114(1992)；Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11141-152(1985))，甲酸咪唑酯(Beauchamp等人，Anal.Biochem.，13125-33(1983))；Berger等人，Blood，711641-1647(1988)，4-二硫代吡啶類(Woghiren等人，Bioconjugate Chem.，4314-318(1993))，異氰酸酯(Byun等人，ASAIO Journal，M649-M-653(1992))和環(huán)氧化物(US專利No.4,806,595，授權(quán)給Noishiki等人(1989)。其它連接基包括在氨基和活化PEG之間的脲烷鍵。參見Veronese等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，11141-152(1985)。
可用于實施本發(fā)明的反應(yīng)基團(tuán)和反應(yīng)類型通常是生物綴合物化學(xué)領(lǐng)域中公知的那些。用反應(yīng)性糖結(jié)構(gòu)部分獲得的目前有利的反應(yīng)類型是在相對溫和條件下進(jìn)行的那些。這些包括、但不限于親核取代(例如，胺和醇與酰基鹵、活性酯的反應(yīng))，親電取代(例如烯胺反應(yīng))以及在碳-碳和碳-雜原子多重鍵上的加成(例如，Michael反應(yīng)，Diels-Alder加成)。這些和其它有用的反應(yīng)例如在March，ADVANCEDORGANIC CHEMISTRY，3rdEd.，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；以及Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances inChemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982中有述。
從糖核或改性基團(tuán)上側(cè)掛的有用的反應(yīng)性官能團(tuán)包括、但不限于(a)羧基及其各種衍生物，包括、但不限于N-羥基丁二酰亞胺酯，N-羥基苯并三唑酯，酰鹵，?；溥颍蝓?，對硝基苯基酯，烷基，鏈烯基，炔基和芳族酯；(b)羥基，其可以轉(zhuǎn)化為例如酯，醚，醛等；(c)鹵代烷基，其中鹵素可以后來被親核基團(tuán)例如胺，羧酸根陰離子，硫醇陰離子，碳陰離子，或烷氧基離子置換，從而導(dǎo)致新基團(tuán)在鹵素原子的官能團(tuán)上以共價鍵連接；(d)親二烯體基團(tuán)，它能夠參與Diels-Alder反應(yīng)，例如馬來酰亞胺基團(tuán)；(e)醛或酮基團(tuán)，使得后續(xù)衍生化可通過形成羰基衍生物，例如亞胺，腙，縮氨基脲或肟類，或通過諸如格利雅加成或烷基鋰加成之類的機(jī)理來進(jìn)行；(f)用于隨后與胺反應(yīng)，例如形成磺酰胺的磺酰鹵基團(tuán)；(g)硫醇基團(tuán)，它例如可以轉(zhuǎn)化為二硫化物或與?；u反應(yīng)；(h)胺或巰基，它例如可以進(jìn)行?；?，烷基化或氧化；(i)鏈烯烴，它們例如可以進(jìn)行環(huán)加成，?；?，邁克爾加成等；和(j)環(huán)氧化物，它們例如可以與胺和羥基化合物反應(yīng)。
可以選擇反應(yīng)性官能團(tuán)，使得它們不參與，或者干擾組裝反應(yīng)性糖核或改性基團(tuán)所必需的反應(yīng)。或者，反應(yīng)性官能團(tuán)可以通過提供保護(hù)基而被保護(hù)，以免參與反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何保護(hù)特定官能團(tuán)，使得它不干涉選擇的一組反應(yīng)條件。關(guān)于有效的保護(hù)基的實例，例如參看Greene等人，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，John Wiley & Sons，New York，1991。
肽綴合物本發(fā)明的化合物的應(yīng)用通過它們在形成支化水溶性聚合物的肽綴合物中的用途來舉例說明。論述的焦點是為了清楚說明。技術(shù)人員明白，該論述與使用本發(fā)明的支化水溶性聚合物形成各種綴合物的方法相關(guān)。在示例性實施方案中，化學(xué)反應(yīng)性支化水溶性聚合物通過本領(lǐng)域已知的方法或其變型而綴合于肽上的互補(bǔ)反應(yīng)性基團(tuán)。
在另一示例性實施方案中，支化水溶性聚合物包括作為支型核的糖結(jié)構(gòu)部分，或者，該支化水溶性聚合物連接于糖。糖是將糖基支化水溶性聚合物(或糖-支化水溶性聚合物綴合物)轉(zhuǎn)移到肽的氨基酸或糖基殘基的酶的底物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚，上述方法不限于用肽實施，而是廣泛適用于其它物質(zhì)，例如脂類，糖脂，糖核其它治療用結(jié)構(gòu)部分。
本發(fā)明的綴合物通過支化水溶性聚合物改性的糖與糖基化或非糖基化肽的酶促連接來形成。改性糖直接加入到糖基化位置，或直接或間接(例如通過一個或多個糖基殘基)連接于糖基化位置的糖基殘基。
當(dāng)在肽(或糖基殘基)和糖的改性基團(tuán)之間插入時，支化水溶性聚合物-改性糖成為本文所謂的“糖基連接基”。糖基連接基可以是“完整的”，或者它可以在支化水溶性聚合物與糖的連接過程中改變，例如氧化和還原胺化。使用酶比如糖基轉(zhuǎn)移酶的高選擇性，本發(fā)明方法提供了在一個或多個特定位置攜帶支化水溶性聚合物的肽。因此，根據(jù)本發(fā)明，改性糖直接連接于肽鏈上的選擇位置，或者，改性糖連接于糖肽的碳水化合物結(jié)構(gòu)部分。其中改性糖鍵接于糖肽碳水化合物并且直接鍵接于肽骨架的氨基酸殘基的肽也是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
與已知的化學(xué)和酶促肽加工策略不同，本發(fā)明提供了具有基本上均勻的衍生方式的肽-和糖肽-綴合物；在本發(fā)明中采用的酶一般對肽的特定氨基酸殘基或氨基酸殘基的組合有選擇性。本發(fā)明的綴合物也能夠以大規(guī)模制備。因此，本發(fā)明提供了大規(guī)模制備具有預(yù)選擇均勻衍生化方式的糖肽的實用方法。這些方法特別適合于治療用肽的改性，包括、但不限于在細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞(例如哺乳動物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞，真菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞或原核細(xì)胞)或轉(zhuǎn)基因植物或動物中在生產(chǎn)過程中不完全糖基化的糖肽。
肽的支化水溶性聚合物綴合物一般被表征為具有增高的治療半衰期，例如，由于減低的清除率，或減低的被免疫或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)攝取的速率。而且，在本發(fā)明的綴合物的肽組分上的抗原決定簇用支化水溶性聚合物來屏蔽，減少或消除了宿主對該肽的免疫反應(yīng)。使用適當(dāng)?shù)母男蕴堑膶?dǎo)向劑與肽的選擇性連接還可以用來將肽導(dǎo)向?qū)μ囟▽?dǎo)向劑特異的特定組織或細(xì)胞表面受體。
治療用糖肽的體內(nèi)半衰期還可以用包括聚乙二醇(PEG，m-PEG)和聚丙二醇(PPG)的支化水溶性聚合物增強(qiáng)。例如，蛋白用支化PEG的化學(xué)改性(PEG化，m-PEG化)增加了它們的分子尺寸和降低了它們的表面-和官能團(tuán)-易接近性，后者各自取決于連接于蛋白的PEG的大小。肽用水溶性聚合物的改性一般被公認(rèn)為改進(jìn)血漿半衰期和蛋白水解穩(wěn)定性，以及降低免疫原性和肝攝取的有前景的策略(Chaffee等人，J.Clin.Invest.891643-1651(1992)；Pyatak等人，Res.Commun.Chem.Pathol Pharmacol.29113-127(1980))。已經(jīng)報道了白介素-2的PEG化提高了其體內(nèi)的抗腫瘤潛能(Katre等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.841487-1491(1987))以及由單克隆抗體A7得到的F(ab′)2的PEG化改進(jìn)了其腫瘤定位(Kitamura等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.281387-1394(1990))。因此，在另一個優(yōu)選實施方案中，通過本發(fā)明的方法用水溶性聚合物衍生化的肽的體內(nèi)半衰期相對于非衍生化肽的體內(nèi)半衰期提高。
本發(fā)明的綴合物的肽體內(nèi)半衰期的增加最佳地作為該量增加的百分率范圍來表示。百分率增加的范圍的下限是大約40％，大約60％，大約80％，大約100％，大約150％或大約200％。該范圍的上限是大約60％，大約80％，大約100％，大約150％或超過大約250％。
在示例性實施方案中，在肽和選擇結(jié)構(gòu)部分之間的連接包括位于肽和水溶性聚合物之間的完整糖基連接基。如本文所述，水溶性聚合物與糖結(jié)構(gòu)部分的連接(或糖支型核的使用)提供了被適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移酶識別的“改性糖”，它將改性糖連接于肽。當(dāng)在肽和選擇結(jié)構(gòu)部分之間插入時，改性糖的糖組分成為“糖基連接基”，例如“完整糖基連接基”。該糖基連接基由任何單糖或寡糖形成，在用水溶性聚合物改性之后，它是適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移酶的底物。
本發(fā)明的綴合物通常對應(yīng)于以下通式 其中符號a、b、c、d和s表示正的非零整數(shù)；以及t是0或正整數(shù)。“試劑”是本發(fā)明的支化水溶性聚合物。或者，糖-試劑通過基于糖支型核的支化水溶性聚合物來提供。該連接基可以是下文各種連接基的任何一種?；蛘?，該連接基可以是單鍵或“零級連接基”。肽的身份不是限制的。
在示例性實施方案中，該水溶性聚合物是PEG，m-PEG，PPG或m-PPG，以及該支化水溶性聚合物經(jīng)由完整的糖基連接基以共價鍵連接于肽。糖基連接基以共價鍵連接于肽的氨基酸殘基或糖基殘基?；蛘撸撎腔B接基連接于糖肽的一個或多個糖基單元。本發(fā)明還提供了其中糖基連接基(例如GalNAc)連接于氨基酸殘基(例如Thr或Ser)的綴合物。
除了提供通過酶促加成的完整糖基連接基形成的綴合物以外，本發(fā)明提供了其取代方式高度均勻的綴合物。使用本發(fā)明的方法，可以形成肽綴合物，其中在本發(fā)明的綴合物的群體中基本上所有的改性糖結(jié)構(gòu)部分連接于結(jié)構(gòu)相同的氨基酸或糖基殘基。因此，在第二個方面，本發(fā)明提供了具有支化水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分群體的肽綴合物，這些結(jié)構(gòu)部分通過糖基連接基，例如完整糖基連接基以共價鍵連接于肽。在本發(fā)明的優(yōu)選綴合物中，該群體的基本上各成員經(jīng)由糖基連接基鍵接于肽的糖基殘基，以及糖基連接基所連接的肽的各糖基殘基具有相同的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還提供了具有通過完整糖基連接基以共價鍵連接的支化水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分的群體的肽綴合物。在優(yōu)選的實施方案中，支化水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分的群體的基本上各成員經(jīng)由完整的糖基連接基鍵接于肽的氨基酸殘基，以及具有連接于其上的完整糖基連接基的各氨基酸殘基具有相同結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還提供了與上述那些類似的綴合物，其中該肽經(jīng)由完整糖基連接基進(jìn)一步綴合于治療用結(jié)構(gòu)部分，診斷用結(jié)構(gòu)部分，靶向結(jié)構(gòu)部分，毒素結(jié)構(gòu)部分等。上述結(jié)構(gòu)部分各自可以是小分子，天然聚合物(例如，多肽)或合成聚合物。
在又一個實施方案中，本發(fā)明提供了由于存在作為綴合物的組分的導(dǎo)向劑，選擇性定位于特定組織中的綴合物。在一個示例性實施方案中，該導(dǎo)向劑是蛋白。示例性蛋白包括鐵傳遞蛋白(腦，血池)，HS-糖蛋白(骨，腦，血池)，抗體(腦，具有抗體-特異性抗原的組織，血池)，凝血因子V-XII(損傷組織，凝塊，癌，血池)，血清蛋白，例如α-酸糖蛋白，胎球蛋白，α-胎兒蛋白(腦，血池)，β2-糖蛋白(肝，動脈粥樣硬化斑，腦，血池)，G-CSF，GM-CSF，M-CSF，和EPO(免疫刺激，癌，血池，紅血球過度產(chǎn)生，神經(jīng)保護(hù))，白蛋白(半衰期增加)，IL-2和IFN-α。
在示例性實施方案中，該綴合物在支化水溶性聚合物和糖基化或非糖基化肽之間形成。該聚合物、治療用結(jié)構(gòu)部分或生物分子經(jīng)由完整糖基連接基綴合于肽，該連接基插入肽和改性基團(tuán)(例如水溶性聚合物)之間，并且以共價鍵連接于二者。該方法包括讓肽與含有改性糖和改性糖是其底物的糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物接觸。該反應(yīng)在足以在改性糖和肽之間形成共價鍵的條件下進(jìn)行。改性糖的糖結(jié)構(gòu)部分優(yōu)選從核苷酸糖、活化糖和既非核苷酸又未活化的糖中選擇。
受體肽(糖基化或非糖基化)通常從頭合成，或者在原核細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞，比如E.coli)或真核細(xì)胞比如哺乳動物、酵母、昆蟲、真菌或植物細(xì)胞中重組表達(dá)。該肽可以是全長蛋白或片段。而且，該肽可以是野生型或突變的肽。在示例性實施方案中，肽包括將一個或多個共有糖基化位點加入到肽序列的突變。
本發(fā)明的方法還提供用于重組生產(chǎn)的不完全糖基化肽的改性。許多重組生產(chǎn)的糖肽被不完全地糖基化，暴露了可能具有不希望有的性能，例如免疫原性、被RES識別的碳水化合物殘基。在本發(fā)明的方法中使用改性糖，肽可以同時進(jìn)一步糖基化和例如用水溶性聚合物，治療劑等衍生化。改性糖的糖結(jié)構(gòu)部分可以是適當(dāng)綴合于完全糖基化肽中的受體的殘基，或者具有所需性能的另一糖基結(jié)構(gòu)部分。
在表1中給出了本發(fā)明的綴合物的示例性肽組分。
表1

本發(fā)明的綴合物的其它示例性肽組分包括免疫球蛋白家族的成員(例如抗體，MHC分子，T細(xì)胞受體等)，細(xì)胞間受體(例如整聯(lián)蛋白，激素或生長因子的受體等)凝集素，和細(xì)胞因子(例如白介素)。其它實例尤其包括組織型纖溶酶原激活物(t-PA)，腎素，凝血因子比如因子V-XII，鈴蟾肽，凝血酶，造血生長因子，集落刺激因子，病毒抗原，補(bǔ)體蛋白，α1-抗胰蛋白酶，紅細(xì)胞生成素，P-選擇蛋白糖肽配體-1(PSGL-1)，粒性白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，抗凝血酶III，白介素，干擾素，蛋白質(zhì)A和C，纖維蛋白原，赫賽汀(herceptin)，來普汀(leptin)，糖苷酶，HS-糖蛋白，血清蛋白(例如，α-酸糖蛋白，胎球蛋白，α-胎兒蛋白質(zhì))，β2-糖蛋白。這多肽名單是示例性的，不是排他性的。綴合物的肽組分還可以包括融合蛋白和嵌合蛋白，包括、但不限于含有由免疫球蛋白比如IgG或免疫球蛋白的片段例如FAb(Fc區(qū))衍生的結(jié)構(gòu)部分的嵌合蛋白。此外，在附錄1中給出了可以用本發(fā)明的方法改性的示例性肽。本文提供的示例性肽用來提供可以用來實施本發(fā)明的肽的選擇；因此，它們不是限制性的。技術(shù)人員清楚，本發(fā)明可以使用可以使用來自任何來源的基本上所有的肽來實施。
本發(fā)明的綴合物的肽組分可以是合成或野生型肽，或者它們可以是突變的肽，后者用本領(lǐng)域已知的方法，比如定向誘變來生產(chǎn)。肽的糖基化通常是N-連接的或O-連接的。示例性N-連接是改性糖與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈的連接。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)是碳水化合物結(jié)構(gòu)部分與天冬酰胺側(cè)鏈的酶法連接的識別序列。因此，這些三肽序列的任何一種在多肽中的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化是指一個糖(例如N-乙?；肴樘前?，半乳糖，甘露糖，GlcNAc，葡萄糖，巖藻糖，木糖)與羥基氨基酸，優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸的羥基側(cè)鏈的連接，雖然還可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。
