專利名稱：片劑形式的滅活的霍亂弧菌疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具有疫苗學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是一種用于霍亂感染的口服疫苗。
本發(fā)明公開了一種新的疫苗配方和它的治療性的應(yīng)用。更具體地說，本發(fā)明提出了對霍亂孤菌發(fā)生反應(yīng)，能以片劑形式口服的由滅活疫苗配方的組成。
霍亂是一種傳染病，它最顯著的癥狀是以急劇和大量地排出液體糞便為特征的急性腹瀉。腹瀉可以很嚴(yán)重，如果病人沒有受到足夠的醫(yī)療重視，甚至可以在癥狀開始后5小時(shí)之內(nèi)致死。它經(jīng)口從被污染的食品或液體獲得。到目前，已經(jīng)報(bào)道了7種導(dǎo)致提高的發(fā)病率和死亡率指標(biāo)的傳染病。在導(dǎo)致很差的衛(wèi)生條件的不發(fā)達(dá)地區(qū)或受自然災(zāi)害、戰(zhàn)爭或其它破壞性事件影響區(qū)域居住的群體中，感染最常見，具有目的地的并因此而受影響的旅行者也容易受到感染(CDC/NCID.Organización Panamericana de la Salud.Métodos de laboratoriopara el diagnóstico de Vibrio cholerae.EnPrograma especialde publicaciones.Ed.Washington，D.C.，Estados Unidos 1994)。
盡管用抗菌素和鹽水合物治療是有效的，仍然需要全面和協(xié)調(diào)的醫(yī)藥處理對這種疾病的急劇效應(yīng)作出反應(yīng)。另一方面，已經(jīng)表明該感染誘導(dǎo)與血清中的殺孤菌抗體的存在相關(guān)的特異的免疫防護(hù)，作為人體保護(hù)的指標(biāo)(Glass，R.I.，Svennerholm，A.M.，Stoll，B.J.，Khan，M.R.，Hossain，K.M.，Huq，M.I.，Holmgren，J.1983.Protectionagainst cholera in breast-fed children by antibodies in breastmilk.N.Engl.J.Med.3081389-1392 and Jer tborn，M.，Svennerholm，A.M.，Holmgren，J.1993.Evaluation of differentimmunization schedules for oral B subunit vaccine in Swedishvolunteers.Vaccine.10130-2)。這已經(jīng)導(dǎo)致來源于完整的滅活細(xì)胞或者來自活減毒細(xì)胞的不同種類的霍亂疫苗的開發(fā)。由于其短期的活性(3到6個(gè)月)和低水平(30到60％)的保護(hù)，以及它們導(dǎo)致紅斑、局部的疼痛、硬化、發(fā)燒和cephalia的高水平的反應(yīng)性，非腸道使用的來源于用苯酚滅活的完整的細(xì)胞的疫苗已經(jīng)從市場除去(OMS.1991.Reunión sobre la vacuna contra el cólera.Informe final.Washington，D.C.)。
在用膽汁滅活的整個(gè)細(xì)胞中(膽汁菌苗)發(fā)現(xiàn)了一種選擇。該口服疫苗提供中等的防護(hù)水平，還沒有在工業(yè)上開發(fā)(Svennerholm，A.M.and Holmgren，J.1986.Oral combined B subunit-whole cellcholera vaccine.In J.Holmgren A.Lindberg and R.Mollby(ed).Development of vaccines and drugs against diarrhea.11th NovelConference，Stockholm，1985.Student litteratur，Lund，Sweden.p.33-43)。
