專利名稱：Nogo受體結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和分子生物學(xué)。更特別地，本發(fā)明涉及用于治療神經(jīng)性疾病、異常和損傷如脊髓損傷的分子和方法。
背景技術(shù)：
軸突和樹突從神經(jīng)元中伸展出來。伸展的軸突或神經(jīng)突的末梢包括一個(gè)專門區(qū)域，被稱作生長錐。生長錐感覺局部環(huán)境，并引導(dǎo)軸突朝向神經(jīng)元靶點(diǎn)細(xì)胞生長。生長錐對(duì)環(huán)境誘因響應(yīng)，例如表面粘附、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)和電場(chǎng)。生長錐通常以每天1-2毫米的速度向前生長。生長錐在兩側(cè)借助被稱為片狀偽足和絲狀偽足的伸長來探測(cè)其前方的區(qū)域。當(dāng)伸長部分接觸到不宜的表面時(shí)，就會(huì)縮回來。當(dāng)伸長部分接觸到適宜生長的表面時(shí)，就會(huì)繼續(xù)伸長，并朝該方向引導(dǎo)生長錐。當(dāng)生長錐到達(dá)適當(dāng)?shù)陌悬c(diǎn)細(xì)胞時(shí)，就會(huì)建立突觸聯(lián)系。
神經(jīng)細(xì)胞的功能受到神經(jīng)元與它們的相鄰環(huán)境中的其它細(xì)胞之間的接觸的影響(Rutishauser，等人，1988，Physiol.Rev.68819)。這些細(xì)胞包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的特化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，少突細(xì)胞以及外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中的神經(jīng)膜細(xì)胞(Schwann cell)，施萬細(xì)胞用髓磷脂覆蓋神經(jīng)軸突(Lemke，1992，An Introduction to Molecular Neurobiology，Z.Hall，編輯，281，Sinauer)。
CNS神經(jīng)元具有在受損后再生的內(nèi)在潛能，但是髓磷脂中存在的抑制蛋白限制了它們的再生(Brittis等人，2001，Neuron 3011-14；Jones等人，2002，J.Neurosci.222792-2803；Grimpe等人，2002，J.Neurosci.223144-3160)。
數(shù)個(gè)存在于少突細(xì)胞中的髓磷脂抑制蛋白已經(jīng)被表征。髓磷脂抑制蛋白的已知例子包括NogoA(Chen等人，Nature，2000，403，434-439；Grandpre等人，Nature 2000，403，439-444)，髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)(McKerracher等人，1994，Neuron 13805-811；Mukhopadhyay等人，1994，Neuron 13757-767)和少突細(xì)胞糖蛋白(OM-gp)，Mikol等人，1988，J.Cell.Biol.1061273-1279)。這些蛋白質(zhì)中的每一種已經(jīng)分別地被證明是神經(jīng)元NgRl的配體(Wang等人，Nature 2002，417，941-944；Grandpre等人，Nature 2000，403，439-444；Chen等人，Nature，2000，403，434-439；Domeniconi等人，Neuron2002，2002年6月28日在線發(fā)表)。
Nogo受體-1(NgRl)是GPI錨定的膜蛋白，含有8個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)(Fournier等人，2001，Nature 409341-346)。在與抑制蛋白(例如NogoA、MAG和OM-gp)相互作用時(shí)，NgRl復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，導(dǎo)致生長錐崩解(growthcone collape)，抑制神經(jīng)突的延長。
迫切需要用于阻止NgRl介導(dǎo)的生長錐崩解和這所導(dǎo)致的對(duì)神經(jīng)突生長(neurite outgrowth)的抑制的分子和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了各種與名為“Sp35”(本發(fā)明人的命名)的多肽相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。Sp35的可替代命名包括“LINGO”和“LINGO-1”。本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)包括如下。Sp35結(jié)合NgRl。Sp35以同型相互作用(homotypic interaction)與自身結(jié)合。Sp35-Fc融合蛋白誘導(dǎo)或促進(jìn)粒狀神經(jīng)元(granular neuron)成束。在紅核脊束半切損傷模型(rubro-spinal tract hemisection injury model)和視神經(jīng)橫切模型中，Sp35-Fc融合蛋白都促進(jìn)神經(jīng)元存活。當(dāng)將Sp35逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的皮層原代細(xì)胞遞送到脊髓受損的大鼠中時(shí)，提高了神經(jīng)元存活，增強(qiáng)了軸突的βIII微管蛋白染色，并增加了髓磷脂的含量。
部分地基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的特征在于分離的核酸，含有編碼多肽的核苷酸序列，其中(a)該多肽包括(i)Sp35LRR結(jié)構(gòu)域，(ii)位于LRR結(jié)構(gòu)域的C末端的Sp35堿性區(qū)，和(iii)位于所述堿性區(qū)的C末端的Sp35免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域；和(b)該多肽缺少跨膜結(jié)構(gòu)域。Sp35LRR結(jié)構(gòu)域含有羧基末端的LRR(LRRCT)，氨基末端的LRR(LRRNT)或者兩者。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所編碼的Sp35多肽缺少胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所編碼的Sp35多肽包括SEQ ID NO2的氨基酸殘基34-532，而缺少氨基酸殘基533-614。
本發(fā)明還包括編碼多肽的核酸，其中該多肽包括Sp35Ig結(jié)構(gòu)域，而缺少Sp35LRR結(jié)構(gòu)域，Sp35堿性區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明還包括編碼多肽的核酸，其中該多肽包括Sp35LRR結(jié)構(gòu)域，而缺少Sp35Ig結(jié)構(gòu)域，Sp35堿性區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明還包括編碼多肽的核酸，其中該多肽缺乏功能性胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，但是包括所有其它Sp35結(jié)構(gòu)域。例如，所編碼的多肽包括SEQ ID NO2的氨基酸1-576(在信號(hào)肽加工前)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所編碼的多肽是融合多肽，含有非Sp35c部分。非Sp35部分可以是，例如，Ig部分、血清白蛋白部分、靶向部分、受體部分，或者有助于純化的部分。優(yōu)選的非Sp35部分是Ig部分，例如Fc部分。
核苷酸序列被可操作地連接到表達(dá)調(diào)控序列上，例如在表達(dá)載體中。本發(fā)明還包括用表達(dá)本發(fā)明的Sp35多肽的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還包括由上述核酸的任何一種所編碼的Sp35多肽。
本發(fā)明還包括偶聯(lián)到多聚體上的Sp35多肽，該多聚體例如聚亞烷基二醇(polyalkylene glycol)、糖多聚體和多肽。優(yōu)選的多聚體是聚亞烷基二醇，例如聚乙二醇(PEG)。多肽被偶聯(lián)到1，2，3或4個(gè)多聚體上。優(yōu)選地，偶聯(lián)到每個(gè)Sp35多肽上的多聚體的總分子量從20,000Da到40,000Da。
本發(fā)明還包括用NgRl抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。該方法包括用有效量的Sp35多肽接觸NgRl。用于該方法的優(yōu)選多肽包括如下(a)Sp35多肽，其中(a)該多肽包括(i)Sp35LRR結(jié)構(gòu)域，(ii)位于LRR結(jié)構(gòu)域的C末端的Sp35堿性區(qū)，和(iii)位于該堿性區(qū)C末端的Sp35免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域；和(b)多肽缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域；和(b)Sp35多肽，包括Sp35Ig結(jié)構(gòu)域，而缺乏Sp35LRR結(jié)構(gòu)域，Sp35堿性區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明還包括降低對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)元的軸突生長的抑制的方法。該方法包括用有效量的多肽接觸神經(jīng)元，該多肽例如Sp35多肽，抗Sp35抗體，或者抗Sp35抗體的抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明還包括抑制CNS神經(jīng)元的生長錐的崩解的方法。該方法包括用有效量的多肽接觸神經(jīng)元，該多肽例如Sp35多肽，抗Sp35抗體，或者抗Sp35抗體的抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明還包括治療哺乳動(dòng)物中的CNS疾病、異?；驌p傷的方法。該方法包括將治療有效量的多肽施用給哺乳動(dòng)物，該多肽例如Sp35多肽，抗Sp35抗體，或者抗Sp35抗體的抗原結(jié)合片段。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，CNS疾病、異?；驌p傷是脊髓損傷?？梢跃植渴┯肧p35多肽。在該方法的一些實(shí)施方案中，Sp35多肽在脊髓損傷的48小時(shí)內(nèi)開始施用。對(duì)于局部施用，治療有效量的多肽優(yōu)選為10μg/kg-10mg/kg。對(duì)于全身性施用，治療有效量的多肽優(yōu)選為1mg/kg-20mg/kg。
本發(fā)明還包括治療哺乳動(dòng)物中的CNS疾病、異常或損傷的離體基因治療(ex vivo gene therapy)方法。該方法包括(a)提供表達(dá)重組Sp35多肽的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和(b)將宿主細(xì)胞導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的CNS疾病、異常或損傷部位，CNS疾病、異常或損傷例如脊髓損傷。培養(yǎng)的宿主細(xì)胞來源于將被處理的哺乳動(dòng)物。在這種離體基因治療方法中，重組Sp35多肽可以是全長的Sp35多肽。
本發(fā)明還包括在CNS疾病、異?；驌p傷部位促進(jìn)髓鞘形成。該方法包括用有效量的Sp35多肽接觸CNS疾病、異?；驌p傷部位，例如，多肽含有Sp35LRR結(jié)構(gòu)域，而缺乏Sp35Ig結(jié)構(gòu)域，Sp35堿性區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明還包括通過體內(nèi)基因治療來治療CNS疾病、異?；驌p傷的體內(nèi)基因治療方法。該方法包括給哺乳動(dòng)物位于或者接近CNS疾病、異?；驌p傷部位，施用含有編碼Sp35多肽的核苷酸序列的病毒性載體，使得在哺乳動(dòng)物中位于或接近損傷部位，核苷酸序列以足以減少通過神經(jīng)元的軸突伸長的抑制的含量表達(dá)Sp35多肽。病毒性載體可以是例如腺病毒載體，慢病毒載體，桿狀病毒載體，EB病毒載體(Epstein Barr viral vector)，乳多空病毒載體(papovaviral vector)，痘苗病毒載體(vaccinia viral vector)和單純皰疹病毒載體。該疾病、異常或損傷是例如脊髓損傷或者視神經(jīng)損傷。病毒性載體可以通過例如局部施用、眼內(nèi)施用、胃腸外施用、鞘內(nèi)施用(intrathecaladministration)、硬膜下施用和皮下施用的路徑施用。
本發(fā)明還包括促進(jìn)處于垂死危險(xiǎn)中的神經(jīng)元的存活的方法。該方法包括用有效量的Sp35多肽接觸神經(jīng)元。Sp35多肽可以是可溶形式的Sp35，例如Sp35-Fc融合蛋白。該神經(jīng)元可以是體外或體內(nèi)的，例如在患有神經(jīng)退化性疾病、異常或損傷的哺乳動(dòng)物中，例如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)、ALS、享廷頓病(Hantington’s disease)、阿爾茨海默氏病、帕金森病(Parkinson’sdisease)、糖尿病性神經(jīng)病(neuropathy)、發(fā)作綜合征(stroke)、創(chuàng)傷性大腦損傷(traumatic brain injury)和脊髓損傷。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，間接施用Sp35多肽，通過(a)提供表達(dá)重組Sp35多肽的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和(b)將該宿主細(xì)胞導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物的神經(jīng)元部位。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過體內(nèi)基因治療施用多肽。在這樣一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括位于或接近神經(jīng)元的部位施用包含編碼Sp35多肽的核苷酸序列的病毒性載體，使得核苷酸序列在哺乳動(dòng)物中以足以促進(jìn)神經(jīng)元存活的含量表達(dá)Sp35多肽。
如在此所用，“全長的人Sp35多肽”是指氨基酸序列為SEQ ID NO2的氨基酸34-614的多肽。
如在此所用，“異源部分”是指不存在于全長Sp35多肽中的氨基酸序列。
如在此所用，“nogo受體-1”是指序列是公眾在Genbank登錄號(hào)AAG53612下可獲得的多肽。
如在此所用，“Sp35拮抗劑多肽”是指阻斷、抑制或干擾天然存在的Sp35的生物學(xué)活性的Sp35多肽。
如在此所用，“Sp35堿性區(qū)”是指如下的氨基酸基序R R A R I R D R K(SEQ ID NO4)K K V K V K E K R(SEQ ID NO5)R R L R L R D R K(SEQ ID NO6)R R G R G R D R K(SEQ ID NO7)R R I R A R D R K(SEQ ID NO8)最上面一行氨基酸(粗體；SEQ ID NO4)是優(yōu)選的Sp35堿性區(qū)序列，具有可選擇的取代的變體被顯示在下面(SEQ ID NO5，6，7和8)。
如在此所用，“Sp35融合蛋白”是指包括融合到異源部分上的Sp35部分的融合蛋白。
如在此所用，“Sp35Ig結(jié)構(gòu)域”是指SEQ ID NO2的氨基酸433-493，只要該序列含有五個(gè)以上的獨(dú)立的(individual)氨基酸插入、缺失或者保守氨基酸取代。特別地包括如下取代(基于SEQ ID NO2的編號(hào))位置6上的V變化為M；位置294上的S變化為G；位置348上的V變化為A；位置419上的R變化為H。
如在此所用，“Sp35LRR結(jié)構(gòu)域”是指包括10-14個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)的結(jié)構(gòu)域，包括LRRNT和LRRCT，被列舉在表1中，只要在聚集的10-14個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)中，出現(xiàn)達(dá)五個(gè)氨基酸插入、缺失或者保守氨基酸取代。
如在此所用，“Sp35部分”是指全長的Sp35多肽的生物學(xué)活性片段。
如在此所用，″Sp35多肽″是指Sp35部分或包括Sp35部分的融合蛋白。
除非另外定義，所有在此所用的科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義。在相互沖突的情形下，以本說明書為準(zhǔn)，包括定義。所有的出版物、專利和其它在此提及的參考文獻(xiàn)都被引入作為參考。
雖然可以在實(shí)施和檢驗(yàn)本發(fā)明中采用與在此描述的那些相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?，下面將描述?yōu)選的方法和材料。材料、方法和實(shí)施例僅是說明性的，而不用于限制。根據(jù)詳細(xì)描述的說明書和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)是顯然的。


附圖1是全長的人Sp35cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。
附圖2是全長的人Sp35多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