而且，除了肽以外，與本發(fā)明的支化水溶性聚合物綴合的綴合物的組分可以是除了肽以外的生物結(jié)構(gòu)(例如糖脂，脂類，鞘氨基醇，神經(jīng)酰胺，整個細(xì)胞等)。
將糖基化位點加入到肽或其它結(jié)構(gòu)可方便地通過改變氨基酸序列，使得它含有一個或多個糖基化位點來完成。該添加可以通過突變或肽的全化學(xué)合成來進(jìn)行。肽氨基酸序列優(yōu)選通過在DNA水平下的改變，尤其通過以預(yù)選擇堿基使編碼該肽的DNA突變，使得產(chǎn)生翻譯為所需氨基酸的密碼子來改變。DNA突變優(yōu)選使用本領(lǐng)域已知的方法來進(jìn)行。
在示例性實施方案中，糖基化位點通過改組(shuffling)多核苷酸來添加。編碼候選的肽的多核苷酸可以用DNA改組工序來調(diào)節(jié)。DNA改組是遞歸重組和突變的方法，通過無規(guī)分裂相關(guān)基因庫，隨后通過聚合酶鏈反應(yīng)類方法重新組裝片段來進(jìn)行。例如，參見Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature370389-391(1994)；和U.S.專利Nos.5,605,793，5,837,458，5,830,721和5,811,238。
本發(fā)明的綴合物還可以包括已經(jīng)添加或已經(jīng)除去一個或多個選擇糖基殘基，此后將改性糖綴合于肽的選擇糖基殘基的至少一個的肽。例如，當(dāng)希望將改性糖綴合于不存在于肽上或不以所需量存在的選擇糖基殘基時，該實施方案是有用的。因此，在將改性糖偶聯(lián)于肽之前，通過酶促偶聯(lián)或化學(xué)偶聯(lián)，將選擇糖基殘基綴合于肽。在另一個實施方案中，糖肽的糖基化方式在綴合改性糖之前在通過從糖肽上除去碳水化合物殘基來改變。例如，參見WO 98/31826。
增加或除去存在于糖肽上的任何碳水化合物結(jié)構(gòu)部分用化學(xué)法或酶法來完成?；瘜W(xué)去糖基化優(yōu)選通過多肽變體接觸化合物三氟甲磺酸或等效化合物來完成。該處理導(dǎo)致了除了連接糖(N-乙?；咸前坊騈-乙?；肴樘前?以外的大多數(shù)或所有糖的裂解，但保持肽完整。Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)和Edge等人，Anal.Biochem.118131(1981)描述了化學(xué)去糖基化。在多肽變體上的碳水化合物結(jié)構(gòu)部分的酶促裂解可以通過使用如由Thotakura等人，Meth.Enzymol.138350(1987)所述的各種內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶來完成。
糖基結(jié)構(gòu)部分的化學(xué)加成通過任何技術(shù)上公認(rèn)的方法來進(jìn)行。糖基結(jié)構(gòu)部分的酶促加成優(yōu)選使用本文所述的方法的變型，用天然糖基單元代替在本發(fā)明中使用的改性糖來進(jìn)行。加成糖結(jié)構(gòu)部分的其它方法公開在US專利No.5,876,980，6,030,815，5,728,554和5,922,577中。
用于選擇糖基殘基的示例性連接位置包括、但不限于(a)N-和O-糖基化的共有位點；(b)屬于糖基轉(zhuǎn)移酶的受體的末端糖基結(jié)構(gòu)部分；(c)精氨酸，天冬酰胺和組氨酸；(d)游離羧基；(e)游離巰基比如半胱氨酸的那些；(f)游離羥基，比如絲氨酸，蘇氨酸，或羥基脯氨酸的那些；(g)芳族殘基，比如苯基丙氨酸，酪氨酸，色氨酸的那些；或(h)谷氨酰胺的胺基。用于本發(fā)明的示例性方法描述在1987年9月11日公開的WO 87/05330以及Aplin和Wriston，CRC，CRIT.REV.BIOCHEM.，pp.259-306(1981)中。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過連接基連接兩個或多個肽的方法。該連接基具有任何有效的結(jié)構(gòu)，可以選自直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，連接于肽的連接基的各末端包括改性糖(即，初生完整的糖基連接基)。
在本發(fā)明的示例性方法中，經(jīng)由包括支化水溶性聚合物連接基的連接結(jié)構(gòu)部分將兩個肽連在一起。該結(jié)構(gòu)符合在以上圖中所示的通式。如本文所述，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)包括兩個完整的糖基連接基(即s+t＝1)。集中描述包含兩個糖基的PEG連接基是為了清楚的目的，不應(yīng)被認(rèn)為限制用于本發(fā)明的該實施方案的連接臂的身份。
改性糖改性糖基給體物質(zhì)(“改性糖”)優(yōu)先從改性糖核苷酸，活化改性糖和屬于既非核苷酸又未活化的簡單糖的改性糖中選擇。任何合乎需要的碳水化合物結(jié)構(gòu)可以引入到本發(fā)明的綴合物中。通常，該結(jié)構(gòu)是單糖，但本發(fā)明不限于使用改性單糖；寡糖和多肽也是有用的。
改性基團(tuán)通過酶方式，化學(xué)方式或它們的組合而連接于糖結(jié)構(gòu)部分，從而產(chǎn)生改性糖。糖在允許連接改性結(jié)構(gòu)部分，但仍然可使糖起用于將改性糖結(jié)合于肽的酶的底物的作用的任何位置上取代。在一個優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)唾液酸是糖時，唾液酸被在丙酮酰(pyruvyl)側(cè)鏈的9位上或正常在唾液酸中乙?；陌方Y(jié)構(gòu)部分的5位上用改性基團(tuán)取代。
在本發(fā)明的某些實施方案中，利用改性糖核苷酸來將改性糖加到肽上。以其改性形式在本發(fā)明中采用的示例性糖核苷酸包括一、二或三磷酸核苷酸或它們的類似物。在優(yōu)選的實施方案中，改性糖核苷酸選自UDP-糖苷，CMP-糖苷，或GDP-糖苷。還更優(yōu)選，改性糖核苷酸選自UDP-半乳糖，UDP-半乳糖胺，UDP-葡萄糖，UDP-葡糖胺，GDP-甘露糖，GDP-巖藻糖，CMP-唾液酸，或CMP-NeuAc。糖核苷酸的N-乙酰基胺衍生物也可用于本發(fā)明的方法。
本發(fā)明還提供了使用改性糖，例如改性半乳糖，改性巖藻糖，改性GalNAc和改性唾液酸合成改性肽的方法。當(dāng)采用改性唾液酸時，唾液酸基轉(zhuǎn)移酶或反式唾液酸酶(僅對于α2，3-連接的唾液酸)可以在這些方法中使用。
在其它實施方案中，改性糖是活化糖?？捎糜诒景l(fā)明的活化改性糖通常是通過合成改變?yōu)榘罨x去基團(tuán)的糖苷。本文所使用的術(shù)語“活化離去基團(tuán)”是指容易在酶調(diào)節(jié)的親核取代反應(yīng)中被置換的那些結(jié)構(gòu)部分。在本領(lǐng)域中已知有許多活化糖。例如，參見Vocadlo等人，In CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY，Vol.2，Ernst等人，Ed.，Wiley-VCH VerlagWeinheim，Germany，2000；Kodama等人，Tetrahedron Lett.346419(1993)；Lougheed等人，J.Biol.Chem.27437717(1999)。
活化基團(tuán)(離去基團(tuán))的實例包括氟，氯，溴，甲苯磺酸酯，甲磺酸酯，三氟甲磺酸酯等。用于本發(fā)明的優(yōu)選的活化離去基團(tuán)是不顯著位阻糖苷酶法轉(zhuǎn)移到受體上的那些。因此，活化糖苷衍生物的優(yōu)選實施方案包括糖基氟化物和糖基甲磺酸酯，其中糖基氟化物是特別優(yōu)選的。在糖基氟化物中，氟化α-半乳糖，氟化α-甘露糖，氟化α-葡萄糖，氟化α-巖藻糖，氟化α-木糖，氟化α-唾液酸，氟化α-N-乙酰基葡糖胺，氟化α-N-乙?；肴樘前?，氟化β-半乳糖，氟化β-甘露糖，氟化β-葡萄糖，氟化β-巖藻糖，氟化β-木糖，氟化β-唾液酸，氟化β-N-乙?；咸前泛头?N-乙酰基半乳糖胺是最優(yōu)選的。
舉例來說，可以通過首先將糖乙酰化和然后用HF/吡啶處理來由游離糖制備糖基氟化物。這產(chǎn)生了熱力學(xué)最穩(wěn)定的保護(hù)(乙?；?糖基氟化物(即，α-糖基氟化物)的異頭物。如果需要不穩(wěn)定的異頭物(即，β-糖基氟化物)，它可以通過用HBr/HOAc或HCl將全乙?；寝D(zhuǎn)化為異頭溴化物或氯化物來制備。乙?；腔锟梢酝ㄟ^與溫和(催化)堿在甲醇(例如NaOMe/MeOH)中反應(yīng)來去保護(hù)。另外，許多糖基氟化物可以市購。
其它活化糖基衍生物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通方法來制備。例如，甲磺酸糖基酯可以通過用甲磺酰氯處理完全芐基化半縮醛形式的糖，隨后催化氫化以除去芐基來制備。
在另一個示例性實施方案中，改性糖是具有觸角結(jié)構(gòu)的寡糖。在一個優(yōu)選的實施方案中，觸角的一個或多個末端攜帶改性結(jié)構(gòu)部分。當(dāng)一個以上的改性結(jié)構(gòu)部分連接于具有觸角結(jié)構(gòu)的寡糖時，該寡糖可用于“放大”改性結(jié)構(gòu)部分；綴合于肽的各寡糖單元將多個拷貝的改性基團(tuán)連接于該肽。如在上圖中所示的本發(fā)明的典型綴合物的一般結(jié)構(gòu)包括了由采用觸角結(jié)構(gòu)制備本發(fā)明的綴合物獲得的多價物質(zhì)。許多觸角的糖結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域中是已知的，以及本發(fā)明方法可以不帶限制地用它們來實施。
一般，糖結(jié)構(gòu)部分和改性基團(tuán)通過使用反應(yīng)性基團(tuán)連在一起，該反應(yīng)性基團(tuán)通常通過連接方法轉(zhuǎn)化為新的有機(jī)官能團(tuán)或未反應(yīng)的物質(zhì)。糖反應(yīng)性官能團(tuán)位于糖結(jié)構(gòu)部分的任何位置上。
在以下論述中，闡明了可用于實施本發(fā)明的改性糖的許多具體例子。在示例性實施方案中，唾液酸用作連接改性基團(tuán)的糖核。論述集中在唾液酸衍生物是為了清楚說明，不應(yīng)被認(rèn)為是本發(fā)明的范圍的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白，多種其它糖結(jié)構(gòu)部分可以按照與使用唾液酸作為例子所述類似的方式進(jìn)行活化和衍生化。例如，許多方法可用于改性半乳糖，葡萄糖，N-乙?；肴樘前泛蛶r藻糖來提供幾種糖底物，它們?nèi)菀淄ㄟ^本領(lǐng)域公認(rèn)的方法來改性。例如，參見Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.693(1999)；和Schafer等人，J.Org.Chem.6524(2000)。
在示例性實施方案中，通過本發(fā)明的方法改性的肽是在原核細(xì)胞(例如E.coli.)，包括酵母和哺乳動物細(xì)胞在內(nèi)的真核細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞)，或轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生并因此含有N-和/或O-連接的寡糖鏈的糖肽，它們被不完全唾液酸化。缺乏唾液酸但含有末端半乳糖殘基的糖肽的寡糖鏈可以進(jìn)行糖PEG化，糖PPG化或者用改性唾液酸改性。
在方案2中，氨基糖苷1用保護(hù)氨基酸(例如甘氨酸)衍生物的活性酯處理，將糖胺殘基轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的保護(hù)氨基酸酰胺加合物。該加合物用醛縮酶處理，形成α-羥基羧酸鹽2。通過CMP-SA合成酶的作用，化合物2轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的CMP衍生物，隨后催化氫化該CMP衍生物，形成化合物3。通過讓化合物3與活化(m-)PEG或(m-)PPG衍生物(例如PEG-C(O)NHS，PPG-C(O)NHS)反應(yīng)，分別形成4或5，經(jīng)由形成甘氨酸加合物所引入的胺用作PEG或PPG連接的位點。
方案2 其中X-BWSP是本發(fā)明的活化支化水溶性聚合物，以及BWSP是支化水溶性聚合物。
表2給出了用PEG或PPG結(jié)構(gòu)部分衍生化的糖單磷酸酯的代表性實例。表2的某些化合物通過方案4的方法來制備。其它衍生物通過本領(lǐng)域公認(rèn)的方法來制備。例如，參見Keppler等人，Glycobiology 1111R(2001)；和Charter等人，Glycobiology 101049(2000)。其它胺反應(yīng)性PBG和PPG類似物可以市購，或者它們可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員便于獲得的方法來制備。
表2 其中R是本發(fā)明的支化水溶性聚合物。
可用于實施本發(fā)明的改性糖磷酸酯可以在其它位置以及上述那些上被取代。以下給出了唾液酸的目前優(yōu)選的取代
其中X是連接基，優(yōu)先選自-O-，-N(H)-，-S，CH2-和-N(R)2，其中各R是獨立地選自R1-R5中的一員。符號Y、Z、A和B各自表示選自以上對于X的身份所述的基團(tuán)中的基團(tuán)。X、Y、Z、A和B可以各自獨立地選擇，因此，它們可以是相同或不同的。符號R1、R2、R3，R4和R5表示H，或者支化水溶性聚合物。另外，這些符號表示鍵接于支化水溶性聚合物的連接基。
交聯(lián)基團(tuán)用于本發(fā)明的方法的改性糖的制備包括將改性基團(tuán)連接于糖殘基和形成穩(wěn)定的加合物，后者是糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。糖和改性基團(tuán)可以通過零級或高級交聯(lián)劑來偶聯(lián)?？捎糜趯⒏男曰鶊F(tuán)連接于碳水化合物結(jié)構(gòu)部分的示例性雙官能化合物包括、但不限于雙官能化聚(乙二醇)，聚酰胺，聚醚，聚酯等。用于將碳水化合物連接于其它分子的一般方法在文獻(xiàn)中是已知的。例如，參見Lee等人，Biochemistry281856(1989)；Bhatia等人，Anal.Biochem.178408(1989)；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.1128886(1990)和Bednarski等人，WO92/18135。在以下的論述中，在新生改性糖的糖結(jié)構(gòu)部分上的反應(yīng)性基團(tuán)進(jìn)行有利處理。集中論述是為了清楚說明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚，該論述與在改性基團(tuán)上的反應(yīng)性基團(tuán)相關(guān)。
示例性策略包括使用異雙官能交聯(lián)劑SPDP(n-丁二酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯將保護(hù)巰基引入到糖上和然后將巰基去保護(hù)，與在改性基團(tuán)上的另一巰基形成二硫鍵。
如果SPDP有害地影響了改性糖用作糖基轉(zhuǎn)移酶底物的能力，一系列其它交聯(lián)劑之一比如2-亞氨基硫環(huán)(2-iminothiolane)或N-丁二酰亞胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)用來形成二硫鍵。2-亞氨基硫環(huán)與伯胺反應(yīng)，立即將未保護(hù)的巰基引入到含胺的分子中。SATA還與伯胺反應(yīng)，但引入了保護(hù)的巰基，其后來使用羥胺來去乙酰化，形成游離巰基。在各種情況下，所引入的巰基自由地與其它巰基或保護(hù)巰基比如SPDP反應(yīng)，形成所需的二硫鍵。
上述策略是用于本發(fā)明的連接基的示例，不是限制性的。可以獲得其它交聯(lián)劑，它們可用于將改性基團(tuán)與肽交聯(lián)的不同策略。例如，TPCH(S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰肼和TPMPH((S-(2-硫代吡啶基)巰基-丙酰肼)與預(yù)先通過溫和的高碘酸鹽處理來氧化的碳水化合物結(jié)構(gòu)部分反應(yīng)，因此在交聯(lián)劑的酰肼部分和高碘酸鹽產(chǎn)生的醛之間形成了腙鍵。TPCH和TPMPH將2-吡啶基硫酮保護(hù)的巰基引入到糖上，它能夠用DTT去保護(hù)，然后用于綴合，比如形成在組分之間的二硫鍵。
