專利名稱：用作細菌載體的細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及經細菌感染的細胞及其用于生產藥物組合物的用途，尤其是用于治療癌癥。
背景技術：
和現有技術對于治療以前不能治愈或不能充分治愈的疾病的新方法包括基因治療和免疫治療的各種可能性。
基因治療的意向是將編碼所需蛋白質的核酸序列通過合適的載體運送至目標組織中并穿透進入其中的細胞中，并轉化它們來表達所需的蛋白質。已經發(fā)展和測試了用于基因治療的各種不同技術方法。然而，總地來看，各種方法測試的臨床結果全部趨向于失望，尤其是對于腫瘤疾病。技術問題是對此的實質性原因。因此，對于治療效果，核酸序列的載體顯示出對目標細胞的特異性太低，可以被轉化的細胞數量太少，所需蛋白質表達的強度和持續(xù)時間太小。
已經建立的免疫治療形式之一是用抗原來免疫，稱為接種疫苗。用抗原免疫后，身體產生特定的抗體和/或特定的細胞毒素淋巴細胞，其具有預防或治療活性，例如對抗感染物。數十年來已經嘗試了各種方法來通過接種疫苗治療以前不能充分治療或不能治愈的疾病。最前沿的是通過腫瘤接種疫苗來治療腫瘤疾病。目的是通過腫瘤疫苗引起針對腫瘤的免疫反應，導致腫瘤細胞的胞溶并最終消滅所有的腫瘤組織。然而，至今使用經測試的各種腫瘤疫苗在腫瘤治療中還沒有獲得突破。實質性原因源自所謂的腫瘤宿主對其腫瘤的免疫耐受性。因此，盡管用大量免疫治療方法來誘導相對好的腫瘤特異性T-細胞反應是可能的，但是這經常和破壞腫瘤效果沒有關聯(例如，Thurner等，J.ExpMed 1901669-1678(1999))。最近的探索指向各種原因。這些包括特異性T細胞不能足夠地穿透進入腫瘤組織(Mukai等，CancerResearch 595245-5249(1999))和/或腫瘤內T細胞的失活(例如通過TFG-β或通過表達負調節(jié)標記如腫瘤組織中的B7-H1或通過刺激具有免疫抑制效果的調控T細胞(ReviewBach，Nature Reviews，3189-198(2003))。
目前在不同臨床階段中采用不同方法用于腫瘤接種且經常是基于樹突細胞(概述于Bancherau等，Cell，106271-4(2001))。用樹突細胞免疫的最常見類型包括離體激活細胞、將其裝載(“pulsen”)抗原(例如純化的蛋白質、腫瘤細胞提取物或限定的肽)并隨后將其給藥?；蛘撸€使用了包括細胞融合的方法。在這種情況下，例如，通過合適的方法如電場將經輻射的腫瘤細胞融合至樹突細胞并隨后給藥(Kugler等，Nat Med 6332-6(2000))。
已經發(fā)展了一種新方法，在重組減毒細菌的幫助下，例如沙門氏茵和利斯特氏茵(listeriae)作為選定腫瘤抗原的載體來突破患者對其腫瘤的免疫耐受性(DE 102 08 653；DE 102 06 325，未公開)。還沒有了解通過其突破所述免疫耐受性的機理的全部細節(jié)。然而，注射后發(fā)生細菌如沙門氏茵或利斯特氏茵在腫瘤組織中累積，并通過這些細茵在腫瘤組織中引起炎癥，看來在這中間起了實質性作用。因此，已知靜脈內給藥沙門氏茵后，這些細菌可能在腫瘤組織中累積。然而，動力學研究已經顯示在注射細菌后的早期，腫瘤組織中只發(fā)現少數細菌，且這些能夠在腫瘤組織中擇優(yōu)地焦點生長。因此，如果在靜脈內注射后在腫瘤中觀察到相對大量的細菌，它們源自相對少的母體(Mei等，Anticancer Res 223261-6(2002))。然而，這對于治療用途是不理想的，例如用沙門氏茵作為基因載體的基因治療情況中，因為在這種情況下，腫瘤的移生是不均衡的；相反，只產生了少數高細茵數的焦點。
