專利名稱：用于粘膜和口服施用的包含hcg片段的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及免疫介導(dǎo)的疾病如過敏癥、自身免疫性疾病、移植相關(guān)性疾病和其他炎癥性疾病。本發(fā)明特別涉及通過施用含有基因調(diào)節(jié)性肽的藥物組合物來治療炎癥性疾病。
背景技術(shù)：
當(dāng)宿主受到有害物質(zhì)、微生物入侵或損傷的威脅時(shí)，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞因子和其他體液和細(xì)胞因子，以炎癥的形式作出應(yīng)答以保護(hù)宿主。在大多數(shù)情況下，這種復(fù)雜的防御體系可成功地重建正常的體內(nèi)平衡，不過在其他情況下，免疫學(xué)介質(zhì)或炎癥介質(zhì)實(shí)際上對(duì)宿主可能是有害的。一些已經(jīng)得到廣泛研究的免疫性疾病和免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的損傷的實(shí)例包括過敏性休克、自身免疫性疾病和免疫復(fù)合物疾病。
有關(guān)體液和細(xì)胞免疫學(xué)、分子生物學(xué)和病理學(xué)的最新進(jìn)展已經(jīng)改變了當(dāng)前關(guān)于自身免疫作為免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病的因素的觀念。這些進(jìn)展增進(jìn)了我們對(duì)抗體、B細(xì)胞和T細(xì)胞多樣性的基本方面、天然免疫應(yīng)答(由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞、γδT細(xì)胞、補(bǔ)體、急性期蛋白等等實(shí)現(xiàn))和適應(yīng)性免疫應(yīng)答(T和B細(xì)胞和抗體)或細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的產(chǎn)生及其互相依賴、誘導(dǎo)(自身)耐受的機(jī)制以及針對(duì)自身抗原性組分的免疫學(xué)活性是如何產(chǎn)生的等問題的認(rèn)識(shí)。
1900年以來，免疫學(xué)的核心思想一直是免疫系統(tǒng)正常情況下不會(huì)對(duì)自身產(chǎn)生反應(yīng)。然而，最近已經(jīng)清楚地認(rèn)識(shí)到，自身免疫應(yīng)答并非如曾經(jīng)以為的那樣，且并非所有的自身免疫應(yīng)答均是有害的；一些應(yīng)答在介導(dǎo)總體免疫應(yīng)答上具有截然不同的作用。例如，一些形式的自身免疫應(yīng)答，例如對(duì)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)編碼的細(xì)胞表面抗原的識(shí)別，以及抗自身個(gè)體基因型(idiotype)的抗個(gè)體基因型應(yīng)答，對(duì)于完好的免疫系統(tǒng)的多樣化和發(fā)揮正常的功能來說是重要的，實(shí)際上甚至是必需的。
顯然，免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(如T細(xì)胞)亞群之間維持了一種相互制衡的復(fù)雜系統(tǒng)，由此使得個(gè)體具有能夠應(yīng)對(duì)外來入侵者的免疫系統(tǒng)。就此而言，自身免疫在免疫系統(tǒng)中行使了調(diào)節(jié)的角色。
不過，現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到，對(duì)于很多人類和動(dòng)物疾病，異常的自身免疫應(yīng)答有時(shí)是原發(fā)的起因，而在其他情況下則是繼發(fā)的作用者。自身免疫性疾病的類型往往相互重疊，且同一個(gè)體傾向于發(fā)生一種以上的自身免疫性疾病，對(duì)于那些患有自身免疫性內(nèi)分泌病的個(gè)體來說是特別如此。自身免疫綜合征可出現(xiàn)于淋巴增殖疾病、惡性淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞增殖疾病以及免疫缺陷病中，后者例如為高丙種球蛋白血癥、選擇性Ig缺乏和不同成分缺乏癥。
自身免疫性疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、產(chǎn)后甲狀腺功能紊亂、自身免疫性血小板減少，僅舉數(shù)例，均以自身免疫性炎癥性反應(yīng)為特征，例如針對(duì)廣泛分布的自身抗原性決定簇，或針對(duì)器官或組織特異性抗原。此類疾病可繼發(fā)于僅僅針對(duì)一種抗原性靶位的免疫應(yīng)答，或繼發(fā)于針對(duì)多種自身抗原的免疫應(yīng)答。在很多情形中，并不清楚自身免疫應(yīng)答究竟針對(duì)的是未經(jīng)改變的自身抗原，還是被例如病毒、細(xì)菌抗原和半抗原族(haptenic groups)等各種因素改變的(或模擬的)自身抗原。
目前尚未確立一種統(tǒng)一的觀點(diǎn)來解釋各種自身免疫性疾病的起因和發(fā)病機(jī)理。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究支持這樣一種認(rèn)識(shí)，即自身免疫性疾病可能是由于不同個(gè)體之間各不相同的廣譜遺傳學(xué)和免疫學(xué)異常的結(jié)果，且取決于是否存在各種疊加的外源性(病毒、細(xì)菌)或內(nèi)源性(激素、細(xì)胞因子、異?；?促進(jìn)因素而在一生中或早或晚地表現(xiàn)出來。不過，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這些不同疾病的一個(gè)共同之處在于它們均涉及炎癥反應(yīng)，且常常為全身性炎癥反應(yīng)。
顯然，相似的阻止原發(fā)性自身免疫性疾病的相互制衡在其他免疫介導(dǎo)的疾病中也受到損害，這些疾病例如為過敏癥(哮喘)、急性炎癥性疾病如敗血癥或感染性休克、慢性炎癥性疾病(即風(fēng)濕性疾病、干燥綜合征、多發(fā)性硬化)、移植相關(guān)性炎癥性反應(yīng)(移植物抗宿主病、輸血后血小板減少)、以及許多其他的疾病，其中作為起因的抗原(至少在最初)可能不是自身抗原，但其中炎癥反應(yīng)主要是非所需的且對(duì)個(gè)體是有害的。
作為急性全身性炎癥反應(yīng)的一個(gè)具體實(shí)例，在此討論一下敗血癥/SIRS的概念。敗血癥是一種綜合征，其中例如由微生物侵入、損傷或者其他因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫介質(zhì)誘導(dǎo)一種急性炎癥狀態(tài)，后者導(dǎo)致體內(nèi)平衡異常、器官損害，并最終導(dǎo)致致死性休克。敗血癥是指由嚴(yán)重感染引起的一種全身性反應(yīng)?；加袛⊙Y的患者通常表現(xiàn)為發(fā)熱、心動(dòng)過速、呼吸急促、白細(xì)胞增多以及局灶感染。血液或感染部位的微生物培養(yǎng)通常，但并不總是，呈陽性。當(dāng)這種綜合征導(dǎo)致低血壓或多器官功能衰竭(MOSF)時(shí)，這種狀態(tài)稱為敗血癥或感染性休克。起初，微生物在感染灶增殖。微生物可侵入到血流中，導(dǎo)致血培養(yǎng)陽性，或者可在局部生長(zhǎng)但釋放多種物質(zhì)進(jìn)入血流。這些物質(zhì)中的致病性成分可分為兩種基本類型內(nèi)毒素和外毒素。內(nèi)毒素通常為微生物結(jié)構(gòu)性成分，例如來自葡萄球菌的磷壁酸抗原或來自革蘭氏陰性微生物的內(nèi)毒素如LPS。外毒素(例如中毒性休克綜合征毒素-1或葡萄球菌腸毒素A、B或C)由微生物合成并直接釋放。正如其名稱所提示的，這兩種類型的細(xì)菌毒素均具有致病性，促進(jìn)自血漿蛋白前體或細(xì)胞(單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等等)釋放大量?jī)?nèi)源性的、來自宿主的免疫性介質(zhì)。敗血癥/SIRS是針對(duì)各種各樣的侵害(這種侵害特別是感染因素例如細(xì)菌感染，但非感染性侵害也是熟知的和常見的)的急性全身性炎癥反應(yīng)。引起敗血癥/SIRS中所見的全身性炎癥反應(yīng)的是由各種免疫性介質(zhì)激活的免疫性過程，這些免疫性介質(zhì)例如是細(xì)胞因子、趨化因子、一氧化氮以及體內(nèi)其他的免疫介導(dǎo)性化合物。這些免疫性介質(zhì)引起敗血癥/SIRS中常見的威脅生命的全身性疾病。但在另一方面，這些免疫性介質(zhì)在局部是必需的，例如作為有效的抗細(xì)菌反應(yīng)，不同的是，當(dāng)其釋放入循環(huán)中時(shí)則具有潛在的危害。這些介質(zhì)釋放入循環(huán)后可引起互為因果的正反饋?zhàn)饔?，?dǎo)致全身進(jìn)一步釋放這些介質(zhì)，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，例如多器官衰竭和死亡。至關(guān)重要的炎性介質(zhì)為腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、組織生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、干擾素γ、白介素(IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23、IL-40，等等)、一氧化氮(NO)、花生四烯酸代謝物和前列腺素1和2(PGE1和PGE2)，等等。
實(shí)際上，敗血癥或膿毒血癥涉及血液中存在致病性微生物或其毒素以及與此相關(guān)的全身性炎癥性疾病。個(gè)體發(fā)生敗血癥的關(guān)鍵在于該個(gè)體感染了微生物，由于所述微生物出現(xiàn)于受累個(gè)體的血液中或者由于該個(gè)體的血液中出現(xiàn)所述微生物的毒素，而引起全身性釋放免疫性介質(zhì)。僅當(dāng)所述出現(xiàn)引起了涉及并影響整個(gè)肌體的全身性疾病時(shí)，才稱為敗血癥。