如果發(fā)現(xiàn)二硫鍵不適于產(chǎn)生穩(wěn)定的改性糖，可以使用引入了組分之間的更穩(wěn)定的鍵的其它交聯(lián)劑。異雙官能交聯(lián)劑GMBS(N-γ-馬來酰亞胺基丁酰氧基)丁二酰亞胺)和SMCC(丁二酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷)與伯胺反應(yīng)，因此將馬來酰亞胺基團(tuán)引入到該組分上。馬來酰亞胺基隨后可以與在另一組分上的巰基反應(yīng)，后者可以通過前述交聯(lián)劑引入，因此形成了在組分之間的穩(wěn)定硫醚鍵。如果在組分之間的位阻干擾了任何一種組分的活性或改性糖用作糖基轉(zhuǎn)移酶底物的能力，可以使用交聯(lián)劑，它在組分之間引入了長間隔臂并包括了前述交聯(lián)劑的一些的衍生物(即，SPDP)。因此，具有可使用的大量適合的交聯(lián)劑；它們各自根據(jù)其對最佳肽綴合物和改性糖生產(chǎn)所具有的效果來選擇。
多種試劑可用來用分子內(nèi)化學(xué)交聯(lián)劑改性改性糖的組分(關(guān)于交聯(lián)劑和交聯(lián)工序的評述，參見Wold，F(xiàn).，Meth.Enzymol.25623-651，1972；Weetall，H.H.，和Cooney，D.A.，InENZYMES ASDRUGS.(Holcenberg，和Roberts，eds.)pp.395-442，Wiley，NewYork，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，它們?nèi)恳氡疚墓﹨⒖?。優(yōu)選的交聯(lián)劑由各種零長、同雙官能和異雙官能交聯(lián)劑獲得。零長交聯(lián)劑包括兩個內(nèi)在化學(xué)基團(tuán)的直接綴合，不引入外來材料。催化二硫鍵形成的試劑屬于這類。另一個例子是誘發(fā)羧基和伯氨基縮合，以形成酰胺鍵的試劑，比如碳化二亞胺，氯甲酸乙酯，Woodward試劑K(2-乙基-5-苯基異噁唑翁-3′-磺酸鹽)，和羰基二咪唑。除了這些化學(xué)試劑以外，酶-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(谷氨酰基-肽γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶；EC2.3.2.13)可以用作零長交聯(lián)劑。該酶催化在蛋白結(jié)合的谷氨酰胺?；鶜埢聂弱０坊幫ǔＥc作為底物的伯氨基的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。優(yōu)選的同和異雙官能試劑分別含有兩個相同或兩個不同位點，它們可以對氨基、巰基、胍基、吲哚或非特定基團(tuán)具有反應(yīng)性。
i.交聯(lián)劑中的優(yōu)選特異位點1、氨基反應(yīng)性基團(tuán)在一個優(yōu)選實施方案中，在交聯(lián)劑上的位點是氨基反應(yīng)性基團(tuán)。氨基反應(yīng)性基團(tuán)的有用的非限制性實例包括N-羥基丁二酰亞胺(NHS)酯，亞氨基酯，異氰酸酯，?；u化物，芳基疊氮化物，對硝基苯基酯，醛，和磺酰氯。
NHS酯優(yōu)先與改性糖組分的伯(包括芳族)氨基反應(yīng)。組氨酸的咪唑基團(tuán)已知與伯胺競爭反應(yīng)，但反應(yīng)產(chǎn)物是不穩(wěn)定的和容易水解。該反應(yīng)涉及胺在NHS的酸性羧基上的親核攻擊，形成酰胺，釋放N-羥基丁二酰亞胺。因此，初始氨基的正電荷失去。
亞氨基酯是用于與改性糖組分的胺基反應(yīng)的最特異的?；瘎?。在7-10的pH下，亞氨基酯僅僅與伯胺反應(yīng)。伯胺親核攻擊亞氨酸酯，形成在高pH下分解成脒或者在低pH下分解為新的亞氨酸酯的中間體。該新亞氨酸酯可以與另一伯胺反應(yīng)，因此使兩個氨基交聯(lián)，即，推定的雙官能反應(yīng)的單官能化亞氨酸酯的情況。與伯胺反應(yīng)的主要產(chǎn)物是堿性強(qiáng)于初始胺的脒。初始氨基的正電荷因此被保留。
異氰酸酯(和異硫氰酸酯)與改性糖組分的伯胺反應(yīng)，形成穩(wěn)定的鍵。它們與巰基、咪唑和酪氨?；姆磻?yīng)獲得了相對不穩(wěn)定的產(chǎn)品。
還可以使用?；B氮化物作為氨基特異性試劑，其中親合組分的親核胺在弱堿性條件下，例如pH8.5下攻擊酸性羧基。
芳基鹵化物比如1，5-二氟-2，4-二硝基苯優(yōu)先與改性糖組分的氨基和酪氨酸苯酚基團(tuán)反應(yīng)，而且與巰基和咪唑基團(tuán)反應(yīng)。
單羧酸和二羧酸的對硝基苯基酯也是有用的氨基反應(yīng)性基團(tuán)。雖然該試劑特異性不是很高，但α-和ω-氨基似乎最快速地反應(yīng)。
醛比如戊二醛與改性糖的伯胺反應(yīng)。雖然在氨基與醛的反應(yīng)時形成了不穩(wěn)定的Schiff堿，但戊二醛能夠用穩(wěn)定的交聯(lián)改性該改性糖。在pH6-8，典型的交聯(lián)條件的pH下環(huán)狀聚合物經(jīng)歷了脫水，形成α，β-不飽和醛聚合物。然而，Schiff堿是穩(wěn)定的，當(dāng)綴合于另一雙鍵時。兩個雙鍵的共振相互作用防止了Schiff鍵的水解。此外，在高局部濃度下的胺能夠攻擊烯屬雙鍵，從而形成穩(wěn)定的Michael加成產(chǎn)物。
芳族磺酰氯與改性糖組分的各個位點反應(yīng)，但與氨基的反應(yīng)是最重要的，形成了穩(wěn)定的磺酰胺鍵。
2、巰基反應(yīng)性基團(tuán)在另一個優(yōu)選的實施方案中，該位點是巰基反應(yīng)性基團(tuán)。巰基反應(yīng)性基團(tuán)的有用的、非限制性實例包括馬來酰亞胺，烷基鹵，二硫化吡啶，和硫代鄰苯二甲酰亞胺。
馬來酰亞胺優(yōu)先與改性糖組分的巰基反應(yīng)，從而形成穩(wěn)定的硫醚鍵。它們還以慢得多的速率與組氨酸的伯氨基和咪唑基團(tuán)反應(yīng)。然而，在pH7下，馬來酰亞胺基團(tuán)可以被認(rèn)為是巰基特異性基團(tuán)，因為在該pH下，簡單硫醇的反應(yīng)速率比相應(yīng)胺的速率高1000倍。
烷基鹵與巰基、硫化物、咪唑和氨基反應(yīng)。然而，在中性到弱堿性pH下，烷基鹵主要與巰基反應(yīng)，形成穩(wěn)定的硫醚鍵。在較高的pH下，與氨基的反應(yīng)是優(yōu)先的。
二硫化吡啶經(jīng)由二硫化物交換而與游離巰基反應(yīng)，獲得混和二硫化物。結(jié)果，二硫化吡啶是特異性最高的巰基反應(yīng)性基團(tuán)。
硫代鄰苯二甲酰亞胺與游離巰基反應(yīng)，形成二硫化物。
3、羧基反應(yīng)性殘基在另一個實施方案中，可溶于水和有機(jī)溶劑兩者的碳化二亞胺用作羧基反應(yīng)性試劑。這些化合物與游離羧基反應(yīng)，形成假脲，它然后可以偶聯(lián)于可獲得的胺，形成了酰胺鍵，這教導(dǎo)了怎樣用碳化二亞胺改性羧基(Yamada等人，Biochemistry 204836-4842，1981)。
ii.在交聯(lián)試劑中的優(yōu)選的非特異性位點除了位點特異性反應(yīng)性結(jié)構(gòu)部分以外，本發(fā)明打算使用非特異性反應(yīng)性基團(tuán)來將糖連接于改性基團(tuán)。
示例的非特異性交聯(lián)劑包括可光活化的基團(tuán)，在黑暗中是完全惰性的，在吸收適當(dāng)能量的光子時轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性物質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，可光活化的基團(tuán)選自在加熱或光解疊氮化物時產(chǎn)生的氮賓類的前體。缺電子氮賓類的反應(yīng)性極高，能夠與包括N-H、O-H、C-H和C＝C在內(nèi)的各種化學(xué)鍵反應(yīng)。雖然可以使用三類疊氮化物(芳基、烷基和?；苌?，但芳基疊氮化物目前是優(yōu)選的。芳基疊氮化物在光解時的與N-H和O-H的反應(yīng)性要比與C-H的反應(yīng)性好。缺電子芳基氮賓類快速地環(huán)擴(kuò)大，形成脫氫氮雜，其傾向于與親核體反應(yīng)，而非形成C-H插入產(chǎn)物。芳基疊氮化物的反應(yīng)性可以通過在環(huán)中提供吸電子取代基比如硝基或羥基來提高。此類取代基將芳基疊氮化物的最大吸收推動到較長的波長。未取代的芳基疊氮化物具有260-280nm范圍內(nèi)的最大吸收，而羥基和硝基芳基疊氮化物吸收超過305nm的大量光線。因此，羥基和硝基芳基疊氮化物是最優(yōu)選的，因為與未取代的芳基疊氮化物相比，它們允許使用不太有害的光解條件來用于親和組分。
在另一個優(yōu)選實施方案中，可光活化基團(tuán)選自氟化芳基疊氮化物。氟化芳基疊氮化物的光解產(chǎn)物是芳基氮賓類，它們?nèi)窟M(jìn)行該基團(tuán)的特性反應(yīng)，包括C-H鍵插入，具有高的效率(Keana等人，J.Org.Chem.553640-3647，1990)。
在另一個實施方案中，可光活化的基團(tuán)選自二苯甲酮殘基。二苯甲酮試劑一般比芳基疊氮化物試劑獲得了更高交聯(lián)收率。
在另一個實施方案中，可光活化的基團(tuán)選自重氮化合物，其在光解時形成缺電子碳烯。這些碳烯類經(jīng)歷各種反應(yīng)，包括插入到C-H鍵中，加成到雙鍵(包括芳族體系)中，氫吸引和配位于親核中心，獲得碳離子。
在又一個實施方案中，可光活化基團(tuán)選自重氮丙酮酸酯。例如，重氮丙酮酸對硝基苯基酯的對硝基苯基酯于脂族胺反應(yīng)，獲得重氮丙酮酸酰胺，后者經(jīng)歷紫外線光解，形成醛。光解的重氮丙酮酸酯改性的親和組分將如同甲醛或戊二醛一樣反應(yīng)，形成交聯(lián)。
iii.同雙官能試劑1、與伯胺反應(yīng)的同雙官能交聯(lián)劑胺反應(yīng)性交聯(lián)劑的合成、性能和應(yīng)用大量描述在文獻(xiàn)中(對于交聯(lián)工序和試劑的評述，參見上文)。許多試劑可以獲得(例如，PierceChemical Company，Rockford，I11.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同雙官能NHS酯的優(yōu)選的非限制性實例包括戊二酸二丁二酰亞胺酯(DSG)，辛二酸二丁二酰亞胺酯(DSS)，辛二酸雙(磺基丁二酰亞胺酯)(BS)，酒石酸二丁二酰亞胺酯(DST)，酒石酸二(磺基丁二酰亞胺)酯(磺基-DST)，雙-2-(丁二酰亞胺氧基羰氧基)乙基砜(BSOCOES)，雙-2-(磺基丁二酰亞胺氧基羰氧基)乙基砜(磺基-BSOCOES)，乙二醇雙(丁二酰亞胺基丁二酸酯)(EGS)，乙二醇雙(磺基丁二酰亞胺基丁二酸酯)(磺基-EGS)，二硫代雙(丙酸丁二酰亞胺酯)(DSP)，以及二硫代雙(丙酸磺基丁二酰亞胺基酯)(磺基-DSP)。同雙官能亞氨基酯的優(yōu)選、非限制性實例包括丙二酰亞氨酸二甲酯(DMM)，丁二酰亞氨酸二甲酯(DMSC)，己二酰亞氨酸二甲酯(DMA)，庚二酰亞氨酸二甲酯(DMP)，辛二酰亞氨酸二甲酯(DMS)，3，3′-氧二丙酰亞氨酸二甲酯(DODP)，3，3′-(亞甲基二氧基)二丙酰亞氨酸二甲酯(DMDP)，3，3′-(二亞甲基二氧基)二丙酰亞氨酸二甲酯(DDDP)，3，3′-(四亞甲基二氧基)-二丙酰亞氨酸二甲酯(DTDP)，以及3，3′-二硫代雙丙酰亞氨酸二甲酯(DTBP)。
同雙官能異硫氰酸酯的優(yōu)選的、非限制性實例包括對亞苯基二異硫氰酸酯(DITC)，和4，4′-二異硫氰基-2，2′-二磺酸均二苯乙烯(DIDS)。
同雙官能異氰酸酯的優(yōu)選的非限制性實例包括二甲苯二異氰酸酯，甲苯-2，4-二異氰酸酯，甲苯-2-異氰酸酯-4-異硫氰酸酯，3-甲氧基二苯基甲烷-4，4′-二異氰酸酯，2，2′-二羧基-4，4′-偶氮苯基二異氰酸酯，和六亞甲基二異氰酸酯。
同雙官能芳基鹵化物的優(yōu)選的、非限制性實例包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)，和4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基砜。
同雙官能脂族醛試劑的優(yōu)選的、非限制性實例包括乙二醛，丙二醛和戊二醛。
同雙官能酰化劑的優(yōu)選的、非限制性實例包括二羧酸的硝基苯基酯。
同雙官能芳族磺酰氯的優(yōu)選的、非限制性實例包括苯酚-2，4-二磺酰氯，和α-萘酚-2，4-二磺酰氯。
另外的氨基反應(yīng)性同雙官能試劑的優(yōu)選的、非限制性實例包括赤蘚醇雙碳酸酯，其可與胺反應(yīng)，獲得雙氨基甲酸酯。
2.與游離巰基反應(yīng)的同雙官能交聯(lián)劑此類試劑的合成、性能和應(yīng)用描述在文獻(xiàn)中(關(guān)于交聯(lián)工序和試劑的評述，參見上文)。許多試劑可以市購(例如，Pierce ChemicalCompany，Rockford，I11.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同雙官能馬來酰亞胺的優(yōu)選的、非限制性實例包括雙馬來酰亞胺基己烷(BMH)，N，N′-(1，3-亞苯基)雙馬來酰亞胺，N，N′-(1，2-亞苯基)雙馬來酰亞胺，偶氮苯基二馬來酰亞胺，和雙(N-馬來酰亞胺基甲基)醚。
同雙官能二硫化吡啶的優(yōu)選的、非限制性實例包括1，4-二-3′-(2′-吡啶二硫基)丙酰胺基丁烷(DPDPB)。
同雙官能烷基鹵化物的優(yōu)選的、非限制性實例包括2，2′-二羧基-4，4′-二碘乙酰胺基偶氮苯，α，α′-二碘-對二甲苯磺酸，α，α′-二溴-對二甲苯磺酸，N，N′-雙(b-溴乙基)芐基胺，N，N′-二(溴乙?；?苯基肼，和1，2-二(溴乙?；?氨基-3-苯基丙烷。
3.同雙官能可光活化的交聯(lián)劑此類試劑的合成、性能和應(yīng)用大量描述在文獻(xiàn)中(對于交聯(lián)工序和試劑的評述，參見上文)。這些試劑的一些可以市購(例如，PierceChemical Company，Rockford，I11.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
同雙官能可光活化的交聯(lián)劑的優(yōu)選的、非限制性實例包括雙-β-(4-疊氮基水楊基酰胺基)乙基二硫化物(BASED)，二-N-(2-硝基-4-疊氮基苯基)-胱胺-S，S-二氧化物(DNCO)，和4，4′-二硫代雙苯基疊氮化物。
iv.異雙官能試劑1、具有二硫化吡啶基結(jié)構(gòu)部分的氨基反應(yīng)性異雙官能試劑此類試劑的合成、性能和應(yīng)用大量描述在文獻(xiàn)中(對于交聯(lián)工序和試劑的評述，參見上文)。這些試劑的許多可以市購(例如，PierceChemical Company，Rockford，I11.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
具有二硫化吡啶結(jié)構(gòu)部分和氨基反應(yīng)性NHS酯的異雙官能試劑的優(yōu)選的、非限制性實例包括N-丁二酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)，丁二酰亞胺基6-3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基己酸酯(LC-SPDP)，磺基丁二酰亞胺基6-3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基己酸酯(磺基-LCSPDP)，4-丁二酰亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)，和磺基丁二酰亞胺基6-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯酰胺基己酸酯(磺基-LC-SMPT)。
2、具有馬來酰亞胺結(jié)構(gòu)部分的氨基反應(yīng)性異雙官能試劑此類試劑的合成、性能和應(yīng)用大量描述在文獻(xiàn)中。具有馬來酰亞胺結(jié)構(gòu)部分和氨基反應(yīng)性NHS酯的異雙官能試劑的優(yōu)選的、非限制性實例包括馬來酰亞胺基乙酸丁二酰亞胺酯(AMAS)，3-馬來酰亞胺基丙酸丁二酰亞胺酯(BMPS)，N-γ-馬來酰亞胺基丁酰氧基丁二酰亞胺酯(GMBS)，N-γ-馬來酰亞胺基丁酰氧基磺基丁二酰亞胺酯(磺基-GMBS)，丁二酰亞胺基6-馬來酰亞胺基己酸酯(EMCS)，丁二酰亞胺基3-馬來酰亞胺基苯甲酸酯(SMB)，間-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基丁二酰亞胺酯(MBS)，間-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基磺基丁二酰亞胺酯(磺基-MBS)，丁二酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)，磺基丁二酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)，丁二酰亞胺基4-(對馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(SMPB)，和磺基丁二酰亞胺基4-(對馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)。