已經(jīng)表明用加熱和甲醛滅活的與霍亂菌毒素B亞單位(B-WC)結(jié)合的整個(gè)細(xì)胞在給藥后3年提供中等的保護(hù)水平(60％)(Holmgren，J.，Svennerholm，A.，M.，Lonroth，I.，F(xiàn)all-Persson，M.，Markham，B.and Lundback，H.1977.Development of improved choleravaccine based on subunit toxoid.Nature 269602-604)；但是由于需要獲得和純化霍亂毒素的B亞單位，該疫苗的生產(chǎn)十分昂貴和復(fù)雜(Tayot，J.L.，Holmgren，J.，Svennerholm，L.，Lindblad，M.，Tardy，M.1981.Receptor-specific large scale purification ofcholera toxin on silica beads derivatized with lyso-GMIgaglioside.Eur.J.Biochem.113249-258)。
上述的選擇的一種變體采用通過重組方法獲得的霍亂菌毒素的B亞單位(rB-WC)，證明是可靠的，但是在給藥后3年仍然提供了僅僅60％的保護(hù)水平，并且它包括繁瑣的制備過程。該疫苗在兩個(gè)多層封套中制備，一個(gè)含粉末形式的鹽混合物，另一個(gè)含凍干的霍亂孤菌菌株。當(dāng)給藥時(shí)，第一個(gè)必須在水中重新懸浮，第二個(gè)懸浮在鹽溶液和水中；然后必須口服含鹽溶液，接著在15分鐘后按照同樣的方式服用包含菌株的懸浮液(Sánchez，J.L.，Holmgren，J.1989.Recombinant system for overexpression of cholera toxin BSubunit in Vibrio cholerae as basis for vaccine development.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86481-485)。
另一種類似于最后一種的最新的疫苗來源于滅活的完整的細(xì)胞，用569B菌株(El Tor，Inaba)代替了霍亂弧菌Cairo 50菌株(Classic，Ogawa)。它提供一種給藥后直到8到10個(gè)月的可接受的水平的保護(hù)(66％)。它是一種不同的血清型和生物類型的霍亂孤菌菌株的混合物，在含有懸浮菌株的瓶子中和含有鹽混合物的封套中制備(Trach，D.D.，Clemens，J.D.，Ke，N.T.，Thuy，H.T.，Son，N.D.，Canh，D.G.，Hang，P.V.D，Rao，M.R.1997.Field trial of a locally produced，killed，oral cholera vaccine in Vietnam.Lancet.349231-235)。作為上述的疫苗，它的應(yīng)用要求鹽混合物溶于水并且口服，而且包含細(xì)胞株的瓶子的內(nèi)容物在15分鐘后給藥，導(dǎo)致需要時(shí)間以及技術(shù)人員的緩慢的和慎重的過程，并且過程更加昂貴。
以CVD103菌株為基礎(chǔ)的CVD103 HgR疫苗，為了區(qū)分流行株，補(bǔ)充了另外插入菌株中的耐汞基因，該疫苗包括安全的給藥方法并在志愿者中實(shí)施的試驗(yàn)中導(dǎo)致良好水平的保護(hù)，但是它必須高劑量給藥以獲得實(shí)質(zhì)性的免疫原性反應(yīng)(OMS.1991.Reunión sobre la vacunacontra el cólera.Informe final.Washington，D.C.and Holmgren，J.，and Svennerholm，A.M.1999.Vaccines against DiarrhealDiseases.In Perlmann，P.and Wigzell，H.[ed].Vaccines.Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York.p290-328)。