因此，敗血癥局限于那些特征在于個(gè)體的血液中出現(xiàn)微生物或其毒素的情況，且同時(shí)(分別)局限于所述個(gè)體對(duì)所述微生物的全身性反應(yīng)或所述個(gè)體對(duì)所述毒素的全身性反應(yīng)。在此，敗血癥包括嚴(yán)重的敗血癥和感染性休克，其中嚴(yán)重的敗血癥涉及的是伴有器官功能障礙的敗血癥，而感染性休克涉及的是伴有低血壓或伴有灌注異?；蛲瑫r(shí)伴有兩者的敗血癥。SIRS涉及的是敗血癥中所見的一類嚴(yán)重全身性疾病，但其同時(shí)也涉及那些血液中未出現(xiàn)致病性微生物或其毒素的全身性炎癥性疾病。
個(gè)體發(fā)生SIRS的關(guān)鍵在于出現(xiàn)一些免疫性介質(zhì)及其造成的影響，所述免疫性介質(zhì)產(chǎn)生涉及且影響整個(gè)肌體的全身性疾病。這種全身性免疫學(xué)應(yīng)答可以是多種臨床侵害的結(jié)果，所述臨床侵害例如創(chuàng)傷、燒傷以及胰腺炎。此外，燒傷患者無論是否合并呼吸道損傷通常均表現(xiàn)出由全身性炎癥引起的臨床相。術(shù)語“全身性”炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)即被用來指代患有這樣一種病癥的患者的體征和癥狀。SIRS的嚴(yán)重程度自出現(xiàn)心動(dòng)過速、呼吸急促、發(fā)熱和白細(xì)胞升高，到出現(xiàn)難治性低血壓，乃至出現(xiàn)休克和多器官系統(tǒng)功能障礙的最為嚴(yán)重的程度，而表現(xiàn)不一。對(duì)于遭受熱損傷的患者，引起SIRS的最常見的原因是燒傷本身。敗血癥，即出現(xiàn)感染或菌血癥的SIRS，也很常見。反應(yīng)過度的免疫系統(tǒng)可引起代謝、心血管、消化以及凝血等系統(tǒng)的病理學(xué)改變。細(xì)胞和體液機(jī)制均參與了這些疾病過程，并在各種燒傷和敗血癥模型中得到了廣泛的研究。術(shù)語全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)由American College of ChestPhysicians/Society for Critical Care Medicine(ACCP/SCCM)聯(lián)合會(huì)于1992年推薦使用，用于描述一種全身性炎癥反應(yīng)過程，而與其原因無關(guān)。這一提議的基礎(chǔ)在于臨床和實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果表明，多種情況，無論是感染性還是非感染性(即燒傷、缺血性再灌注損傷、多發(fā)性創(chuàng)傷、胰腺炎)，均誘發(fā)宿主產(chǎn)生相似的反應(yīng)。必需滿足兩種以上的下列情況才能做出SIRS的診斷 體溫＞38℃或＜36℃； 心率＞90次/分； 呼吸頻率＞20/分或Paco2＜32mmHg； 白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞12.000/μl、＜4000/μL、或不完全成熟(桿狀)型＞10％所有這些病理生理學(xué)改變必須是在沒有其他已知誘因(例如化療引起的粒細(xì)胞減少和白細(xì)胞減少)的情況下自基線出現(xiàn)的急性變化。
作為亞急性或慢性全身性炎癥反應(yīng)的一個(gè)具體代表，在此討論自身免疫性炎癥性疾病例如糖尿病的臨床表現(xiàn)。非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠是自身免疫性疾病的模型，在此為胰島素依賴型糖尿病(IDDM)，其主要臨床表現(xiàn)是血葡萄糖水平升高(高血糖癥)。所述的血葡萄糖水平升高的原因是胰腺的胰島中產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞受到自身免疫性炎癥破壞。其伴有胰島周圍和內(nèi)部的大量細(xì)胞侵潤(rùn)(胰島炎(insulitis)，這些細(xì)胞是CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的異質(zhì)性混合物。此外，在亞急性和慢性炎癥中，至關(guān)重要的炎性介質(zhì)是腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、組織生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、干擾素γ、白介素(IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23、IL-40)、一氧化氮(NO)、花生四烯酸代謝物和前列腺素1和2(PGE1和PGE2)，等等。
NOD小鼠模型中的原發(fā)性炎癥反應(yīng)是由炎性介質(zhì)介導(dǎo)的并針對(duì)β細(xì)胞，這種炎癥反應(yīng)是發(fā)生IDDM的根源性事件。當(dāng)NOD小鼠尚未出現(xiàn)糖尿病時(shí)即發(fā)生持續(xù)針對(duì)β細(xì)胞的炎癥。與該人類疾病相同，糖尿病發(fā)病是通過一種獨(dú)特的MHC II類基因與多種非連鎖基因座之間的多因子相互作用而介導(dǎo)的。此外，NOD小鼠極好地證明了遺傳與環(huán)境以及原發(fā)性與繼發(fā)性炎癥反應(yīng)之間的重要的相互作用，例如，其臨床表現(xiàn)取決于各種外界條件，最重要的是NOD小鼠所處環(huán)境中的微生物負(fù)荷。在糖尿病階段，小鼠(以及確診糖尿病的人類患者)的炎癥反應(yīng)是多種多樣的，這是由血糖水平高引起血管損害產(chǎn)生的全身性組織損害的結(jié)果，同樣，炎性介質(zhì)被釋放，且繼發(fā)性炎癥活躍，導(dǎo)致全身性炎癥，但其給患者帶來的后果卻比前一階段看起來要炎癥的多。
對(duì)于NOD小鼠中的明顯的自身免疫，針對(duì)各種抗原檢測(cè)到的絕大多數(shù)抗原特異性抗體和T細(xì)胞應(yīng)答均被測(cè)定為糖尿病患者中的自身抗原。了解這些自身抗原在NOD糖尿病中的作用有助于將針對(duì)致病性自身抗原的、導(dǎo)致糖尿病階段的起初的炎癥反應(yīng)與所觀察到的作為伴隨癥狀的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)進(jìn)一步區(qū)分開。
通常，T淋巴細(xì)胞在引發(fā)免疫介導(dǎo)的疾病過程中具有關(guān)鍵的作用。CD4+T細(xì)胞可分為至少兩種亞型，即Th1和Th2。活化的Th1細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α，而Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-10。Th1細(xì)胞關(guān)鍵性地參與產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫，而Th2細(xì)胞有助于產(chǎn)生體液和粘膜免疫以及過敏癥，包括嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的活化和產(chǎn)生IgE。一些研究在小鼠和人類的糖尿病與Th1表型之間建立了關(guān)聯(lián)。另一方面，Th2T細(xì)胞是相對(duì)無害的。一些人甚至認(rèn)為Th2 T細(xì)胞實(shí)際上可能具有保護(hù)作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞能夠?qū)⑻悄虿鬟f給原初受者( )的原因并不在于由TCR本身所識(shí)別的抗原特異性，而是在于T細(xì)胞應(yīng)答的表型特性。強(qiáng)烈分化的Th1 T細(xì)胞將疾病傳遞給NOD新生小鼠，而Th2 T細(xì)胞則不會(huì)，盡管其被活化并攜帶與致糖尿病Th1 T細(xì)胞群相同的TCR。此外，進(jìn)行共轉(zhuǎn)移后，Th2 T細(xì)胞不能改善Th1誘導(dǎo)的糖尿病，既便將Th2細(xì)胞以超過10倍的量進(jìn)行共轉(zhuǎn)移也是如此。
簡(jiǎn)言之，促成急性和全身性炎癥的至關(guān)重要的病理生理學(xué)事件是組織損傷，組織損傷后釋放了引發(fā)炎癥過程的炎性介質(zhì)，特別是細(xì)胞因子。這可以由機(jī)械創(chuàng)傷或熱創(chuàng)傷造成的組織直接損傷的結(jié)果，也可以是由免疫性或炎性介質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的結(jié)果，例如見于缺血再灌注損傷后或所述組織發(fā)生微生物感染過程中。細(xì)胞損傷導(dǎo)致急性釋放促炎性細(xì)胞因子。如果損傷嚴(yán)重，例如廣泛組織損傷，可釋放極大量的細(xì)胞因子，結(jié)果是誘導(dǎo)全身性炎癥反應(yīng)。宿主對(duì)這種全身性炎癥反應(yīng)的(急性或慢性)適應(yīng)能力取決于反應(yīng)的程度、反應(yīng)持續(xù)的時(shí)間、以及宿主的適應(yīng)能力。
本發(fā)明涉及肌體對(duì)重要的生理學(xué)過程進(jìn)行調(diào)節(jié)的內(nèi)在途徑，并基于WO99/59617、WO01/72831和PCT/NL02/00639中所提出的認(rèn)識(shí)。
這些在先申請(qǐng)公開了小的基因調(diào)節(jié)性肽，其天然存在于孕婦體內(nèi)，并來自于妊娠過程中產(chǎn)生的胎盤促性腺激素如人絨毛膜促性腺激素(hCG)的蛋白水解降解。這些肽(在其活性狀態(tài)下通常僅為大約4至6個(gè)氨基酸)被發(fā)現(xiàn)具有卓越的免疫學(xué)活性，它們可以通過調(diào)節(jié)編碼炎性介質(zhì)如細(xì)胞因子的基因的表達(dá)而發(fā)揮活性。令人驚異地，發(fā)現(xiàn)hCG的降解產(chǎn)生了一連串的肽，這些肽有助于維持孕婦的免疫學(xué)體內(nèi)平衡。這些肽是天然的自身物質(zhì)，其平衡免疫系統(tǒng)以確保母親保持健全的免疫系統(tǒng)，而同時(shí)其胎兒在孕期不會(huì)被過早排異，相反卻被安全地?cái)y帶于母體中直至出生。
通常認(rèn)為，蛋白質(zhì)的最小降解產(chǎn)物其自身不具有特別的生物學(xué)功能(除作為免疫系統(tǒng)的抗原以外)，而現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到，肌體實(shí)際上常規(guī)利用其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的蛋白水解降解這一正常過程來產(chǎn)生重要的基因調(diào)節(jié)性化合物，即一些調(diào)控肌體自身基因表達(dá)的短肽。顯然，肌體利用的是由其自身基因編碼的完整蛋白質(zhì)的小降解產(chǎn)物所調(diào)控的基因調(diào)控系統(tǒng)。