3、具有烷基鹵結(jié)構(gòu)部分的氨基反應(yīng)性異雙官能試劑此類試劑的合成、性能和應(yīng)用大量描述在文獻(xiàn)中。具有烷基鹵結(jié)構(gòu)部分和氨基反應(yīng)性NHS酯的異雙官能試劑的優(yōu)選的、非限制性實例包括N-丁二酰亞胺基-(4-碘乙?；?氨基苯甲酸酯(SIAB)，磺基丁二酰亞胺基-(4-碘乙?；?氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)，丁二酰亞胺基-6-(碘乙?；?氨基己酸酯(SIAX)，丁二酰亞胺基-6-(6-((碘乙?；?-氨基)己?；被?己酸酯(SIAXX)，丁二酰亞胺基-6-(((4-(碘乙?；?-氨基)-甲基)-環(huán)己烷-1-羰基)氨基己酸酯(SIACX)，以及丁二酰亞胺基-4(碘乙?；?-氨基)甲基環(huán)己烷-1-羧酸酯(SIAC)。
具有氨基反應(yīng)性NHS酯和烷基二鹵化物結(jié)構(gòu)部分的異雙官能試劑的優(yōu)選實例是N-羥基丁二酰亞胺基2，3-二溴丙酸酯(SDBP)。SDBP通過綴合其胺基將分子內(nèi)交聯(lián)引入到親和組分。二溴丙酰基結(jié)構(gòu)部分與伯胺基的反應(yīng)性通過反應(yīng)溫度來控制(McKenzie等人，Protein Chem.7581-592(1988))。
具有烷基鹵結(jié)構(gòu)部分和氨基反應(yīng)性對硝基苯基酯結(jié)構(gòu)部分的異雙官能試劑的優(yōu)選的、非限制性實例包括碘乙酸對硝基苯基酯(NPIA)。
其它交聯(lián)劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。例如，參見Pomato等人，U.S.專利No.5,965,106。選擇適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑用于特定應(yīng)用是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。
v.可裂解的連接基在又一個實施方案中，該連接基具有能夠裂解，以從糖殘基上釋放改性基團(tuán)的基團(tuán)。許多可裂解基團(tuán)在本領(lǐng)域中是已知的。例如，參見Jung等人，Biochem.Biophys.Acta 761152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.26514518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.124913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.155141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.261205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.1431859-1867(1989)。而且，各種可裂解的、雙官能(同和異雙官能)連接基可以從供應(yīng)商比如Pierce那里市購。
示例性可裂解結(jié)構(gòu)部分可以使用光、熱或試劑比如硫醇，羥胺，堿，高碘酸鹽等來裂解。而且，作為對內(nèi)吞的響應(yīng)，某些優(yōu)選基團(tuán)在體內(nèi)裂解(例如，順式-烏頭基；參見Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048(1991))。優(yōu)選的可裂解的基團(tuán)包括可裂解的結(jié)構(gòu)部分，它是選自二硫化物，酯，酰亞胺，碳酸酯，硝基芐基，苯甲?；捅脚家龌鶊F(tuán)中的成員。
方法本發(fā)明還提供了制備聚(乙二醇)分子的基本單分散群體的方法。該方法包括讓具有明確分子量的PEG分子，例如PEG200與至少2當(dāng)量的也具有明確分子量的雙官能活化PEG，例如PEG200接觸，從而形成PEG的單分散樣品，例如PEG600 G是離去基團(tuán)，比如磺酸酯和tresylate酯。PEG600的單分散樣品然后可以與雙官能活化PEG200接觸，形成單分散PEG100?；蛘撸瑔畏稚EG600可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的雙官能衍生物并與至少2當(dāng)量的單分散二羥基PEG600反應(yīng)，形成單分散PEG1800。本發(fā)明的方法重復(fù)到獲得所需尺寸的單分散PEG為止。可以設(shè)計該合成，使得在起始原料和產(chǎn)物之間的分子量差允許通過尺寸排阻色譜法分離任何未反應(yīng)或部分反應(yīng)的材料。
活化PEG衍生物本發(fā)明還提供了制備聚(乙二醇)衍生物的方法。在方案I中概括了該方法 a.R-Y/(酸或堿)；b.活化，例如甲苯磺酰化，鹵-去羥基化，例如HX或SOX2，以及與PEGm反應(yīng)；c.活化(R′)，例如用氯甲酸對硝基苯基酯。
其中，下標(biāo)m和n獨立地表示1-100,000的整數(shù)。R是選自取代或未取代烷基，取代或未取代雜烷基，取代或未取代芳基，烷基胺，保護(hù)烷基胺，或活化基團(tuán)中的成員，例如三氟甲磺酸根，甲苯磺酸根等。
R′選自取代或未取代烷基，取代或未取代雜烷基，取代或未取代芳基，取代或未取代雜環(huán)烷基和取代或未取代雜芳基。當(dāng)R不包括用于活化它所連接的CH2-O結(jié)構(gòu)部分的離去基團(tuán)時，R′一般是離去基團(tuán)，或包括離去基團(tuán)。
在示例性實施方案中，R是低級烷基，比如甲基。在另一個示例性實施方案中，R′是取代烷基，比如氯甲酸對硝基苯基酯。
在步驟a中，起始二醇與活化基團(tuán)(R-Y)接觸，該活化基團(tuán)與二醇的羥基結(jié)構(gòu)部分反應(yīng)。Y通常是離去基團(tuán)，使R安放在PEG分子的羥基結(jié)構(gòu)部分之一上。在步驟b中，所得加合物的游離羥基通過其轉(zhuǎn)化為諸如鹵素例如氯或磺酸酯之類的基團(tuán)來活化?；罨腜EG物質(zhì)與作為起始PEG(“PEGm”)的相同或不同聚合度的另一PEG結(jié)構(gòu)部分接觸。為了使其連接于另一物質(zhì)，RO-PEG(n+m)任選在游離羥基結(jié)構(gòu)部分處活化。
一般，R基團(tuán)經(jīng)由包括反應(yīng)性官能團(tuán)的物質(zhì)連接于PEG結(jié)構(gòu)部分。而且，兩個聚(乙二醇)片段通過使用反應(yīng)性官能團(tuán)連在一起，它們通過連接方法轉(zhuǎn)化為新的有機(jī)官能團(tuán)或未反應(yīng)的物質(zhì)。反應(yīng)性官能團(tuán)位于聚(乙二醇)結(jié)構(gòu)部分上的任何位置，但優(yōu)選在末端之一。
支化聚合物改性的糖與肽的綴合改性糖使用適當(dāng)?shù)拿妇Y合于糖基化或非糖基化肽，以調(diào)解該綴合。優(yōu)選地，選擇改性給體糖、酶和受體肽的濃度，使得糖基化進(jìn)行到受體被消耗為止。雖然就唾液酸基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了闡明，但下述考慮一般適用于其它糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。
使用糖基轉(zhuǎn)移酶合成所需寡糖結(jié)構(gòu)的許多方法是已知的，并且一般適用于本發(fā)明。示例性方法例如描述在WO96/32491，Ito等人，Pure Appl.Chem.65753(1993)，和U.S.Pat.Nos.5,352,670，5,374,541，和5,545,553。
本發(fā)明使用單一糖基轉(zhuǎn)移酶或糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)合物來實施。例如，可以使用唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)合物。在使用一種以上的酶的這些實施方案中，酶和底物優(yōu)選在初始反應(yīng)混合物中合并，或者一旦第一酶促反應(yīng)結(jié)束或者幾乎結(jié)束，將用于第二酶促反應(yīng)的酶和試劑加入到反應(yīng)介質(zhì)中。通過在單一容器中按序進(jìn)行兩種酶促反應(yīng)，總收率比其中分離中間體物質(zhì)的工序改進(jìn)。而且，減少了附加溶劑和副產(chǎn)物的清除和處理。
在優(yōu)選的實施方案中，第一和第二種酶各自是糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一種酶是內(nèi)糖苷酶。在其它優(yōu)選的實施方案中，使用兩種以上的酶來裝配本發(fā)明的改性糖蛋白。在將改性糖加成到肽之前和之后，使用酶來改變肽上的任何位置的糖結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的綴合物的O-連接的糖基結(jié)構(gòu)部分一般用連接于肽的GalNAc結(jié)構(gòu)部分來產(chǎn)生。GalNAc轉(zhuǎn)移酶的家族的任何成員可以用來將GalNAc結(jié)構(gòu)部分結(jié)合于肽(Hassan H，Bennett EP，Mandel U，Hollingsworth MA，and Clausen H(2000))。粘液型O-糖基化O-聚糖占有率的控制通過多肽GalNAc-轉(zhuǎn)移酶的底物特異性來指導(dǎo)(Eds.Ernst，Hart，and Sinay)。Wiley-VCH chapter″Carbohydrates inChemistry and Biology-a Comprehension Handbook″，273-292)。GalNAc結(jié)構(gòu)部分本身可以是完整的糖基連接基。另外，糖基殘基可以使用一種或多種酶和一種或多種適當(dāng)?shù)拿傅奶腔孜飦碓鼋?，改性糖被加入到增建的糖基結(jié)構(gòu)部分上。
在另一個實施方案中，該方法利用一種或多種外或內(nèi)糖苷酶。糖苷酶一般是突變體，它被工程化形成糖基鍵，而非裂解它們。突變體聚糖酶一般包括代替活性位點酸性氨基酸殘基的氨基酸殘基。例如，當(dāng)內(nèi)聚糖酶是內(nèi)-H時，取代活性位點殘基一般是在130位的Asp，在132位的Glu，或它們的組合。氨基酸一般用絲氨酸、丙氨酸，天冬酰胺或谷氨酰胺來代替。
突變體酶通常通過與內(nèi)聚糖酶水解步驟的逆反應(yīng)類似的合成步驟來催化該反應(yīng)。在這些實施方案中，糖基給體分子(例如，所需的寡糖或單糖結(jié)構(gòu))含有離去基團(tuán)，以及該反應(yīng)通過將給體分子加成到蛋白上的GlcNAc殘基上來進(jìn)行。例如，離去基團(tuán)可以是鹵素，比如氟。在其它實施方案中，離去基團(tuán)是Asn，或Asn-肽結(jié)構(gòu)部分。在其它實施方案中，糖基給體分子上的GlcNAc殘基被改性。例如，GlcNAc殘基可以包括1，2-噁唑啉結(jié)構(gòu)部分。
在優(yōu)選的實施方案中，用于生產(chǎn)本發(fā)明的綴合物的各種酶以催化量存在。特定酶的催化量根據(jù)酶的底物的濃度以及反應(yīng)條件比如溫度、時間和pH值來改變。測定既定酶在預(yù)選擇底物濃度和反應(yīng)條件下的催化量的方式是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。
進(jìn)行以上方法的溫度可以是剛好在冰凍以上的溫度到最敏感的酶變性的溫度。優(yōu)選的溫度范圍是大約0到大約55℃，以及更優(yōu)選是大約20到大約30℃。在另一個示例性實施方案中，本發(fā)明方法的一種或多種組分在高溫下使用嗜熱酶處理。
反應(yīng)混合物保持受體足以被糖基化，從而形成所需綴合物的時間。綴合物的一些常?？梢栽趲仔r后檢測，可回收量通常在24小時或更短的時間內(nèi)回收。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解，反應(yīng)速率取決于可變因素的值(例如酶濃度，給體濃度，受體濃度，溫度，溶劑體積)，這些值對于選擇體系可以進(jìn)行優(yōu)化。
本發(fā)明還提供了改性肽的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)方法。本文使用的工業(yè)規(guī)模一般產(chǎn)生了至少大約250mg，優(yōu)選至少大約500mg和更優(yōu)選至少大約1g的成品、提純綴合物，優(yōu)選在一個反應(yīng)周期結(jié)束之后，即，該綴合物不是來自相同、連續(xù)重復(fù)的合成周期的反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)合物。
在以下的論述中，本發(fā)明通過改性唾液酸結(jié)構(gòu)部分與糖基化肽的綴合來舉例說明。示例性改性唾液酸用(m-)PEG標(biāo)記。以下論述集中于PEG改性唾液酸和糖基化肽的使用是為了清楚說明，不是暗示本發(fā)明限于這兩種配對物的綴合物。技術(shù)人員理解，該論述一般適用于除了唾液酸以外的改性糖基結(jié)構(gòu)部分的加成。而且，該論述同樣適用于糖基單元用除了PEG以外的試劑(包括其它水溶性聚合物，治療用結(jié)構(gòu)部分和生物分子)的改性。
酶促方法可以用于將支化聚合物改性的碳水化合物選擇性引入到肽或糖肽上。該方法采用含有支化水溶性聚合物的改性糖，并且與適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶或糖合成酶結(jié)合。通過選擇獲得所需碳水化合物鍵的糖基轉(zhuǎn)移酶和采用改性糖作為給體底物，該支化水溶性聚合物可以直接引入到肽骨架上，糖肽的現(xiàn)有糖殘基上或已經(jīng)加成到肽上的糖殘基上。
唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的受體作為天然存在的結(jié)構(gòu)，或者作為重組、酶法或化學(xué)法設(shè)置的結(jié)構(gòu)存在于所要通過本發(fā)明的方法改性肽上，適合的受體例如包括半乳糖基受體，比如GalNAc，Galβ1，4GlcNAc，Galβ1，4GalNAc，Galβ1，3GalNAc，乳-N-四糖，Galβ1，3GlcNAc，Galβ1，3Ara，Galβ1，6GlcNAc，Galβ1，4Glc(乳糖)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它受體(例如參見Paulson等人，J.Biol.Chem.2535617-5624(1978))。
在一個實施方案中，唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的受體存在于在糖肽的體內(nèi)合成時改性的糖肽上。此類糖肽可以使用所要求的方法來唾液酸化，不應(yīng)預(yù)選改變糖肽的糖基化方式?；蛘撸景l(fā)明的方法可以用來唾液酸化不包括適合的受體的肽；人們首先可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法改性該肽，以引入受體。
在示例性實施方案中，半乳糖基受體通過將半乳糖殘基連接于與肽相連的適當(dāng)受體，例如GalNAc來組裝。該方法包括用含有適量的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(例如Galβ1，3或Galβ1，4)和適合的半乳糖基給體(例如UDP-半乳糖)的反應(yīng)混合物孵化所要改性的肽。使該反應(yīng)進(jìn)行到基本上完全，或者，當(dāng)添加了預(yù)定量的半乳糖殘基時，終止反應(yīng)。裝配選擇糖受體的其它方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的。
在又一個實施方案中，首先總體或部分“修剪”糖肽連接的寡糖，以暴露唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的受體，或者可以添加一個或多個適合的殘基以獲得適合的受體的結(jié)構(gòu)部分。酶比如半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)切糖苷酶(例如參見US專利No.5,716,812)可用于連接和修剪反應(yīng)。