附圖3是Sp35結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和缺失作圖的示例性說明，以鑒定結(jié)合NgRl的Sp35序列。
附圖4是總結(jié)結(jié)合到COS7細(xì)胞上的SP35的數(shù)據(jù)的柱形圖，該COS7細(xì)胞用表達(dá)大鼠p75的載體或者載體對(duì)照轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，AP-SP35或AP與細(xì)胞一起培養(yǎng)。被結(jié)合的AP可用顯色AP檢測(cè)試劑檢測(cè)。
附圖5是總結(jié)關(guān)于AP-Omgp和AP-Nogo-66結(jié)合到COS7細(xì)胞上的數(shù)據(jù)的柱形圖，COS7細(xì)胞用編碼NgRl；NgRl和p75；NgRl、p75、和SP35的表達(dá)載體或者載體對(duì)照轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，AP-Omgp、AP-Nogo-66或AP與細(xì)胞一起培養(yǎng)。被結(jié)合的AP可用顯色AP檢測(cè)試劑檢測(cè)。
附圖6是總結(jié)關(guān)于髓磷脂抑制劑對(duì)神經(jīng)突體外生長的抑制活性的減弱(relief)的數(shù)據(jù)的柱形圖。在出生后第7天，在表達(dá)DN-Sp35、全長的Sp35的大鼠大腦粒狀神經(jīng)元(cerebellar granular neuron)或者培養(yǎng)在固定底物Omgp、Myelin和Nogo-66上的對(duì)照中測(cè)量神經(jīng)突的長度。DN-SP35轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)抑制底物的響應(yīng)降低。量化對(duì)來自兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的每個(gè)處理組的1000個(gè)神經(jīng)元的神經(jīng)突的長度(p＜0.01)。
附圖7是總結(jié)關(guān)于SP35-Fc逆轉(zhuǎn)髓磷脂抑制劑的抑制活性的數(shù)據(jù)的柱形圖。出生后第7天的大鼠大腦粒狀神經(jīng)元(1000個(gè)神經(jīng)元)的神經(jīng)突長度，在存在或者缺乏SP35-Fc時(shí)，在固定底物OMgp、髓磷脂或者Nogo-66上培養(yǎng)這些神經(jīng)元。SP35-Fc降低Omgp，Nogo-66和MAG對(duì)神經(jīng)突生成的抑制作用。量化來自兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的、每個(gè)處理組1000個(gè)神經(jīng)元的神經(jīng)突的長度(p＜0.01)。
附圖8是總結(jié)來自一個(gè)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)的圖形，表明鞘內(nèi)施用Sp35-Fc改善了大鼠在背部半切后(dorsal hemisection)的功能恢復(fù)。測(cè)量移行BBB(locomoter BBB)分值，作為對(duì)照(IgG)或者Sp35-Fc-處理大鼠(每組8只大鼠)在背部半切后的時(shí)間函數(shù)(function of time)。處理開始于脊髓損傷。
附圖9是顯示在附圖8中概述的試驗(yàn)中的第4周的各個(gè)動(dòng)物的BBB分值的圖形。
發(fā)明詳述天然存在的人Sp35是糖基化的CNS特異性蛋白，含有614個(gè)氨基酸(附圖2；SEQ ID NO2)。全長的野生型的人SP35多肽含有一個(gè)由14個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)(包括N-和C-末端帽子)組成的LRR結(jié)構(gòu)域、Ig結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(附圖3)。胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有規(guī)則的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。此外，天然存在的Sp35蛋白含有信號(hào)序列、位于LRRCT和Ig結(jié)構(gòu)域之間的短的堿性區(qū)，和位于Ig結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的跨膜區(qū)(附圖3)。人Sp35基因含有可選擇的翻譯起始密碼子，使得在Sp35信號(hào)序列的N末端可能存在或不存在六個(gè)額外的氨基酸，即MQVSKR(SEQ ID NO9)。表1中列舉了Sp35結(jié)構(gòu)域和其它區(qū)域，對(duì)應(yīng)于附圖2中序列的氨基酸殘基的編號(hào)(SEQ ID NO2)。
表1

已經(jīng)在人和大鼠中研究了Sp35的組織分布和發(fā)育表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(大鼠)模型中研究了Sp35的生物學(xué)。大鼠SP35的表達(dá)局限于CNS神經(jīng)元和大腦少突細(xì)胞，通過northern印跡和免疫組化染色確定。大鼠Sp35mRNA的表達(dá)水平在發(fā)育中被調(diào)控，而在出生后立即(在出生后第一天)急劇升高。在大鼠脊髓橫斷損傷模型中，通過RT-PCR確定，Sp35在損傷部位被上調(diào)。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，全長的野生型Sp35結(jié)合到NgRl上?？扇苄缘腟p35衍生物作為Sp35拮抗多肽起作用，通過結(jié)合到NgRl上，并阻斷、抑制或干擾NgRl的功能，從而減輕通常發(fā)生在CNS神經(jīng)元中的由NgRl介導(dǎo)的對(duì)軸突伸長的抑制作用。這在大腦或脊髓中需要軸突伸長或神經(jīng)突萌發(fā)的情形下是有益的。脊髓損傷，包括部分或完全粉碎或斷裂，示例說明了需要軸突伸長的情形，但是該軸突伸長通常被Nogo路徑運(yùn)行所抑制。其中大腦中的軸突伸長和/或神經(jīng)突萌發(fā)將是有益的疾病或異常的例子包括卒中、多發(fā)性硬化和其它神經(jīng)退行性疾病或異常。
在本發(fā)明的方法中，Sp35多肽或者Sp35阻斷抗體(結(jié)合抗原的抗體片段)作為預(yù)制的(preformed)多肽直接施用，或者通過核酸載體間接施用，以拮抗NgRl功能，準(zhǔn)許有益的軸突生成。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在治療方法中施用可溶性的Sp35拮抗多肽，該方法包括(1)用核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染可移植的宿主細(xì)胞，所述核酸例如表達(dá)Sp35多肽的載體；和(2)將被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞移植到哺乳動(dòng)物的疾病、異?；驌p傷的部位。例如，被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞移植到脊髓損傷的部位。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，從哺乳動(dòng)物上獲取可移植的宿主細(xì)胞，暫時(shí)培養(yǎng)，用編碼可溶性的Sp35多肽的分離核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，再植回到獲取該細(xì)胞的同一哺乳動(dòng)物中。該細(xì)胞可以，但是不是必須，從與所植入的部位相同的部位獲取。這種實(shí)施方案有時(shí)也被稱作為離體基因治療，能夠在有限時(shí)期內(nèi)，在作用局部連續(xù)供應(yīng)Sp35多肽。
本發(fā)明提供作為Sp35與NgRl互作以及Sp35同型互作的調(diào)節(jié)物的寡肽。該寡肽包括如下氨基酸基序L S P R K H(SEQ ID NO10)I T P K R R(SEQ ID NO11)A C P H H K(SEQ ID NO12)V S P R K H(SEQ ID NO13)頂端一行氨基酸(粗體；SEQ ID NO10)是優(yōu)選序列，包含可選擇的取代的變體顯示在下面(SEQ ID NO11，12和13)。
各種示例性的Sp35多肽、抗Sp35抗體和抗體片段，以及用于獲得這些分子來實(shí)施本發(fā)明的方法和材料將在下面描述。
融合蛋白和偶聯(lián)多肽本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括Sp35多肽的用途，例如Sp35拮抗多肽，其中Sp35部分被融合到異源多肽部分上，形成Sp35融合蛋白。Sp35融合蛋白被用于實(shí)施各種目的，例如延長血清半衰期，提高生物利用度，體內(nèi)靶向特定器官或組織類型，提高重組表達(dá)效率，改進(jìn)宿主細(xì)胞分泌，容易純化，提高親合性。根據(jù)所有達(dá)到的目的，插入惰性或生物活性的異源部分。此外，還可以選擇異源部分，以在體外或體內(nèi)被穩(wěn)定地融合到Sp35部分上或者在體內(nèi)或體外是可裂解的。在本領(lǐng)域，用于實(shí)施不同目的的異源部分是已知的。
作為Sp35融合蛋白的表達(dá)的替代，可以預(yù)制所選擇的異源部分，并化學(xué)偶聯(lián)到Sp35部分上。在大多數(shù)情形下，無論是融合或者偶聯(lián)到Sp35部分上，所選擇的異源部分會(huì)類似地起作用。因此，在如下對(duì)異源氨基酸序列的討論中，除非另外指出，應(yīng)當(dāng)理解，異源序列以融合蛋白形式或者作為化學(xué)偶聯(lián)物被連接到Sp35部分上。
藥學(xué)活性的多肽例如Sp35，通常在體內(nèi)被迅速清除，迫使需要大劑量來在機(jī)體中達(dá)到治療有效濃度。此外，小于約60kDa的多肽可能發(fā)生腎小球?yàn)V過，腎小球?yàn)V過有時(shí)會(huì)導(dǎo)致腎毒癥?？梢匀诤匣蚺悸?lián)相對(duì)小的多肽，例如Sp35片段，以降低或避免這種腎毒癥的危險(xiǎn)。用于增加治療性多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性即血清半衰期的各種異源氨基酸序列，即多肽部分或者“載體”，是已知的。
由于半衰期長、體內(nèi)分布廣泛，并且沒有酶的或免疫學(xué)的功能，基本上全長的人血清白蛋白(HSA)或者HSA片段是優(yōu)選的異源部分。通過應(yīng)用方法和材料如Yeh等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，891904-1908和Syed等人，1997，Blood 893243-3252中教導(dǎo)的那些，HAS被用于構(gòu)成Sp35融合蛋白或偶聯(lián)物，具有依賴于Sp35部分的藥學(xué)活性，而體內(nèi)穩(wěn)定性顯著地升高，例如10倍到100倍。優(yōu)選地，HSA的C末端被融合到Sp35部分的N末端上。由于HSA是天然分泌的蛋白質(zhì)，當(dāng)在真核動(dòng)物如哺乳動(dòng)物的表達(dá)系統(tǒng)中生成Sp35融合蛋白時(shí)，HSA信號(hào)序列被利用，將該融合蛋白分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案使用Sp35多肽，其中Sp35部分被融合到Fc區(qū)域，即Ig重鏈恒定區(qū)的C末端部分上。Sp35-Fc融合物的潛在優(yōu)點(diǎn)包括溶解性，體內(nèi)穩(wěn)定性，和多價(jià)(multivalency)，例如二聚作用。所用的Fc區(qū)可以是IgA、IgD或IgG Fc區(qū)(鉸鏈-CH2-CH3)?？商娲?，可以是IgE或IgM Fc區(qū)(鉸鏈-CH2-CH3-CH4)。IgG Fc區(qū)是優(yōu)選的，例如IgGl Fc區(qū)或IgG4 Fc區(qū)。在本領(lǐng)域，用于構(gòu)建和表達(dá)編碼Fc融合物的DNA的材料和方法是已知的，可以被用于獲得Sp35融合物，而無需過度的試驗(yàn)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中采用Sp35融合蛋白，例如在Capon等人的美國專利5,428,130和5,565,335中所描述的那些。
信號(hào)序列是編碼起始將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜的氨基酸序列的多核苷酸。用于構(gòu)建免疫融合物(immunofusin)的信號(hào)序列包括抗體輕鏈信號(hào)序列，例如抗體14.18(Gillies等人，1989，J.Immunol.Meth.，125191-202)，抗體重鏈信號(hào)序列，例如MOPC141抗體重鏈信號(hào)序列(Sakano等人，1980，Nature 2865774)?？商娲兀梢栽囼?yàn)其它信號(hào)序列。參見，例如Watson，1984，Nucleic Research 125145)。信號(hào)肽通常在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)被信號(hào)肽酶切割。這導(dǎo)致分泌含有Fc區(qū)和Sp35部分的免疫融合物蛋白。
在一些實(shí)施方案中，DNA序列編碼分泌表達(dá)盒(secretion cassette)與Sp35部分之間的蛋白水解切割位點(diǎn)。切割位點(diǎn)被用于蛋白水解斷裂所編碼的融合蛋白，從目標(biāo)蛋白上分離Fc結(jié)構(gòu)域。有用的蛋白水解切割位點(diǎn)包括蛋白水解酶，例如胰蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、因子Xa或腸激酶K所識(shí)別的氨基酸序列。
分泌表達(dá)盒被插入到可復(fù)制的表達(dá)載體中。有用的載體包括線性核酸、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒等。示例性的表達(dá)載體是pdC，其中免疫融合物DNA的轉(zhuǎn)錄受人巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子調(diào)控。參見，例如Lo等人，1991，Biochim.Biophys.Acta 1088712；和Lo等人，1998，Protein Engineering 11495-500。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞用編碼Sp35多肽的DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，用于表達(dá)和分泌Sp35多肽。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括無限增殖的雜交瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、293細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、Hela細(xì)胞和COS細(xì)胞。
完整的野生型Fc區(qū)具有效應(yīng)子功能，這種功能在本發(fā)明的Fc融合蛋白中是不需要和不期望的。因此，在構(gòu)建分泌表達(dá)盒的過程中，優(yōu)選從Fc區(qū)中刪除某些結(jié)合位點(diǎn)。例如，由于不必與輕鏈一起共表達(dá)，從IgE的Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域中刪除重鏈結(jié)合蛋白Bip(Hendershot等人，1987，Immunol.Today 8111-114)的結(jié)合位點(diǎn)，使得該位點(diǎn)不會(huì)干擾免疫融合物的有效分泌。同樣地，存在于Fc區(qū)中的半胱氨酸殘基負(fù)責(zé)結(jié)合到免疫球蛋白的輕鏈上，應(yīng)當(dāng)被刪除或者用其它氨基酸取代，使得這些半胱氨酸殘基不會(huì)干擾作為免疫融合物生成時(shí)的Fc區(qū)的正確折疊?？缒そY(jié)構(gòu)域序列應(yīng)當(dāng)被刪除，例如存在于IgM中的那些。
IgGl Fc區(qū)是優(yōu)選的?？商娲?，可以在表達(dá)盒中使用其它亞類的免疫球蛋白γ(γ-2、γ-3和γ-4)的Fc區(qū)。免疫球蛋白γ-1的IgGl Fc區(qū)優(yōu)選被用于分泌表達(dá)盒中，該表達(dá)盒包括鉸鏈區(qū)(至少部分)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。在一些實(shí)施方案中，免疫球蛋白γ-1的Fc區(qū)是CH2-刪除的-Fc，其中包括部分鉸鏈區(qū)和CH3區(qū)，而不包括CH2區(qū)。CH2-刪除的-Fc已經(jīng)在Gillies等人，1990，Hum.Antibod.Hybridomas，147中描述。在一些實(shí)施方案中，使用IgA、IgD、IgE或IgM的Fc區(qū)。
可以用幾種不同結(jié)構(gòu)來構(gòu)建Sp35-Fc融合蛋白。在一種結(jié)構(gòu)中，Sp35部分的C末端被直接融合到Fc部分的N末端上。在一種稍微不同的結(jié)構(gòu)中，將短多肽例如2-10個(gè)氨基酸，插入到Sp35部分的N末端和Fc部分C末端之間的融合中。這種接頭具有構(gòu)象彈性，在有些情形下會(huì)提高生物學(xué)活性。如果在Fc部分中保留足夠的鉸鏈區(qū)部分，Sp35-Fc融合將會(huì)二聚化，從而形成二價(jià)分子。相同群體的單體Fc融合物將會(huì)產(chǎn)生特異性的、二價(jià)二聚物。各自具有不同特異性的兩種單體Fc融合物的混合將會(huì)生成雙特異性的、二價(jià)二聚物。