除了實際的腫瘤細胞和結締組織以外，腫瘤含有相當數量的白細胞，尤其是淋巴細胞(腫瘤-浸潤淋巴細胞；TIL)和巨噬細胞(腫瘤-相關巨噬細胞；TAM)。設想白細胞的腫瘤定位通過腫瘤細胞的表達產物來影響，尤其是通過細胞因子、內皮素以及通過缺氧(Sica等，IntImmunpharmacol，21045-1054(2002)；Grimshaw等，Eur J Immunol，322393-2400(2002))。
位于腫瘤中的白細胞的功能是自相矛盾的。尤其是已經證明TAM具有抗腫瘤活性(抗原呈遞；細胞毒性；Funada等，Oncol Rep，10309-313(2003)；Nakayama等，AntiCancer Res 224291-4296)；Kataki等，J Lab Clin Med，140320-328(2002))和促進腫瘤生長活性(分泌生長因子；促進血管生成和病灶轉移；Leek和Harris J.，Mammary Gland Biol Neoplasia，7177-189(2002)；細胞毒性細胞因子如IL-1α；IL-1β；IL-6；TNFα減少的分泌；Kataki等，J LabClin Med，140320-328(2002))。
已經作出一些時間的嘗試通過給藥細胞毒性淋巴細胞、TIL、自然殺傷細胞、巨噬細胞或樹突細胞來影響腫瘤生長。然而，臨床結果是自相矛盾的(Faradji等，Cancer Immunol Immunotherap，33319-326(1991)；Montovani等，Immunology Today，13265-270(1992)；Ravaud等，British J of Cancer，71331-336(1995)；Semino等，Minerva Biotec，11311-317，1999))。實驗上顯示可能的是注射輕度激活的巨噬細胞可以導致腫瘤生長的促進，但是注射高度激活的巨噬細胞可以導致腫瘤生長的抑制(Mantovani等，Immunology Today，13265-270(1992))。關于這一點，經激活的巨噬細胞的給藥看來似乎偏好腫瘤的位置(Fidler，Adv Pharmacol，30271-326(1974)；Chokri等，Int J Immunol，179-84，(1990))。注射用編碼抗腫瘤蛋白的基因序列體外轉化的淋巴細胞至今在腫瘤治療中還沒有導致任何臨床上的突破(Hege和Roberts，Current Opinion inBiotechnology，7629-634(1996))。然而，在這些研究中顯示了淋巴細胞，還有其它細胞，尤其是腫瘤細胞，在靜脈內注射后，可以到達腫瘤組織(Shao J等，Drug Dellv 2(2001))，但是大多數給藥的細胞位于正常組織如肺、脾和肝中(Adams J，Clin Pathol Mol Path49256-267(1996))。
本發(fā)明的技術問題本發(fā)明是基于通過將含有編碼活性物質的外源DNA的微生物定位于靶細胞，尤其是定位于腫瘤的方法可以改善生產方法的技術問題。
本發(fā)明的認知和原理以及實施方案本發(fā)明是基于以下的認知已經受到感染的(即用細茵體外裝載的)巨噬細胞或樹突細胞，在靜脈內給藥后將它們運送至腫瘤組織中，在靜脈內注射體外裝載細菌的巨噬細胞后，定位于腫瘤中的細菌量顯著高于靜脈內注射相應量游離細菌后；腫瘤中累積被感染的異種腫瘤細胞，且甚至經感染的細胞預先通過輻射失活，仍然維持該效果。