早已知道，在妊娠過程中，母體系統(tǒng)處于一種暫時(shí)性免疫調(diào)變狀態(tài)，其抑制了母體針對(duì)胎兒的排異反應(yīng)。與此相矛盾的是，在妊娠過程中，母親對(duì)感染的抵抗力通常是增強(qiáng)，且發(fā)現(xiàn)其可更好地抵抗如風(fēng)濕病和多發(fā)性硬化等自身免疫性疾病的臨床癥狀。因此，對(duì)胎兒的保護(hù)不能被解釋為僅僅是免疫抑制的結(jié)果。根據(jù)上述3個(gè)申請(qǐng)中所提出的觀點(diǎn)，可以理解母體保護(hù)與胎兒保護(hù)之間的免疫學(xué)平衡。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)hCG的某些短的降解產(chǎn)物(即一些短肽，其能夠容易地合成，如果需要可進(jìn)行修飾，且可用作藥物組合物)對(duì)由NFκB家族支配的促炎性或抗炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)具有主要的調(diào)節(jié)活性，NFκB家族是至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，其處于調(diào)控那些塑造肌體免疫應(yīng)答的基因表達(dá)的中樞。
妊娠過程中產(chǎn)生的絕大部分hCG是由胎盤細(xì)胞產(chǎn)生的，胎盤是母體和胎兒的細(xì)胞和組織接觸最密切且最需要進(jìn)行免疫調(diào)變以防止排異反應(yīng)的器官。在胎盤局部產(chǎn)生的這些來自hCG降解的基因調(diào)節(jié)性肽立即平衡母體與胎兒之間的這片“無主之地(no-mans land)”中的促炎性或抗炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)。由于是由典型的胎盤細(xì)胞即滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生的，這些肽可跨過細(xì)胞外間隙；進(jìn)入免疫系統(tǒng)的細(xì)胞并通過調(diào)變NFκB介導(dǎo)的細(xì)胞因子基因的表達(dá)而發(fā)揮其免疫調(diào)變活性，由此阻止胎盤處的免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
在此推測(cè)，在妊娠婦女中觀察到的對(duì)自身免疫性疾病的發(fā)生及其嚴(yán)重程度的有益影響，其原因在于體內(nèi)衍生于hCG的肽的總體過剩；不過，這些影響不能被估計(jì)過高，這可以簡(jiǎn)單地理解為，如果僅僅是因?yàn)轶w內(nèi)由胎盤產(chǎn)生的肽總體被稀釋，那么距離胎盤越遠(yuǎn)，所能看到的針對(duì)預(yù)防胎兒排異反應(yīng)的免疫調(diào)變活性就越小。但是，決不應(yīng)該認(rèn)為這些肽的免疫調(diào)變和基因調(diào)節(jié)活性僅僅出現(xiàn)于孕期且僅僅存在于胎盤；男人和女人均產(chǎn)生hCG，例如在垂體，并且大自然一定會(huì)在更大程度上利用肽的這些基因調(diào)節(jié)活性。
因此，利用基因調(diào)節(jié)性肽及其衍生物的藥用潛力，本發(fā)明提供了一種新的治療途徑。實(shí)際上，無論是通過基因陣列的在硅片上(in silico)表達(dá)譜研究，還是對(duì)處理的免疫細(xì)胞的體外研究，還是在以基因調(diào)節(jié)性肽處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)研究，均發(fā)現(xiàn)了那些由NFκB所驅(qū)動(dòng)的、各自或協(xié)同指揮肌體免疫應(yīng)答的促炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)或抗炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)的特異性上調(diào)或下調(diào)的證據(jù)。同樣，考慮到NFκB是疾病的一種主要的效應(yīng)分子(A.S.Baldwin，J.Clin.Invest.，2001，1073-6)，使用衍生于hCG的基因調(diào)節(jié)性肽為治療多種人類和動(dòng)物疾病提供了重要的前景，并可由此篩選出那些有助于保持母體免疫系統(tǒng)平衡以維持孕期安全的具有藥用潛力的確切物質(zhì)。


圖1以基因調(diào)節(jié)性肽4+5+6進(jìn)行粘膜治療(實(shí)驗(yàn)3，LQGV+GVLPALPQ+VLPALP(分別為SEQ ID NO1、23和4))使得不成熟的MP20強(qiáng)陽性骨髓細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)顯著增加。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及通過給患有疾病或被認(rèn)為患有疾病的個(gè)體經(jīng)粘膜施用、優(yōu)選地經(jīng)口服施用一種藥物組合物來治療所述個(gè)體，所述藥物組合物包含藥理學(xué)有效量的基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物以及藥物學(xué)可接受的稀釋劑。特別適用的藥物學(xué)可接受的稀釋劑是無菌水或等張鹽溶液，例如0.9％鹽水或磷酸緩沖液(PBS)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過給患有疾病或被認(rèn)為患有疾病的個(gè)體經(jīng)粘膜施用、優(yōu)選地經(jīng)口服施用一種藥物組合物來治療所述個(gè)體，所述藥物組合物包含藥理學(xué)有效量的兩種或兩種以上基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物以及藥物學(xué)可接受的稀釋劑。基因調(diào)節(jié)性肽的施用劑量可以有相當(dāng)寬的范圍。活性分子的施用濃度的低限受限于化合物的功效，而濃度的高限受限于化合物的溶解度。具體患者的最佳劑量應(yīng)該而且能夠通過參考一些相關(guān)因素而確定，例如患者的病情、體重和年齡以及有關(guān)醫(yī)生或醫(yī)學(xué)專家的其他考慮。
因此本發(fā)明涉及將調(diào)節(jié)性肽藥物組合物經(jīng)粘膜、優(yōu)選地經(jīng)口服施用于個(gè)體，以便在所述患者的整個(gè)肌體中產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的全身性調(diào)變。該基因調(diào)節(jié)性肽的有用的實(shí)例可選自寡肽LQG、AQG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、LQGA(SEQ ID NO3)、VLPALPQVVC(SEQ ID NO21)、VLPALP(SEQ ID NO4)、ALPALP(SEQ ID NO5)、VAPALP(SEQ ID NO6)、ALPALPQ(SEQ ID NO7)、VLPAAPQ(SEQ ID NO8)、VLPALAQ(SEQ ID NO9)、LAGV(SEQ IDNO10)、VLAALP(SEQ ID NO11)、VLPALA(SEQ ID NO12)、VLPALPQ(SEQ ID NO13)、VLAALPQ(SEQ ID NO14)、VLPALPA(SEQ ID NO15)、GVLPALP(SEQ ID NO16)、GVLPALPQ(SEQ IDNO23)、LQGVLPALPQVVC(SEQ ID NO17)、VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL (SEQ IDNO24)、RPRCRPINATLAVEK(SEQ ID NO25的1-15位氨基酸)、EGCPVCITVNTTICAGYCPT(SEQ ID NO25的16-35位氨基酸)、SKAPPPSLPSPSRLPGPS(SEQ ID NO26)、SIRLPGCPRGVNPVVS(SEQID NO27)、LPGCPRGVNPVVS(SEQ ID NO18)、LPGC(SEQ IDNO19)、MTRV(SEQ ID NO20)、MTR、VVC、QVVC(SEQ ID NO29)及其功能性類似物或衍生物。功能性類似物例如可見于來自妊娠婦女的尿液成分或商品化的hCG制劑，至少見于那些含有相當(dāng)量的hCG斷裂產(chǎn)物并具有基因調(diào)節(jié)活性的商品化制劑中，但是，使用此類尿液成分甚或商品化hCG制劑的一個(gè)缺點(diǎn)在于，它們可能不含有(足夠量的)活性化合物，因此優(yōu)選合成的肽。