可以使用大量含有相應(yīng)的氨基反應(yīng)基和巰基反應(yīng)基的交聯(lián)劑的任何一種，將Sp35連接到血清白蛋白上。合適的交聯(lián)劑的例子包括氨基反應(yīng)交聯(lián)劑，該交聯(lián)劑插入與巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺，例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS和GMBS。其它合適的交聯(lián)劑插入與巰基反應(yīng)的鹵代乙酸鹽(酯)(haloacetate)基團(tuán)，例如SBAP、S1A、SLAB。為與巰基反應(yīng)提供的保護(hù)性或非保護(hù)性的硫醇(thiol)以產(chǎn)生還原性連接的接頭包括SPDP、SMPT、SATA和SATP。這種試劑可以購買得到(例如，Pierce Chemicals)。
偶聯(lián)不必包括Sp35多肽的N末端或者血清白蛋白的巰羥基部分。例如，可以采用遺傳工程化技術(shù)來獲得Sp35-白蛋白融合物，其中Sp35部分被融合到血清白蛋白基因的N末端、C末端或兩者上。
Sp35多肽被融合到異源多肽上，以方便Sp35部分的純化或鑒定。例如，將組氨酸標(biāo)記融合到Sp35多肽上，方便采用商業(yè)上可獲得的層析介質(zhì)來純化。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用Sp35融合構(gòu)建體來提高在細(xì)菌中生成Sp35部分。在這種構(gòu)建體中，高水平表達(dá)和/或分泌的細(xì)菌蛋白被用作Sp35多肽的N末端融合配偶體。參見，例如Smith等人，1988Gene 6731；Hopp等人，1988，Biotechnology 61204；La Vallie等人，1993，Biotechnology 11187。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，融合構(gòu)建體包括Sp35部分和第二個(gè)人NgRl-結(jié)合部分，例如少突細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)部分、髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)部分或Nogo66部分。這種構(gòu)建體的優(yōu)點(diǎn)包括NgRl結(jié)合親合性升高。
全長的Omgp氨基酸序列在本領(lǐng)域是已知的(Genbank登錄號(hào)P23515)。Sp35-OMgp融合物的特定例子包括如下Sp35(氨基酸34-532)+IgGl Fc+OMgp(氨基酸殘基25-400)；和Sp35(氨基酸34-532)+HSA+OMgp(氨基酸殘基25-400)。
全長的MAG氨基酸序列在本領(lǐng)域是已知的(Genbank登錄號(hào)A61084)。Sp35-MAG融合物的特定例子包括如下Sp35(氨基酸34-532)+IgGl Fc+MAG(氨基酸殘基12-500)；和Sp35(氨基酸34-532)+HSA+MAG(氨基酸殘基12-500)。
全長的Nogo氨基酸序列在本領(lǐng)域是已知的(NogoA Genbank登錄號(hào)AY102279)。Sp35-Nogo融合物的特定例子包括如下Sp35(氨基酸34-532)+IgGl Fc+Nogo66(NogoA氨基酸殘基1056-1122)；Sp35(氨基酸34-532)+HSA+Nogo66(NogoA氨基酸殘基1056-1122)；Sp35(氨基酸34-532)+IgGl Fc+氨基Nogo(NogoA氨基酸殘基1-949)；和Sp35(氨基酸34-532)+HSA+氨基Nogo(NogoA氨基酸殘基1-949)。
將Sp35部分融合到合適的融合配偶體的氨基末端和羧基末端上，可以獲得二價(jià)或者四價(jià)形式的Sp35多肽。例如，將Sp35部分融合到Ig部分的氨基末端和羧基末端上，生成含有兩個(gè)Sp35部分的二價(jià)單體多肽。借助Ig部分，二聚化兩個(gè)這種單體，獲得四價(jià)形式的Sp35蛋白。這種四價(jià)形式用于提高對(duì)靶點(diǎn)的結(jié)合親合性。將Sp35部分串聯(lián)放置，形成串聯(lián)體，獲得多價(jià)形式的Sp35，該串聯(lián)體可以單獨(dú)使用或者被融合到融合配偶體如Ig或HSA上。
偶聯(lián)多聚體(除多肽之外)本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及一種Sp35多肽，其中一種或多種多聚體被偶聯(lián)(共價(jià)連接)到Sp35多肽上。適合用于這種偶聯(lián)的多聚體的例子包括多肽(上述)、糖多聚體和聚亞烷基二醇鏈。典型地，但是不是必需，多聚體被偶聯(lián)到Sp35多肽上，以提高一種或多種如下性能溶解性、穩(wěn)定性或生物利用度。
用于偶聯(lián)到Sp35多肽上的優(yōu)選類型的多聚體是聚亞烷基二醇。聚乙二醇(PEG)是特別優(yōu)選的。PEG部分，例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)PEG的多聚體被偶聯(lián)到各個(gè)Sp35多肽上，以當(dāng)與單獨(dú)的Sp35多肽相比時(shí)，延長了血清半衰期。PEG部分是非抗原性的，和基本上是生物學(xué)惰性的。用于實(shí)施本發(fā)明的PEG部分可以是有分支的或無分支的。
連接到Sp35多肽上的PEG部分的數(shù)量以及單條PEG鏈的分子量是可變的。總之，多聚體的分子量越大，連接到多肽上的多聚體鏈越少。優(yōu)選地，連接到Sp35多肽上的所有多聚體的質(zhì)量為20kDa到40kDa。因此，如果連接一條多聚體鏈，該鏈的優(yōu)選分子量為20-40kDa。如果連接兩條鏈，每條鏈的優(yōu)選分子量為10-20kDa。如連接三條鏈，優(yōu)選每個(gè)鏈的分子量為7-14kDa。
多聚體，例如PEG，通過任何合適的、暴露在多肽上的反應(yīng)基團(tuán)連接到Sp35多肽上。暴露的反應(yīng)基團(tuán)可以是，例如，內(nèi)在的賴氨酸的N末端氨基或ε氨基，或者兩者。活化的多聚體發(fā)生反應(yīng)，并共價(jià)連接到Sp35多肽上的任何游離氨基上。Sp35上的游離的羧基、合適的活化的羰基、羥基、胍基、咪唑、氧化的碳水化合物部分和巰基(如果有)也可以被用作多聚體連接的反應(yīng)基團(tuán)。
優(yōu)選地，在偶聯(lián)反應(yīng)中，根據(jù)多肽的濃度，每摩爾多肽使用從約1.0-約10摩爾的活化的多聚體。通常，所選擇的比例表示最大化該反應(yīng)和最小化副反應(yīng)(通常是非特異性的)之間的平衡，該副反應(yīng)會(huì)影響Sp35的期望藥學(xué)活性。優(yōu)選地，Sp35多肽的生物活性的至少50％被保留(如在本文所描述或者本領(lǐng)域已知的任何分析中所證明)，最優(yōu)選幾乎100％被保留。
用傳統(tǒng)化學(xué)方法，將多聚體偶聯(lián)到Sp35多肽上。例如，聚亞烷基二醇部分被偶聯(lián)到Sp35多肽的賴氨酸的ε氨基上?？梢杂肗-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯例如PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亞胺丙酸酯(SPA-PEG)，連接到賴氨酸側(cè)鏈上。合適的聚亞烷基二醇部分包括，例如羧甲基-NHS、正亮氨酸-NHS、SC-PEG、tresylate、醛、環(huán)氧化物、金剛基咪唑和PNP碳酸鹽。這些試劑可以購買得到?？捎闷渌贩磻?yīng)活性的PEG接頭來取代琥珀酰亞胺部分。這些包括，例如異硫氰酸鹽、碳酸硝基苯酯、環(huán)氧化物和苯并三唑碳酸鹽。優(yōu)選選擇反應(yīng)條件，以最大化選擇性和程度或者反應(yīng)。這種反應(yīng)條件的優(yōu)化是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的事。
可以用本領(lǐng)域已知的任何PEG化反應(yīng)來進(jìn)行PEG化。參見，例如Focuson Growth Factors，34-10，1992；公開的歐洲專利申請(qǐng)EP 0154316和EP0401384?？梢杂梅磻?yīng)活性的聚乙二醇分子(或類似的反應(yīng)活性的水溶性多聚體)，通過?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)來進(jìn)行PEG化。
通過?；瘉鞵EG化通常包括與聚乙二醇的活性酯衍生物反應(yīng)。任何反應(yīng)活性PEG分子都可以被用于PEG化中。優(yōu)選的活化的PEG酯是被酯化到N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)上的PEG。如在此所用，“酰化”包括，而不限于如下類型的治療性蛋白和水溶性多聚體如PEG之間的連接酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯等。參見，例如，Bioconiugate Chem.5133-140，1994。應(yīng)當(dāng)選擇反應(yīng)參數(shù)來避免將會(huì)損害或滅活Sp35多肽的溫度、溶劑和pH條件。
優(yōu)選地，連接鍵為酰胺。優(yōu)選地，至少95％的最終產(chǎn)物是一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)PEG化的。但是，一些具有較高PEG化程度的種類以一定量形成，取決于所用的特定反應(yīng)條件?？蛇x擇地，通過傳統(tǒng)的純化方法，包括例如透析、脫鹽、超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析和電泳，從混合物中分離純化的PEG化種類，特別是未反應(yīng)的種類。
通過烷基化PEG化通常包括在存在還原劑時(shí)，將PEG的末端醛衍生物與Sp35反應(yīng)。此外，可以操作反應(yīng)條件，以基本上僅在Sp35的N末端氨基發(fā)生PEG化(即，單一PEG化的蛋白)。在單一PEG化或多PEG化的情形下，PEG基團(tuán)優(yōu)選通過-CH2-NH-基團(tuán)連接到蛋白質(zhì)上。特別提及的是-CH2-基團(tuán)，該類型的連接被稱作為“烷基”連接。
通過還原性烷基化進(jìn)行衍生，生成單一PEG化產(chǎn)物，利用了可用于衍生化的不同類型的伯氨基(相對(duì)于N末端的賴氨酸)的不同反應(yīng)活性。在一定pH下進(jìn)行反應(yīng)，使得可以利用賴氨酸殘基的ε氨基和蛋白質(zhì)的N末端氨基之間的pKa差異。通過這種選擇性的衍生化，控制含有反應(yīng)活性基團(tuán)如醛的水溶性多聚體連接到蛋白質(zhì)上與多聚體的偶聯(lián)主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的N末端，而其它反應(yīng)基團(tuán)例如賴氨酸側(cè)鏈氨基無顯著的改變發(fā)生。
用于?；屯榛椒ㄖ械亩嗑垠w分子選自水溶性多聚體。所選擇的多聚體應(yīng)當(dāng)被修飾，以具有單一的反應(yīng)基團(tuán)，例如用于?；幕钚怎セ蛘哂糜谕榛娜瑑?yōu)選地，在本發(fā)明的方法中控制聚合程度。示例性的反應(yīng)活性PEG醛為聚乙二醇丙醛，這種醛是水溶性的，或其單C1-C10烷氧基的或芳氧基的衍生物(參見，美國專利5,252,714)。多聚體可以是分支的或無分支的。對(duì)于?；磻?yīng)，所選擇的多聚體應(yīng)當(dāng)具有單一的反應(yīng)活性酯基。對(duì)于還原的烷基化，所選擇的多聚體應(yīng)當(dāng)具有單一的反應(yīng)活性的醛基。總之，水溶性的多聚體不選自天然存在的糖基殘基，因?yàn)檫@些殘基通常更加便利地通過哺乳動(dòng)物重組表達(dá)系統(tǒng)來制備。
用于制備PEG化Sp35的方法通常包括步驟(a)在分子連接到一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)上的條件下，將Sp35蛋白或多肽與聚乙二醇(例如PEG的反應(yīng)活性的酯或醛衍生物)反應(yīng)，和(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。總之，可以根據(jù)已知的反應(yīng)參數(shù)和期望結(jié)果，逐一地確定用于?；磻?yīng)的最佳反應(yīng)條件。例如，PEG蛋白的比例越大，多聚PEG化的產(chǎn)物的比例越高。
用于生成基本上均一的(homogeneous)單多聚體/Sp35的群體的還原烷基化反應(yīng)通常包括步驟(a)在還原烷基化反應(yīng)條件下，在適合選擇性地修飾Sp35的N末端氨基的pH下，將Sp35蛋白或多肽與反應(yīng)活性的PEG分子反應(yīng)；和(b)獲取反應(yīng)產(chǎn)物。
對(duì)于基本上均一的單多聚體/Sp35的群體，還原的烷基化反應(yīng)條件是允許選擇性地將水溶性多聚體部分連接到Sp35的N末端上的條件。這種反應(yīng)條件通常規(guī)定在賴氨酸側(cè)鏈氨基和N末端氨基之間存在pKa差異。為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選pH的范圍在3-9，優(yōu)選為3-6。
Sp35多肽可以包括標(biāo)記，例如隨后可以通過蛋白水解釋放的部分。因此，賴氨酸部分首先用具有低分子量的接頭如Traut試劑(Pierce)修飾的His標(biāo)記反應(yīng)選擇性地修飾，Traut試劑會(huì)與賴氨酸和N末端反應(yīng)，然后釋放His標(biāo)記。然后多肽含有游離的SH基團(tuán)，SH基團(tuán)選擇性地被含有巰基反應(yīng)活性的頭部基團(tuán)(head group)的PEG修飾，頭部基團(tuán)如馬來酰亞胺基、乙烯基碘酸(vinylsulfone)基團(tuán)、鹵代醋酸鹽(酯)基團(tuán)或者游離的或被保護(hù)的SH。
Traut試劑可以用任何可以為PEG連接建立特定位點(diǎn)的接頭所替代。例如，Traut試劑可以用SPDP、SMPT、SATA或SATP(Pierce)替代。類似地，還可以將蛋白質(zhì)與胺反應(yīng)活性的接頭反應(yīng)，插入馬來酰亞胺(例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或GMBS)、鹵代醋酸鹽(酯)基團(tuán)(SBAP、SIA、SIAB)或者乙烯基碘酸基團(tuán)，和將生成的產(chǎn)物與含有游離SH的PEG反應(yīng)。
在一些實(shí)施方案中，聚亞烷基二醇部分被偶聯(lián)到Sp35多肽的半胱氨酸基團(tuán)上。采用馬來酰亞胺基團(tuán)、乙烯基碘酸基團(tuán)、鹵代醋酸鹽(酯)基團(tuán)或巰基基團(tuán)來進(jìn)行偶聯(lián)。
可選擇地，Sp35多肽通過不穩(wěn)定鍵偶聯(lián)到聚乙二醇部分上。在如生物化學(xué)水解、蛋白水解或者巰基斷裂中，這種不穩(wěn)定鍵會(huì)被斷裂。例如，該鍵在體內(nèi)(生理)條件下被斷裂。
如果反應(yīng)活性基團(tuán)位于N末端的α氨基上時(shí)，優(yōu)選在約pH5-8，例如，pH5，6，7或8，通過任何用于使生物活性材料與惰性多聚體反應(yīng)的合適方法進(jìn)行反應(yīng)。通常，該過程包括制備被活化的多聚體，接著將蛋白質(zhì)與被活化的多聚體反應(yīng)，制備適合配制成制劑的可溶性蛋白。
載體本發(fā)明提供包含編碼Sp35多肽的核酸的載體。對(duì)載體和可操作連接本發(fā)明的核酸的表達(dá)控制序列的選擇取決于期望特性，例如，蛋白質(zhì)表達(dá)和所要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本領(lǐng)域，用于調(diào)控被可操作地連接的編碼序列的表達(dá)的表達(dá)控制元件是已知的。例子包括，但是不限于，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、分泌信號(hào)和其它調(diào)控元件。當(dāng)使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子時(shí)，其表達(dá)受宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)狀況的變化或溫度變化的控制。
該載體包括原核復(fù)制子，即能夠在細(xì)菌宿主細(xì)胞中引導(dǎo)自動(dòng)復(fù)制維持染色體外和重組DNA分子的DNA序列。在本領(lǐng)域，這種復(fù)制子是已知的。此外，包括原核復(fù)制子的載體還包括其表達(dá)賦予可檢測(cè)標(biāo)記如抗藥性的基因。細(xì)菌抗藥性基因的例子是賦予對(duì)氨卡青霉素或四環(huán)素抗性的那些基因。
包括原核復(fù)制子的載體還包括原核或噬菌體啟動(dòng)子，用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中引導(dǎo)編碼基因序列的表達(dá)。通常在質(zhì)粒載體中提供與細(xì)菌宿主相容的啟動(dòng)子序列，該質(zhì)粒載體含有用于插入將要表達(dá)的DNA片段的便捷限制性位點(diǎn)。這種質(zhì)粒載體的例子為pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioRad)、pPL和pKK223(Pharmacia)。任何合適的原核宿主都可以被用于表達(dá)編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的重組DNA分子。
在本領(lǐng)域，真核細(xì)胞表達(dá)載體是已知的，可以購買得到。典型地，這種載體含有用于插入期望的DNA片段的便捷的限制性位點(diǎn)。示例性的載體包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1、pML2d(InternationalBiotechnologies)、pTDTl(ATCC 31255)，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pMIG、腺病毒穿梭載體pDC315和AAV載體。
真核細(xì)胞表達(dá)載體可以包括可選擇標(biāo)記，例如，抗藥性基因。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因(Southem等人，1982，J.Mol.Anal.Genet.1327-341)是這種基因的一個(gè)例子。