這種菌株的生產(chǎn)需要完全封閉的系統(tǒng)(Cryz，S.J.and Gluck，R.，1997.Large-Scale production of live attenuated bacterial and viralvaccines.In New Generation Vaccine.Second Edition.Ed.Levine，M.M.，Woodrow，G.C.，Kaper，J.B.and Cobon，G.S.Library ofCongress.Cataloguing in Publication Data.New York.P1153-1163)，它按照與上述疫苗相同的方式制備，在給藥時(shí)間方面表現(xiàn)出同樣的困難。
基于638菌株的活減毒疫苗來源于C7258流行株，處理后去除CTXφ毒性噬菌體，在編碼血凝素蛋白酶的hap基因中包括疫苗標(biāo)記celA，證明應(yīng)用時(shí)間是可靠的，并導(dǎo)致充分的免疫應(yīng)答(Benítez，J.A.，García L.，Silva A.，García，H.，F(xiàn)ando，R.，Cedré，B.，Pérez，A.，Campos，J.，Rodríguez，B.，Pérez，J.L.，Balmaseda，T.，Pérez，O.，Ramírez，M.，Ledbn，T.，Díaz，M.，Bravo，L.and Sierra，G.1999.Preliminary assessment of the safety and immunogenicityof a new CTXφ-negative，haemaglutinin/protease-defective ElTor strain as a cholera vaccine candidate.Infect.Immun.67539-545)。然而，由于制備過程與上述的疫苗類似，它表現(xiàn)出與前面考慮的疫苗相關(guān)的所有的困難。
以減毒霍亂弧菌菌株為基礎(chǔ)的疫苗利用諸如Peru-3、Bah-3和Bang-3的菌株，盡管提供了免疫原性反應(yīng)，卻被證明具有無法接受的反應(yīng)原性(Taylor，D.N，Killen，K.P.，Hack，D.C＞，Kenner，J.R.，Coster，T.S.，Beatle，D.T.，Ezzell，J.，Hyman，T.，Tropa，A.，Sjogrem，M.H.，F(xiàn)riedlander，A.，Mekalanos，J.J.，Sadoff，J.C.1994.Development of a live，oral，attenuated vaccine againstEl Tor cholera.J.Infect.Dis.1701518-1523)。
該疫苗以Peru-3菌株為基礎(chǔ)，采用了Peru15菌株，具有安全的應(yīng)用方法并在志愿者中實(shí)施的試驗(yàn)中產(chǎn)生了良好的保護(hù)水平(Kener，J.R.，Coster，T.S.，Taylor，D.N.，Troffa，A.F.，Barrera-Oro，M.，Hyman，T.，Adams，J.M.，Beattie，D.T.，Killeen，K.P.，Spriggs，D.R.，Mekalanos，J.J.，Sadoff，J.C.1995.Peru-15，animproved and attenuated oral vaccine candidate for Vibriocholerae 01.J.Infect.Dis.721126-1129)。然而還沒有進(jìn)行臨床研究，且疫苗表現(xiàn)出與上述疫苗同樣的難點(diǎn)。
本發(fā)明由新的疫苗配方組成，包括滅活的完整霍亂孤菌細(xì)胞、凝集素、潤滑劑、包衣物質(zhì)、填充和崩解物質(zhì)，用于最后制備為片劑形式的制劑，保持它的不同的組分在穩(wěn)定條件下，并防止它們互相干擾。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)的成品和抗原性以及免疫原性效果與組成配方的活性復(fù)合物的滅活細(xì)胞所提供的效果是相似的。