例如，如果巨噬細胞用作沙門氏菌的載體，在兩個不同的轉基因腫瘤模型中(肺腫瘤模型Raf轉基因小鼠，Kerkhoff等，Cell GrowthDiffer，11185-90(2000)，乳房腫瘤模型Her-2轉基因鼠，Bouchard等，Cell，57931-6(1989))，靜脈內給藥裝載沙門氏菌的巨噬細胞18小時后，在腫瘤組織中檢測到的沙門氏茵比靜脈內注射相應量游離沙門氏茵后的高十倍多。
在使用異種腫瘤系時，發(fā)現是相似的。腫瘤細胞系4T1(ATCCNo.CRL-2539)源自BALB/c小鼠乳腺組織的腫瘤，在感染減毒利斯特氏茵后給藥于所述的Raf腫瘤模型中(C57BL/6為基礎)。使用經感染的細胞這種情況下發(fā)現，在腫瘤組織中也是極大增加數量的細菌，甚至在細胞預先經過輻射的情況下也維持這種現象。
因此原理上可能的是將這些令人驚訝的觀察延伸至任何細胞，只要這些細胞可以通過細菌感染或細茵能在其上牢固附著，并因此是這些細菌的載體。因此，例如在上述的腫瘤模型中，在靜脈內注射沙門氏菌感染的腫瘤細胞后，發(fā)現腫瘤組織中沙門氏茵的定位比靜脈內注射相應量游離沙門氏茵后大得多。
細菌具有強烈輔助效果，尤其是通過細菌的組成部分，如脂多糖(LPS)、細胞壁成分、鞭毛、具有免疫刺激CpG基序的細菌DNA，其中所有的和抗原呈遞細胞上的各種所謂的Toll樣受體(TLR)相互作用，并因此能刺激它們。因此期望用細菌感染的細胞并將這些細胞給藥，不僅能帶來細菌在腫瘤中累積的提高，而且該感染還能引起炎癥以及增強全身和局部免疫反應。因此該方法還可以作為免疫治療的一部分來提高局部免疫反應。
因此，本發(fā)明涉及裝載了細茵的哺乳動物細胞，并涉及這些細胞用于預防或治療疾病的用途。
本發(fā)明范圍內的細胞可以是例如自體的、同種異體的或異種的巨噬細胞、淋巴細胞、樹突細胞或腫瘤細胞。當使用腫瘤細胞時，它們優(yōu)選是經輻射過的或用細胞抑制劑處理過的，以此來阻斷它們的分裂能力。優(yōu)選通過本領域技術人員已知方法從血液或腫瘤中分離這樣的細胞。然而，還可能的是使用正常組織或腫瘤的在培養(yǎng)中建立的稱為細胞系的自體的、同種異體的或異種的細胞。這樣的細胞系是以任何種類和數量可獲得的，例如來自細胞文庫如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。此外還可能的是使用通過本領域技術人員已知方法改造過的細胞。在此的改造包括尤其是基因修飾，以及另外的細胞裝載如用肽、蛋白質、藥物活性物質或病毒顆粒。
本發(fā)明范圍內的裝載是將細菌吸附至細胞上，通過細胞和/或細胞感染的細菌吞噬作用。
本發(fā)明范圍內的細菌是例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，優(yōu)選任意地胞內細菌，優(yōu)選沙門氏茵或利斯特氏菌，優(yōu)選細菌能夠分裂但不具有對接受者的致病性或其毒性是減毒的或其是滅活的。減毒細菌的特征在于例如這些細菌的至少一個染色體的用于代謝酶的至少一個基因是被刪除的或突變的，使得代謝酶是有缺陷的。這些細菌中，可能的是i)刪除染色體中合成芳族氨基酸的酶的一個基因，例如aroA基因，其編碼芳族氨基酸生物合成中的第一個酶，使得這些細菌的生長依賴于芳族氨基酸的存在，ii)可能是使細菌移動的蛋白質未削弱地表達，例如因為iap和actA基因的能力，保留其功能，和iii)刪除染色體中編碼色氨酰基-tRNA合成酶的基因trpS，已經引入這些細菌的質粒中，iv)通過合適的復制源例如ori