在示例性實施方案中，碳水化合物殘基在添加改性糖之前“修剪”。例如，將GalNAc-Gal殘基重新修剪成GalNAc。攜帶水溶性聚合物的改性糖綴合于通過“修剪”暴露的一個或多個糖殘基。在一個實例中，“修剪”糖肽，經(jīng)由綴合于水溶性聚合物的糖基結(jié)構(gòu)部分，例如Sia，Gal或GalNAc結(jié)構(gòu)部分，將水溶性聚合物加成到所得O-側(cè)鏈氨基酸或糖肽聚糖上。將改性糖基結(jié)構(gòu)部分連接于“修剪”的糖肽上的受體位點上?；蛘撸锤男缘奶腔Y(jié)構(gòu)部分，例如Gal可以在O-連接的聚糖末端連接。
在另一個示例性實施方案中，經(jīng)由具有半乳糖殘基的改性糖，將支化水溶性聚合物加成到GalNAc殘基上。或者，可以將未改性Gal加成到末端GalNAc殘基。
在又一個實例中，使用改性唾液酸將支化水溶性聚合物加成到Gal殘基上。
上述示例性實施方案提供了本文所述的方法的能力的說明。使用本發(fā)明的方法，可以“削減”和“增加”基本上任何合乎需要結(jié)構(gòu)的碳水化合物殘基。改性糖可以加成到如上所述的碳水化合物結(jié)構(gòu)部分的末端，或者它可以介于肽核和碳水化合物末端之間。
在示例性實施方案中，使用聚合物改性的唾液酸將支化水溶性聚合物加成到末端Gal殘基上。使用適當(dāng)?shù)耐僖核峄D(zhuǎn)移酶來加成改性唾液酸。該方法在方案3中總結(jié)。
方案3 在方案4中總結(jié)的又一種方法中，封閉的反應(yīng)性官能團(tuán)存在于唾液酸中。該封閉反應(yīng)性基團(tuán)優(yōu)選不受用于將改性唾液酸連接于肽的條件的影響。在將改性唾液酸共價連接于肽之后，除去掩閉物，用諸如PEG、PPG、治療用結(jié)構(gòu)部分、生物分子之類的試劑或其它試劑來綴合肽。該試劑通過其與改性糖殘基上的未封閉反應(yīng)性基團(tuán)的反應(yīng)而以特定方式綴合于肽。
方案4 取決于糖肽的寡糖側(cè)鏈的末端糖(表3)，任何改性糖可以與它的適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶一起使用。如上所述，引入支化水溶性聚合物結(jié)構(gòu)所需的糖肽的末端糖可以在表達(dá)過程中自然引入，或者它可以通過使用適當(dāng)?shù)奶擒彰福腔D(zhuǎn)移酶，或者糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物在表達(dá)后生成。
表3


在可供選擇的實施方案中，使用已知將糖基殘基轉(zhuǎn)移到肽骨架的O-連接的糖基化位點上的糖基轉(zhuǎn)移酶，將改性糖直接加成到肽骨架上。該示例性實施方案在方案5中闡述?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的示例性糖基轉(zhuǎn)移酶包括、但不限于GalNAc轉(zhuǎn)移酶(GalNAc T1-20)，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，木糖基轉(zhuǎn)移酶，甘露糖基轉(zhuǎn)移酶等。使用該方法可以將改性糖直接加成到缺乏任何碳水化合物的肽，或者現(xiàn)有的糖肽上。在兩種情況下，改性糖的加成發(fā)生在如由糖基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性所規(guī)定的肽骨架上的特定位置上，而不是象在使用化學(xué)方法改性蛋白的肽骨架過程中發(fā)生的無規(guī)方式。通過將適當(dāng)?shù)陌被嵝蛄泄こ袒蕉嚯逆溨?，可以將系列試劑引入到缺乏糖基轉(zhuǎn)移酶底物肽序列的蛋白或糖肽中。
方案5 在上述各示例性實施方案中，在將改性糖綴合于肽之后，可以采用一個或多個附加化學(xué)或酶法改性步驟。在示例性實施方案中，使用酶(例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)將糖基單元(例如巖藻糖)連接于與肽相連的末端改性糖。在另一個實例中，使用酶促反應(yīng)來“封端”(例如唾液酸化)改性糖未能綴合的位點。或者，采用化學(xué)反應(yīng)來改變綴合的改性糖的結(jié)構(gòu)。例如，綴合的改性糖與穩(wěn)定或去穩(wěn)定其與改性糖所連接的肽組分的鍵的試劑反應(yīng)。在另一個實例中，在其綴合于肽之后，將改性糖的組分去保護(hù)。技術(shù)人員清楚，在將改性糖綴合于肽之后的階段中，具有可用于本發(fā)明的方法的系列酶促和化學(xué)工序。改性糖-肽綴合物的進(jìn)一步細(xì)節(jié)是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在另一個示例性實施方案中，將糖肽綴合于導(dǎo)向劑，例如鐵傳遞蛋白(用于輸送肽穿過血腦屏障，以及到達(dá)核內(nèi)體)，肉毒堿(用于將肽輸送到肌肉細(xì)胞；例如參見LeBorgne等人，Biochem.Pharmacol.591357-63(2000)，以及膦酸酯，例如雙膦酸酯(用于將肽導(dǎo)向到骨和其它含鈣組織；例如參見Modern Drug Discovery，2002年8月，第10頁)。可用于導(dǎo)向的其它試劑是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所顯而易見的。例如，葡萄糖、谷氨酰胺和IGF還可用于導(dǎo)向到肌肉。
導(dǎo)向結(jié)構(gòu)部分和治療用肽通過本文所述的任何方法或者本領(lǐng)域已知的其它方法來綴合。技術(shù)人員清楚，除了上述那些以外的肽也可以如本文所述衍生化。在2001年10月10日提交的待審查、共同擁有的US臨時專利申請No.60/328,523所附的附錄中闡述了示例性肽。
在示例性實施方案中，導(dǎo)向劑和治療用肽經(jīng)由連接基結(jié)構(gòu)部分偶聯(lián)。在該實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法，治療用肽或?qū)騽┑闹辽僖环N經(jīng)由完整的糖基連接基偶聯(lián)于連接基結(jié)構(gòu)部分。在示例性實施方案中，連接基結(jié)構(gòu)部分包括聚(醚)比如聚(乙二醇)。在另一示例性實施方案中，連接基結(jié)構(gòu)部分包括在將綴合物輸送到人體的目標(biāo)組織或部位之后，在體內(nèi)降解，從導(dǎo)向劑釋放治療用肽的至少一個鍵。
在又一個示例性實施方案中，治療用肽的體內(nèi)分布通過改變治療用結(jié)構(gòu)部分的糖形，不用將治療用肽綴合于導(dǎo)向結(jié)構(gòu)部分來改變。例如，治療用肽可以通過用唾液酸(或其衍生物)封端糖基的末端半乳糖結(jié)構(gòu)部分而避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所攝取。
i.酶1、糖基轉(zhuǎn)移酶糖基轉(zhuǎn)移酶以分步方式催化活化糖(給體NDP-糖)在蛋白、糖肽、脂類或糖脂上或生長寡糖的非還原末端上的加成。N-連接的糖肽經(jīng)由轉(zhuǎn)移酶和脂類連接的寡糖給體Dol-PP-NAG2Glc3Man9以整體轉(zhuǎn)移和隨后修剪核的方式合成。在該情況下，“核”糖的性質(zhì)有些不同于后續(xù)連接。本領(lǐng)域已知有大量的糖基轉(zhuǎn)移酶。
用于本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶可以是任何一種，只要它能夠使用改性糖作為糖給體。此類酶的實例包括Leloir途徑糖基轉(zhuǎn)移酶，比如半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰氨基葡糖基轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，唾液酸基轉(zhuǎn)移酶，甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，木糖基轉(zhuǎn)移酶，葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶等。
對于涉及糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的酶促糖合成，糖基轉(zhuǎn)移酶可以克隆，或者從任何來源分離。許多克隆的糖基轉(zhuǎn)移酶是已知的，它們的多核苷酸序列也是已知的。例如參見“The WWW Guide To ClonedGlycosyltransferases”，(http//www.vei.co.uk/TGN/gt_guide.htm)。糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列和可以推論出氨基酸序列的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列也可在各種公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫中找到，包括GenBank，Swiss-Prot，EMBL等。
可以在本發(fā)明的方法中使用的糖基轉(zhuǎn)移酶包括、但不限于半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰氨基葡糖基轉(zhuǎn)移酶，葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶，唾液酸基轉(zhuǎn)移酶，甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶以及寡糖基轉(zhuǎn)移酶。適合的糖基轉(zhuǎn)移酶包括由真核細(xì)胞以及原核生物獲得的那些。
DNA編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶可以通過化學(xué)合成，從適當(dāng)?shù)募?xì)胞或細(xì)胞系培養(yǎng)物篩選mRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，通過篩選來自適當(dāng)細(xì)胞的基因庫，或者通過結(jié)合這些工序來獲得。mRNA或基因組DNA的篩選可以用由糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列產(chǎn)生的寡核苷酸探針來進(jìn)行。探針可以按照已知并且在普通雜交試驗中使用的工序用可檢測的基團(tuán)比如熒光基團(tuán)，放射性原子或化學(xué)發(fā)光基團(tuán)來標(biāo)記。在替代的方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列可以通過使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)工序來獲得，其中PCR寡核苷酸引物由糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列產(chǎn)生。參見US專利No.4,683,195(Mullis等人)和US專利No.4,683,202(Mullis)。
糖基轉(zhuǎn)移酶可以在用含有編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中合成。載體用于擴(kuò)增編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA和/或表達(dá)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA。表達(dá)載體是可復(fù)制的DNA結(jié)構(gòu)，其中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列可操作地連接于能夠在適合宿主中表達(dá)該糖基轉(zhuǎn)移酶的適合控制序列(control sequence)。對于這種控制序列的需求將根據(jù)所選擇的宿主和所選擇的轉(zhuǎn)化方法而改變。一般，控制序列包括轉(zhuǎn)錄啟動子，任選的用于控制轉(zhuǎn)錄的操縱基團(tuán)序列，編碼適合的mRNA核糖體結(jié)合部位的序列，以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。擴(kuò)增載體不需要表達(dá)控制區(qū)。所需的全部是在宿主中復(fù)制的能力，通常由復(fù)制的起點和有利于轉(zhuǎn)化體的識別的選擇基因所賦予。
在示例性實施方案中，本發(fā)明采用原核酶。這種糖基轉(zhuǎn)移酶包括在脂寡糖(LOS)的合成中涉及的酶，它們通過許多革蘭氏陰性細(xì)菌生產(chǎn)(Preston等人，Critical Reviews in Microbiology23(3)139-180(1996))。此類酶包括、但不限于物種比如E.coli和鼠傷寒沙門氏菌的rfa操縱子的蛋白，它們包括β-1，6-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和β-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，參見EMBL Accession Nos.M80599和M86935(E.coli)；EMBL Accession No.S56361(S.typhimurium))，糖基轉(zhuǎn)移酶(Swiss-Prot Accession No.P25740(E.coli)，β1，2-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(rfaJ)(Swiss-Prot Accession No.P27129(E.coli)和Swiss-Prot Accession No.P 19817(S.typhimurium))，和β1，2-N-乙酰氨基葡糖基轉(zhuǎn)移酶(rfaK)(EMBL Accession No.U00039(E.coli))。氨基酸序列已知的其它葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶包括由操縱子比如rfaB(它們已經(jīng)在微生物比如肺炎克雷伯桿菌，大腸桿菌，鼠傷寒桿菌，腸沙門氏菌(Salmonella enteric)，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprosum)中鑒定)，以及銅綠假單胞菌的rhl操縱子編碼的那些。
還適用于本發(fā)明的是在生產(chǎn)含有乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)，D-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰基-D-葡糖胺基-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖，以及Pk血型三糖序列，D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖的結(jié)構(gòu)中涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶，它們已經(jīng)在粘膜病原體淋病奈瑟菌(Neisseria gonnorhoeae)和腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的LOS中鑒定(Scholten等人，J.Med.Microbiol.41236-243(1994))。在這些結(jié)構(gòu)的生物合成中涉及的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的基因已經(jīng)由腦膜炎奈瑟菌免疫型(immunotypes)L3和L1(Jennings等人，Mol.Microbiol.18729-740(1995))和淋病奈瑟菌突變體F62(Gotshlich，J.Exp.Med.1802181-2190(1994))識別。在腦膜炎奈瑟菌中，由三個基因lgtA，lgtB和lgE組成的基因座編碼了在乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)中添加最后三個糖所需的糖基轉(zhuǎn)移酶(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271(45)19166-73(1996))。最近，lgtB和IgtA基因產(chǎn)物的酶促活性被證實，提供了所提出的它們的糖基轉(zhuǎn)移酶功能的第一個直接證據(jù)(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271(45)28271-276(1996))。在淋病奈瑟菌中，具有兩個其它基因，將β-D-GalNAc加成到乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)結(jié)構(gòu)的末端半乳糖的3位上的lgtD以及將末端α-D-Gal加成到截斷LOS的乳糖結(jié)構(gòu)單元，因此產(chǎn)生了Pk血型抗原結(jié)構(gòu)(Gotshlich(1994)上文)的lgtC。在腦膜炎奈瑟菌中，獨立的免疫型L1還表達(dá)了Pk血型抗原，并且已經(jīng)表明攜帶lgtC基因(Jennings等人，(1995)，上文)。奈瑟菌屬糖基轉(zhuǎn)移酶和相關(guān)基因也描述在USPN 5,545,553中(Gotschlich)。來自幽門螺旋菌的α1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因也已經(jīng)被鑒定(Martin等人，J.Biol.Chem.27221349-21356(1997))。還可用于本發(fā)明的是空腸彎曲桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如參見http//afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf_42.html)。