本發(fā)明提供了一種由屬于血清型0139、或血清型01以及典型的ElTor、Ogawa或Inaba bio和血清型的滅活的霍亂弧菌菌株細(xì)胞組成的疫苗，采用野生型或減毒株。這里給出的疫苗制劑含有滅活的霍亂弧菌細(xì)胞，優(yōu)選每一片劑有109-1011的滅活細(xì)菌。它可以含有凝集素聚烯吡酮、明膠、羧甲基纖維素，其濃度相對于片劑的總質(zhì)量必須為1-5％；潤滑劑羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂、膠體二氧化硅和滑石，采用的濃度相對片劑的總質(zhì)量在0.25-1.5％；包衣物質(zhì)纖維素乙酰基鄰苯二甲酸酯、鄰苯二甲酸二乙酯纖維素、濃度為10％的硝基纖維素(lacquer)，以及二氧化鈦，采用的濃度相對片劑的總質(zhì)量在1-2％；填充物質(zhì)乳糖和玉米淀粉，其濃度相對片劑的總質(zhì)量為65-80％，以及崩解物質(zhì)croscaramelose鈉、玉米淀粉和微晶纖維素，采用的濃度相對片劑的總質(zhì)量為5-15％。
迄今為止最新技術(shù)的疫苗學(xué)方法仍沒有本發(fā)明的片劑配方的先例。應(yīng)該指出本配方最先在抵抗化學(xué)和物理應(yīng)激的制劑中將合成化合物與生物材料，特別是細(xì)胞組合，該技術(shù)的應(yīng)用沒有影響它的活性復(fù)合物的主要的免疫特性。
本發(fā)明的目標(biāo)將通過下列實(shí)施例描述實(shí)施例1在對霍亂弧菌的LPS的鑒定中采用的ELISA測試的過程中對該片劑中的賦形劑的可能干擾的研究。
本實(shí)施例研究了滅活細(xì)胞及其混合物，包括每一不同的賦形劑以及單獨(dú)的賦形劑溶液。采用滅活的細(xì)胞作為陽性對照組。采用的賦形劑是羧甲基淀粉鈉、croscaramelose鈉、聚烯吡酮、滑石、硬脂酸鎂、二氧化鈦、膠體二氧化硅、玉米淀粉和乳糖。
ELISA技術(shù)由下列步驟組成
1.用溶于PBS的100μL/孔的細(xì)胞混合物-賦形劑覆蓋聚苯乙烯板(Maxisorp，Nunc，丹麥)，在濕潤的容器中4℃孵育過夜。
2.在酶聯(lián)免疫試驗(yàn)的每一步驟之間用0.05％的吐溫20水溶液洗滌平板。
3.用PBS中的1％濃度的150μL/孔脫脂乳封閉平板。在濕潤室中在37℃孵育1小時(shí)。
4.加入100μL/孔的抗LPS單克隆抗體。
5.加入100μL/孔的從小鼠中提取的抗IgG抗體，與在含0.05％吐溫20和1％脫脂奶的PBS中稀釋的VI型辣根過氧化物酶綴合(Sig maChemical Co.Saint Louis MO)，在濕潤的室中室溫孵育2小時(shí)。
6.用在含有0.01％的H2O2的0.1M pH值為4.5的檸檬酸鹽緩沖液中的濃度為0.4mg/mL的100μL/孔的鄰苯二胺溶液(Sigma ChemicalCo.Saint Louis MO)建立反應(yīng)。
7.施加底物30分鐘后采用50μL/孔的2.5M的H2SO4溶液終止反應(yīng)，在微板讀碼器(reader)492nm波長處讀板。
結(jié)果顯示，在采用的賦型劑和分析過程的成分之間沒有干擾發(fā)生，如

圖1所示，其中賦型劑與滅活細(xì)胞的混合表現(xiàn)出與單獨(dú)的滅活細(xì)胞相似的值，而未混合的賦型劑呈現(xiàn)顯著降低的值。
實(shí)施例2確定在賦型劑和疫苗活性復(fù)合體之間可能的干擾。
采用ELISA技術(shù)確定含有滅活霍亂弧菌細(xì)胞懸液和采用的不同賦型劑的的混合物的抗原性(如實(shí)施例1中所述)，將混合物分為相同的2部分，并將1部分在4℃孵育，另1部分在28℃孵育。在起始時(shí)間和孵育30天后進(jìn)行研究。本實(shí)施例中采用的賦型劑是乳糖、淀粉、羧甲基淀粉鈉、croscaramelose、聚烯吡酮、滑石、硬脂酸鎂和二氧化鈦。結(jié)果顯示，滅活細(xì)胞的脂多糖的抗原性不受不同賦型劑的存在的影響。在4℃和28℃進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中ELISA值在30天的孵育期間一直都維持不變(圖2)。