pAMβ1(Simon和Chopin，1988)使其復制穩(wěn)定，v)其包括編碼色氨酰基-tRNA合成酶的trpS基因，vi)其包括細胞內溶素的基因，例如噬菌體A118的胞溶基因(ply118；Loessner等，1995)，該胞溶基因在啟動子控制下在哺乳動物細胞的胞液中可被激活，例如actA啟動子(PactA，Dietrich等，1998)，和vii)其包括編碼至少一種活性物質的至少一個核苷酸序列，該序列在啟動子控制下在細菌或哺乳動物細胞中可被激活，啟動子的激活可以是非細胞特異性的、細胞特異性的、細胞周期特異性的、細胞功能特異性的或取決于代謝物、藥物或氧濃度。
由于必需的代謝蛋白質的至少一個基因的缺失，這種類型的細茵呈現出毒性的劇烈降低，例如通過它們體內增殖能力測量的，且仍然顯示了顯著提高的細菌感染、細菌在胞液中的裂解、該細菌含有的質粒的釋放，和質粒編碼的活性物質的穩(wěn)定表達。這樣的細菌微生物通常包含編碼活性物質的外源核酸序列，且任選地在調控核酸序列控制下，其中微生物染色體DNA中，細菌固有的編碼細菌酶表達的核酸序列是被刪除的或突變的，附帶條件是其產生的翻譯產物是非功能性的，且其中微生物含有編碼酶的非外源核酸序列。
胞內細菌的實例是結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝桿茵(M.bovis)、牛分枝桿菌茵株BCG、BCG次代菌株、鳥分枝桿菌(M.avium)、胞內分枝桿菌(M.intracellailare)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、海分枝桿菌(M.marinum)、潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、鳥分枝桿茵副結核亞種、星狀諾卡氏茵(Nocardiaasteroides)、其他諾卡氏茵屬茵種、嗜肺性軍團病桿菌(Legionellapneumophila)、其他軍團病桿菌茵種、傷寒沙門氏茵(Salmonellatyphi)、鼠傷寒沙門氏茵(S.typhimurium)、其他沙門氏茵茵種、志賀氏菌(Shigella)菌種、鼠疫耶爾森氏茵(Yersinia pestis)、溶血性巴斯德氏茵(Pasteurella haemolytica)、多殺巴斯德氏茵(Pasteurella multocida)、其他巴斯德氏茵屬菌種、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、單核細胞增生利斯特氏茵(Listeria monocytogenes)、綿羊利斯特氏茵(L.ivanovii)、流產布魯氏桿菌(Brucella abortus)、其他布魯氏桿菌屬茵種、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、砂眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)和Q熱病原體(Coxiella burnetii)。
沙門氏茵減毒的實例是pab基因、pur基因、aro基因、asd、dap基因、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、dam、phoP、phoQ、rfc、poxA、galU、metL、metH、mviA、sodC、recA、ssrA、ssrB、sirA、sirB、sirC、inv、hilA、hilC、hilD、rpoE、flgM、tonB或slyA及其組合的失活突變。通過用于沙門氏菌減毒的實例方法使所列基因失活突變是本領域技術人員熟知的。