為了表達(dá)抗體或抗體片段，編碼部分或全長的輕鏈和重鏈的DNA被插入到表達(dá)載體中，例如質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、粘粒、YACs，、EBV來源的附加體等。選擇表達(dá)載體和表達(dá)控制序列，與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因被插入到分開的載體中。在一些實(shí)施方案中，這兩種基因被插入到同一表達(dá)載體中。
便捷的載體是編碼功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的載體。優(yōu)選地，工程化限制性位點(diǎn)，使得可以容易地插入和表達(dá)任何的VH和VL序列。在這種載體中，剪接通常發(fā)生在插入J區(qū)中的剪接供體位點(diǎn)和人C區(qū)前的剪接受體位點(diǎn)之間，還發(fā)生在存在于人CH外顯子的剪接區(qū)。多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生在編碼區(qū)下游的天然染色體位點(diǎn)上。重組表達(dá)載體還編碼信號(hào)肽，該信號(hào)肽方便抗體鏈從宿主細(xì)胞中分泌。
用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)控序列包括病毒性元件，該元件在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引導(dǎo)高水平的蛋白表達(dá)，例如來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)，來源于猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))、多瘤病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及強(qiáng)大的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子如天然免疫球蛋白和肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。對(duì)病毒性調(diào)控元件及其序列的進(jìn)一步描述參見，例如Stinski美國專利5,168,062；Bell美國專利4,510,245和Schaffner美國專利4,968,615。
重組表達(dá)載體含有在宿主細(xì)胞中調(diào)控載體復(fù)制的序列(例如復(fù)制起始)和可選擇的標(biāo)記?？蛇x擇的標(biāo)記基因方便導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞的分泌(參見，例如Axel美國專利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，可選擇標(biāo)記基因賦予宿主細(xì)胞對(duì)藥物的抗性，例如對(duì)G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性，宿主細(xì)胞中導(dǎo)入了載體。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于用氨甲蝶呤選擇/放大的dhfr-宿主細(xì)胞)和neo基因(用G418選擇)。
編碼Sp35多肽和抗Sp35抗體的核酸分子，以及包含這些核酸分子的載體用于合適的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化可以通過任何合適的方法進(jìn)行。用于將外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法在本領(lǐng)域是已知的，包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、polybrene介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、多核苷酸封裝在脂質(zhì)體中，和將DNA微注射到細(xì)胞核中。此外，通過病毒載體將核酸分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。
用適合于所采用的載體和宿主細(xì)胞的常規(guī)方法進(jìn)行宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。對(duì)于原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可采用電穿孔和鹽處理方法(Cohen等人，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692110-2114)。對(duì)于脊椎動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可以采用電穿孔、陽離子脂質(zhì)或鹽處理的方法。參見，例如Graham等人，1973，Virology 52456-467；Wigler等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761373-1376f。
在本領(lǐng)域，可獲得作為表達(dá)宿主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是已知的，包括許多可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的無限增殖的細(xì)胞系。這些細(xì)胞其中包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NSO、SP2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼兒倉鼠腎臟(BHK)細(xì)胞、猴腎臟細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，HepG2)、A549細(xì)胞和大量其它細(xì)胞系。
可以用已知方法來增強(qiáng)從產(chǎn)物細(xì)胞系中表達(dá)多肽。例如，谷氨酸合成酶(GS)系統(tǒng)通常被用于在一定條件下增強(qiáng)表達(dá)。參見，例如歐洲專利0216846、0256055和0323997和歐洲專利申請(qǐng)89303964.4。
宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞包括，但是不限于，酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(ATCC保藏號(hào)CCL61)、NIH Swiss小鼠胚胎細(xì)胞NIH-3T3(ATCC保藏號(hào)CRL1658)和幼兒倉鼠腎臟細(xì)胞(BHK)。其它有用的真核宿主細(xì)胞包括昆蟲細(xì)胞和植物細(xì)胞。示例性的原核宿主細(xì)胞為大腸桿菌和鏈霉菌。
制劑含有Sp35多肽、抗Sp35抗體或者抗Sp35抗體的抗原結(jié)合片段的組合物含有藥學(xué)上可接受的載體。例如，組合物可以含有賦形劑和/或佐劑，以有利于將活性化合物加工成適合向作用部位遞送的制劑。用于胃腸外施用的合適制劑包括水溶形式的活性化合物的水溶液，例如水溶性鹽。此外，可以施用作為合適的油性注射懸浮液的活性化合物的懸浮液。合適的親脂性溶劑或載體包括油脂，例如，芝麻油或者合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或者甘油三酯。水性注射懸浮液含有增加懸浮液粘性的物質(zhì)，包括，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖。可選擇地，懸浮液還含有穩(wěn)定劑。脂質(zhì)體可用于封裝本發(fā)明的分子，以遞送到細(xì)胞中或者胞間隙中。示例性的藥學(xué)上可接受的載體為生理相容的溶劑、分散介質(zhì)、包被物、抗菌劑和抗真菌劑、等滲試劑和延緩吸收試劑、水、鹽水、磷酸緩沖鹽溶液、葡聚糖、甘油和乙醇等。在一些實(shí)施方案中，組合物含有等滲試劑、例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。在一些實(shí)施方案中，組合物含有藥學(xué)上可接受的物質(zhì)如濕潤劑或少量的輔佐物質(zhì)如濕潤劑或乳化劑，防腐劑或緩沖液，延長了活性成分的保存期限或者提高效力。
本發(fā)明的組合物可以是各種形式的，包括，例如，液體(例如，可注射的和可灌注的溶液)、分散液、懸浮液、半固體和固體的劑量形式。優(yōu)選形式取決于施用的模式和治療性應(yīng)用的模式。
組合物可被配制成溶液、微乳化液、分散液、脂質(zhì)體或者其它適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)(ordered structure)。按照需要，將以所需量溶解在合適的溶劑中的活性成分與上面列舉的成分的一種或其組合相結(jié)合，接著通過過濾滅菌，制備無菌的注射液。通常，通過將活性成分納入到無菌載體中來制備分散體，所述無菌載體含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自上面列舉的那些的其它必需成分。對(duì)于用于制備無菌的可注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥，產(chǎn)生活性成分的粉末，加入到從先前的無菌過濾溶液中獲得的任何其它期望的成分。維持適當(dāng)?shù)娜芤毫鲃?dòng)性，例如使用包被，入卵磷脂，在為分散體的情形下維持期望的顆粒大小，和使用表面活性劑。在組合物中包括延長吸收的試劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，延長可注射的組合物的吸收。
活性成分與控制釋放制劑或裝置一起配制。這種制劑和裝置的例子包括埋植劑(implant)、經(jīng)皮貼片和微包囊的遞送系統(tǒng)。使用可生物降解的、生物相容性多聚體，例如，乙烯基醋酸乙酯、多元酸酐(polyanhydride)、聚乙二醇酸(polyglycolic acid)、膠原聚原酸酯和多聚乳酸。用于制備這種制劑和裝置的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson編輯，MarcelDekker，Inc.，紐約，1978。
通過在可生物降解的多聚體如聚交酯-聚乙醇的交酯中形成藥物的微包囊基質(zhì)，制備可注射的存儲(chǔ)制劑。根據(jù)藥物與多聚體的比例和所用的多聚體的性質(zhì)，可以控制藥物釋放的速度。其它的示例性可生物降解的多聚體為聚原酸酯(polyorthoester)和多元酸酐。將藥物裝載在脂質(zhì)體或者微乳劑中，制備可注射的存儲(chǔ)制劑。
將輔助的活性化合物結(jié)合到組合物中。在一些實(shí)施方案中，Sp35多肽、抗Sp35抗體或其片段與抗NgRl抗體，或其抗原結(jié)合片段，或可溶的NgRl多肽或者NgRl融合蛋白一起施用。
調(diào)整劑量方案，產(chǎn)生最佳的期望反應(yīng)。例如，施用單次大藥丸(bolus)給藥，在一段時(shí)期內(nèi)施用多個(gè)分開的劑量，或者可以根據(jù)治療情形的要求，按比例地減少或增加劑量。以容易施用和統(tǒng)一劑量地配制胃腸外組合物是有利的。參見，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，Easton，PA 1980)。
除了活性化合物，液體劑量形式含有惰性成分，如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油脂、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯。
基因治療在哺乳動(dòng)物體內(nèi)生成Sp35多肽，例如在人類患者中，采用基因治療方法來治療CNS疾病、異?；驌p傷，在該疾病、異常或損傷中，降低對(duì)軸突伸長的抑制在治療上是有益的。該方法包括施用被可操作地連接到合適的表達(dá)控制序列上的合適的表達(dá)Sp35多肽的核酸。優(yōu)選地，這些序列被結(jié)合到病毒性載體中。用于這種基因治療的合適病毒性載體包括腺病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、EB病毒載體、乳多空病毒載體、痘苗病毒載體、單純皰疹病毒載體和腺伴隨病毒(AAV)載體。病毒性載體可以是復(fù)制缺陷的病毒性載體。優(yōu)選的腺病毒載體缺失其E1基因或者E3基因。當(dāng)采用腺病毒載體時(shí)，優(yōu)選該哺乳動(dòng)物不暴露于編碼可選擇的標(biāo)記基因的核酸。
實(shí)施例通過如下實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例來闡明本發(fā)明。提供實(shí)施例，僅用于說明目的，而無論如何不被解釋為限制本發(fā)明的保護(hù)范圍或內(nèi)容。
實(shí)施例1Sp35的表達(dá)模式通過Northern印跡分析，評(píng)價(jià)Sp35在人組織中的表達(dá)。在68℃，含有12種人的主要組織或者14種人的CNS組織的多組織印跡與p32標(biāo)記的Sp35探針(Sp35cDNA序列的核苷酸150-450)雜交過夜。用2x SSC，0.5％SDS洗滌印跡3次，然后用0.5x SSC，0.1％SDS洗滌3次。然后將印跡曝光到X射線膠片上，通過自動(dòng)射線照相術(shù)顯示mRNA水平。
Sp35在人大腦中高度表達(dá)，但是在心臟、骨骼肌、結(jié)腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和外周血白細(xì)胞中，表達(dá)水平不高。在所有被檢測(cè)的大腦組織中，都表達(dá)Sp35，包括前皮層(frontal cortex)、后皮層(posterior cortex)、海馬、嗅球、紋狀體、丘腦、小腦、中腦、腦橋、延髓和脊髓。沿著喙/索軸(rostral/cordal axis)，觀察Sp35的基因表達(dá)梯度，最高表達(dá)水平在皮層，最低表達(dá)水平在脊髓。
采用免疫組織化學(xué)(IHC)染色，確定在特定大腦細(xì)胞中是否表達(dá)Sp35。按需要，將4％多聚甲醛固定的大鼠大腦、脊髓切片或者原代粒狀神經(jīng)元(granular neuron)培養(yǎng)物與第一Sp35抗體溫育，接著用偶聯(lián)到Alexa 480或590(Molecular Probes Inc.)上的第二抗體溫育。然后將切片裝載在Vectashield中，用熒光顯微鏡顯示。采用MorPhosys技術(shù)，從Fab噬菌體展示文庫中生成用于IHC的抗Sp35的特定抗體。
在神經(jīng)元和少突細(xì)胞中，特異性地表達(dá)Sp35，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)Sp35。這在用各種試劑對(duì)大鼠大腦組織切片染色的試驗(yàn)中被確定，這些試劑包括抗星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記GFAP、少突細(xì)胞標(biāo)記的抗體(O4)和對(duì)神經(jīng)元標(biāo)記βIII微管蛋白的抗體，都用抗Sp35抗體進(jìn)行復(fù)染。少突細(xì)胞和神經(jīng)元被抗Sp35抗體強(qiáng)烈地染色。而星形膠質(zhì)細(xì)胞未被染色。
作為一種不受約束的對(duì)Sp35的表達(dá)模式的證實(shí)，用mRNA進(jìn)行半定量的RT-PCR，mRNA從大鼠的純化星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突細(xì)胞和小腦粒狀神經(jīng)元的原代細(xì)胞培養(yǎng)物中提取得到(Ambion試劑盒)。采用正向引物AAGGCCCAGCAGGTGTTTGTGGA(SEQ ID NO14)和反向引物TACTCGATCTCGATGTTGTGCTTT(SEQ ID NO15)。進(jìn)行26個(gè)循環(huán)，在來自神經(jīng)元的mRNA中觀察到明顯的條帶，在少突細(xì)胞的mRNA中檢測(cè)到清楚但是較弱的信號(hào)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中未觀察到條帶。
實(shí)施例2Sp35-Fc融合蛋白為了研究Sp35的生物學(xué)功能，制備一個(gè)構(gòu)建體，將人Sp35的細(xì)胞外部分(殘基1-531)融合到人IgGl的鉸鏈區(qū)和Fc區(qū)上。采用正向引物5′CAGCAGGTCGACGCGGC CGCATGCTGGCGGGGGGCGT3′(SEQ ID NO16)和反向引物5′CAGCAGGTCGACCTCGCCCGGCTGGTTGG3′(SEQIDNO17)，通過PCR，從克隆227.2(Incyte)獲得人Sp35的部分編碼序列。
將平端PCR產(chǎn)物亞克隆到PCR SCRIPT AMP載體(Stratagene)的Srf I位點(diǎn)上，生成PCR SCRIPT AMP-sp35。從PCR SCRIPT AMP-sp35分離Sal I片段，亞克隆到PCRCAMP Ig載體中(Stratagene載體PCR SCRIPT AMP的衍生物，其中Fcγ序列作為SalI(5′)亞克隆到NotI(3′)的片段)，在讀框內(nèi)，將Sp35信號(hào)序列和外結(jié)構(gòu)域序列(密碼子1-531)與編碼人Igl的鉸鏈區(qū)和Fc區(qū)的序列融合。鑒定正確的分離物，將包括Sp35Fc片段的Not I片段亞克隆到293E表達(dá)載體CH274的單一克隆Not I位點(diǎn)上，所述CH274是商業(yè)表達(dá)載體REP4(Invitrogen)的衍生物。新載體CH274/sp35-Fc編碼的Sp35-Fc融合物通過DNA測(cè)序被確定為質(zhì)粒GT123。