a)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在某些實施方案中，用于本發(fā)明的方法的糖基轉(zhuǎn)移酶是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。示例性巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括將L-巖藻糖從GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)移到受體糖的羥基位置的酶。將非核苷酸糖轉(zhuǎn)移到受體的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶也可用于本發(fā)明。
在某些實施方案中，受體糖例如是在寡糖糖苷中的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-基團(tuán)中的GlcNAc。適用于該反應(yīng)的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FTIIIE.C.No.2.4.1.65)，它們首先從人乳中被鑒定(參見Palcic等人，Carbohydrate Res.1901-11(1989)；Prieels等人，J.Biol.Chem.25610456-10463(1981)；以及Nunez等人，Can.J.Chem.592086-2095(1981))，以及Galβ(1→4)GlcNAcβ-α巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FTIV，F(xiàn)TV，F(xiàn)TVI)，它們在人血清中被發(fā)現(xiàn)。FTVII(E.C.No.2.4.1.65)，唾液酸基α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAcβ巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶也已經(jīng)被鑒定。Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的重組形式也已經(jīng)被鑒定(參見Dumas等人，Bioorg.Med.Letters 1425-428(1991)和Kukowska-Latallo等人，Genes andDevelopment 41288-1303(1990))。其它示例性巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶例如包括α1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.No.2.4.1.69)。酶促巖藻糖基化可以通過在Mollicone等人，Eur.J Biochem.191169-176(1990)或U.S.專利No.5,374,655中所述的方法來進(jìn)行。用于生產(chǎn)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞還包括用于合成GDP-巖藻糖的酶促體系。
b)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在另一組實施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。示例性半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括α(1，3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.No.2.4.1.151，例如參見Dabkowski等人，Transplant Proc.252921(1993)和Yamamoto等人，Nature 345229-233(1990)，牛(GenBank j04989，Joziasse等人，J.Biol.Chem.26414290-14297(1989))，鼠科動物(GenBank m26925；Larsen等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA868227-8231(1989))，豬(GenBank L36152；Strahan等人，Immunogenetics 41101-105(1995))。另一適合的α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是在血型B抗原的合成中涉及的那種(EC 2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.2651146-1151(1990)(人))。又一個示例性半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是核Gal-T1。
還適用于本發(fā)明的方法的是β(1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，例如包括EC2.4.1.90(LacNac合成酶)和EC2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等人，Eur.J.Biochem.183211-217(1989))，人(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.157657-663(1988))，鼠(Nakazawa等人，J.Biochem.104165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神經(jīng)酰胺半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38234-242(1994))。其它適合的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶例如包括α1，2半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(例如來自Schizosaccharomycespombe，Chapell等人，Mol.Biol.Cell 5519-528(1994))。
c)唾液酸基轉(zhuǎn)移酶唾液酸基轉(zhuǎn)移酶是可用于重組細(xì)胞和本發(fā)明的反應(yīng)混合物的另一類糖基轉(zhuǎn)移酶。生產(chǎn)重組唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞還產(chǎn)生CMP-唾液酸，它是唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的唾液酸給體。適用于本發(fā)明的唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的實例包括ST3Gal III(例如鼠或人ST3Gal III)，ST3Gal IV，ST3GalI，ST6Gal I，ST3Gal V，ST6Gal II，ST6GalNAc I，ST6GalNAc II，和ST6GalNAc III(在本文使用的唾液酸基轉(zhuǎn)移酶命名法如在Tsuji等人，Glycobiology 6v-xiv(1996)中所述)。稱為α(2，3)唾液酸基轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.99.6)的示例性α(2，3)唾液酸基轉(zhuǎn)移酶將唾液酸轉(zhuǎn)移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非還原末端Gal上。參見Van denEijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1981)，Weinstein等人，J.Biol.Chem.25713845(1982)和Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)。另一示例性α2，3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.99.4)將唾液酸轉(zhuǎn)移到二糖或糖苷的非還原末端Gal上。參見Rearick等人，J.Biol.Chem.2544444(1979)和Gillespie等人，J.BioL Chem.26721004(1992)。其它示例性酶包括Gal-β-1，4-GlcNAc α-2，6唾液酸基轉(zhuǎn)移酶(參見Kurosawa等人，Eur.J.Biochem.219375-381(1994))。
優(yōu)選地，對于糖肽的碳水化合物的糖基化，唾液酸基轉(zhuǎn)移酶將能夠?qū)⑼僖核徂D(zhuǎn)移到序列Galβ1，4GlcNAc-上，位于完全唾液酸化碳水化合物結(jié)構(gòu)上的末端唾液酸下面的最常見的倒數(shù)第二序列(參見表4)。
表4使用Galβ1，4GlcNAc序列作為受體底物的唾液酸基轉(zhuǎn)移酶

1)Goochee等人，Bio/Technology 91347-1355(1991)2)Yamamoto等人，J.Biochem.120104-110(1996)3)Gilbert等人，J.Biol Chem.27128271-28276(1996)可用于所要求的方法的唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的實例是ST3Gal III，還稱為α(2，3)唾液酸基轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.99.6)。該酶催化唾液酸轉(zhuǎn)移到Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc的Gal(例如參見Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)；Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1991))，并且導(dǎo)致在糖肽中的天冬酰胺連接的寡糖的唾液酸化。該唾液酸連接于Gal，形成了在兩個糖之間的α鍵。在糖之間的鍵接(連接)是在NeuAc的2位和Gal的3位之間。該特定的酶能夠從鼠肝中分離(Weinstein等人，J.Biol.Chem.25713845(1982))；人cDNA(Sasaki等人(1993)，J.Biol.Chem.26822782-22787；Kitagawa& Paulson(1994)，J.Biol.Chem.2691394-1401)和基因組(Kitagawa等人，(1996)J.Biol.Chem.271931-938)DNA序列是已知的，有利于通過重組表達(dá)來生產(chǎn)該酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，所要求的唾液酸化方法使用鼠ST3Gal III。
用于本發(fā)明的其它示例性唾液酸基轉(zhuǎn)移酶包括從空腸彎曲桿菌中分離的那些，包括α(2，3)。例如參見WO99/49051。
除了表5中列舉的那些以外的唾液酸基轉(zhuǎn)移酶也可用于唾液酸化工業(yè)上重要的糖肽的經(jīng)濟(jì)而有效的大規(guī)模方法。作為發(fā)現(xiàn)這些其它酶的用途的簡單試驗，不同量的各酶(1-100mU/mg蛋白)與脫唾液酸-α1AGP(1-10mg/ml)反應(yīng)，以比較所研究的唾液酸基轉(zhuǎn)移酶與牛ST6Gal I，ST3GalIII或該兩種糖基轉(zhuǎn)移酶的唾液酸化糖肽的能力?；蛘?，用酶法從肽骨架上釋放的其它糖肽或N-連接的寡糖可以代替脫唾液酸-α1AGP用于該評價。具有比ST6Gal I更有效地唾液酸化糖肽的N-連接的寡糖的能力的唾液酸基轉(zhuǎn)移酶可用于肽唾液酸化的實用大規(guī)模方法(如在本公開中對ST3Gal III所說明)。
d)GalNAc轉(zhuǎn)移酶N-乙?；肴樘前坊D(zhuǎn)移酶可用于實施本發(fā)明，尤其用于將GalNAc結(jié)構(gòu)部分結(jié)合于肽的O-連接的糖基化位點的氨基酸。適合的N-乙酰基半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶包括、但不限于α(1，3)N-乙?；肴樘腔D(zhuǎn)移酶，β(1，4)N-乙?；肴樘前坊D(zhuǎn)移酶(Nagata等人，J.Biol.Chem.26712082-12089(1992)和Smith等人，J.Biol Chem.26915162(1994))和多肽N-乙?；肴樘前坊D(zhuǎn)移酶(Homa等人，J.Biol.Chem.26812609(1993))。
通過基因工程由克隆的基因生產(chǎn)蛋白比如酶GalNAcTI-XX的方法是公知的。例如參見US專利No.4,761,371。一種方法包括收集足夠的樣品，然后通過N-末端測序測定酶的氨基酸序列。然后使用該信息來分離編碼全長(膜結(jié)合)轉(zhuǎn)移酶的cDNA克隆，它在昆蟲細(xì)胞系Sf9中表達(dá)時合成了完全活性酶。然后使用在16種不同蛋白的已知糖基化位點周圍的氨基酸的半定量分析，隨后進(jìn)行合成肽的體外糖基化研究來測定酶的受體特異性。該研究工作已經(jīng)證明，某些氨基酸殘基在糖基化肽鏈段中過度表現(xiàn)，以及在糖基化絲氨酸和蘇氨酸殘基周圍的特定位置中的殘基可以比其它氨基酸結(jié)構(gòu)部分對受體效率具有更顯著影響。
2、磺基轉(zhuǎn)移酶本發(fā)明還提供了生產(chǎn)包含硫酸化分子，例如硫酸化多肽比如肝素，硫酸乙酰肝素，角叉菜膠(carragnen)和相關(guān)化合物的肽的方法。適合的磺基轉(zhuǎn)移酶包括例如軟骨素-6-磺基轉(zhuǎn)移酶(由Fukuta等人，J.Biol.Chem.27018575-18580(1995)所述的雞cDNA；GenBank Accession No.D49915)，糖胺聚糖N-乙酰氨基葡糖N-脫乙酰酶/N-磺基轉(zhuǎn)移酶1(Dixon等人，Genomics 26239-241(1995)；UL 18918)，以及糖胺聚糖N-乙酰氨基葡糖N-脫乙酰酶/N-磺基轉(zhuǎn)移酶2(在Orellana等人，J.Biol.Chem.2692270-2276(1994)和Eriksson等人，J.Biol.Chem.26910438-10443(1994)中所述的鼠科動物cDNA；在GenBankAccession No.U2304中所述的人cDNA)。
3、細(xì)胞結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶在另一個實施方案中，在本發(fā)明的方法中采用的酶是細(xì)胞結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶。雖然許多可溶性糖基轉(zhuǎn)移酶是已知的(例如參見US專利No.5,032,519)，但在與細(xì)胞聯(lián)系時，糖基轉(zhuǎn)移酶通常以膜結(jié)合形式存在。所研究的許多膜結(jié)合酶迄今被認(rèn)為是嵌入蛋白；即，它們不能通過超聲處理而從膜中釋出，需要用于增溶的洗滌劑。表面糖基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)在脊椎和無脊椎動物細(xì)胞的表面上被鑒定，還已經(jīng)認(rèn)識到，這些表面轉(zhuǎn)移酶在生理條件下保持了催化活性。然而，更為公認(rèn)的細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶的功能是細(xì)胞間識別(Roth，MOLECULAR APPROACHES toSUPRACELLULAR PHENOMENA，1990)。