本發(fā)明進一步涉及為細菌載體的細胞，已經將編碼蛋白質的核酸序列引入這些細菌中，這些蛋白質優(yōu)選表現出預防或治療疾病的活性物質。
這樣的蛋白質可以是例如感染物如病毒、細茵、支原體、寄生蟲的抗原，腫瘤特異性抗原，尤其是致癌基因編碼的蛋白質，抗體，抗體的抗原決定簇結合片段和含有抗體的至少一個抗原決定簇結合片段的融合蛋白，該抗體定向對抗腫瘤細胞上的、淋巴細胞如T淋巴細胞上的、或內皮細胞如腫瘤內皮細胞上的抗原，酶，尤其是激活藥物無活性前體的酶，例如，β-葡糖苷酸酶，磷酸酯酶，水解酶，脂酶，免疫抑制細胞因子如IL-10，免疫刺激細胞因子如IL-1、IL-2、IL-3或IL-6，趨化因子，干擾素，生長因子如G-CSF、GM-CSF、M-CSF、FGF；VEGF或EGF，或細胞因子、趨化因子、干擾素或生長因子的抑制性蛋白質。
通過合適的啟動子來調控這些基因在細菌中的表達，所述啟動子可以源自細菌或病毒或真核生物且是非特異性、細胞特異性或功能特異性可激活的。
本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中使用基因核酸序列，其能夠跨膜表達或通過細菌分泌該基因編碼的蛋白質。這樣稱為信號序列的實例描述于參考文獻EP 1042495、EP 1015023和Hess等，PNAS USA931458-1463(1996)。
本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明細胞用于預防或治療疾病的用途。本發(fā)明的細胞優(yōu)選用于治療腫瘤疾病或免疫疾病。為了該目的，引入細菌的基因編碼蛋白質，其具有以下特征i)是腫瘤細胞毒性的，ii)具有促炎癥作用，iii)抑制負調控的免疫細胞，如通過抑制CTLA-4、B7-H1或CD25或TGFβ，iv)具有免疫抑制作用或v)可以將細胞毒性的、免疫調節(jié)或免疫抑制物質的無活性前體轉化成活性物質。
為了預防或治療疾病，優(yōu)選給藥100至109個細胞，每個細胞優(yōu)選攜帶約0.1(統(tǒng)計學平均)至100個細菌。將這樣的細胞局部給藥于皮膚，進入循環(huán)、進入體腔、進入組織、進入器官，或口服、直腸或支氣管給藥至少一次。
使用本發(fā)明細胞的疾病是例如腫瘤疾病、自體免疫疾病。慢性炎癥和器官移植。
以下通過示范性實施方案更詳細地解釋本發(fā)明。
說明本發(fā)明的實施例實施例1通過感染的自體骨髓巨噬細胞提供鼠傷寒沙門氏茵72071.1骨髓巨噬細胞的分離(MΦ)將約2-3個月大的BxB 23小鼠或約2個月大的MMTV/neb轉基因小鼠用于分離骨髓巨噬細胞。根據以下實驗方案分離巨噬細胞i)從小鼠卸下股骨，ii)將培養(yǎng)皿中的骨去除軟組織并兩側割開，iii)用2ml DMEM 10(DMEM Gibco，含有10％ FCS Gibo，2mM L-谷氨酰胺Gibco，50μM β-巰基乙醇Gibco)在Bluecap注射器輔助下用DMEM 10漂洗骨髓，iv)在1200rmp下離心5分鐘，抽吸并置于5ml分化培養(yǎng)基中。將分化培養(yǎng)基(DMEM10+10ng/ml GM-CSF(重組小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子；RD系統(tǒng)，Wiesbaden Cat.No.415-ML)中的細胞數調節(jié)至1×105個細胞/ml并以5ml為一份分配至Nunc培養(yǎng)皿中(NUNCLONTM，58mm，NUNC No.16955)，v)在37℃和10％CO2下孵育8天，vi)1.2用鼠傷寒沙門氏菌7207(SL 7207)體外感染巨噬細胞用DMEM洗滌附著在NUNC細胞培養(yǎng)皿上的MΦ，然后用細胞刮器收集附著的細胞，計數并放入分化培養(yǎng)基中。