用質(zhì)粒GT123通過電穿孔CHO宿主細(xì)胞DG44，生成表達(dá)Sp35-Fc融合蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系。在存在10％的透析血清和4mM谷氨酰胺時(shí)，將被轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞培養(yǎng)在alpha minus MEM中，選擇不依賴于核苷的生長。在轉(zhuǎn)染后14天，往細(xì)胞中加入新鮮的培養(yǎng)基。為了篩選表達(dá)Sp35-Fc的細(xì)胞，用藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的山羊抗人IgG(Jackson Labs)來標(biāo)記CHO細(xì)胞，在FACS Mo-Flo(Cytomation)中進(jìn)行高速流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。選擇表達(dá)最高水平的Sp35-Ig的細(xì)胞。在培養(yǎng)中擴(kuò)增這些細(xì)胞7天，然后再標(biāo)記和再計(jì)數(shù)。在96孔平板中，以單個(gè)克隆分離表達(dá)最高水平的Sp35-Ig的細(xì)胞。這些克隆生長兩周，然后在進(jìn)行FACS分析前的一天，加入新鮮的培養(yǎng)基，以檢測(cè)表達(dá)水平。擴(kuò)增表達(dá)最高水平的Sp35-Fc的克隆，建立冷凍細(xì)胞庫使該細(xì)胞適應(yīng)以懸浮形式在無血清培養(yǎng)基BCM16中生長。在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞系4-5代，以確定由這些克隆生成的Sp35-Fc的滴度，然后培養(yǎng)細(xì)胞到50％的最大細(xì)胞密度，在28℃培養(yǎng)細(xì)胞10-15天，直到活細(xì)胞密度降低到75％。此時(shí)，收集培養(yǎng)基，通過離心去除細(xì)胞和碎片，用抗人Ig抗體(Jackson Lab)作為探針，通過Western印跡滴定培養(yǎng)上清液的Sp35-Fc水平。
如下，從澄清的培養(yǎng)基中純化Sp35-Fc融合蛋白將9ml的1M HEPESpH7.5加入到900ml條件培養(yǎng)基中。在4℃，將培養(yǎng)基批量3小時(shí)加載到3ml的蛋白A瓊脂糖(Pharmacia)上。將該樹脂集中到1.5cm(I.D.)柱中，用3ml PBS洗滌四次，用4ml含有800mM NaCl的PBS洗滌2次，然后再用3mL PBS洗滌一次。用25mM NaH2PO4pH2.8，100mM NaCl以1.5mL級(jí)分洗脫Sp35-Fc，加入75μL的0.5M NaH2PO4pH8.6進(jìn)行中和。根據(jù)280nm的吸收值，確定含有峰值蛋白的級(jí)分，匯集，在1mL蛋白A柱中進(jìn)一步純化。在加載前，加入NaCl達(dá)600mM和加入HEPES pH7.5達(dá)50mM。柱用600μL的10mM HEPES pH7.5，1M NaCl洗滌兩次，然后用1mL PBS洗滌。用25mM NaH2PO4pH2.8，100mM NaCl從柱上洗脫Sp35-Fc，收集0.5mL級(jí)分，加入25μL的0.5MNaH2PO4pH8.6進(jìn)行中和。根據(jù)280nm的吸收值，確定含有峰值蛋白的級(jí)分，匯集。通過還原SDS-PAGE，Sp35-Ig以具有90kDa的表觀質(zhì)量的單一條帶(＞95％的純度)遷移。在非還原的條件下，蛋白質(zhì)以具有180kDa的表觀質(zhì)量的二聚物遷移。等分純化的Sp35-Fc并且存儲(chǔ)在-70℃下。GT123的Not I片段含有Sp35氨基酸1-531和人IgGlFc，被亞克隆到PV90載體的Not I位點(diǎn)上，產(chǎn)生DB002。
實(shí)施例3His-AP-Sp35融合蛋白為了研究和分離Sp35的受體，在COS7和CHO細(xì)胞中以His標(biāo)記的堿性磷酸酶(His-AP)融合蛋白表達(dá)Sp35。如下構(gòu)建質(zhì)粒用引物(正向)5′-AATTAAGAATTCACGGGCTGCCCGCCCCGCTGCGAGT-3′(SEQ IDNO18)，含有Eco RI切割位點(diǎn)(下劃線)和(反向)5′TATATTTCTAGATCACTCGCCCGGCTGGTTGGAGATGAAAGCGA-3′(SEQ ID NO19)，含有Xba I切割位點(diǎn)(下劃線)，PCR擴(kuò)增Sp35的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸34-532)。用XbaI切割PCR產(chǎn)物，生成的粘性末端用T4DNA聚合酶補(bǔ)平，然后用Eco RI消化，凝膠純化。將消化產(chǎn)物連接到來自His-AP-pcDNA 1.1載體(Invitrogen)的Hind III添加/EcoR I His-AP片段。用Hind III和Eco RI消化His-AP-Sp35片段，補(bǔ)平，然后連接到載體pV90中的Not I添加位點(diǎn)上。通過DNA測(cè)序來確認(rèn)插入物的DNA序列。
轉(zhuǎn)染的前一天，破裂COS7細(xì)胞。采用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(Invitrogen)，用His-AP-Sp35載體DNA(8μg)轉(zhuǎn)染5×106細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集條件培養(yǎng)基。
采用pV90質(zhì)粒，本發(fā)明人開發(fā)了表達(dá)His-AP-Sp35融合蛋白的CHO細(xì)胞系。用100μg質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)染CHO宿主細(xì)胞DG44(2×106個(gè)細(xì)胞)。存在10％的被透析血清和4mM谷氨酰胺時(shí)，在alpha minus MEM中培養(yǎng)細(xì)胞，選擇不依賴于核苷的生長。在轉(zhuǎn)染后14天，往細(xì)胞中加入新鮮的培養(yǎng)基，期望通過FACS Mo-Flo(Cytomation)計(jì)數(shù)進(jìn)行篩選。用抗人胎盤堿性磷酸酶(Sigma)的小鼠單克隆抗體8B6標(biāo)記被轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。用二抗體PE標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG產(chǎn)生特異于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的信號(hào)。在PE標(biāo)記后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高速流式細(xì)胞分選，選擇峰端的5％(the top 5％selected)。
為了用His-AP-Sp35制備條件培養(yǎng)基，選擇表達(dá)最高水平HIS-ApSp35的細(xì)胞。使細(xì)胞系適應(yīng)懸浮培養(yǎng)在無血清的培養(yǎng)基(BCM16)中。通過在37℃進(jìn)行4-5次傳代，然后培養(yǎng)細(xì)胞到50％的最大細(xì)胞密度，在28℃培養(yǎng)10-15天，直到活細(xì)胞濃度降低到75％，確定由這些克隆產(chǎn)生的His-AP-Sp35的滴度。收集培養(yǎng)基，通過離心去除細(xì)胞和碎片，用抗人AP抗體(Jackson Labs)作為探針，通過Western印跡滴定培養(yǎng)上清液中的His-AP-Sp35水平。
如下，從澄清的培養(yǎng)基中純化His-AP-Sp35用400mL水稀釋400mL來自表達(dá)His-AP-Sp35的CHO細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。加入0.5M的母液，使得三羥基乙基胺pH8.5到25mM，在4℃，將樣本批量加載到6ml的Fractogel TMAE(EM Industries)陰離子交換樹脂中2小時(shí)。將樹脂收集到1.5cm(I.D.)柱中，用6mL的10mM HEPES pH7.5，50mM NaCl洗滌兩次。用10mM HEPES pH7.5，200mM NaCl，將AP-Sp35洗脫到2mL的級(jí)分中。通過監(jiān)控AP活性和通過SDS-PAGE，確定峰值級(jí)分。來自TMAE柱的流下來的級(jí)分用300ml水進(jìn)一步稀釋，在4℃批量過夜加載到6ml的TMAE樹脂中。收集樹脂，并且如上所述進(jìn)行洗滌，用10mM HEPES pH7.5，150mMNaCl洗脫。再通過監(jiān)控AP活性和通過SDS-PAGE，確定峰值級(jí)分。來自第一柱的His-AP-Sp35的純度為50％，而來自第二柱的AP-Sp35的純度為90％。在還原條件下，His-AP-Sp35以130kDa的表觀質(zhì)量在SDS-PAGE凝膠上遷移。雖然90％純度物質(zhì)適合于大部分研究，對(duì)于某些研究，在Ni-NTA瓊脂糖樹脂(Qiagen)上進(jìn)一步純化His-AP-Sp35。往來自TMAE柱的洗脫級(jí)分中加入NaCl，達(dá)到800mM，而加入0.5M三羥基乙基胺pH.8.5和1M咪唑pH7.0，分別達(dá)到25mM和15mM。將4.5ml樣本加載到400μL NiNTA柱中。該柱用25mM三羥基乙基胺pH8.5，800mM NaCl，15mM咪唑洗滌三次，用200mM咪唑pH7.0，350mM NaCl，從該柱上洗脫His-AP-Sp35，收集200μL級(jí)分。收集含有峰值A(chǔ)P的級(jí)分，用250體積的10mM HEPES pH7.5，200mM NaCl透析過夜。加入MgCl2和ZnCl2，分別保持在2mM和0.25mM。通過SDS-PAGE，終產(chǎn)物的純度超過95％，在還原條件下，以具有約140kDa質(zhì)量的條帶遷移。
Sp35構(gòu)建體還被工程化為Fc融合物。通過PCR生成Sp-35LRR-Fc構(gòu)建體，采用引物(正向)5′CTTGACACGGGATCCGCGGCCGCATGCTGGCGGGGGGCGTGAGG3′(SEQ ID NO20)和(反向)5′GCAGCGGGGCGGGCAGCCCGTGGCCGAGCCTGACAGCACTGAGCC3′(SEQ ID NO21)。將PCR產(chǎn)物插入到PV90載體的NotI位點(diǎn)上。通過PCR生成Sp35IG-Fc構(gòu)建體，采用引物(正向)5′CTTGACACGGGATCCGCGGCCGCATGCTGGCGGGGGGC GTGAGG3′(SEQ ID NO22)和(反向)5′GTCCCGGATGCGGGCGCGGGCCGAGCCTGACAGCACTGAGCCCAG3′(SEQ ID NO23)。將PCR產(chǎn)物插入到PV90載體的NotI位點(diǎn)上。在CHO細(xì)胞中表達(dá)蛋白，用蛋白A瓊脂糖柱進(jìn)行純化。
實(shí)施例4Sp35結(jié)合到表達(dá)NgRl的細(xì)胞上四種不同方法用于證明Sp35結(jié)合到NgRl上。第一，在定向結(jié)合分析中檢測(cè)相互作用，在該分析中，用堿性磷酸酶-Sp35偶聯(lián)物(AP-Sp35)與表達(dá)NgRl的細(xì)胞一起培養(yǎng)，用顯色AP檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)結(jié)合。將90％匯合的COS7細(xì)胞培養(yǎng)在100mm組織培養(yǎng)皿中，采用Fugene 6試劑(Roche)，用表達(dá)NgRl的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，用HBH(Hank平衡鹽緩沖液，1mg/ml BSA，20mM HEPES，pH7.0)洗滌被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞一次，然后在23℃用溶解在HBH中的4μg/ml的AP-Sp35融合蛋白培養(yǎng)1.5小時(shí)。用冰冷的HBH洗滌細(xì)胞三次，每次3分鐘，然后用溶于20mM HEPES，pH7.0，150mM NaCl中的3.7％甲醛固定l5分鐘，再轉(zhuǎn)移到HBH緩沖液中。在67℃，熱滅活內(nèi)在的熱不穩(wěn)定AP。通過用硝基藍(lán)四唑NBT(Roche)溫育來檢測(cè)結(jié)合的AP-Sp35。Ap-Sp35結(jié)合到表達(dá)人NgRl受體的COS7的細(xì)胞上，但是不結(jié)合到僅用載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照COS7細(xì)胞上。觀察NgRl的點(diǎn)狀染色模式，表明僅一種級(jí)分，約50％細(xì)胞轉(zhuǎn)染了NgRl。
為了更好地量化結(jié)合，進(jìn)行相同試驗(yàn)，但是平行細(xì)胞樣本用8，4，2，1，0.5，0.125，0.06μg/ml的AP-Sp35處理。被結(jié)合的AP與4-磷酸硝基苯溫育，在96孔平板閱讀器(Molecular Devices)中評(píng)價(jià)AP活性。從這些數(shù)據(jù)可以估計(jì)，Ap-Sp35結(jié)合到人NgRl上的EC50約6nM。
第二，在ELISA方法中檢測(cè)Sp35結(jié)合到NgRl上。在37℃，用溶解在0.1M NaHCO3，pH9.0中的10μg/ml可溶性的NgRl-Fc受體(含有融合到大鼠IgGl鉸鏈區(qū)和Fc上的大鼠NgRl肽35-310的sNgR310-Fc和含有融合到大鼠IgGl上的大鼠NgRl肽35-344的sNgR344-Fc)包被ELISA平板(Costar)1小時(shí)。用25mM Hepes，pH7.0，0.1％BSA，0.1％卵清白蛋白，0.1％無脂奶粉和0.001％NaN3封閉和洗滌平板。將4μg/ml的AP-Sp35蛋白添加到平板上，4℃溫育過夜。然后用10mM Tris pH7.5，150mM NaCl洗滌平板，用稀釋在0.1M甘氨酸、1mM MgCl2、1mM ZnCl2pH10.5中的10μg/ml顯色底物4-磷酸硝基苯檢測(cè)結(jié)合的AP。在裝備有Softmax程序的ELISA閱讀器(MolecularDevices)中確定OD410。AP-Sp35結(jié)合到固定的sNgR-344-Fc上，但是未結(jié)合到sNgR-310-Fc蛋白上，表明較長的NgRl是Sp35競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所需的。通過用100倍過量的sNgR344-Fc預(yù)培養(yǎng)AP Sp35，可以使80％的AP-Sp35競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到sNgR344-Fc NgRl上。用猬-大鼠Igl融合蛋白作為大鼠Ig融合對(duì)照蛋白，未出現(xiàn)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。
第三，通過用NgRl免疫共沉淀Sp35，檢測(cè)Sp35結(jié)合到NgRl上。對(duì)于該研究，生長在100mm的組織培養(yǎng)皿上的80％匯合COS7細(xì)胞用編碼Sp35-血凝素(Sp35-HA)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用Fugene 6試劑(Roche)進(jìn)行NgR-FLAG，收集細(xì)胞，在4℃，在1ml的溶解緩沖液(50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，1.5mM MgCl2，1mM EGTA，1％Triton X-100和10％甘油)中溶解30分鐘。然后，以14,000xg離心溶解產(chǎn)物15分鐘，收集上清液，4℃攪拌培養(yǎng)過夜，使用抗HA親合基質(zhì)(Roche)。樣本用1ml溶解緩沖液洗滌3次，然后在Laemmli樣本緩沖液中沸騰3分鐘，進(jìn)行4-15％SDS-PAGE，用抗FLAG M2抗體(Sigma)，進(jìn)行免疫印跡分析?？笻A標(biāo)記親合樹脂收集含有Sp35-HA和FLAG-NgR的復(fù)合物，作為FLAG存在的證據(jù)。該復(fù)合物不存在于來自對(duì)照轉(zhuǎn)染的溶解產(chǎn)物中，在對(duì)照轉(zhuǎn)染中，細(xì)胞僅用Sp35-HA質(zhì)?；蛘逨LAG-NgRl質(zhì)粒處理，或者細(xì)胞用Flag-NgRI和HA標(biāo)記的對(duì)照蛋白共轉(zhuǎn)染，對(duì)照蛋白不結(jié)合NgRl。
如下制備Sp35-HA。PCR擴(kuò)增Sp35信號(hào)序列和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-531)，采用引物5′ATATTCTAGAATGCTGGCGGGGGGCGTGAG3′(SEQIDNO24)和5′ATATACTAGTGTCGTTGCCGCCCGCGTTGG3′(SEQID NO25)，含有XbaI和SpeI位點(diǎn)(下劃線)。PCR產(chǎn)物用XbaI和SpeI消化，被插入到載體pCGCHA中，在Xba I和Spe I位點(diǎn)之間。插入物的序列通過DNA測(cè)序確認(rèn)。FLAG NgRl構(gòu)建體由Zhigang He博士贈(zèng)送(Nature，420，2002年7月)。
第四，本發(fā)明人證明Ap-Sp35結(jié)合到表達(dá)NgRl的大鼠小腦粒狀神經(jīng)元(CGN)上。對(duì)于該試驗(yàn)，90％匯合的出生后8天的CGN細(xì)胞生長在100mm的組織培養(yǎng)皿上。48小時(shí)后，細(xì)胞用HBH緩沖液洗滌一次，然后在23℃，用溶解在HBH緩沖液中的4μg/ml的AP-Sp35培養(yǎng)1.5小時(shí)。細(xì)胞用冰冷的HBH洗滌3次，每次3分鐘，然后用溶解在20mM HEPES，pH7.0和150mMNaCl中的3.7％甲醛固定15分鐘，再轉(zhuǎn)移到HBH中。67℃下，熱滅活內(nèi)在的熱不穩(wěn)定AP 2小時(shí)。通過用硝基藍(lán)四唑NBT(Roche)溫育，檢測(cè)被結(jié)合的AP-Sp35。AP-Sp35結(jié)合到出生后8天的小腦粒狀神經(jīng)元上，該神經(jīng)元表達(dá)NgRl。用PIPLC(5單位/ml)處理CGN，抑制AP-Sp35結(jié)合到神經(jīng)元上，所述PIPLC從膜表面上斷裂大部分的GPI錨定蛋白。由于NgRl是連接GPI的蛋白，該結(jié)果進(jìn)一步證明了Sp35結(jié)合到位于CGN細(xì)胞上的NgRl上的觀點(diǎn)。