本發(fā)明的藥物組合物中的基因調(diào)節(jié)性肽優(yōu)選為至多15個(gè)氨基酸，不過，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)更小的分子特別有效。令人驚異地，本發(fā)明在此提供了這樣一種觀點(diǎn)，即局部施用于粘膜的小肽可全身性調(diào)變或調(diào)節(jié)基因表達(dá)?？诜委熓莾?yōu)選的，但是本發(fā)明也提供了除口服以外的其他粘膜治療方式。優(yōu)選的肽是較大的多肽的斷裂產(chǎn)物，所述多肽例如是絨毛膜促性腺激素(CG)和生長(zhǎng)激素或生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、EGF、VEGF、RNA 3′末端磷酸環(huán)化酶和CAP18，或其合成物。優(yōu)選用于口服治療的是小于5個(gè)氨基酸的肽，即長(zhǎng)度為3或4個(gè)氨基酸。一般而言，此類調(diào)節(jié)性肽序列可衍生于由真核細(xì)胞和/或原核細(xì)胞產(chǎn)生的任何多肽分子的蛋白質(zhì)，且本發(fā)明提供了這樣的觀點(diǎn)，即多肽的斷裂產(chǎn)物、優(yōu)選地為具有在此提供的大小的、天然地作為基因調(diào)節(jié)性肽參與調(diào)變基因表達(dá)的寡肽，可通過粘膜施用以產(chǎn)生全身性作用。特別是提供了可自β-人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)、優(yōu)選地可自帶切口的(nicked)β-HCG獲得或衍生的(合成)基因調(diào)節(jié)性肽。以往認(rèn)為，β-hCG的斷裂產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)而參與免疫調(diào)變(WO99/59671、WO01/72831、PCT/NL02/00639)或參與衰竭綜合征的治療(WO97/49721)，但這些出版物中沒有給出其與全身性調(diào)變基因表達(dá)的關(guān)系，特別是其通過局部施用于粘膜或通過粘膜施用與全身性調(diào)變基因表達(dá)的關(guān)系。當(dāng)然，這樣的基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性等價(jià)物或衍生物可以得自或衍生于那些可被斷裂或蛋白水解的且與基因調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)關(guān)系密切的其他蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，肽信號(hào)分子得自具有至少10個(gè)氨基酸的肽，例如具有氨基酸序列MTRVLQGVLPALPQVVC(SEQ ID NO30)、SIRLPGCPRGVNPVVS(SEQ ID NO27)、VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL(SEQ IDNO24)、RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT(SEQ IDNO25)、CALCRRSTTDCGGPKDHPLTC(SEQ ID NO31)、SKAPPPSLPSPSRLPGPS(SEQ ID NO26)、CRRSTTDCGGPKDHPLTC(SEQ ID NO32)、TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO33)的肽。
實(shí)施例無意于受到理論的束縛，本發(fā)明人認(rèn)為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種出乎預(yù)料的基因調(diào)節(jié)模式，其對(duì)疾病的口服或粘膜治療法具有深遠(yuǎn)的影響。多肽，例如內(nèi)源性CG、EGF等，以及病原體多肽例如病毒、細(xì)菌或原蟲多肽，均易于斷裂為不同的寡肽，例如通過細(xì)胞內(nèi)蛋白水解。細(xì)胞內(nèi)廣泛存在不同的蛋白水解酶，例如在真核細(xì)胞的溶酶體或蛋白酶體系統(tǒng)中。產(chǎn)生的斷裂產(chǎn)物中有一些是長(zhǎng)度為3至15個(gè)氨基酸、優(yōu)選地4至9個(gè)氨基酸、最優(yōu)選地4至6個(gè)氨基酸的寡肽，令人驚異的是這些寡肽并非對(duì)細(xì)胞沒有任何功能或影響，而正如在此所證實(shí)的那樣，其有可能通過內(nèi)源性多肽斷裂的反饋機(jī)制作為信號(hào)分子參與基因表達(dá)調(diào)控，這一點(diǎn)可通過例如LQGV(SEQ ID NO1)、VLPALPQVVC(SEQ ID NO21)、LQGVLPALPQ(SEQ ID NO17)、LQG、GVLPALPQ(SEQ ID NO23)、VLPALP(SEQ ID NO4)、VLPALPQ(SEQ ID NO13)、GVLPALP(SEQID NO16)、VVC、MTRV(SEQ ID NO20)、和MTR等肽對(duì)基因轉(zhuǎn)錄因子如NFκB的活性或轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)而證實(shí)。上述這些肽的合成物以及這斷裂產(chǎn)物的功能性類似物或衍生物，可用于調(diào)變細(xì)胞中的基因表達(dá)和用于糾正基因表達(dá)的錯(cuò)誤的方法或用于全身性疾病的粘膜或口服治療法中。寡肽如LQG、AQG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV、LQGA(SEQ IDNO3)、VLPALP(SEQ ID NO4)、ALPALP(SEQ ID NO5)、VAPALP(SEQ ID NO6)、ALPALPQ(SEQ ID NO7)、VLPAAPQ(SEQ IDNO8)、VLPALAQ(SEQ ID NO9)、LAGV(SEQ ID NO10)、VLAALP(SEQ ID NO11)、VLPALA(SEQ ID NO12)、VLPALPQ(SEQ IDNO13)、VLAALPQ(SEQ ID NO14)、VLPALPA(SEQ ID NO15)、GVLPALP(SEQ ID NO16)、GVLPALPQ(SEQ ID NO23)、LQGVLPALPQVVC(SEQ ID NO17)、SIRLPGCPRGVNPVVS(SEQ IDNO27)、SKAPPPSLPSPSRLPGPS(SEQ ID NO26)、LPGCPRGVNPVVS(SEQ ID NO18)、LPGC(SEQ ID NO19)、MTRV(SEQ ID NO20)、MTR、VVC、或其功能性類似物或其較長(zhǎng)序列的三聚體或四聚體衍生物(包括斷裂產(chǎn)物)是特別有效的。具體而言，優(yōu)選用于口服施用的是LQG、QVV、PALP(SEQ ID NO34)、AQG、LAG、LQGV(SEQ IDNO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、和LAGV(SEQ ID NO10)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及經(jīng)粘膜施用、優(yōu)選地經(jīng)口服施用一種藥物組合物來治療患有或被認(rèn)為患有炎癥性疾病的個(gè)體，所述藥物組合物包含藥理學(xué)有效量的基因調(diào)節(jié)性肽，所述基因調(diào)節(jié)性肽能夠調(diào)節(jié)編碼炎性介質(zhì)例如細(xì)胞因子的基因的表達(dá)。可納入制藥用途用來通過粘膜施用治療疾病且特別是炎癥性疾病的基因調(diào)節(jié)性肽是那些天然存在于妊娠婦女體內(nèi)和來自于妊娠過程中產(chǎn)生的胎盤促性腺激素如人絨毛膜促性腺激素(hCG)經(jīng)蛋白水解斷裂的肽，不過，本領(lǐng)域人員同樣可以容易地合成這些肽的具有等同功能或類似活性的合成變體和修飾物，并可容易地測(cè)試其活性，例如通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，例如在此所述的以NOD小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于粘膜施用的藥物組合物，其包含基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，并提供了基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物在制備用于粘膜施用的藥物組合物中的用途。這種組合物最為適合施用于粘膜表面部位、口腔內(nèi)表面和舌面、(上、下)消化道表面、鼻和(上、下)呼吸道的粘膜表面，而考慮到粘膜表面通?？赏高^大多數(shù)長(zhǎng)度小于9個(gè)氨基酸、優(yōu)選地小于7個(gè)氨基酸、例如3或4個(gè)氨基酸的基因調(diào)節(jié)性肽，因此其常常不只影響到其所施用的部位，同時(shí)也最為適合用于對(duì)全身即整個(gè)肌體進(jìn)行治療。
本發(fā)明人在此提出有關(guān)細(xì)胞生物體中基因調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)因子的生物學(xué)和生理學(xué)特性的一種觀點(diǎn)，由此能夠加速作為基因調(diào)節(jié)物的人工或合成化合物的鑒別和開發(fā)，并能夠加速其作為新的化學(xué)本體(chemical entity)在制備用于粘膜施用的藥物組合物中的用途以及通過粘膜施用基因調(diào)節(jié)性肽而治療炎癥性疾病的用途。許多可通過生物體內(nèi)源性蛋白質(zhì)的蛋白水解斷裂作用而產(chǎn)生的、或可通過病原體蛋白質(zhì)的蛋白水解斷裂作用(即當(dāng)宿主生物體內(nèi)存在該病原體的過程中)而產(chǎn)生的小肽，對(duì)所述生物體的細(xì)胞施加通常為非常特異性的基因調(diào)節(jié)活性，本發(fā)明人提供的認(rèn)識(shí)在于，當(dāng)這些小肽通過粘膜攝取方式(例如通過口服、直腸施用、鼻部噴霧、上呼吸道氣霧劑施用，等等)施用時(shí)，實(shí)際上甚至可在全身水平施加這種活性。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明對(duì)于研究者有重要價(jià)值，有助于在質(zhì)和量上加深有關(guān)通過以粘膜施用(例如口服)的藥物組合物治療個(gè)體以調(diào)控個(gè)體的NFκB啟動(dòng)的基因表達(dá)和產(chǎn)生的炎癥性反應(yīng)的全身性機(jī)制。
這一觀點(diǎn)來自于兩方面。在一個(gè)用于測(cè)試粘膜攝取基因調(diào)節(jié)性肽的影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在非糖尿病性NOD小鼠的頰膜囊中每日一次滴加下調(diào)NFκB的肽，對(duì)這些小鼠的糖尿病的總體發(fā)生情況產(chǎn)生了預(yù)想不到的有益影響。顯著降低了胰島炎癥(糖尿病發(fā)病機(jī)理的主要炎癥)的發(fā)生率。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，給已經(jīng)發(fā)生糖尿病的NOD小鼠飲用含有或不含下調(diào)NFκB的肽的水，也觀察到了有益的影響，由血管損害引起的典型的繼發(fā)性和全身性炎癥的臨床后果得以顯著減輕，其中飲用水治療導(dǎo)致治療組與非治療組相比其體格狀況明顯更好。在粘膜或口服施用包含基因調(diào)節(jié)性肽(一種妊娠期產(chǎn)生的人絨毛膜促性腺激素(hCG)及其蛋白水解斷裂產(chǎn)物)的功能性類似物的藥物組合物的小鼠中觀察到了類似的結(jié)果，不過，觀察到了劑量和效果的批次差異，可能反映了所使用的調(diào)節(jié)性肽的濃度的批次差異。