根據以下的實驗方案進行SL7207的感染(Hoiseth S.K.等，Nature 291238-239(1981))i)37℃培養(yǎng)箱中，1小時MOI(感染倍數)1∶20，ii)將106個巨噬細胞接種于NUNC培養(yǎng)皿中的2ml培養(yǎng)基中并用2×107個細菌(MOI＝20)在37℃孵育1小時，iii)然后洗滌，iv)用慶大霉素(終濃度100μg/ml(Sigma))在37℃孵育1小時，v)洗滌、測定細胞數、涂布于腦心浸液(BHI)平板(Gibco)上來計數細菌茵落形成單位(CFU)。
1.3裝載巨噬細胞的結果用20的MOI和1小時的裝載時間可以恒定地檢測到105個巨噬細胞中約有104個沙門氏菌。裝載12小時后，裝載密度大致保持恒定并顯示根本沒有細菌繁殖。
1.4將SL7207“體外”感染的巨噬細胞給藥于BxB23和MMTV/neu腫瘤小鼠將體外感染的并懸浮于100μl PBS中的5×155個骨髓巨噬細胞靜脈內注射入每只BxB23和MMTV/neu腫瘤小鼠的尾靜脈中(所用的實驗動物顯示出改善的腫瘤發(fā)展，年齡約12個月，BxB23小鼠中的肺質量由于肺腫瘤為0.75-1.25g)。根據實驗，每只小鼠注射細菌數為3-5×104的鼠傷寒沙門氏茵7207(通過計數CFU來測定)。作為對照，將鼠傷寒沙門氏茵7207靜脈內給藥至BxB23和MMTV/neu腫瘤小鼠中(懸浮于100μl PBS中的2.5×105個細菌每只小鼠)。18小時后，犧牲動物并測定肺中(BxB23)和腫瘤中(MMTV)的CFU(涂布于BHI平板)。在靜脈內注射鼠傷寒沙門氏菌aroA7207后，在對照組中研究感染的進程。為了該目的，使用相同實驗方案在不同時間通過測定CFU來研究細菌數。
1.5靜脈內注射后鼠傷寒沙門氏茵7207在腫瘤中的累積在給藥沙門氏茵感染的巨噬細胞后，感染18小時后，在BxB23小鼠的帶有腫瘤的肺中和MMTV/neu小鼠的乳房腫瘤中檢測到的沙門氏茵量，比用游離沙門氏茵處理的對照組中動物的高十倍。注射裝載細菌的巨噬細胞后，甚至在注射18小時后細菌的累積(高于注射裸細菌10倍，參見

圖1及相關表格)，和對照組(即，在單獨注射細菌后)中僅在一些天后(注射5天后)相對獲得的一樣高。因此，在本發(fā)明裝載細菌的細胞輔助下，可以在實質上較短的時間內在腫瘤中累積比注射純細菌懸浮液后所可能的顯著多的細菌。在注射本發(fā)明細胞后的第1、7、14天對肺和器官中CFU的測定，揭示了CFU保持于恒定的高水平或在帶有腫瘤的BxB23小鼠的肺中升高了，而C57BL/6對照小鼠肺中的CFU以及BxB23小鼠和C57BL/6小鼠脾中的顯著低于各自肺中的值或不再能檢測到(參見圖2和圖3，及相關表格；圖2顯示了帶有(肺)腫瘤BxB23小鼠肺中與C57BL/6對照動物肺中的CFU比較，圖3顯示了在靜脈內注射5×105個鼠傷寒沙門氏茵后，MMTV/neu小鼠乳房腫瘤中和脾中的CFU比較)。