實(shí)施例3疫苗的抗原性。
通過ELISA抑制實(shí)驗(yàn)確定疫苗的抗原性，目的是檢測片劑中的霍亂弧菌的脂多糖(LPS)。
采用片劑的溶液，霍亂弧菌的LPS Ogawa、霍亂弧菌的LPS 0139、El Tor和Ogawa菌株的活霍亂孤菌細(xì)胞的懸浮液，以及滅活細(xì)胞的懸液作為實(shí)驗(yàn)樣本。
ELISA測試包括下列步驟用溶于磷酸緩沖液(PBS)的100μL/孔的濃度為25μg/mL的霍亂弧菌的LPS Ogawa覆蓋聚苯乙烯板(Maxisorp，Nunc，丹麥)，在濕潤的室中4℃孵育過夜。
在酶聯(lián)免疫試驗(yàn)的每一步驟之間用0.05％的吐溫20水溶液洗滌平板。
用PBS中的1％濃度的150μL/孔脫脂乳封閉平板，在濕潤室中37℃孵育1小時(shí)。
加入100μL預(yù)先在室溫下孵育1小時(shí)的溶液中的樣本，樣本和抗LPS Ogawa單克隆抗體的濃度比例分別為1∶2，溶解于PBS 0.05％Tween20中，終濃度為25ug/ml，在濕潤室中室溫孵育2小時(shí)。
加入100μL/孔的種特異性抗IgG抗體，抗體與在0.05％吐溫20和1％脫脂奶的PBS稀釋的VI型辣根過氧化物酶(Sigma Chemical Co.Saint Louis MO)綴合。在濕潤的室中室溫孵育2小時(shí)。
用在含有0.01％的H2O2的0.1M pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液中的0.4mg/mL濃度的100μL/孔的鄰苯二胺溶液(Sigma Chemical Co.SaintLouis)建立反應(yīng)。
30分鐘后終止反應(yīng)。加入底物后用50μL/孔的2.5M的H2SO4溶液，在Titerkek Multiskan Plus micro平板讀碼器(FlowLaboratories，USA)中492nm波長處讀板。
結(jié)果顯示了采用片劑懸浮液時(shí)高水平的抑制，與從采用了活細(xì)胞、滅活細(xì)胞和LPS Ogawa中獲得的值相似。在涉及LPS 0139的情形下沒有觀察到抑制(圖3)。這證明滅活細(xì)胞的抗原活性在最終的片劑配方中仍然不受影響。
實(shí)施例4疫苗的免疫原性通過用待測樣本的十二指腸內(nèi)接種兔研究疫苗的免疫原性。采用ELISA和殺弧菌技術(shù)評估血清抗體的動(dòng)力學(xué)。利用含有片劑配方的懸浮液，以及E1 Tor和Ogawa菌株的霍亂弧菌滅活細(xì)胞作為待檢測樣本。
進(jìn)行腹壁部分切除術(shù)暴露十二指腸和用5mL的重懸浮片劑接種十二指腸內(nèi)腔，采用疫苗菌株的滅活培養(yǎng)物或鹽溶液。采用ELISA和殺弧菌技術(shù)評估抗體的血清動(dòng)力學(xué)。
確定IgG抗脂多糖抗體的動(dòng)力學(xué)的ELISA技術(shù)1.用25μg/mL的純LPS覆蓋Nunc或Maxisorp 96孔的聚苯乙烯板，在4℃溫育過夜或37℃孵育2小時(shí)。
2.用濃度為0.05％的吐溫20水溶液洗滌3次。
3.用150μL/孔的PBS中的2％濃度的脫脂乳37℃封閉1小時(shí)。
4.洗滌3次。
5.制備PBS吐溫0.05％中的待測血清的連續(xù)的溶液，室溫下孵育2小時(shí)。
6.同前一樣洗滌3次。
7.加入用1％ PBS-T中的牛奶稀釋的綴合抗IgG-HRP，室溫孵育1小時(shí)。
8.洗滌6次。
9.用在pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液中的1mg/mL濃度的鄰苯二胺溶液和30％濃度的H2O2建立反應(yīng)。
10.在492nm波長處閱讀吸光度。
檢測殺菌抗體的殺弧菌技術(shù)采用平底的消毒平板。
1.在首先的孔中加入50μL的待測血清，在其余的孔中加入25μL的鹽水溶液。
2.制備系列溶液，并移出最后的25μL。