基于這些觀點(diǎn)，本發(fā)明還提供了一種用于鑒別或獲得適合于粘膜或口服施用的基因調(diào)節(jié)性肽的篩選方法，其中所述基因調(diào)節(jié)性肽包含能夠(無論是在體外還是在實(shí)驗(yàn)性患病動(dòng)物如猴或小的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如大鼠或小鼠等的體內(nèi))調(diào)變細(xì)胞的基因表達(dá)的肽或其或其功能性衍生物或類似物，所述方法包含通過粘膜途徑給所述動(dòng)物提供至少一種肽或其衍生物或類似物，并確定所述動(dòng)物對(duì)治療的反應(yīng)或所述動(dòng)物中一或多種基因的表達(dá)或基因轉(zhuǎn)錄因子的活性和/或核轉(zhuǎn)移(nuclear translocation)。特別有用的是所述肽的長(zhǎng)度為3至15個(gè)氨基酸，更加優(yōu)選的是其中所述肽的長(zhǎng)度為3至9個(gè)氨基酸，最優(yōu)選地其中所述肽的長(zhǎng)度為3或4至6個(gè)氨基酸。
功能性衍生物或類似物在此涉及例如可通過測(cè)定肽或其類似物或衍生物對(duì)基因表達(dá)或有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)移(例如NFκB測(cè)試中的NFκB或AP-1測(cè)試中的AP-1)或通過現(xiàn)有技術(shù)中的其他方法而測(cè)定的基因調(diào)節(jié)作用或活性。片段可以在一側(cè)或兩側(cè)更短或更長(zhǎng)一些(即1或2個(gè)氨基酸)，但仍舊具有功能活性。
本發(fā)明所提供的篩選方法還包含確定所述基因轉(zhuǎn)錄因子是否調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，這例如可通過測(cè)定被處理的細(xì)胞或動(dòng)物內(nèi)的細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平或其實(shí)際存在情況，或者其中所述基因轉(zhuǎn)錄因子包含NFκB/Rel蛋白，或通過確定所述動(dòng)物所表達(dá)的至少一種感興趣的基因或所述動(dòng)物所表達(dá)的多種基因的相對(duì)上調(diào)和/或下調(diào)而實(shí)現(xiàn)，這可使用基因芯片技術(shù)容易地進(jìn)行。
當(dāng)然，本發(fā)明的目的在于提供用于粘膜施用的藥物組合物，例如口服施用，所述藥物組合物可作為信號(hào)分子用于調(diào)變細(xì)胞基因表達(dá)并可通過采用本發(fā)明的篩選方法而鑒別或獲得。在此已經(jīng)提供了作為NFκB/Rel蛋白介導(dǎo)的基因表達(dá)的調(diào)變劑(modulators)的有用的信號(hào)分子，下文還將詳述。本發(fā)明還提供了所述信號(hào)分子在制備用于(例如通過抑制NFκB/Rel蛋白的活化)調(diào)變基因表達(dá)的藥物組合物中的用途，或其在制備用于治療靈長(zhǎng)類動(dòng)物或家畜的藥物組合物中的用途。
小肽甚至斷裂產(chǎn)物可具有生物學(xué)活性這一點(diǎn)是已知的。來自于內(nèi)源性的或病原體的蛋白質(zhì)的蛋白水解斷裂產(chǎn)物可例如通過蛋白酶體系統(tǒng)常規(guī)產(chǎn)生，并呈遞于I或II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)。此外，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到那些熟知的神經(jīng)肽(也稱為肽類神經(jīng)遞質(zhì))或小的肽類激素，例如抗利尿激素、垂體后葉素、促甲狀腺素釋放激素、促性腺激素釋放激素、生長(zhǎng)抑素、胃泌素、膽囊收縮素、P物質(zhì)、腦啡肽、神經(jīng)降壓素(neurotensin)、血管緊張素、及其衍生物或等價(jià)物，具有通常通過細(xì)胞表面受體相互作用介導(dǎo)的不同的生物學(xué)活性。此外，現(xiàn)已知某些小的且富含精氨酸或賴氨酸或脯氨酸(即含有50％以上的精氨酸、或50％以上的賴氨酸、或50％以上的脯氨酸，或者含有50％以上的精氨酸和賴氨酸、或50％以上的精氨酸和脯氨酸、或50％以上的賴氨酸和脯氨酸，或者50％以上的精氨酸和賴氨酸和脯氨酸殘基)的肽具有不同的膜通透特性，這種膜通透特性可具有生物學(xué)活性。在此所用的基因調(diào)節(jié)性肽不同于熟知的神經(jīng)肽或肽類激素，也不同于上述富含精氨酸或賴氨酸或脯氨酸的肽。
本發(fā)明涉及適合于粘膜施用以對(duì)疾病進(jìn)行全身性治療的小肽，其中通過粘膜施用所述小肽，所述粘膜施用可對(duì)個(gè)體的疾病或病癥產(chǎn)生全身性的影響?；蛘{(diào)節(jié)性肽的粘膜應(yīng)用和全身性影響是令人驚訝的。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽是小肽，最優(yōu)選地為4至6個(gè)氨基酸的肽，2至3個(gè)氨基酸的肽也是非?？尚械?，7至15個(gè)氨基酸雖然也是可行的，但變得比較不適合用于粘膜施用，而10至15個(gè)氨基酸或更大的肽優(yōu)選地被斷裂為較小的、在功能上更具活性的片段。
如所述的，本發(fā)明提供了這樣一種觀點(diǎn)，即那些可通過生物體內(nèi)源性蛋白質(zhì)的蛋白水解斷裂作用而產(chǎn)生或獲得的小肽、或那些可通過病原體蛋白質(zhì)的蛋白水解斷裂作用(即當(dāng)宿主生物體內(nèi)存在該病原體的過程中)而產(chǎn)生或獲得的小肽，對(duì)所述生物體整個(gè)肌體的細(xì)胞可施加通常為非常特異性的且全身性的基因調(diào)節(jié)活性，即使是僅僅將其施用于所述生物體的粘膜表面時(shí)也是如此。這一觀點(diǎn)產(chǎn)生了一種關(guān)于全身性措施的直接啟示通過獲得有關(guān)小(寡)肽或其修飾物或衍生物(在此通稱為引導(dǎo)肽(lead peptide))在粘膜施用后的全身性調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力或傾向的信息而實(shí)施在此所提供的方法來鑒別信號(hào)分子，并產(chǎn)生了一種要嘗試并測(cè)試改變皮內(nèi)、經(jīng)皮或皮下施用的啟示。
可通過任何粘膜途徑、且有可能通過透過皮膚而將基因調(diào)節(jié)性肽施用和導(dǎo)入體內(nèi)。所述肽或其修飾物和衍生物可作為本體而施用，且可作為通過與無機(jī)酸(例如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫磺酸、和磷酸)；或與有機(jī)酸(例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、和反丁烯二酸)；或與無機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀)；或與有機(jī)堿(例如單、雙、三烴基和芳基胺和取代的乙醇胺)反應(yīng)形成藥物學(xué)可接受的酸或堿酸或堿加成鹽而施用。選定的肽及任何衍生的本體還可綴合DMSO、轉(zhuǎn)移肽(translocating peptides)、糖、脂質(zhì)、其他多肽、核酸和PNA；并作為綴合物在原位起作用或在到達(dá)靶組織或器官后釋放于局部而起作用。
本發(fā)明還提供了一種用于治療患病個(gè)體的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥理學(xué)有效量的基因調(diào)節(jié)性肽以及藥物學(xué)可接受的稀釋劑。具體而言，本發(fā)明提供了一種用于粘膜施用的藥物組合物，其包含基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，并提供基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物在制備用于粘膜施用的藥物組合物中的用途。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于粘膜施用的藥物組合物，其包含兩種或兩種以上基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，并提供了兩種或兩種以上基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物在制備用于粘膜施用的藥物組合物中的用途。
在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選地所述藥物組合物的形式適合于粘膜施用。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述適合于粘膜施用的形式選自噴劑、液體和凝膠，且優(yōu)選地具有水性基質(zhì)。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于治療患有疾病或病癥的患者的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥理學(xué)有效量的基因調(diào)節(jié)性肽以及藥物學(xué)可接受的稀釋劑，其中所述藥物組合物的形式適合于口服施用。優(yōu)選地所述適于口服施用的形式選自膠囊、片劑、液體、口服懸液、乳劑和粉劑。
盡管可通過已知的用于制備類似化合物的其他方法制備所述基因調(diào)節(jié)性肽(例如通過采用固相合成法)，在本申請(qǐng)的詳細(xì)描述部分提供了一種制備基因調(diào)節(jié)性肽的方法。在制備過程中，可使用的溶劑例如可以是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-丁醇、2-丁醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、己烷、二乙醚、水、乙酸、及其他溶劑。在制備所述基因調(diào)節(jié)性肽中也可使用含有鈀或鉬的催化劑。