實(shí)施例5用NgRl共定位Sp35為了確定是否在同一神經(jīng)元上表達(dá)Sp35和NgRl，進(jìn)行共定位試驗(yàn)。4％多聚甲醛固定的大鼠p8原代粒狀神經(jīng)元培養(yǎng)物與抗Sp35和NgR1的抗體一起溫育(Santa Cruz)，然后與合適的Alexa標(biāo)記的第二抗體(MolecularProbesInc.)溫育。通過共聚焦熒光顯微鏡可視所述細(xì)胞。神經(jīng)元強(qiáng)烈地被Sp35和NgRl的抗體染色。神經(jīng)元的細(xì)胞體和軸突中表達(dá)這兩種蛋白。為了輔助共定位分析，對(duì)兩種類型的抗體采用不同的著色探針。當(dāng)染色(紅色為NgR陽性細(xì)胞，而綠色為Sp35陽性細(xì)胞)匯合時(shí)，在整個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)黃色，表明兩種蛋白共定位在神經(jīng)元內(nèi)。
實(shí)施例6Sp35中的NgRl結(jié)合位點(diǎn)采用缺失作圖來定義參與NgRl互作的Sp35的特定結(jié)構(gòu)域。用Stratagene Quikchange Mutagenesis試劑盒，制備缺失構(gòu)建體。通過對(duì)修飾的插入物進(jìn)行DNA測(cè)序，確認(rèn)所有的載體構(gòu)建體。
通過PCR，從His-AP-Sp35(氨基酸34-532)載體中克隆含有Sp35的富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域和堿性區(qū)(氨基酸34-432)的His-AP-Sp35b。所用的引物為5′CCCAGCAGGTGTTTGTGGACGAGTGATCTAGGGCCGCGGATCCCTG-3′(SEQ ID NO26)和5′-CAGGGATCCGCGGCCCTAGATCACTCGTCCACAAACACCTGCTGGG-3′(SEQ ID NO27)。
His-AP-Sp35d編碼Sp35的Ig結(jié)構(gòu)域和堿性區(qū)(氨基酸417-531)，是通過PCR，從His-AP-Sp35a(氨基酸37-531)載體克隆得到。所用引物為5′CGCCGCGCACCCGGGTGAATTCCGCGCCCGC ATCCGGGACCGC-3′(SEQ ID NO28)和5′-GCGGTCCCGGATGCGGGCGCGAATTCACCCGGGTGCGCGGCG-3′(SEQ ID NO29)。
His-AP-Sp35e僅編碼Ig結(jié)構(gòu)域(氨基酸425-531)，是通過PCR從His-AP-Sp35(氨基酸34-532)載體克隆得到。所用引物為5′-CGCCGCGCACCCGGGTGAATTCGCCCAGCAGGTGTTTGTGGAC-3′(SEQ ID NO30)和5′-GTCCACAAACACCTGCTGGGCGAATTCACCCGGGTGCGCGGCG-3′(SEQ ID NO31)。
用商業(yè)的誘變?cè)噭┖泻头桨?Stratagene Quikchange)，突變載體His-AP-Sp35(34-532)中的Sp35氨基酸456(由精氨酸變?yōu)楣劝彼?和氨基酸458(由組氨酸變?yōu)槔i氨酸)。所用的引物為5′-CATCCTCTGGCTCTCACCCGAAAAGGTACTGGTCTCAGCCAAGAGC-3′(SEQ ID NO32)和5′-GCTCTTGGCTGAGACCAGTACCTTTTCGGGTGAGAGCCAGA GGATG-3′(SEQ ID NO33)。
His-AP-Sp35缺失構(gòu)建體(附圖3)被工程化到pV90表達(dá)載體中，在293細(xì)胞中表達(dá)。收集條件培養(yǎng)基，通過連續(xù)的層析步驟，在Fractogel TMAE樹脂和NiNTA瓊脂糖中純化AP加合物。檢測(cè)純化的蛋白質(zhì)結(jié)合到COS7細(xì)胞上表達(dá)的NgRl上。三種構(gòu)建體都微弱地結(jié)合到Sp35上。這些結(jié)果表明，Sp35LRR的重復(fù)1-14(氨基酸34-417)和Sp35的Ig結(jié)構(gòu)域(氨基酸425-531)都對(duì)Sp35結(jié)合到NgRl上起作用。Ig結(jié)構(gòu)域具有高于LRR結(jié)構(gòu)域的親合性。
采用NCAM結(jié)晶結(jié)構(gòu)作為框架，生成Sp35的Ig結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型(Rasmussen等人，2000，Nat.Struct.Biol.7389-393)。從該模型，可以觀察到一個(gè)環(huán)(殘基編號(hào)454-458，氨基酸SPRKH；SEQ ID NO34)，該環(huán)可能參與結(jié)合。為了驗(yàn)證該假設(shè)，構(gòu)建Sp35構(gòu)建體，其中位置456的殘基R和位置458的殘基H分別被改變?yōu)镋和V。當(dāng)該構(gòu)建體檢測(cè)NgRl的結(jié)合時(shí)，觀察到信號(hào)降低超過10倍。作為檢測(cè)該環(huán)在結(jié)合中的作用的替代方法，假設(shè)一種肽對(duì)應(yīng)于序列LSPRKH(SEQ ID NO10)，通過在該肽的N和C末端添加半胱氨酸進(jìn)行環(huán)化。在結(jié)合到NgRl時(shí)，該肽阻斷、抑制和干擾NgRl功能。
實(shí)施例7Sp35誘導(dǎo)p8 CGN成束為了確定Sp35在神經(jīng)元中的生物學(xué)功能，將Sp35-Fc與出生后8天的粒狀神經(jīng)元一起培養(yǎng)，查看Sp35是否能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)突生成。在點(diǎn)樣Sp35-Fc蛋白(16μg/孔蛋白)之前，Labtek培養(yǎng)載玻片(8孔)用0.1mg/ml多聚D-賴氨酸(Sigma)包被。載玻片干燥過夜然后漂洗，用10μg/ml層粘連蛋白(Gibco)包被。分離出生后8天的小腦粒狀神經(jīng)元，種植到預(yù)包被的載玻片上。在37℃，在5％CO2中培養(yǎng)載玻片培養(yǎng)物24小時(shí)。然后，在含有20％蔗糖的4％多聚甲醛中固定該載玻片，用抗βIII微管蛋白(Covance TUJ1)染色。24小時(shí)后，CGN顯示出清楚的成束形態(tài)，作為神經(jīng)元成束的證據(jù)。在未被處理的細(xì)胞或者Fc蛋白包被的樣本對(duì)照中，未出現(xiàn)成束現(xiàn)象。
實(shí)施例8Sp35對(duì)RhoA活化/滅活的作用Sp35-Fc誘導(dǎo)出生后的小腦粒狀神經(jīng)元發(fā)生成束現(xiàn)象。由于已知信號(hào)分子RhoA參與成束現(xiàn)象，確定Sp35-Fc是否能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元中的RhoA的功能。如下進(jìn)行RhoA活化試驗(yàn)使用Fugene 6試劑(Roche)，用含有RhoA、Sp35或NgRl的組合的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或者COS7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，細(xì)胞在缺乏血清狀態(tài)下過夜，然后將細(xì)胞溶解在50mM Tris，pH7.5，1％Triton X-100，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，500mM NaCl，10mMMgCl2，加上蛋白酶抑制劑混合物中。通過在4℃，以13,000xg離心5分鐘，使細(xì)胞溶解產(chǎn)物澄清，95％上清液與20μg被固定的GST-Rho結(jié)合結(jié)構(gòu)域親合基質(zhì)(Rhotekin beads，Upstate Biotechnology)在4℃溫育45分鐘。用洗滌緩沖液(50mM Tris，pH7.5，1％ Triton X-100，150mM NaCl，10mMMgCl2，含有蛋白酶抑制劑)洗滌珠三次。通過在95℃，在SDS-PAGE樣本緩沖液中加熱，從珠上洗脫GTP結(jié)合Rho。用抗RhoA的單克隆抗體(Santa Cruz)，通過western印跡檢測(cè)被結(jié)合的總的Rho蛋白。用Sp35轉(zhuǎn)染的COS7和HEK293細(xì)胞誘導(dǎo)RhoA活化，作為用Sp35基因轉(zhuǎn)染后，在印跡中檢測(cè)到的RhoA-GTP的量增加的證據(jù)。用Sp35-Fc處理后，也觀察到RhoA-GTP進(jìn)一步增加。與僅用Sp35轉(zhuǎn)染后RhoA-GTP增加相反，當(dāng)細(xì)胞用Sp35和NgRl轉(zhuǎn)染時(shí)，RhoA被部分地滅活。用Sp35-Fc處理這些細(xì)胞，導(dǎo)致進(jìn)一步滅活RhoA。
用FLIPR分析(Molecular Devices)確認(rèn)由Sp35產(chǎn)生的信號(hào)反應(yīng)，確定Sp35處理對(duì)Ca++流的作用。在用Sp35-Fc處理的表達(dá)Sp35的細(xì)胞中，觀察到顯著的Ca++流，但是在用Sp35-Fc處理的對(duì)照細(xì)胞中，沒有觀察到該Ca++流。當(dāng)用NgRl和Sp35共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用Sp35-Fc融合蛋白處理時(shí)，Ca++流減弱。
實(shí)施例9Sp35蛋白與自身互作由于LRR結(jié)構(gòu)域常常參與同型互作，本發(fā)明人觀察到，將可溶的Sp35加入Sp35轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，會(huì)導(dǎo)致RhoA-GTP升高，超過在僅用Sp35轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到的結(jié)果，檢測(cè)Sp35結(jié)合到自身上。為了進(jìn)行該測(cè)試，采用共免疫沉淀方法。80％匯合的COS7細(xì)胞生長在100mm組織培養(yǎng)皿中，用質(zhì)粒Sp35HA或Sp35-FLAG，或者兩者進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用Fugene 6試劑(Roche)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集細(xì)胞，4℃，將細(xì)胞溶解在緩沖液中(50mMHEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1.5mM MgCl2，1mM EGTA，1％Triton X-100和10％甘油)30分鐘。然后以14,000xg離心溶解產(chǎn)物15分鐘，收集上清液并用抗HA親合基質(zhì)(Roche)溫育，4℃攪拌過夜。然后用1ml溶解緩沖液洗滌樣本三次，在Laemmli樣本緩沖液中沸騰，進(jìn)行4-15％SDS-PAGE，用抗FLAG抗體通過免疫印跡進(jìn)行分析?？笻A抗體樹脂捕獲一種含有Sp35-FLAG的復(fù)合物，通過Western印跡確定。這表明Sp35與自身直接相互作用。還用Sp35-Fc處理用HA-Sp35轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，采用類似的免疫沉淀方法來證明，HA-Sp35結(jié)合到Sp35-Fc上。
如下制備Sp35-FLAG。PCR擴(kuò)增Sp35基因細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-531)，使用引物5′AATTAAGCGGCCGCATGCTGGCG GGGGGCGT3′(SEQID NO35)和5′AATTAAGCGGCCGCTTTGTCATGT′3(SEQ ID NO36)，含有NotI位點(diǎn)(下劃線)。用NotI消化PCR產(chǎn)物，插入到載體pV90的NotI位點(diǎn)上。通過DNA測(cè)序來證實(shí)插入物的DNA序列。
實(shí)施例10Sp35轉(zhuǎn)化細(xì)胞的體內(nèi)移植為了確定Sp35在脊髓損傷大鼠中的生物學(xué)功能，用表達(dá)全長Sp35的逆轉(zhuǎn)錄病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)照來感染皮層原代培養(yǎng)細(xì)胞(混合培養(yǎng)物)，用于遞送到大鼠脊髓的損傷中心中。導(dǎo)入2×106細(xì)胞，在第10天處死大鼠。將脊髓在4％多聚甲醛中固定過夜，然后在70％乙醇中脫水，接著在95％ETOH中脫水。將組織樣本包埋在石蠟中。切片(10微米厚度)用于免疫組化染色。與對(duì)照相比，接受表達(dá)Sp35的細(xì)胞的大鼠表現(xiàn)出較少的軸突回縮，在損傷中心具有較多的βIII微管蛋白染色。在接受Sp35的受損大鼠中，存活的神經(jīng)元增加。
如下制備Sp35逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體PCR擴(kuò)增Sp35基因，采用引物5′-GATTACTCGAGATGCTGGCGGGGGGCGT GAGG-3′(SEQ ID NO37)，含有XhoI位點(diǎn)(下劃線)和5′CGCGGGAATTCTCATATCATCTTCATGTTGAACTTG-3′(SEQ ID NO38)，含有EcoRI位點(diǎn)(下劃線)。PCR產(chǎn)物用XhoI和EcoRI消化，然后連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMIG(含有IRES-GFP)上，該載體預(yù)先用XhoI和EcoRI斷裂。新載體命名為pMMC078。pMMC078的所有分離物中含有意外的點(diǎn)突變，所以將pMMC078的兩個(gè)分離物連接在一起。pMMC078.6用XhoI和AccI切割，pMMC078.7用XhoI和AccI切割。將這兩個(gè)片段連接在一起，制備最終的正確質(zhì)粒pMMC089。通過DNA測(cè)序來確認(rèn)插入物的DNA序列。如所述制備Sp35逆轉(zhuǎn)錄病毒。轉(zhuǎn)染前的一天，破裂293G細(xì)胞。通過脂轉(zhuǎn)染胺(Invitrogen)，用8μg Sp35逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA轉(zhuǎn)染5×106細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后92小時(shí)，收集條件培養(yǎng)基。以5000g離心條件培養(yǎng)基10分鐘，上清液用作Sp35逆轉(zhuǎn)錄病毒母液。該母液在4℃存儲(chǔ)1周，或在-80℃存儲(chǔ)6個(gè)月。
實(shí)施例11脊髓損傷的動(dòng)物模型所有手術(shù)操作采用無菌技術(shù)進(jìn)行。在進(jìn)行任何手術(shù)操作的前1周，處理動(dòng)物。手術(shù)前后，預(yù)防性施用氨卡青霉素100mg/kg SC，降低膀胱感染損傷的發(fā)生率。
采用IP注射2.5mg/kg的Midazolam來麻醉動(dòng)物，結(jié)合溶于氧氣中的2-3％Isoflurane進(jìn)行深度麻醉，通過腳趾收縮來確定。在手術(shù)和蘇醒過程中，將動(dòng)物保持在循環(huán)水加熱墊上。用眼潤滑劑防止角膜干燥，SC給予0.05mg/kg阿托品以減少唾液過度分泌。在皮膚上切一小口，肌肉回縮，暴露脊骨。在脊髓水平L6(和如果需要放置鞘內(nèi)導(dǎo)管，則為L7，參見下文)進(jìn)行背部椎板切除術(shù)，將L6/L7和相連的棘突緊緊地固定在脊椎框架上(DavidKopfInstruments)。使用精細(xì)的虹膜切除剪，在L6上進(jìn)行背部半切術(shù)，完全切斷主要的背內(nèi)側(cè)(dorsomedial)和次要的背側(cè)(dorsolateral)的皮質(zhì)脊髓束(CST)成分。手術(shù)后，椎板切除部位覆蓋保護(hù)性物質(zhì)，例如Durafilm，和重疊的肌肉用4.0鉻絲(chromic gut)縫合以保護(hù)暴露的脊柱?？p合皮膚，用碘酊(betadine)溶液擦拭。
動(dòng)物IS的功能恢復(fù)，采用Basso Beattie和Bresnehan(BBB)評(píng)分方法來評(píng)價(jià)，該方法通常被用于評(píng)價(jià)脊髓損傷后的大鼠。該方法通過仔細(xì)分析關(guān)節(jié)活動(dòng)和承重能力，量化大鼠的后腿功能。在脊髓損傷后的第一天和此后每周，對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)。
在CST橫斷后，立即將表達(dá)Sp35或GFP的腺病毒或者對(duì)照病毒(1010個(gè))注射到橫斷部位以及緊鄰損傷部位的尾端(caudal)和吻端(rostral)的區(qū)域上?？偣矊?Oμl的Adv注射到5個(gè)不同部位上(4μl/部位)。對(duì)于鞘內(nèi)施用Sp35蛋白，在損傷L7的尾部2mm的脊索硬脊膜上作一個(gè)小洞，將鞘內(nèi)導(dǎo)管插入到L7處的蛛網(wǎng)膜下腔中。導(dǎo)管緩慢和輕輕地滑到脊索上方，在近損傷尾部的1mm處。位于鞘內(nèi)間隙外的導(dǎo)管的部分被緊緊縫合到環(huán)繞組織的位置中。預(yù)先制備的小型滲透泵(Alza corp.)含有測(cè)試物質(zhì)(Sp35蛋白或者對(duì)照蛋白)，被連接到暴露的導(dǎo)管末端上，插入到皮下空間中。手術(shù)后，椎板切除部位覆蓋保護(hù)性物質(zhì)，例如Durafilm，和重疊的肌肉用4.0鉻絲縫合以保護(hù)暴露的脊柱?？p合皮膚，用碘酊溶液擦拭。