已經(jīng)開發(fā)了方法來改變由細(xì)胞表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶。例如，Larsen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989)，報道了測定細(xì)胞表面寡糖結(jié)構(gòu)和它們的關(guān)聯(lián)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)的分離克隆的cDNA序列的基因方法。將由已知表達(dá)UDP-半乳糖酶β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的鼠科動物細(xì)胞系分離的mRNA的產(chǎn)生cDNA文庫轉(zhuǎn)染到COS-1細(xì)胞。然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并分析α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
Francisco 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892713-2717(1992)公開了將β-內(nèi)酰胺酶錨固于大腸桿菌的外表面的方法。生產(chǎn)由(i)外膜蛋白的信號序列，(ii)外膜蛋白的跨膜段，和(iii)完全成熟的β-內(nèi)酰胺酶序列組成的三聯(lián)融合體，獲得了活性表面結(jié)合的β-內(nèi)酰胺酶分子。然而，F(xiàn)rancisco法僅限于原核細(xì)胞體系，根據(jù)作者的認(rèn)識，適當(dāng)?shù)陌l(fā)揮作用需要完全三聯(lián)融合。
4、融合蛋白在其它示例性實施方案中，本發(fā)明的方法采用具有與所需糖肽綴合物的合成有關(guān)的一種以上的酶活性的融合蛋白。融合多肽可以例如由連接于輔助酶的催化活性區(qū)域的糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性區(qū)域組成。輔助酶催化區(qū)域例如可以催化屬于糖基轉(zhuǎn)移酶的給體的核苷酸糖的形成中的步驟，或者催化糖基轉(zhuǎn)移酶循環(huán)中涉及的反應(yīng)。例如，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸可以在框內(nèi)連接于編碼在核苷酸糖合成中涉及的酶的多核苷酸。所得融合蛋白然后不僅可以催化核苷酸糖的合成，而且催化糖結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)移到受體分子上。該融合蛋白可以是連接于一個可表達(dá)的核苷酸序列的雙或多循環(huán)酶。在其它實施方案中，融合蛋白包括兩種或多種糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性區(qū)域。例如參見5,641,668。本發(fā)明的改性糖肽可以容易地利用各種適合的融合蛋白來設(shè)計和生產(chǎn)(例如，參見PCT專利申請PCT/CA98/01180，它作為WO99/31224在1999年6月24日公開)。
5、固定化酶除了細(xì)胞結(jié)合的酶以外，本發(fā)明還提供了固定在固體和/或可溶性載體上的酶的用途。在示例性實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法經(jīng)由完整糖基連接基綴合于PEG的糖基轉(zhuǎn)移酶。PEG-連接基-酶綴合物任選連接于固體載體。固體擔(dān)載的酶在本發(fā)明的方法中的應(yīng)用簡化了反應(yīng)混合物的后處理和反應(yīng)產(chǎn)物的提純，還可以容易回收酶。糖基轉(zhuǎn)移酶綴合物在本發(fā)明的方法中采用。酶和載體的其它結(jié)合是本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的。
肽綴合物的提純用以上方法生產(chǎn)的產(chǎn)物可以不用提純來使用。然而，通常優(yōu)選回收產(chǎn)物。可以采用用于回收糖基化糖的標(biāo)準(zhǔn)、公知的技術(shù)比如薄層或厚層色譜法、柱色譜法、離子交換色譜法或膜過濾。優(yōu)選使用膜過濾法，更優(yōu)選采用反滲透膜，或者如在下文和本文引用文獻(xiàn)中所述的用于回收的一種或多種柱色譜技術(shù)。例如，其中膜具有大約3000到大約10,000的分子量截止的膜過濾可以用于除去蛋白比如糖基轉(zhuǎn)移酶。然后可以使用納米過濾或反滲透來除去鹽和/或提純產(chǎn)物糖(例如參見WO 98/15581)。納米過濾膜是通過單價鹽，但保留大于約100到約2,000道爾頓的多價鹽和不帶電荷的溶質(zhì)的一類反滲透膜，這取決于所使用的膜。因此，在典型應(yīng)用中，用本發(fā)明的方法制備的糖保留在膜中，但污染的鹽將通過。
如果改性糖蛋白在分子內(nèi)產(chǎn)生，作為第一步，例如通過離心或超濾除去顆粒碎片，即宿主細(xì)胞或溶解片段；任選地，該蛋白可以用市購蛋白濃縮過濾器濃縮，隨后通過選自下列之中的一個或多個步驟分離多肽變體與其它雜質(zhì)免疫親和色譜法、離子交換柱分級(例如用二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺基丙基的基質(zhì))，用Blue-Sepharose，CM Blue-Sepharose，MONO-Q，MONO-S，扁豆凝集素(lentil lectin)-Sepharose，WGA-Sepharose，Con A-Sepharose，Ether Toyopearl，Butyl Toyopearl，Phenyl Toyopearl，SP-Sepharose，或protein A Sepharose層析，SDS-PAGE色譜法，硅膠色譜法，色譜聚焦，反相HPLC(例如具有附加脂族基的硅膠)，例如使用Sephadex分子篩或尺寸排阻色譜法的凝膠過濾，用選擇性結(jié)合多肽的柱子的色譜法，以及乙醇或硫酸銨沉淀。
在培養(yǎng)物中生產(chǎn)的改性糖肽通常通過從細(xì)胞、酶等中初始萃取，隨后的一個或多個濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻色譜步驟(例如SP Sepharose)來分離。另外，改性糖蛋白可以通過親和色譜法來提純。HPLC還可以用于一個或多個提純步驟。
蛋白酶抑制劑，例如甲基磺酰氟(PMSF)可以在任何以上步驟中包括，以抑制蛋白水解，以及可以包括抗生素，以防止外來污染物的生長。
在另一個實施方案中，來自產(chǎn)生本發(fā)明的改性糖肽的體系的上清液首先使用市購蛋白濃縮過濾器，例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元來濃縮。在濃縮步驟之后，可以將該濃縮物施加于適合的純化基質(zhì)。例如，適合的親和基質(zhì)可以包括結(jié)合于適合的載體的肽、凝集素或抗體分子的配體。或者，可以使用陰離子交換樹脂，例如具有側(cè)掛DEAE基團(tuán)的基質(zhì)或底物。適合的基質(zhì)包括丙烯酰胺，瓊脂糖，右旋糖苷，纖維素，或在蛋白提純中通常使用的其它類型?；蛘?，可以使用陽離子交換步驟。適合的陽離子交換劑包括含有磺基丙基或羧甲基的各種不溶基質(zhì)?；腔翘貏e優(yōu)選的。
最后，采用疏水RP-HPLC介質(zhì)，例如具有側(cè)掛甲基或其它脂族基團(tuán)的硅膠的一個或多個RP-HPLC步驟可以用來進(jìn)一步提純多肽變體組合物。各種組合的上述提純步驟的一些或全部還可以用來提供均勻改性的糖蛋白。
由大規(guī)模發(fā)酵獲得的本發(fā)明的改性糖肽可以通過于由Urdal等人，J.Chromatog.296171(1984)所公開的那些類似的方法來提純。該參考文獻(xiàn)描述了用制備HPLC柱子提純重組人IL-2的兩個按序RP-HPLC步驟。另外，諸如親和色譜法之類的技術(shù)可用來提純改性糖蛋白。
除了上述綴合物以外，本發(fā)明提供了制備這些和其它綴合物的方法。而且，本發(fā)明提供了通過將本發(fā)明的綴合物給藥于具有罹患疾病風(fēng)險的個體或患者來預(yù)防、治療或改善疾病狀態(tài)的方法。
藥物組合物綴合于本發(fā)明的支化水溶性聚合物的治療用結(jié)構(gòu)部分具有各種藥物應(yīng)用。例如改性促紅細(xì)胞生成素(EPO)可以用于治療一般性貧血，再生障礙性貧血，化療誘發(fā)的損傷(比如對骨髓的損傷)，慢性腎衰竭，腎炎，和地中海貧血癥。改性EPO可以進(jìn)一步用于治療神經(jīng)系統(tǒng)紊亂比如腦/脊髓損傷，多發(fā)性硬化癥和阿爾茨海默病。
第二個例子是α干擾素(IFN-α)，其可用于治療AIDS和乙肝或丙肝，由各種病毒比如人乳頭狀瘤病毒(HBV)，冠狀病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)，單純性皰疹病毒(HSV)，和水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)引起的病毒感染，癌比如毛細(xì)胞白血病，AIDS相關(guān)性卡波西肉瘤，惡性黑色素瘤，濾泡性非霍杰金淋巴瘤，費城染色體(Ph)陽性、慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)，腎癌，骨髓瘤，慢性髓性白血病，頭頸部腫瘤，骨癌，以及子宮頸非典型增生和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病比如多發(fā)性硬化癥。另外，根據(jù)本發(fā)明的方法改性的IFN-α可用于治療各種其它疾病和狀態(tài)比如干燥綜合癥(自身免疫病)，貝切特病(自身免疫炎性疾病)，纖維肌痛(肌與骨骼疼痛/疲勞疾病)，口瘡性潰瘍(口潰瘍)，慢性疲勞綜合癥，和肺纖維化。
另一例子是β-干擾素，可用于治療CNS障礙比如多發(fā)性硬化癥(復(fù)發(fā)型/緩和型或慢性進(jìn)行性)，AIDS和乙肝或丙肝，由各種病毒比如人乳頭狀瘤病毒(HBV)，人類免疫缺陷病毒(HIV)，單純性皰疹病毒(HSV)，和水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)引起的病毒感染，耳感染，肌與骨感染，以及癌，包括乳腺癌，腦癌，結(jié)腸直腸癌，非小細(xì)胞肺癌，頭頸部癌，基底細(xì)胞癌，子宮頸非典型增生，黑色素瘤，皮膚癌，和肝癌。根據(jù)本發(fā)明的方法改性的IFN-β還用于治療其它疾病和狀態(tài)比如移植排斥(例如骨髓移植)，慢性舞蹈病，結(jié)腸炎，腦炎，肺纖維化，黃斑變性，肝硬化，和角膜結(jié)膜炎。
粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是另一例子。根據(jù)本發(fā)明的方法改性的G-CSF可以在治療癌的化療中用作助劑，以及用于防止或緩解與某些醫(yī)療過程有關(guān)的病情或并發(fā)癥，例如化療誘發(fā)的骨髓損傷；白血球減少(一般性)；化療誘發(fā)的發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少；與骨髓移植有關(guān)的中性粒細(xì)胞減少；以及重型慢性中性粒細(xì)胞減少。改性G-CSF還可用于移植；外周血細(xì)胞動員；在接受骨髓消融(myeloablative)或骨髓抑制化療的病人中用于收集的外周血祖細(xì)胞的動員；以及在急性骨髓性白血病的誘導(dǎo)/鞏固治療之后的中性粒細(xì)胞減少，發(fā)燒，抗生素使用，住院治療的持續(xù)時間的減少。其它病情或障礙可以用改性G-CSF治療，包括哮喘和過敏性鼻炎。
作為一個另外的例子，根據(jù)本發(fā)明的方法改性的人生長激素(hGH)可以用來治療與生長相關(guān)的疾病比如侏儒癥，兒童和成人的身材矮小，惡病質(zhì)/肌肉消耗，一般肌肉萎縮，以及性染色體異常(例如特納氏綜合癥)?？梢杂酶男詇GH治療的其它疾病包括短腸綜合征，脂肪營養(yǎng)障礙，骨質(zhì)疏松癥，尿毒癥(uraemaia)，燒傷，女性不育癥，骨增生，一般糖尿病，II型糖尿病，骨關(guān)節(jié)炎，慢性阻塞性肺病(COPD)，和失眠癥(insomia)。而且，改性hGH還可以用于促進(jìn)各種過程，例如一般組織再生，骨再生，和傷口愈合，或者作為疫苗助劑。
因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了藥物組合物。該藥物組合物包括藥物可接受的稀釋劑和非天然存在、水溶性聚合物，治療用結(jié)構(gòu)部分或生物分子和糖基化或非糖基化肽的共價綴合物。該聚合物、治療用結(jié)構(gòu)部分或生物分子經(jīng)由完整糖基連接基綴合于肽，該完整糖基連接基介于并以共價鍵連接于肽與聚合物、治療用結(jié)構(gòu)部分或生物分子。
本發(fā)明的藥物組合物適用于各種藥物輸送體系。適用于本發(fā)明的制劑可在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mace PublishingCompany，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)中找到。對于用于藥物輸送的方法的簡述，參見Langer，Science2491527-1533(1990)。
該藥物組合物可以配制用于任何適當(dāng)?shù)慕o藥方式，例如包括局部，口，鼻，靜脈內(nèi)，顱內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下或肌內(nèi)給藥。對于腸胃外給藥，比如皮下注射，載體優(yōu)選包括水，鹽水，醇，脂肪，蠟或緩沖劑。對于口服給藥，可以使用以上載體的任何一種或固體載體比如甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，鈉糖，滑石，纖維素，葡萄糖，蔗糖，和碳酸鎂。還可以使用可生物降解的基質(zhì)，比如微球(例如聚乳酸聚乙醇酸)作為本發(fā)明的藥物組合物的載體。適合的可生物降解的微球例如公開在US專利Nos.4,897,268和5,075,109中。
通常，藥物組合物皮下或腸胃外，例如靜脈內(nèi)給藥。因此，本發(fā)明提供了包含溶于或懸浮于可接受的載體，優(yōu)選水性載體，例如水，緩沖水，鹽水，PBS等的化合物的用于腸胃外給藥的組合物。組合物還可以含有洗滌劑比如Tween20和Tween80；穩(wěn)定劑比如甘露醇，山梨醇，蔗糖和海藻糖；和防腐劑比如EDTA和間甲酚。組合物可以含有模擬生理條件所需的藥物可接受的助劑，比如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑，張性調(diào)節(jié)劑，潤濕劑，洗滌劑等。
這些組合物可以通過普通滅菌技術(shù)來滅菌，或者可以無菌過濾。所得水溶液可以包裝，用于直接使用，或者凍干。凍干制劑在給藥之前與無菌含水載體合并。該制劑的pH一般是3-11，更優(yōu)選5-9，最優(yōu)選7-8。
在一些實施方案中，本發(fā)明的糖肽可以引入到由標(biāo)準(zhǔn)囊泡形成脂類所形成的脂質(zhì)體中。多種方法可供用于制備脂質(zhì)體，例如描述在Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，U.S.Pat.Nos.4,235,871，4,501,728和4,837,028中。使用各種導(dǎo)向劑(例如本發(fā)明的唾液酸基半乳糖苷)的脂質(zhì)體的導(dǎo)向在本領(lǐng)域中是公知的(參見例如US專利Nos.4,957,773和4,603,044)。
可以采用用于將導(dǎo)向劑偶聯(lián)于脂質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法一般包括將可活化用于連接導(dǎo)向劑的脂類組分，比如磷脂酰乙醇胺，或者衍生化親脂性化合物，比如本發(fā)明的脂類衍生化糖肽引入到脂質(zhì)體。
導(dǎo)向機(jī)理一般要求導(dǎo)向劑定位在脂質(zhì)體的表面上，使得目標(biāo)結(jié)構(gòu)部分可與目標(biāo)物，例如細(xì)胞表面受體相互作用。本發(fā)明的碳水化合物可以在使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法形成脂質(zhì)體之前連接于脂類分子(例如，存在于分別具有長鏈烷基鹵化物或具有脂肪酸的碳水化合物上的羥基的烷基化或酰化)。或者，脂質(zhì)體可以按在形成膜的時候?qū)⑦B接部分首先引入到膜中的方式來制成。該連接部分必須具有親脂部分，其牢固地在膜中嵌入和錨固。它還必須具有反應(yīng)性部分，其在脂質(zhì)體的水性表面上可化學(xué)利用。選擇反應(yīng)性部分，使得它在化學(xué)上適于與后來添加的導(dǎo)向劑或碳水化合物形成穩(wěn)定化學(xué)鍵。在某些情況下，可以直接將導(dǎo)向劑連于連接分子，但在大多數(shù)情況下，更適合使用第三分子來用作化學(xué)橋，因此將膜內(nèi)的連接分子與從囊泡表面立體伸出的導(dǎo)向劑或碳水化合物連接。