無論以何種方式制得，基因調(diào)節(jié)性肽與藥理學(xué)可接受的有機(jī)酸或無機(jī)酸形成藥理學(xué)可接受的鹽，有機(jī)酸或無機(jī)酸例如為鹽酸、溴化氫、反丁烯二酸、磷酸、抗壞血酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、馬來酸、棕櫚酸及其他已知的酸。特別優(yōu)選的是鹽酸鹽和乙酸鹽?？赏ㄟ^將所述基因調(diào)節(jié)性肽與酸反應(yīng)而得到酸加成的鹽。
使化合物結(jié)晶化的方法可參見Chase et al.，Remington′sPharmaceutical Sciences(16th ed.，Mack Publishing Co.，Easton.PA，U.S.A.，1980)(″Remington′s″)，1535頁。
結(jié)晶形式的基因調(diào)節(jié)性肽可用于制備多種劑型，如噴灑用粉劑、重建用粉劑、片劑研制劑(例如分散片劑和皮下片劑)、其他片劑等等。
含有結(jié)晶形式的基因調(diào)節(jié)性肽的藥物組合物優(yōu)選地以單位劑型配藥，例如片劑、膠囊、丸劑、粉劑、顆粒、栓劑、無菌胃腸外溶液或混懸液以及非胃腸外溶液或混懸液，均含有合適量的所述基因調(diào)節(jié)性肽的藥用可接受的鹽。
用于制備此類劑型的方法和組成是本領(lǐng)域人員已知的。例如，Remington′s在1535至1552頁公開了制備粉劑的方法及其組成。吹入劑見1552頁，吹入器見1792頁。制備含有活性充分的片劑和丸劑的方法和組成見Remington′s，1553頁至1584頁。包被藥用劑型并制備緩釋藥物的方法見Remington′s，1585-1613頁。將這些內(nèi)容并入本文作為參考。
也可將結(jié)晶形式的基因調(diào)節(jié)性肽加入到用于植入患者體內(nèi)的裝置中。此類裝置及其可采用的聚合物以及兩者的制備方法可參見美國(guó)專利No.3,773,919、4,767,628、和4,675,189。例如，可將足量的結(jié)晶形式的基因調(diào)節(jié)性肽加入到PLAGA植入體中以便將基因調(diào)節(jié)性肽(例如每天5mg，達(dá)一個(gè)月)釋放入患者體內(nèi)。
含有所述結(jié)晶的藥物組合物相對(duì)于無定形產(chǎn)物(amorphous product)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，含有結(jié)晶鹽產(chǎn)物的藥物組合物具有兩倍于無定形產(chǎn)物的生物利用度，這樣在特定粘膜處可僅需要含有活性成分的絕對(duì)量的一半，由此可降低吹入的或以其他方式施用的成分的量并降低組合物的最終成本。所述粘膜可包括鼻粘膜和頰粘膜。
盡管所述含有結(jié)晶形式的基因調(diào)節(jié)性肽藥物組合物可與佐劑如助溶劑一起配制，但這不是必需的?？蓛H將藥物組合物中的結(jié)晶形式的基因調(diào)節(jié)性肽(即結(jié)晶形式的所述基因調(diào)節(jié)性肽的酸加成的鹽)施用于例如鼻粘膜，這是具有優(yōu)勢(shì)的。原因之一在于某些佐劑不適合長(zhǎng)期施用。然而，對(duì)于攝入所述基因調(diào)節(jié)性肽的具體個(gè)人來說長(zhǎng)期施用可能是必需的。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于佐劑一定會(huì)占據(jù)藥物組合物的一個(gè)部分，而該部分可能更適合用于基因調(diào)節(jié)性肽以便降低粘膜不適。
不過，如果需要，可在配制品中使用合適的助溶劑、緩沖劑、溶脹劑等等。緩沖劑優(yōu)選地為那些能夠保持所述基因調(diào)節(jié)性肽處于非離子化形式的緩沖劑。
施用的結(jié)晶形式的酸加成鹽/基因調(diào)節(jié)性肽的劑量一般取決于所治療的疾病的種類、患者的類型、年齡、健康狀況、體重、以及同時(shí)采用的(如果有的話)治療的類型和治療的時(shí)間長(zhǎng)短和頻率。
所以施用的劑型可隨治療過程而變化。為了治療疾病，要給患者施用化合物足夠長(zhǎng)的時(shí)間以減輕患者所患疾病的相關(guān)癥狀。這是可以改變的，不過，超過2個(gè)月的時(shí)間是特別優(yōu)選的。癥狀減輕后可停用所述化合物，以確定具體的患者是否仍然需要該治療。
要預(yù)防出現(xiàn)炎癥性疾病，并由此減少治療的需要，可在將來的某時(shí)將化合物施用于被認(rèn)為易感于炎癥性疾病的人(例如正在接受細(xì)胞毒藥物如長(zhǎng)春新堿的患者；糖尿病患者；酗酒者；等等)，只要其被認(rèn)為是易感的。預(yù)防性施用化合物的療程是可變的，不過，超過2個(gè)月的時(shí)間是同樣是優(yōu)選的。如果該人被認(rèn)為具有的對(duì)炎癥性疾病的易感性不再存在，則可停止使用所述化合物。但是，如果疾病的成因沒有消失(例如就糖尿病而言)，該人可終身需要施用所述化合物。
示例性地，施用的活性化合物的劑量水平可以為(鼻內(nèi))每天0.55mg至270mg之間。對(duì)于人類的治療，優(yōu)選地可采用的口服施用的每日劑量為8mg至120mg之間。
本發(fā)明提供了用于口服施用的藥物組合物，其包含基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，并提供了基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物在制備用于口服施用的藥物組合物中的用途。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于口服施用的藥物組合物，其包含兩種或兩種以上的基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，并提供了兩種或兩種以上基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物在制備用于口服施用的藥物組合物中的用途。
用于口服施用的劑量單位可包括一或多種基因調(diào)節(jié)性肽。術(shù)語“劑量單位”是指物理學(xué)分離的單位，其適合于作為人或動(dòng)物的單個(gè)劑量，每個(gè)劑量單位含有根據(jù)要達(dá)到的所需效果而計(jì)算出的預(yù)先確定量的活性物質(zhì)(如基因調(diào)節(jié)性肽)。
用于制備此類劑量單位的方法和組合物是本領(lǐng)域人員已知的。例如，標(biāo)準(zhǔn)的參考文獻(xiàn)公開了用于制備含有活性成分的片劑和丸劑的方法和組成，可參見Chase et al.，Remington′s Pharmaceutical Sciences.(16thed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，U.S.A.，1980)(″Remington′s″)，1553至1584頁。制備粉劑的方法及其組成見該參考文獻(xiàn)1535至1552頁。用于包被藥用劑型的方法見Remington′s，1585至1593頁。
為制備劑量單位，例如片劑，預(yù)期可采用常規(guī)的各種添加劑，例如填充劑、著色劑、聚合物粘合劑，等等。一般而言，只要不干擾活性化合物的功能，在一或多種組合物中可使用任何藥用可接受的添加劑。
可與所述組合物一同施用的合適的載體包括適量的乳糖、淀粉、纖維素衍生物等等。乳糖是優(yōu)選的載體，也可以使用載體的混合物。
制備用于口服施用的藥物組合物的方法包括將預(yù)先確定量的肽與預(yù)先確定量的載體混合，并將混合物轉(zhuǎn)化為第一劑量單位(如通過以所述混合物及任何所需的賦型劑進(jìn)行膠囊填充或片劑成型)。
制備本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)性產(chǎn)物的優(yōu)選的方法包括以熟知的方法將所需劑量的基因調(diào)節(jié)性肽加入到片劑中。含有不同量和不同類型的基因調(diào)節(jié)性肽的片劑或其他劑量單位的顏色可以是不同的，并可置于例如泡罩片劑的不同部分。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于直腸施用的藥物組合物，例如栓劑，其包含基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，并提供了所述基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物在制備用于直腸施用的藥物組合物中的用途。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于皮下或經(jīng)皮施用的藥物組合物，其包含所述基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，并提供了基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物在制備用于皮下或經(jīng)皮施用的藥物組合物中的用途。
在此提供的用于粘膜施用或通過皮膚施用的藥物組合物特別適合用于通過抑制NFκB/Rel蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞因子活化而調(diào)變基因表達(dá)。
NFκB/Rel蛋白是一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的且在進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì)(Rel)。熟知的是c-Rel、RelA(p65)、RelB、NFκB1(p50及其前體p105)、和NFKB2(p52及其前體p100)。絕大多數(shù)NFκB二聚體是轉(zhuǎn)錄活化因子；p50/p50和p52/p52同二聚體抑制其靶基因的轉(zhuǎn)錄。所有NFκB/Rel蛋白均具有高度保守的NH2-末端Rel同源結(jié)構(gòu)域(RHD)。RHD負(fù)責(zé)DNA結(jié)合、二聚化、并與被稱為IκB的抑制性蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。在靜息細(xì)胞中，NFκB/Rel二聚體結(jié)合于IκB并在胞漿中保持無活性形式。IκB是多基因家族(IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBepsilon、Bcl-3、和前體Rel蛋白質(zhì)p100和p105)的成員。其具有的多拷貝的錨蛋白重復(fù)序列通過RHD與NFκB相互作用(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)。在合適的刺激下，IκB被IκB激酶(IKK)磷酸化，被遍在蛋白連接酶復(fù)合體遍在蛋白化，并被26S蛋白酶體降解。NFκB被釋放并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)以啟動(dòng)基因表達(dá)。