組織分析在手術(shù)時(shí)進(jìn)行管道追蹤手術(shù)，以誘導(dǎo)脊髓損傷。剃除頭部皮膚的毛發(fā)，用碘酊和70％酒精擦拭。將動(dòng)物放置到立體定位框架中?？v向切割頭皮，從顱頂刮掉骨膜。在頭骨上鉆一個(gè)直徑約1-2mm的孔，和將玻璃的微升針頭垂直地插到運(yùn)動(dòng)皮層的位置8上(按照Paxinos和Waston，1997的大鼠大腦寰椎確定的坐標(biāo))。注射大約5μl管道追蹤物質(zhì)(例如，生物素葡聚糖胺，10,000M.Wt)，將針頭在該位置上再放置5分鐘，使溶液擴(kuò)散。在取出針頭后，腦殼上的洞用凝膠泡沫塞緊，關(guān)閉損傷部位上的頭皮。使動(dòng)物復(fù)原，并進(jìn)行手術(shù)后的護(hù)理(如下描述)。4-10周后，深度麻醉動(dòng)物(Inactin 100-110mg/kg ip)，如下描述進(jìn)行組織學(xué)灌注。通過順向傳輸機(jī)制，從皮層脊束到脊髓的尾部，進(jìn)行管道追蹤，提供量化皮層脊束內(nèi)的解剖學(xué)連通的手段。
對(duì)于免疫組織化學(xué)試驗(yàn)，手術(shù)后2-8周，用Inactin(100-110mg/kg IP)進(jìn)行深度麻醉，誘導(dǎo)損傷。打開胸腔，暴露心臟，進(jìn)行灌注。將套管插入左心室中，通過該套管將100cc冰冷的PBS緩慢推入心室中(在右心室切個(gè)口，讓液體溢出)。接著緩慢但是穩(wěn)定地滴加4％多聚甲醛(50-100ml)，直到眼睛/耳朵/腳趾的固定。去除脊髓，小心使損傷部位的改變最小化，在OCT中冷凍，切片，和處理進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。其它組織也被可選擇地收集，用于后面的分析。接受腺病毒Sp35的動(dòng)物表現(xiàn)出軸突萌發(fā)增強(qiáng)，通過用βIII微管蛋白染色神經(jīng)元軸突來確定。
實(shí)施例12Sp-35病毒載體構(gòu)建體如下制備pMIG來源的Sp-35病毒載體。PCR擴(kuò)增全長的Sp35編碼序列PCR，采用引物5′-GATTACTCGAGA TGCTGGCGGGGGGCGTGAGG-3′(SEQ ID NO37)，含有XhoI位點(diǎn)，和5′CGCGGGAATTCTCATATCATCTTCATGTTGAACTTG-3′(SEQ ID NO38)，含有EcoRI位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物用XhoI和EcoRI切割，然后連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMIG上(Cheng等人，1996，Nat.Biotechnol.145576)，該載體用Xhol和EcoRI切割。該載體被命名為pMMC078。pMMC078的所有分離物含有點(diǎn)突變，所以將pMMC078的兩個(gè)分離物連接在一起。載體pMMC078.6用XhoI和AccI切割，而pMMC078.7用XhoI和AccI切割。連接這兩個(gè)片段，制備質(zhì)粒pMMC089。
如下制備pMIG來源的Sp35-HA病毒載體。采用PCR獲得編碼Sp35氨基酸326-614的片段，該片段與HA序列在一個(gè)讀框內(nèi)，采用引物5′-GCCTTCCGCGGCCTCAACTACCTGCGCGTG CTC-3′(SEQ ID NO39)，含有SacII位點(diǎn)，和5′-CCGGAATTCTCAAGCGTAATCAGGAACGTCGTAAGGGTATATCATCTTCAT′GTTGAACTTGCG GGGCGCGTCGGC-3′(SEQ ID NO40)，pMMC089作為模板。較長的引物包括在Sp35密碼子614之后和在EcoR I位點(diǎn)之前的HA編碼序列(斜體)。然后PCR產(chǎn)物用Sac II和EcoRI切割，和用于置換pMIG來源的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的SacII-EcoR I片段，該片段含有野生型Sp35密碼子326-614。
如下制備Sp35桿狀病毒HA載體。來自Sp35-HA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的Sp35-HA編碼序列用Xho I和EcoRI切出，補(bǔ)平末端，克隆到桿狀病毒穿梭載體pBV-CZPG(美國專利6,190,887和6,338,953)的Bgl2插入位點(diǎn)上，替換CMV控制下的LacZ基因。
如下制備Sp35腺病毒載體。來自Sp35逆轉(zhuǎn)錄病毒的Sp35-IRES-GFP編碼序列用Xho I-填充和Nhe I切割，然后克隆到在最小CMV啟動(dòng)子的控制下的腺病毒穿梭載體pDC315的EcoRl-填充/Nhe I位點(diǎn)上。
實(shí)施例13髓鞘再形成的動(dòng)物模型在所有研究中使用Long Evans雌性大鼠。用異氟烷麻醉大鼠，T3/4暴露，進(jìn)行背部半椎板切除術(shù)?；瘜W(xué)脫髓鞘試劑溶血卵磷脂(將3μl的1％溶血卵磷脂溶解在0.9％鹽水中)，然后注射到脊髓的背部脊柱的右側(cè)，脊索表面下方0.5-1mm處)。在手術(shù)前后進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹雇刺幚怼?br> 3天后，再次暴露注射部位(在異氟烷麻醉下，進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹雇刺幚?，將如下的治療劑注射到受損的脊髓中，將編碼蛋白Sp35/對(duì)照蛋白的腺病毒載體注射到損傷部位上。將體積10μl的1010個(gè)編碼Sp35或者GFP對(duì)照的腺病毒顆粒注射到受損大鼠脊髓中，在溶血卵磷脂誘導(dǎo)的脫髓鞘部位和其周圍達(dá)5個(gè)不同部位上。在5個(gè)注射部位的各個(gè)部位上注射不超過2μl的體積。對(duì)于在手術(shù)后2、3、4或6周組織分析脊髓的脫髓鞘/再形成髓鞘，用inactin(100-110mg/kg ip)深度麻醉動(dòng)物，通過心臟灌注固定液。然后去除脊髓，進(jìn)行處理，用于分析。采用抗MBP蛋白的抗體或者luxol堅(jiān)藍(lán)(luxol fastblue)，通過IHC確定接受Sp35處理的動(dòng)物表現(xiàn)出軸突髓鞘形成加強(qiáng)。
實(shí)施例14Sp35RNAi為了證明Sp35在大腦功能中的作用，本發(fā)明人將慢病毒Sp35RNAi導(dǎo)入出生后的8CGN細(xì)胞中。Sp35RNAi感染的細(xì)胞具有較短的神經(jīng)突，和高于對(duì)照細(xì)胞的擴(kuò)增率。這些結(jié)果說明了Sp35在調(diào)節(jié)RhoA活化中的作用。
比較小鼠和大鼠Sp35DNA序列，發(fā)現(xiàn)用于候選shRNA的同源區(qū)。通過退火寡核苷酸LV1-035和LV1-036，并連接到Hpal和Xho1消化的pLL3.7上，構(gòu)建CH324。寡核苷酸購自MWG。序列為LV1-035(有義寡核苷酸)5′TGATCGTCATCCTGCTAGACTTCAAGAGAGTCTAGCAGGATGACGATCTTTTTTC(SEQ ID NO41)LV1-036(反義寡核苷酸)5′TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACTCTCTTGAAGTCTAGCAGGATGACGATCA(SEQ ID NO42)。
在制備病毒之前，用來自pLL3.7的DNA或者pLL3.7中的候選shRNA與小鼠SP35-HA標(biāo)記質(zhì)粒以5∶1的比例共轉(zhuǎn)染6孔平板中的CHO細(xì)胞中。通過western印跡檢測(cè)來自被轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的溶解產(chǎn)物的SP35-HA標(biāo)記，和通過northern印跡檢測(cè)從重復(fù)孔制備的總RNA，分析敲除。印跡用0.7kb的mSP35片段進(jìn)行探查。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)進(jìn)行分析(數(shù)據(jù)未顯示)。從最好的候選物中制備病毒，用于大鼠神經(jīng)元培養(yǎng)。載體，其它方法和病毒生產(chǎn)被描述在Rubinson等″A lentivirus-based system to functionally silence genes inprimary mammalian cell，stem cell and transgenic mice by RNAinterference.″Nat.Genet.33,401-6(2003)。
實(shí)施例15RhoA活化共表達(dá)NgRl和SP35的COS7細(xì)胞在對(duì)Omgp反應(yīng)時(shí)，沒有表現(xiàn)出RhoA/GTP水平的變化。這表明SP35/NgRl復(fù)合物不足以通過髓磷脂抑制劑來調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)。
本發(fā)明研究了SP35/NgRl/p75的三重復(fù)合物調(diào)節(jié)信號(hào)發(fā)送的可能性。用兩種方法評(píng)價(jià)SP35，NgRl和p75之間的相互作用。第一，在直接結(jié)合分析中，用AP-SP35偶聯(lián)物評(píng)價(jià)結(jié)合。AP-SP35偶聯(lián)物微弱地結(jié)合到表達(dá)p75的細(xì)胞上。AP-P75結(jié)合到表達(dá)NgRl的細(xì)胞上。通過ELISA測(cè)量AP-SP35結(jié)合到NgRl和p75(附圖4)。第二，通過免疫共沉淀共表達(dá)SP35NgRl和p75的COS7細(xì)胞，來評(píng)價(jià)SP35結(jié)合到NgRl和p75上?？筃gRl抗體免疫沉淀含有SP35和p75的復(fù)合物。抗SP35抗體也免疫沉淀含有p75的復(fù)合物。相互作用和共免疫沉淀的數(shù)據(jù)提供了SP35，NgRI和p75之間直接相互作用的證據(jù)。本發(fā)明人用共聚焦顯微鏡和抗SP35，p75和NgRl的抗體，來證明SP35，NgRl和p75共定位到細(xì)胞體和來自大鼠的p7CG神經(jīng)元的軸突上。
接著，本發(fā)明人證明SP35，NgRl和p75的組合對(duì)于髓磷脂抑制劑的活性是足夠的。工程化非神經(jīng)元的COS7細(xì)胞來表達(dá)所有三種成分。使用這些細(xì)胞，本發(fā)明人證明RhoA/GTP水平被OMgp上調(diào)。與這三種成分的其它組合相比，OMgp-Fc處理提高共表達(dá)SP35/p75/NgRl的細(xì)胞中的RhoA/GTP水平。通過COS7細(xì)胞溶解產(chǎn)物的Western印跡，本發(fā)明人證明蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)合到NgRl上的髓磷脂抑制劑的親合性不受p75或p75和SP35存在的影響。組合結(jié)果支持一種模式，其中在存在NgRI配體時(shí)，NgRl，SP35和p75的三重復(fù)合物是RhoA調(diào)節(jié)所需的(附圖5)。
SP35含有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可能直接或間接地參與信號(hào)發(fā)送。為了確定胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的作用，本發(fā)明人制備了SP35的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域截?cái)辔?SEQID NO2的氨基酸34-576)，通過形成不能進(jìn)行信號(hào)發(fā)送的無用三重復(fù)合物，以顯性失活的方式起作用。本發(fā)明人將這種具有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域截?cái)嗟姆肿臃Q作為″DN-SP35″(為顯性失活SP35)。用全長的SP35或者DN-SP35轉(zhuǎn)染出生后7天的(p7)CG神經(jīng)元，然后分析對(duì)抑制劑髓磷脂成分(Omgp，髓磷脂和Nogo66)的反應(yīng)。如附圖6中所示，DN-SP35轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不能對(duì)抑制劑髓磷脂成分反應(yīng)，具有比對(duì)照更長的神經(jīng)突。相反，用全長SP35構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)抑制性物質(zhì)的反應(yīng)增強(qiáng)，與比對(duì)相比，具有更短的神經(jīng)突。這證明DN-SP35作為競(jìng)爭(zhēng)者，消弱由髓磷脂成分引起的神經(jīng)突生成的抑制，期望外源的、可溶SP35-Fc也會(huì)結(jié)合NgRl，并阻斷抑制物質(zhì)的作用。如附圖7中所示，SP35-Fc降低由Omgp，Nogo66和MAG引起的對(duì)神經(jīng)突生成的抑制。
實(shí)施例16神經(jīng)保護(hù)活性在存在或缺乏50nM的sp35-Fc蛋白時(shí)，將等量的大鼠p6小腦粒細(xì)胞神經(jīng)元種植在12孔細(xì)胞培養(yǎng)平板的各個(gè)孔中。這些多聚D-賴氨酸平板已經(jīng)用10μg的CNS髓磷脂或者200ng的Nogo66、MAG和Omgp或者對(duì)照Fc進(jìn)行預(yù)包被[干燥]。在37℃和5％CO2環(huán)境下維持神經(jīng)元培養(yǎng)物1-7天。在獨(dú)立于sp35-Fc處理的PBS對(duì)照孔中，神經(jīng)元是健康的，并且生長良好，3天后檢查，神經(jīng)突完全延長[通過神經(jīng)元特異性標(biāo)記βIII微管蛋白確定]。缺乏sp35-Fc時(shí)，在用髓磷脂、Nogo66、MAG和OMgp包被的孔中，神經(jīng)元未能充分地生長。神經(jīng)突萌發(fā)最小[短而且歪曲]，而且神經(jīng)元看上去不健康，具有圓形的細(xì)胞體和濃縮的核物質(zhì)。DAPI染色證明，在這些孔中檢測(cè)到的神經(jīng)元的數(shù)量少于PBS對(duì)照孔中的數(shù)量，表明神經(jīng)元損失。在存在sp35-Fc時(shí)，出現(xiàn)長的神經(jīng)突，神經(jīng)元表現(xiàn)健康。DAPI染色證明，這些孔中具有多于未接受sp35-Fc的孔中的神經(jīng)元數(shù)量。該數(shù)據(jù)被總結(jié)在如下的表2中。
表2


這些數(shù)據(jù)表明，可溶性的Sp35，例如Sp35-Fc，具有神經(jīng)保護(hù)活性。
在脊髓半切(T9，SCT)大鼠中，βIII微管蛋白染色脊髓切片表明，在病灶部位神經(jīng)元真正減少了。用表達(dá)sp35的重組病毒在病灶部位感染SCT動(dòng)物。這些脊髓的組織染色表明，與用載體病毒感染的對(duì)照組相比，病灶部位的神經(jīng)元數(shù)量增加。這與上述體外試驗(yàn)結(jié)果是一致的，并且進(jìn)一步說明了與Sp35相關(guān)的神經(jīng)保護(hù)特性。
實(shí)施例17脊髓損傷的動(dòng)物模型中的Sp35由于Sp35-Fc降低了體外由OMgp，Nogo-66和MAG引起的對(duì)神經(jīng)突的生長抑制作用，本發(fā)明人期望該分子在體內(nèi)促進(jìn)CNS損傷的功能性恢復(fù)。為了證實(shí)這一點(diǎn)，本發(fā)明人將Sp35-Fc施用給脊髓半切大鼠，即，急性CNS損傷動(dòng)物模型。如附圖8和附圖9中所示，與用IgG處理的對(duì)照大鼠相比，Sp35-Fc處理的大鼠顯著促進(jìn)功能的恢復(fù)。
脊髓損傷和行為分析按如下進(jìn)行。所有的手術(shù)操作按照BiogenInstitutional Animal Use and Care Committee的指南進(jìn)行。雌性Long Evans大鼠(190-210g，Charles River，Wilmington，MA)用2.5mg/kg Midazolam，I.P和溶于O2中的2-3％氟烷麻醉。在脊髓水平T6和T7上進(jìn)行背部椎板切除。進(jìn)行背部半切，完全切斷主要的背中和小部分的背側(cè)皮層脊髓束(CST)組分。在CST橫斷后，立即將鞘內(nèi)導(dǎo)管插入到T7處的蛛網(wǎng)膜下隙中，連接到預(yù)先制備好的小型滲透泵(Alzet型號(hào)2004)上，該泵插入到皮下間隙中。小型滲透泵以0.25μl/h的流速，遞送Hu IgG同種型對(duì)照蛋白(5mg/ml，n＝5，Pharmingen)，PBS(n＝3)可溶的Hu Sp35-Ig融合蛋白(4.3mg/ml，n＝8)。手術(shù)后，縫合椎板切除部位，關(guān)閉損傷的皮膚。手術(shù)后的護(hù)理包括手術(shù)后止痛3天(Buprenorphine 0.05mg/kg s.c.)和抗生素處理(每天兩次氨卡青霉素100mg/kg s.c.)7天。在試驗(yàn)過程中(28天)，或者持續(xù)到功能恢復(fù)(該時(shí)間被記錄)，每天人為按摩膀胱兩次。用open-field BBB評(píng)分體系(Basso等人，1995，J.Neurotrauma 121-21；Ono等人，2003，J.Neurosci.235887-5896)，對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)打分。在CST橫斷后的第二天(第2天)和此后4周的每周1次評(píng)價(jià)大鼠，采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(locomotor rating scale)。在試驗(yàn)過程中，調(diào)查人并不清楚各個(gè)處理組。
實(shí)施例18紅核脊束(RST)半切損傷模型中的神經(jīng)元存活和軸突再生本發(fā)明人還研究了Sp35處理對(duì)紅核脊髓束中的神經(jīng)元再生的作用，紅核脊髓束直接對(duì)運(yùn)動(dòng)起作用。
腹腔內(nèi)注射克他命(ketamine)(80mg/kg)和甲苯噻嗪(xylazine)(8mg/kg)來麻醉成年的9周齡Sprague-Dawley大鼠(200-250g)。在操作顯微鏡下，進(jìn)行背部椎板切除手術(shù)，確定第7胸椎骨(C7)。在打開硬腦脊膜后，用彈簧剪，在脊髓高度C7上進(jìn)行右側(cè)半切。在進(jìn)行脊髓半切后，給動(dòng)物施用一塊浸潤了10μl的2μg/ml Sp35-Fc溶液或者10μl的2μg/ml的人Ig溶液或者10μlPBS，放置在病灶部位上。手術(shù)操作后，各組中的動(dòng)物再細(xì)分為軸突追蹤和行為分析。用于軸突追蹤(各組n＝5)和行為分析(各組n＝7)的動(dòng)物允許存活1個(gè)月。