實施例2通過感染異種細胞提供單核細胞增生利斯特氏茵(L.monocytogene)將來自BALB/c小鼠乳腺腫瘤的腫瘤細胞系的4T1細胞(ATCCCRL-2539)用減毒的單核細胞增生利斯特氏茵菌株感染，且在1小時的時間段內MOI為10。然后將細胞洗滌，并通過在慶大霉素存在下孵育一小時來殺滅游離細茵。CFU的測定揭示了細胞裝載為每個細胞0.15個細菌。將細胞數調節(jié)值每ml PBS中5×106個細胞。此外，通過輻射將一些感染的細胞滅活。每只小鼠靜脈內注射0.1ml該懸浮液[即，5×105個感染細胞(利斯特氏菌測量的CFU7.3×104)、3.5×105感染并經輻射的細胞或(計數的CFU)3.5×105個游離利斯特氏菌，各在100μl PBS中]至帶有腫瘤的BxB23小鼠中(年齡＞10個月)或相同大小的C57BL/6小鼠中。
所用的輻射劑量是減少的，通過CFU測定來檢測，游離細茵中最大量為25％，使得在經輻射過的細胞中計算的感染劑量約為3.8×104個細菌。
感染17小時后，通過連續(xù)涂布BHI平板(Gibco)(檢測極限為每個器官10個細菌)測定肺和脾中的細菌CFU。
根據脾中可檢測的CFU，所有動物顯示了成功感染。注射本發(fā)明活的或經輻射過的細胞后，帶有腫瘤的BxB23小鼠和C57BL/6對照小鼠肺中的CFU量明顯高于注射細菌懸浮液后的，且和C57BL/6對照小鼠肺中的細茵數相比較，注射本發(fā)明細胞后的細菌數在帶有腫瘤的BxB23小鼠肺中明顯增加(10倍)。所有組的脾中可檢測的細菌CFU顯著比肺中的多，但是在注射本發(fā)明細胞或細菌懸浮液后，在帶有腫瘤的BxB23小鼠和C57BL/6對照小鼠中，不可能檢測到細茵CFU量的明顯差異(參見圖4及相關表格)。
如在上述實驗中的對照組已經證明的，用減毒鼠傷寒沙門氏茵7207裝載的巨噬細胞，在減毒單核細胞增生利斯特氏茵的情況中也是如此，在注射本發(fā)明細胞和純細菌懸浮液約5天的時間段內，脾和其它不帶有腫瘤的器官中細菌CFU數量減少，但是注射本發(fā)明的細胞和純細茵懸浮液后最多14天帶有腫瘤的BxB23小鼠和C57BL/6對照小鼠中的含量明顯低于帶有(肺)腫瘤BxB23肺中的CFU水平。
與此相反，在注射本發(fā)明細胞后，帶有(肺)腫瘤BxB23小鼠肺中細菌CFU初始提高的量至少堅持整個時間段或甚至開始時還有所增加，只在延長的平臺期后再次下落。
表1靜脈內注射經感染的巨噬細胞或游離沙門氏菌18小時后，被感染的小鼠的肺或腫瘤中的細菌數
表2在帶有(肺)腫瘤的BxB23小鼠肺中和在C57BL/6對照動物肺中的CFU比較
表3靜脈內注射5×105個鼠傷寒沙門氏茵aroA后，在MMTV/neu小鼠的乳房腫瘤和脾中的CFU比較
表4用25戈瑞(經輻射的細胞)或未經輻射的(經感染的細胞)經感染的4T1乳房腫瘤細胞或游離利斯特氏茵感染17小時后，被感染的小鼠中的細菌數
表5注射用25戈瑞(經輻射的細胞)或未經輻射的(經感染的細胞)經感染的4T1乳房腫瘤細胞或游離利斯特氏茵感染17小時后，被感染的小鼠脾中的細菌數
權利要求
1.一種哺乳動物細胞，其是裝載細菌的，用于預防或治療疾病，其中細胞是自體的、同種異體的或異種的，且選自“巨噬細胞、樹突細胞、粒細胞、淋巴細胞、腫瘤細胞和組織細胞”。
2.如權利要求1中所要求的細胞，通過輻射或其它方法來將其滅活。
3.如權利要求1或2中所要求的細胞，其中細菌是活的、無毒的、減毒的或死的。