NFκB對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)包括天然免疫應(yīng)答如由細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α、LT-α、LT-β、GM-CSF調(diào)節(jié)；表達(dá)粘附分子(ICAM、VCAM、內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞粘附分子[ELAM])、急性期蛋白(SAA)、誘導(dǎo)型酶(iNOS和COX-2)以及抗微生物肽(β-防衛(wèi)素)。對(duì)于過繼性免疫，MHC蛋白、IL-2、IL-12和IFN-α受到NFκB調(diào)節(jié)。總體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)那些在凋亡的調(diào)節(jié)中至關(guān)重要的基因(c-IAP-1和c-IAP-2、Fas配體、c-myc、p53和細(xì)胞周期蛋白D1。
考慮到NFκB和有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子是最重要的促炎性轉(zhuǎn)錄因子，且考慮到本發(fā)明提供了適于粘膜施用的、能夠全身性抑制NFκB且同樣能夠抑制其他促炎性轉(zhuǎn)錄因子的基因調(diào)節(jié)性肽及其功能性類似物或衍生物(在此也稱為NFκB抑制劑)，本發(fā)明提供了用于全身性調(diào)變NFκB活化的基因表達(dá)的方法和組合物，特別是用于抑制表達(dá)，并由此抑制關(guān)鍵的促炎性途徑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過口服施用所述基因調(diào)節(jié)性肽，以便在全身，而不是其所施用的粘膜表面，發(fā)揮其活性。
通過粘膜施用(例如口服施用)而全身性抑制該促炎性途徑的能力的結(jié)果是廣泛而深遠(yuǎn)的。
一方面，提供了一種新的治療途徑，其使用粘膜施用或口服施用的基因調(diào)節(jié)性肽及其衍生物的藥用潛能以產(chǎn)生目的在于調(diào)變NKκB介導(dǎo)的疾病的全身性應(yīng)答。此前，本發(fā)明人給出了證據(jù)說明，通過基因陣列的在硅片上表達(dá)譜研究，對(duì)處理的免疫細(xì)胞的體外研究，以及在以基因調(diào)節(jié)性肽處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)研究，均發(fā)現(xiàn)了那些由NFκB所驅(qū)動(dòng)的、各自或協(xié)同指揮肌體免疫應(yīng)答的促炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)或抗炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)的特異性上調(diào)或下調(diào)。同樣，考慮到NFκB是疾病的一種主要的效應(yīng)分子，使用衍生于hCG的基因調(diào)節(jié)性肽通過口服或其他粘膜施用，為治療多種人類和動(dòng)物疾病提供了重要的前景，并由此篩選出那些有助于保持母體免疫系統(tǒng)平衡的具有全身性藥用潛力的確切物質(zhì)，從而通過粘膜施用且優(yōu)選地通過口服施用基因調(diào)節(jié)性肽而維持孕期安全。
NFκB調(diào)變的疾病最先見于此前已經(jīng)討論過的炎癥性疾病。
可采用在此提供的藥物組合物進(jìn)行口服治療的病癥優(yōu)選地包括亞急性或慢性炎癥性疾病，例如I型或II型糖尿病、風(fēng)濕性疾病、干燥綜合征、多發(fā)性硬化、移植相關(guān)性免疫應(yīng)答如移植物抗宿主病、輸血后血小板減少、亞急性和慢性移植排異反應(yīng)、先兆子癇、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、神經(jīng)或精神疾病的炎癥性部分、動(dòng)脈硬化、哮喘、過敏癥和慢性自身免疫性疾病。特別是口服治療全身性自身免疫性疾病可非常有助于治療患有慢性、免疫介導(dǎo)的炎癥，例如自身免疫性疾病?？扇绱酥委煹淖陨砻庖咝约膊》址窍拗菩詫?shí)例包括橋本氏甲狀腺炎、原發(fā)性粘液水腫性甲狀腺毒癥、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、Addison病、早期絕經(jīng)、胰島素依賴型糖尿病、僵體綜合征、肺出血腎炎綜合征、重癥肌無力、男性不育、尋常型天皰瘡、類天皰瘡、交感性眼炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、多發(fā)性硬化、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、特發(fā)性白細(xì)胞減少、原發(fā)性膽汁性肝硬化、慢性活動(dòng)性肝炎、原因不明性肝硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、干燥綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮肌炎、多肌炎、硬皮病、混合結(jié)締組織病、盤狀紅斑狼瘡和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
本發(fā)明因此也涉及治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的炎癥成分或所謂的神經(jīng)免疫性疾病，如精神分裂癥，躁狂抑郁癥及其他雙相性精神障礙，產(chǎn)后精神病and孤獨(dú)癥。本發(fā)明提供了用于調(diào)變對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，其包含將基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物提供給所述對(duì)象。本發(fā)明還提供了NFκB下調(diào)性肽或其功能性類似物在制備用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物中的用途。
本發(fā)明提供了用于調(diào)變對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，其包含給所述對(duì)象口服提供基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，特別是其中所述調(diào)節(jié)性肽下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄因子(例如NFκB/Rel蛋白)的轉(zhuǎn)移和/或活性。優(yōu)選的用于通過口服治療以調(diào)變神經(jīng)系統(tǒng)疾病的肽是LQG、QVV、PALP(SEQID NO34)、AQG、LAG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ IDNO2)、或LAGV(SEQ ID NO10)。所述肽也用來制備用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，特別是其中所述肽或類似物選自在經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞或未經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中具有NFκB下調(diào)活性的肽類似物。
本發(fā)明還涉及口服治療多發(fā)性硬化，且特別涉及治療在該疾病的進(jìn)展期所見的炎癥性損害，如反復(fù)急性發(fā)作，即通常所知的多發(fā)性硬化的發(fā)或惡化，即復(fù)發(fā)性/緩解性疾病(relapsing/remitting disease)。本發(fā)明提供了用于調(diào)變對(duì)象的例如多發(fā)性硬化中所見的復(fù)發(fā)性/緩解性疾病的方法，其包含經(jīng)基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物口服提供給所述對(duì)象。
本發(fā)明具體提供了用于調(diào)變對(duì)象的例如多發(fā)性硬化中所見的復(fù)發(fā)性/緩解性疾病的方法，其包含給所述對(duì)象口服基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，具體而言，其中所述基因調(diào)節(jié)性肽下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)移和/或活性，優(yōu)選地其中所述基因轉(zhuǎn)錄因子包含其轉(zhuǎn)移和/或活性被抑制的NFκB/Rel蛋白。優(yōu)選地當(dāng)所述對(duì)象出現(xiàn)臨床癥狀加重時(shí)口服施用這樣的肽，優(yōu)選地所述肽選自LQG、QVV、PALP(SEQ ID NO34)、AQG、LAG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、LAGV(SEQ IDNO10)。
本發(fā)明還提供了這樣的NFκB下調(diào)性肽或其功能性類似物在制備用于治療如多發(fā)性硬化中所見的復(fù)發(fā)性/緩解性疾病的藥物組合物中用途。
因此，本發(fā)明還涉及糖尿病的治療。本發(fā)明提供了用于調(diào)變對(duì)象的糖尿病的方法，其包含給所述對(duì)象口服基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物。本發(fā)明還提供了NFκB下調(diào)性肽或其功能性類似物在制備用于口服治療糖尿病的藥物組合物中的用途。