用氟-金(FG，6％w/v，熒光染料)標(biāo)記RST神經(jīng)元，該神經(jīng)元在損傷疤痕上具有再生軸突，再伸入近尾部脊髓。在損傷后存活期(1個(gè)月)末前的兩天，用腹膜內(nèi)注射可他命(80mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)來麻醉動(dòng)物。進(jìn)行背部椎板切除，確定T2脊髓節(jié)段。使用Hamilton注射器，人為地將體積0.5ml的FG注射到右側(cè)T2脊髓中。兩天后，用致死量的克他命(150mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)麻醉和處死動(dòng)物，心內(nèi)灌注常規(guī)的鹽水，接著為400ml溶于0.1x PBS中的含有4％多聚甲醛的固定劑。取出大腦和脊髓，用多聚甲醛后固定過夜，然后放置在30％磷酸緩沖蔗糖溶液中。在冷凍切片機(jī)上，將大腦和脊髓組織切成30mm的切片，并固定到明膠包被的載玻片上。
病灶側(cè)的FG標(biāo)記的RST神經(jīng)元的數(shù)量表示為完整對(duì)側(cè)的FG標(biāo)記的神經(jīng)元總數(shù)的百分比。用單因子(one-way)ANOVA，接著通過Tukey-Kramer多重比較檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)比較各組間的所述百分比。如表3中所示，2μg/ml的Sp35-Fc促進(jìn)紅核脊束(RST)神經(jīng)元的存活。
表3

對(duì)于行為分析，在進(jìn)行不同處理后的1個(gè)月，在自發(fā)性垂直探查中，如(Liu等人，1999)所述，并稍作修改，對(duì)前肢進(jìn)行檢查。將大鼠放置在清潔的樹脂玻璃(Plexiglas)圓筒中(直徑15cm，高30cm)，該圓筒使得前肢可以進(jìn)行5分鐘的垂直探查。對(duì)如下行為打分(1)獨(dú)立使用左前肢(未受損)或者右前肢(損傷)接觸圓筒壁；和(2)同時(shí)使用兩前肢接觸圓筒壁。垂直探查行為被表示為(1)相對(duì)于使用損傷肢體、未受損肢體和前后肢的總次數(shù)，使用左(未受損)前肢的百分?jǐn)?shù)；(2)相對(duì)于使用損傷肢體、未受損肢體和前后肢的總次數(shù)，使用右(受損)前肢的比例；和(3)相對(duì)于使用損傷肢體、未受損肢體和前后肢的總次數(shù)，使用兩前肢的百分比。用單因子ANOVA檢測(cè)組間差異，接著進(jìn)行Bonferroni后hoc分析(Bonferroni post hocanalysis)。Sp35-Fc處理的動(dòng)物的前肢運(yùn)動(dòng)顯著改進(jìn)Sp35-1-Fc處理的動(dòng)物利用兩前肢達(dá)到30％，而對(duì)照Fc或PBS處理的動(dòng)物兩前肢的利用為10％；利用左肢(未受損)為55％，而對(duì)照Fc或PBS處理的動(dòng)物為80％；利用右肢(受損)為29％，而對(duì)照Fc或PBS處理的動(dòng)物約為15％。
實(shí)施例19Sp35-Fc促進(jìn)視神經(jīng)橫斷模型中的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的存活用視神經(jīng)橫斷模型進(jìn)一步驗(yàn)證的Sp35活性，研究作用于神經(jīng)元功能的因子。在該試驗(yàn)中使用年輕的成年雌性Sprague Dawley(SD)大鼠。從視盤向眼窩內(nèi)1.5mm處橫斷各個(gè)動(dòng)物的右側(cè)視神經(jīng)。將一塊浸濕了6％氟-金(FG)的明膠海綿施用于新橫斷的部位上，正好在視盤后面，以標(biāo)記存活的視網(wǎng)膜中心細(xì)胞(RGCs)。將動(dòng)物分成6組(每組n＝6)，玻璃體內(nèi)注射Sp35-Fc、人IgGl或者僅PBS。玻璃體內(nèi)注射的體積為4ml，而每次注射的劑量為2mg。在視神經(jīng)橫斷后，立即進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射。
所有動(dòng)物存活1周。在處死動(dòng)物兩天前，橫斷每只動(dòng)物的左側(cè)視神經(jīng)，用6％FG標(biāo)記存活的RGC，作為內(nèi)部對(duì)照。用過量戊巴比妥鈉處死動(dòng)物，將視網(wǎng)膜分離在4％多聚甲醛中。進(jìn)行四個(gè)徑向切斷(radial cut)，將視網(wǎng)膜分成四個(gè)區(qū)(上端、下端、鼻區(qū)和顳區(qū))。在用封固劑(Dako)進(jìn)行不透明封裝(flat-mounted)前，用相同的固定劑進(jìn)行后固定1小時(shí)。在熒光顯微鏡下檢查切片，使用紫外線濾光片(激發(fā)波長＝330-380mn)。在200×200mm的目鏡下，沿著從視盤到視網(wǎng)膜外邊緣的各個(gè)分區(qū)的中線，以500mm的間隔，計(jì)數(shù)被標(biāo)記的RGC。比較受損眼睛與另一側(cè)的眼睛中的存活RGC的數(shù)量，來表示從各個(gè)處理獲得的存活RGC的百分比。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。通過單因子ANOVA來評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)顯著性，接著進(jìn)行Tukey-Kramer后hoc檢測(cè)。p＜0.05視為差異顯著。與對(duì)照Fc或PBS處理的動(dòng)物相比，Sp35-Fc處理的動(dòng)物具有顯著的神經(jīng)元存活(83％)，對(duì)照僅分別具有約50％神經(jīng)元存活。
其它實(shí)施方案其它實(shí)施方案在如下的權(quán)利要求書中。
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸，包含編碼多肽的核苷酸序列，其中(a)該多肽包含(i)Sp35 LRR結(jié)構(gòu)域，(ii)位于LRR結(jié)構(gòu)域C末端的Sp35堿性區(qū)和(iii)位于該堿性區(qū)的C末端的Sp 35免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域；和(b)該多肽缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域。
2.一種分離的核酸，包含編碼多肽的核苷酸序列，其中該多肽包含Sp35Ig結(jié)構(gòu)域，而缺乏Sp35 LRR結(jié)構(gòu)域、Sp35堿性區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
3.一種分離的核酸，包含編碼多肽的核苷酸序列，其中該多肽包含Sp35LRR結(jié)構(gòu)域，而缺乏Sp35 Ig結(jié)構(gòu)域、Sp35堿性區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求1的核酸，其中Sp35多肽缺乏胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求1的核酸，其中該多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸殘基34-532。
6.權(quán)利要求1-3的任何一項(xiàng)的核酸，其中該多肽是包含非Sp35部分的融合多肽。
7.權(quán)利要求6的核酸，其中非Sp35部分選自Ig部分、血清白蛋白部分、靶向部分、報(bào)道分子部分或便于純化的部分。
8.權(quán)利要求7的核酸，其中非Sp35部分是Ig部分。
9.權(quán)利要求8的核酸，其中Ig部分是Fc部分。
10.權(quán)利要求1-3的任何一項(xiàng)的核酸，其中核苷酸序列被可操作地連接到表達(dá)控制序列上。
11.一種載體，包含權(quán)利要求10的核酸。
12.一種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求11的載體。
13.一種分離的多肽，其中(a)該多肽包含(i)Sp35 LRR結(jié)構(gòu)域，(ii)位于LRR結(jié)構(gòu)域C末端的Sp35堿性區(qū)和(iii)位于該堿性區(qū)的C末端的Sp 35免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域；和(b)該多肽缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域。
14.一種分離的多肽，其中該多肽包含Sp35 Ig結(jié)構(gòu)域，而缺乏Sp35LRR結(jié)構(gòu)域、Sp35堿性區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
15.一種分離的多肽，其中該多肽包含Sp35 LRR結(jié)構(gòu)域，而缺乏Sp35Ig結(jié)構(gòu)域、Sp35堿性區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
16.權(quán)利要求13的多肽，其中富含亮氨酸的重復(fù)之一是羧基末端的富含亮氨酸的重復(fù)(LRRCT)。
17.權(quán)利要求13的多肽，其中富含亮氨酸的重復(fù)之一是氨基末端的富含亮氨酸的重復(fù)(LRRNT)。
18.權(quán)利要求13的多肽，其中Sp35多肽缺乏胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
19.權(quán)利要求13的多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸殘基34-532。
20.權(quán)利要求13，14或15的多肽，其中該多肽是包含非Sp35部分的融合多肽。
21.權(quán)利要求20的多肽，其中非Sp35部分選自Ig部分、血清白蛋白部分、靶向部分、報(bào)道分子部分和便于純化的部分。
22.權(quán)利要求21的多肽，其中非Sp35部分是Ig部分。
23.權(quán)利要求22的多肽，其中Ig部分是Fc部分。
24.權(quán)利要求13，14或15的多肽，其中該多肽被偶聯(lián)到多聚體上。
25.權(quán)利要求24的多肽，其中多聚體選自聚亞烷基二醇、糖部分和多肽。
26.權(quán)利要求25的多肽，其中多聚體是聚亞烷基二醇。
27.權(quán)利要求26的多肽，其中聚亞烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
28.權(quán)利要求24的多肽，其中多肽被偶聯(lián)到l，2，3或4多聚體上。
29.權(quán)利要求28的多肽，其中多聚體的總分子量為20,000Da到40,000Da。
30.抑制通過NgRl的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，包含用有效量的Sp35多肽與NgRl接觸。
31.降低對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元的軸突生長抑制的方法，包括用有效量的多肽與神經(jīng)元接觸，該多肽選自Sp35多肽、抗Sp35抗體或者抗Sp35抗體的抗原結(jié)合片段。
32.抑制CNS神經(jīng)元的生長錐崩解的方法，包括用有效量的多肽與神經(jīng)元接觸，該多肽選自Sp35多肽、抗Sp35抗體或者抗Sp35抗體的抗原結(jié)合片段。
33.治療哺乳動(dòng)物中的CNS疾病、異?；驌p傷的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的多肽，該多肽選自Sp35多肽、抗Sp35抗體或者抗Sp35抗體的抗原結(jié)合片段。
34.權(quán)利要求30-33的任何一項(xiàng)的方法，其中Sp35多肽選自這樣的多肽其中(a)該多肽包含(i)含有12-14個(gè)Sp35富含亮氨酸重復(fù)的LRR結(jié)構(gòu)域，(ii)位于LRR結(jié)構(gòu)域C末端的Sp35堿性區(qū)，和(iii)位于堿性區(qū)的C末端的免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域；和(b)該多肽缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域；和這樣的多肽其中該多肽包含Sp35 Ig結(jié)構(gòu)域，而缺乏LRR結(jié)構(gòu)域、堿性區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
35.權(quán)利要求33的方法，其中CNS疾病、異?；驌p傷是脊髓損傷或者視神經(jīng)損傷。
36.權(quán)利要求33的方法，其中多肽被局部施用。
37.權(quán)利要求33的方法，其中多肽在脊髓損傷的48小時(shí)內(nèi)開始施用。
38.權(quán)利要求36的方法，其中多肽的治療有效量為10μg到10mg。
39.治療哺乳動(dòng)物中的CNS疾病、異?；驌p傷的方法，包括(a)提供表達(dá)重組Sp35多肽的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和(b)在位于或接近CNS疾病、異?；驌p傷的部位，將宿主細(xì)胞導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物。
40.權(quán)利要求39的方法，其中疾病、異?；驌p傷是脊髓損傷。
41.權(quán)利要求39的方法，其中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞來源于將被治療的哺乳動(dòng)物。
42.權(quán)利要求39的方法，其中重組Sp35多肽是全長的Sp35多肽。
43.促進(jìn)CNS疾病、異?；驌p傷的部位的髓鞘形成的方法，包括用有效量的Sp35多肽與CNS疾病、異?；驌p傷的部位接觸。
44.權(quán)利要求43的方法，其中Sp35多肽包含Sp35 LRR結(jié)構(gòu)域，而缺乏Sp35 Ig結(jié)構(gòu)域、Sp35堿性區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
45.通過體內(nèi)基因療法來治療CNS疾病、異?；驌p傷的方法，包含在位于或接近疾病、異常或損傷的部位，給哺乳動(dòng)物施用包含編碼Sp35多肽的核苷酸序列的病毒載體，使得在位于或接近損傷的部位，所述Sp35多肽以足以降低對(duì)神經(jīng)元軸突延伸的抑制的量在哺乳動(dòng)物中由所述核苷酸序列表達(dá)。
46.權(quán)利要求36的方法，其中病毒性載體選自腺病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、EB病毒載體、乳多空病毒載體、痘苗病毒載體或單純皰疹病毒載體。
47.權(quán)利要求45的方法，其中疾病、異?；驌p傷選自脊髓損傷和視神經(jīng)損傷。
48.權(quán)利要求45的方法，其中病毒性載體通過一種路徑施用，該路徑選自局部施用、眼內(nèi)施用、胃腸外施用、鞘內(nèi)施用、硬膜下施用或皮下施用。
49.一種編碼多肽的核酸，該多肽包含Sp35 LRR結(jié)構(gòu)域、堿性區(qū)、Ig結(jié)構(gòu)域、連接序列和跨膜結(jié)構(gòu)域；而缺乏功能性胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
50.權(quán)利要求49的核酸，其中該核酸編碼基本上由SEQ ID NO2的氨基酸1-576組成的多肽。
51.促進(jìn)處于死亡危險(xiǎn)中的神經(jīng)元存活的方法，包括用有效量的Sp35多肽與神經(jīng)元接觸。
52.權(quán)利要求51的方法，其中神經(jīng)元是體外的。
53.權(quán)利要求51的方法，其中神經(jīng)元在患有神經(jīng)退行性疾病、異?；驌p傷的哺乳動(dòng)物中。
54.權(quán)利要求53的方法，其中神經(jīng)退行性疾病、異常或損傷選自多發(fā)性硬化、ALS、享廷頓病、阿爾茨海默氏病、帕金森病、糖尿病性神經(jīng)病、發(fā)作綜合征、創(chuàng)傷性腦損傷或脊髓損傷。
55.促進(jìn)患有神經(jīng)退行性疾病、異?；驌p傷的哺乳動(dòng)物中處于死亡危險(xiǎn)中的神經(jīng)元存活的方法，包括(a)提供表達(dá)重組Sp35多肽的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和(b)將宿主細(xì)胞導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的神經(jīng)元處。
56.一種促進(jìn)處于死亡危險(xiǎn)的神經(jīng)元存活的體內(nèi)基因治療方法，包括在位于或接近神經(jīng)元的部位，給哺乳動(dòng)物施用包含編碼Sp35多肽的核苷酸序列的病毒性載體，使得由該核苷酸序列在哺乳動(dòng)物中以足以促進(jìn)神經(jīng)元存活的量表達(dá)Sp35多肽。
57.權(quán)利要求51的方法，其中Sp35多肽是可溶性的。
全文摘要
本發(fā)明提供Sp35多肽及其融合蛋白，Sp35抗體及其抗原結(jié)合片段，以及編碼它們的核酸。本發(fā)明還提供包含這種Sp35抗體、抗體的抗原結(jié)合片段，Sp35多肽及其融合蛋白的組合物，以及制備和使用這種Sp35抗體、其抗原結(jié)合片段，Sp35多肽及其融合蛋白的方法。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1798840SQ200480013836
公開日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月19日
發(fā)明者米莎, 約翰·麥科伊, R·布萊克·佩平斯基, 丹尼爾·H·S·李 申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司