用本發(fā)明的方法制備的化合物還可以用作診斷試劑。例如，標(biāo)記的化合物可以用來定位疑有炎癥的患者中的炎癥或腫瘤轉(zhuǎn)移的區(qū)域。為此，化合物可以用125I，14C或氚標(biāo)記。
以下實施例提供用來說明本發(fā)明的化合物以及方法，但不限制所要求的發(fā)明。
實施例在實施例1-3中使用以下符號。主PEG亞單元由四個乙二醇單元組成。該分子具有194的分子量，在圖中被四舍五入為200。以下符號用來代表主PEG亞單元 主PEG亞單元的結(jié)合物可供選擇地如以下所示用在官能化末端之間所示的四舍五入分子量來表示。
以下符號用來表示單官能化甲氧基PEG亞單元 實施例1單分散PEG和它們的活化形式的制備單分散或單一分子量PEG如下所示來制備。通過調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的片段的大小，制備了任何尺度的PEG。然后通過烷基化將二醇的一端封端，并活化，用于綴合于生物結(jié)構(gòu)部分比如蛋白、糖、脂類或核苷酸。
離去基團(tuán)可以連接于主PEG亞單元，以便產(chǎn)生以下所示的活化主PEG。在該反應(yīng)中，Q可以是與本發(fā)明的化學(xué)過程相容的任何離去基團(tuán)。示例性離去基團(tuán)包括鹵素，tresylate，甲苯磺酸根和甲磺酸根。
在產(chǎn)生活化主PEG之后，如下所示，該化合物與主PEG亞單元反應(yīng)。該產(chǎn)物是第一代PEG延長物。
第二代PEG延長物按照與第一代同樣的方式產(chǎn)生。
第三代PEG延長物如下所示產(chǎn)生。
第四代PEG延長物如下所示產(chǎn)生。
PEG延長過程通過讓單官能化結(jié)構(gòu)部分與雙官能化合物之一反應(yīng)來終止。在該反應(yīng)中，單官能化結(jié)構(gòu)部分是與本發(fā)明的化學(xué)過程相容的任何基團(tuán)。示例性封端基團(tuán)包括烷氧基-PEG和烷基。
在以下示例性實施方案中，將離去基團(tuán)加到甲氧基-PEG亞單元上。該分子然后與第四代PEG延長物反應(yīng)。

在另一個示例性實施方案中，甲基亞單元加到第四代PEG延長物上。
在封端一個末端之后，PEG延長物的另一端如下所示進(jìn)行活化用于生物綴合。在該反應(yīng)中，X是能形成酯的任何離去基團(tuán)。符號X獨立地選自咪唑基，HOBt，HOAt，NHS，和對硝基苯基酯。
最后，PEG延長分子如下所示綴合于生物結(jié)構(gòu)部分。
實施例2不要求活化單分散PEG必須具有與同它反應(yīng)的延長分子相同數(shù)目的PEG亞單元。在示例性實施方案中，活化的單分散PEG具有比同它反應(yīng)的延長分子更大數(shù)目的PEG亞單元。在以下所示的另一示例性實施方案中，活化單分散PEG具有比同它反應(yīng)的延長分子更少數(shù)目的PEG亞單元。
這些分子的封端方法與在實施例1中所述的方法類似。
實施例3可以添加過量的活化PEG亞單元，以便產(chǎn)生以下所示的單分散PEG n是1-100或1-20,000，取決于來源通過改變反應(yīng)劑的比率，所使用的堿，溫度，溶劑和濃度，可以調(diào)節(jié)反應(yīng)，獲得所需的主要分子量(n)。
該方法提供了制備任何大小的單分散PEG的簡單、快速、有效方式。提純通過該方法而被簡化，因為單分散PEG的分子量(和因此物理化學(xué)特性)存在差別。這允許使用簡單、標(biāo)準(zhǔn)的提純技術(shù)比如硅膠、反相纖維素、膜過濾(納米過濾和超濾)。提純的PEG二醇然后衍生化為所需的任何官能化形式。
實施例4烷氧基PEG的生產(chǎn)以下所示的一般方法用來制備烷氧基PEG或其它單官能化PEG。
在第一個實施方案中，活化雙官能化PEG分子如下所示產(chǎn)生 其中符號n表示1-100,000的數(shù)值。符號Q表示與本發(fā)明的化學(xué)過程相容的任何離去基團(tuán)。示例性離去基團(tuán)包括鹵素，tresylate，甲苯磺酸根和甲磺酸根。符號X表示與離去基團(tuán)相容的任何抗衡離子。
該活化雙官能化PEG分子如下所示用于延長PEG分子的長度 其中符號m表示1-100,000的數(shù)值。
在第二個實施方案中，如下所示，延長單官能化PEG，然后活化，用于與生物結(jié)構(gòu)部分綴合。
在第一步中，單官能化PEG進(jìn)行甲苯磺酰化。

其中符號n表示1-100,000的數(shù)值。
在第二步中，延長單官能化PEG 其中符號m表示1-100,000的數(shù)值。
在最后的步驟中，如下所示，延長的單官能化PEG化合物活化用于與生物結(jié)構(gòu)部分綴合。
實施例5用于制備雙觸角聚合物的其它組合物和方法本發(fā)明的其它雙觸角結(jié)構(gòu)具有以下通式 其中符號X表示OH，H，Q(活化基團(tuán))，和生物結(jié)構(gòu)部分，比如蛋白，糖，脂類，或核苷酸。符號n表示1-10的數(shù)值。術(shù)語“聚合物”可以是PEG，mPEG(甲氧基聚乙二醇)，PPG(聚丙二醇)，mPPG，聚谷氨酸，聚天冬氨酸，聚乳酸，和聚唾液酸。
在示例性實施方案中，雙觸角結(jié)構(gòu)具有以下通式 其中符號m和n獨立地表示1-10,000的數(shù)值。符號X表示OH，H，Q(活化基團(tuán))，和生物結(jié)構(gòu)部分，比如蛋白，糖，脂類或核苷酸。
在另一個示例性實施方案中，雙觸角結(jié)構(gòu)具有下式 其中符號a和b獨立地表示1-24的數(shù)值。符號m和o獨立地表示1-10,000的數(shù)值。符號X表示OH，H，Q(活化基團(tuán))，以及生物結(jié)構(gòu)部分，比如蛋白、糖、脂類或核苷酸。
雖然參考具體實施方案公開了本發(fā)明，但顯而易見，在不偏離本發(fā)明的真正精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的其它技術(shù)人員可以設(shè)計本發(fā)明的其它實施方案和變型。
在本申請中列舉的所有專利、專利申請和其它出版物全面引入供參考。
權(quán)利要求
1.肽，其具有以下通式 式中R11，R11′，R12，R12′，R13和R13′獨立地選自H，取代或未取代烷基和水溶性聚合物，前提是R11，R11′，R12，R12′，R13和R13′的至少兩個是水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分；和R14選自O(shè)H，反應(yīng)性官能團(tuán)，含糖結(jié)構(gòu)部分的基團(tuán)或連接于載體分子的基團(tuán)中的一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其中所述水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分包括聚(乙二醇)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的肽，其具有以下通式
4.根據(jù)權(quán)利要求2的肽，其具有以下通式 其中m，n和t獨立地選自整數(shù)1-20,000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其中R14包括糖結(jié)構(gòu)部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的肽，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分是核苷酸糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的肽，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分綴合于選自第二種肽和脂類中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的肽，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分綴合于選自所述肽的氨基酸和糖基殘基中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的肽，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分是在所述肽和所述第二種肽之間的糖基連接基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的肽，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分是在所述肽和所述第二種肽之間的完整糖基連接基。
11.包括根據(jù)權(quán)利要求1的肽和藥物可接受的載體的藥物制劑，其中R14包括載體分子，其選自治療用結(jié)構(gòu)部分中的一種。
12.氨基酸，其具有以下通式 式中R11，R11′和R12獨立地選自H，取代或未取代烷基和水溶性聚合物，前提是R11，R11′和R12的至少兩個是水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分；和R14選自O(shè)H，反應(yīng)性官能團(tuán)，含糖結(jié)構(gòu)部分的基團(tuán)或連接于載體分子的基團(tuán)中的一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的氨基酸，其中所述水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分包括聚(乙二醇)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的氨基酸，其中所述水溶性聚合物結(jié)構(gòu)部分具有以下通式
15.根據(jù)權(quán)利要求14的氨基酸，其具有以下通式
16.根據(jù)權(quán)利要求12的氨基酸，其中R14包括糖結(jié)構(gòu)部分。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的氨基酸，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分是核苷酸糖。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的氨基酸，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分綴合于選自第二種肽和脂類中的一種。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的氨基酸，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分綴合于選自所述肽的氨基酸和糖基殘基中的一種。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的氨基酸，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分是在所述肽和所述第二種肽之間的糖基連接基。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的氨基酸，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分是在所述肽和所述第二種肽之間的完整糖基連接基。
22.包括根據(jù)權(quán)利要求12的氨基酸和藥物可接受的載體的藥物制劑，其中R14包括載體分子，其選自治療用結(jié)構(gòu)部分中的一種。
23.支化水溶性聚合物，其具有選自下列之中的通式 和 式中Q選自H，包含載體分子和活化基團(tuán)，使得C(O)Q′是反應(yīng)性官能團(tuán)的一種；以及m和n是獨立地選自1-20,000中的整數(shù)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的支化水溶性聚合物，其中Q′選自鹵素，全氟苯基，HOBT，HOAt和對硝基苯酚中的一種。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的支化水溶性聚合物，其中Q′包括糖結(jié)構(gòu)部分。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的支化水溶性聚合物，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分是核苷酸糖。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的支化水溶性聚合物，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分綴合于選自第二種肽和脂類中的一種。
28.根據(jù)權(quán)利要求25的支化水溶性聚合物，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分綴合于選自所述肽的氨基酸和糖基殘基中的一種。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的支化水溶性聚合物，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分是在所述肽和所述第二種肽之間的糖基連接基。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的支化水溶性聚合物，其中所述糖結(jié)構(gòu)部分是在所述肽和所述第二種肽之間的完整糖基連接基。
31.包含根據(jù)權(quán)利要求23的氨基酸和藥物可接受的載體的藥物制劑，其中Q′包括載體分子，其選自治療用結(jié)構(gòu)部分中的一種。
32.支化水溶性聚合物，其具有以下通式 其中R16，R16′，R17，R18和R19選自H，OH，NH2，NHAc和通式(I) 式中Z2選自O(shè)，S，CH2和S中的一種，R11是水溶性聚合物，和下標(biāo)“a”表示0-20的整數(shù)，前提是R16，R16′，R17，R18，和R19的至少兩個具有根據(jù)通式I的結(jié)構(gòu)；和R15選自H，核苷酸糖，和連接載體分子的鍵中的一種。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的支化水溶性聚合物，其中所述水溶性聚合物包括聚(乙二醇)。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的支化水溶性聚合物，其中所述載體分子選自肽和脂類中的一種。
35.根據(jù)權(quán)利要求32的支化水溶性聚合物，其具有以下通式
36.支化水溶性聚合物，其具有以下通式 其中R16，R17，R18和R19選自H，OH，NH2，NHAc和通式(I) 式中Z2選自O(shè)，S，CH2和S中的一種，R11是水溶性聚合物，和下標(biāo)“a”表示0-20的整數(shù)，前提是R16，R16′，R17，R18，和R19的至少兩個具有根據(jù)通式I的結(jié)構(gòu)；和R15是選自H，核苷酸糖，和連接載體分子的鍵中的一種。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的支化水溶性聚合物，其中所述水溶性聚合物包括聚(乙二醇)。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的支化水溶性聚合物，其中所述載體分子選自肽和脂類中的一種。
全文摘要
本發(fā)明提供了可允許兩個或多個水溶性聚合物綴合于另一物質(zhì)的支化水溶性聚合物。該支化聚合物提供了獲取在單一位點綴合于兩個或多個水溶性聚合物的治療劑的途徑。該支化聚合物基于屬于簡單支化烷基結(jié)構(gòu)的支化點，反應(yīng)性側(cè)鏈氨基酸和反應(yīng)性側(cè)鏈氨基酸的小肽和糖。還提供了制備明確并可預(yù)定的分子量的單分散聚(乙二醇)的方法，以及聚(乙二醇)的合理的末端官能化的方法。還提供了該支化水溶性聚合物與不同物質(zhì)，例如肽、脂類、糖脂和小分子的綴合物。
文檔編號A61K31/70GK1777364SQ200480010689
公開日2006年5月24日 申請日期2004年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月14日
發(fā)明者S·德弗里斯 申請人:尼奧斯技術(shù)有限公司