4.如權利要求1至3任一項所要求的細胞，其中細菌選自“結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌菌株BCG、BCG次代菌株、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、非洲分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結核亞種、星狀諾卡氏菌、其他諾卡氏菌屬菌種、嗜肺性軍團病桿菌、其他軍團桿菌屬菌種、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、其他沙門氏菌菌種、志賀氏菌菌種、鼠疫耶爾森氏菌、溶血性巴斯德氏菌、多殺巴斯德氏菌、其他巴斯德氏菌屬菌種、胸膜肺炎放線桿菌、單核細胞增生利斯特氏菌、綿羊利斯特氏菌、流產布魯氏桿菌、其他布魯氏桿菌屬菌種、肺炎衣原體、砂眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和Q熱病原體”。
5.如權利要求1至4任一所要求的細胞，其中細菌含有重組DNA，該DNA編碼至少一種活性物質。
6.如權利要求1至5任一所要求的細胞，其中在合適啟動子的輔助下由細菌本身來產生至少一種活性物質，或其表達受真核啟動子控制。
7.如權利要求1至6任一所要求的細胞，其中發(fā)生胞內的、膜結合的或分泌生產。
8.如權利要求1至7任一所要求的細胞，其中活性物質選自“感染物如病毒、細菌、支原體、寄生蟲的抗原，腫瘤特異性抗原，尤其是致癌基因編碼的蛋白質，抗體，抗體的抗原決定簇結合片段和含有抗體的至少一個抗原決定簇結合片段的融合蛋白，該抗體定向例如腫瘤細胞上的、淋巴細胞如T淋巴細胞上的、或內皮細胞如腫瘤內皮細胞上的抗原，酶，尤其是激活藥物無活性前體的酶，例如，β-葡糖苷酸酶，磷酸酯酶，水解酶，脂酶，免疫抑制細胞因子如IL-10，免疫刺激細胞因子如IL-1、IL-2、IL-3或IL-6，趨化因子，干擾素，生長因子如G-CSF、GM-CSF、M-CSF、FGF；VEGF或EGF，或細胞因子、趨化因子、干擾素或生長因子的抑制性蛋白質”。
9.如權利要求1至8任一所要求的細胞用于預防或治療疾病的用途，其中活性物質阻斷腫瘤組織中的負調節(jié)因子。
10.如權利要求1至8任一所要求的細胞用于預防或治療疾病的用途，其中細菌作為腫瘤組織中的促炎癥刺激物。
11.如權利要求1至8任一所要求的細胞用于預防或治療疾病的用途，其中同時使用樹突細胞或巨噬細胞作為疫苗抗原的載體。
12.如權利要求1至8任一所要求的細胞用于預防或治療疾病的用途，其中活性物質和/或疫苗抗原離體裝載至樹突細胞上或巨噬細胞上。
13.如權利要求12中所要求的用途，其中疫苗抗原由所限定的肽構成。
14.如權利要求10中所要求的用途，其中將細胞和表達組織抗原或腫瘤抗原的另一細胞融合。
15.如權利要求14中所要求的用途，其中融合細胞是自體腫瘤細胞。
16.如權利要求1至8任一所要求的細胞用于預防或治療疾病的用途。
17.細胞，尤其是如權利要求1至8任一所要求的細胞用于生產藥物組合物的用途，其裝載了含有外源DNA的微生物，尤其是細菌微生物。
18.如權利要求17中所要求的用途，其中外源DNA編碼所限定的活性物質，且其中藥物組合物用來預防或治療通過該活性物質可以預防和/或治療的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及細胞生產藥物組合物的用途，該細胞裝載了含有外源DNA的微生物，尤其是細菌微生物。優(yōu)選，外源DNA編碼所限定的活性劑且該藥物組合物用于預防或治療通過所述活性劑可以治療的疾病。
文檔編號A61K39/02GK1802175SQ200480015761
公開日2006年7月12日 申請日期2004年6月7日 優(yōu)先權日2003年6月6日
發(fā)明者J·芬斯特雷, W·格貝爾, U·拉普, J·施特里茨克, A·施密特, I·根特舍韋, T·波塔彭克 申請人:贊塔里斯有限公司