3.加入25μL的補(bǔ)體細(xì)菌(complement-bacteria)混合物(每板2.5ml)，并在37℃孵育1小時(shí)。
4.加入BHI培養(yǎng)基(每100ml的培養(yǎng)基采用125μL的溴化甲醇紫(Bromcresol purple)和10ml的葡萄糖，必須從培養(yǎng)基中除去10ml的葡萄糖)。
5.將平板人工均質(zhì)化，并在37℃孵育3小時(shí)。
6.滴度定義為能夠阻止細(xì)菌生長的血清的最大的稀釋度，通過培養(yǎng)基中顏色改變的缺乏而確定。
制備補(bǔ)體-細(xì)菌的混合物1.將保存的霍亂弧菌菌株鋪于2楔狀板或平板的BHI瓊脂中，并在37℃的溫度下與未鋪菌的板一同孵育18到24小時(shí)的任意時(shí)間。
2.取平板中分離的菌落，或取其中的一些在楔狀板中加熱的，置于預(yù)先加熱的楔狀板中，將其在37℃孵育4小時(shí)。
3.用pH值為7的消毒鹽溶液洗滌楔狀板中發(fā)現(xiàn)的生長物，并調(diào)節(jié)洗滌液的D.O＝0.9-0.95。
4.將調(diào)節(jié)的滅活細(xì)胞稀釋為1∶10的比例。
5.制備補(bǔ)體-細(xì)菌混合物，其中-將補(bǔ)體(豚鼠或人血清，不含殺孤菌抗體)稀釋為與冷消毒鹽溶液1∶5的比例。
-混合等體積的滅活細(xì)胞和稀釋的補(bǔ)體。
結(jié)果顯示采用ELISA技術(shù)評估的片劑制劑和滅活細(xì)胞(圖4A)以及殺弧菌抗體(圖4B)的誘導(dǎo)兔抗脂多糖抗體的免疫原性能力沒有差別。實(shí)施例1、2和3顯示本發(fā)明的片劑制劑在模型動(dòng)物中的抗原性和免疫原性與加入制劑之前的滅活細(xì)胞本身相同，這在最終的片劑制劑中抗原的存在和它的誘導(dǎo)殺弧菌抗體的能力中都顯示出來。
本技術(shù)方案的優(yōu)點(diǎn)本技術(shù)方案優(yōu)于以前的疫苗配方，因?yàn)樗歉叨让庖咴缘漠a(chǎn)品(在其誘導(dǎo)抗脂多糖和殺弧菌抗體的能力方面)，可以容易地施用，不涉及活的、通常操作的疫苗的潛在危險(xiǎn)性，也不涉及先前的滅活疫苗產(chǎn)品施用中的困難。
附圖的簡要說明圖1.片劑賦形劑的可能的干擾的研究，采用ELISA技術(shù)評估霍亂弧菌的LPS。從C01到C09賦形劑與滅活細(xì)胞的混合物。C10到C18單獨(dú)的賦形劑。C19單獨(dú)的滅活細(xì)胞。
每個(gè)樣本中采用的賦形劑C01和C10淀粉；C02和C11羧甲基淀粉鈉；C03和C12croscaramelose；C04和C13聚烯吡酮；C05和C14滑石；C06和C15硬脂酸鎂；C07和C16二氧化鈦；C08和C17二氧化硅；C09和C18淀粉1500；C19滅活細(xì)胞。
圖2.確定賦形劑對疫苗的活性復(fù)合物的抗原性的可能的影響。該圖代表孵育30天的樣本的ELISA檢測的平均結(jié)果數(shù)值的相對于在起始時(shí)間檢測的同一樣本的ELISA檢測的結(jié)果值的百分比。在4℃孵育(圖2A)以及在26-28℃的溫度孵育(圖2B)。本實(shí)施例中評估的賦形劑為1.-乳糖、2.-淀粉、3.-羧甲基淀粉鈉、4.-Croscaramelose、5.-聚烯吡酮、6.-滑石、7.-硬脂酸鎂、8.-二氧化鈦、9.-滅活細(xì)胞。
圖3.通過ELISA單克隆抗體抗-LPS抑制試驗(yàn)確定最終的片劑制劑的霍亂弧菌脂多糖(LPS)的抗原性。
圖4.用滅活細(xì)胞或疫苗的片劑制劑接種的兔的血清滴度。通過ELISA檢測霍亂弧菌01、Ogawa的抗脂多糖滴度，列于圖4A。殺弧菌滴度列于圖4B。
權(quán)利要求
1.用于霍亂的疫苗組合物，由下列成分組成a.霍亂弧菌(Vibrio cholera)滅活細(xì)胞b.凝集素c.潤滑劑d.包衣物質(zhì)e.填充物質(zhì)f.崩解物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，滅活細(xì)胞由霍亂弧菌減毒菌株組成。
3.如權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，滅活細(xì)胞屬于血清型0139。
4.如權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，滅活細(xì)胞屬于血清型01。
5.如權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，具有El Tor或Classic型細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的疫苗組合物，滅活細(xì)胞屬于Ogawa或Inaba血清型。
7.如權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，滅活細(xì)胞由由霍亂弧菌的野生菌株組成。
8.如權(quán)利要求7所述的疫苗組合物，滅活細(xì)胞屬于血清型0139。
9.如權(quán)利要求8所述的疫苗組合物，滅活細(xì)胞屬于血清型01。
10.如權(quán)利要求9所述的疫苗組合物，具有El Tor或Classic生物型細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的疫苗組合物，具有Ogawa或Inaba血清型細(xì)胞。
12. 如權(quán)利要求1到11所述的疫苗組合物，每一片含有5×109-1011的細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，以聚烯吡酮、明膠或羧甲基纖維素作為凝集素。
14.如權(quán)利要求13所述的疫苗組合物，其中凝集素的濃度為片劑總質(zhì)量的1-5％。
15.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，以羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂、二氧化硅或滑石作為潤滑劑。
16.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中潤滑劑的濃度為片劑總質(zhì)量的0.25-1.5％。
17.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，以纖維素乙?；彵蕉姿狨?acetophtalate)、鄰苯二甲酸二乙酯纖維素、10％硝基纖維素(lacquer)或二氧化鈦?zhàn)鳛榘挛镔|(zhì)。
18.權(quán)利要求17所述的疫苗組合物，其中包衣物質(zhì)的濃度為片劑總質(zhì)量的1-2％。
19.權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，以乳糖或玉米淀粉作為填充物質(zhì)。
20.權(quán)利要求19所述的疫苗組合物，其中填充物質(zhì)的濃度為片劑總質(zhì)量的65-80％。
21.權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，以croscaramelose鈉、玉米淀粉和微晶纖維素作為崩解物質(zhì)。
22.權(quán)利要求21所述的疫苗組合物，其中崩解物質(zhì)的濃度為片劑總質(zhì)量的1-6％。
全文摘要
本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，特別是口服霍亂疫苗。本發(fā)明的目的是制備等劑形成的滅活的完整細(xì)胞霍亂弧菌疫苗。本發(fā)明描述了該疫苗制劑。
文檔編號A61K9/28GK1791426SQ200480013503
公開日2006年6月21日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月20日
發(fā)明者A·塔拉韋拉科羅內(nèi)爾, G·阿內(nèi)洛佩斯, J·L·卡斯塔尼奧費(fèi)爾南德斯, E·烏里巴里埃爾南德斯, Y·皮諾納瓦羅, H·M·加西亞桑謝斯, T·巴爾馬塞達(dá)佩雷斯, B·塞德雷馬雷羅, L·加西亞伊米亞, J·L·佩雷基尼奧伊, C·托雷斯蘇亞雷斯 申請人:血清疫苗研究生產(chǎn)中心芬雷學(xué)院