本發(fā)明提供了用于調(diào)變對(duì)象的糖尿病的方法，其包含給所述對(duì)象口服基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，具體而言，其中所述調(diào)節(jié)性肽下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)移和/或活性，所述基因轉(zhuǎn)錄因子例如為NFκB/Rel蛋白。用于通過口服治療而調(diào)變糖尿病的肽優(yōu)選地是LQG、QVV、PALP(SEQ ID NO34)、AQG、LAG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ IDNO2)、或LAGV(SEQ ID NO10)。所述肽也可用于制備用于通過口服施用治療糖尿病的藥物組合物，特別是其中所述肽或類似物選自在經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞或未經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中具有NFκB下調(diào)活性的肽類似物。
本發(fā)明還提供了用于治療絕經(jīng)期病癥或絕經(jīng)后病癥(例如骨質(zhì)疏松癥)的方法，其包含以本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)性肽進(jìn)行口服或粘膜治療，以全身性調(diào)變和抑制破骨細(xì)胞的分化并抑制TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡，由此限制骨結(jié)構(gòu)的溶解，而后者在不再具有天然來源的hCG且因此缺乏如在此所示的來源于hCG的信號(hào)分子調(diào)變作用的絕經(jīng)后婦女中十分顯著。本發(fā)明因此提供了對(duì)骨骼疾病，例如骨質(zhì)疏松癥(其通常見于，但并不僅僅見于絕經(jīng)后婦女)，進(jìn)行粘膜或口服治療的方法。此外，在此提供的NO和TNF-α調(diào)變劑抑制牙周炎的炎癥反應(yīng)和骨丟失。此外，考慮到TNF-α活性與強(qiáng)直性脊柱炎的臨床表現(xiàn)的炎癥程度，本發(fā)明也涉及使用在此提供的基因調(diào)節(jié)性肽治療脊柱炎。用于通過口服治療而調(diào)變絕經(jīng)期、絕經(jīng)后或骨質(zhì)疏松癥的優(yōu)選的為QVV、PALP(SEQ ID NO34)、AQG、LAG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、或LAGV(SEQ ID NO10)。
本發(fā)明還涉及口服或粘膜治療缺血事件如中風(fēng)或心肌梗死。
缺血事件是指組織的血液供應(yīng)受阻。這種受阻使得受累血管內(nèi)層的內(nèi)皮組織變得具有“粘性”，并開始吸引循環(huán)的白細(xì)胞。結(jié)合于內(nèi)皮細(xì)胞的白細(xì)胞最終遷移進(jìn)入受累組織，導(dǎo)致顯著的組織損傷。盡管急性心肌梗死和中風(fēng)均不是由炎癥直接導(dǎo)致，但急性缺血事件后出現(xiàn)的許多潛在的病理學(xué)和損傷是由在受累器官恢復(fù)血流的再灌注過程中的急性炎癥性反應(yīng)引起的。缺血組織的早期血流重建對(duì)阻止與氧供應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)輸送降低相關(guān)的細(xì)胞損傷的進(jìn)展是至關(guān)重要的。這為將缺血時(shí)間降至最低是減小缺血損傷程度的唯一重要干預(yù)措施這一觀點(diǎn)提供了依據(jù)。然而，已經(jīng)充分認(rèn)識(shí)到缺血組織的再灌注可引發(fā)一連串復(fù)雜反應(yīng)，其反而會(huì)損傷組織。盡管已經(jīng)提出了若干機(jī)制以試圖解釋缺血—再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制，但絕大多數(shù)關(guān)注的焦點(diǎn)是活性氧和氮的代謝產(chǎn)物以及炎性白細(xì)胞的作用。除了局部的組織損傷，遠(yuǎn)處的器官也可受累，特別是當(dāng)缺血后組織(例如腸道)的炎性反應(yīng)強(qiáng)度非常高的情況下。缺血—再灌注損傷的遠(yuǎn)程效應(yīng)最常見于肺和(心或腦)血管系統(tǒng)，并可導(dǎo)致發(fā)生全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能衰竭綜合征(MODS)，兩者占三級(jí)轉(zhuǎn)診醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)中死亡率的30-40％。
本發(fā)明提供了用于調(diào)變或治療對(duì)象的這種缺血事件的方法，其包含給所述對(duì)象口服或粘膜施用基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，具體而言，其中所述肽下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)移和/或活性，優(yōu)選地其中所述基因轉(zhuǎn)錄因子包含NFκB/Rel蛋白，且其中所述NFκB/Rel蛋白的轉(zhuǎn)移和/或活性被抑制。對(duì)于粘膜或口服施用，優(yōu)選地所述肽選自在經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中具有NFκB下調(diào)活性的肽，特別是所述對(duì)象具有在所述缺血事件后發(fā)生再灌注損傷的風(fēng)險(xiǎn)。
為實(shí)現(xiàn)通過口服或粘膜施用進(jìn)行快速臨床干預(yù)，優(yōu)選地所述肽選自在未經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中具有NFκB下調(diào)活性的肽，然后可給所述對(duì)象施用溶栓劑，例如所述溶栓劑包含組織纖溶酶原活性。
此外，本發(fā)明提供了基因調(diào)節(jié)性肽，優(yōu)選地所述肽包含NFκB下調(diào)性肽或其功能性類似物，在制備用于口服或粘膜治療對(duì)象在發(fā)生缺血事件后出現(xiàn)再灌注損傷的藥物組合物中的用途。用于口服治療如再灌注損傷的最優(yōu)選的肽是AQGV(SEQ ID NO2)。
本發(fā)明還涉及口服或粘膜治療如創(chuàng)傷或大手術(shù)后所見的免疫抑制作用。在美國(guó)，創(chuàng)傷后的所有晚期死亡中的60％是創(chuàng)傷后敗血癥所致。創(chuàng)傷患者易發(fā)生敗血癥的原因至少部分在于創(chuàng)傷、燒傷和出血后出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞免疫抑制。對(duì)發(fā)生創(chuàng)傷或其他威脅生命的事件后的神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系了解甚少且還在研究中。最近的綜述強(qiáng)調(diào)了創(chuàng)傷后自垂體-腎上腺軸釋放的激素和兒茶酚胺的急劇上升的復(fù)雜性質(zhì)，其可能是通過脊髓沿著受損組織的傳入神經(jīng)元而介導(dǎo)的。此外，通常存在免疫系統(tǒng)的廣泛抑制。本發(fā)明提供了用于口服或粘膜治療對(duì)象的免疫抑制狀態(tài)的方法，其包含給所述對(duì)象口服或粘膜施用基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物。此類治療特別適用于已經(jīng)發(fā)生可能導(dǎo)致免疫抑制狀態(tài)的創(chuàng)傷或大手術(shù)的對(duì)象。優(yōu)選地所述肽或類似物上調(diào)基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)移和/或活性，所述基因轉(zhuǎn)錄因子例如是NFκB/Rel蛋白AP-1蛋白。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肽選自在未經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中具有NFκB上調(diào)活性的肽；該治療也特別適用于當(dāng)所述對(duì)象具有發(fā)生反向抗炎癥反應(yīng)綜合征(counter anti-inflammatory response syndrome)的風(fēng)險(xiǎn)的情況，特別是所述肽選自在經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中具有NFκB上調(diào)活性的肽。其他治療可包括給所述對(duì)象提供針對(duì)播散性血管內(nèi)凝血的藥劑，例如所述藥劑包含活性的蛋白C活性。此外，本發(fā)明提供了基因調(diào)節(jié)性肽，具體為NFκB上調(diào)性肽或其功能性類似物，在制備用于口服或粘膜治療對(duì)象的免疫抑制狀態(tài)或反向抗炎癥反應(yīng)綜合征的藥物組合物中的用途。
本發(fā)明還涉及(獸)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并涉及口服或粘膜治療患有醫(yī)原性疾病的對(duì)象(無論是人或動(dòng)物)，即患有因醫(yī)學(xué)治療引起的問題或并發(fā)癥的對(duì)象。由例如內(nèi)科醫(yī)生或外科醫(yī)生的活動(dòng)導(dǎo)致的醫(yī)原性事件在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中是常見的且通常可能是無法避免的。出現(xiàn)各種不良情況的原因可以是處理不當(dāng)或疏忽，例如錯(cuò)誤地選擇或?qū)嵤┲委?、在手術(shù)過程中錯(cuò)誤放置或忘記取出手術(shù)器械，等等。不過，大多數(shù)治療性干預(yù)或手術(shù)，既便其本身的選擇是正確的且實(shí)施是適當(dāng)?shù)?，也可以，甚至是在其有益作用之外，?dǎo)致患者出現(xiàn)不良情況，且通常是炎癥性情況。此外，在感染性疾病中，既便是經(jīng)過驗(yàn)證的治療，例如抗生素或抗病毒治療，也具有醫(yī)原性不良反應(yīng)，其通常涉及這些治療恰恰所針對(duì)的微生物的裂解或破壞，以及微生物膜碎片和/或毒素的釋放，而這又誘導(dǎo)釋放其他促炎性細(xì)胞因子。無論原因如何，大多數(shù)醫(yī)原性事件(在此被定義為因使用藥物組合物或通過內(nèi)科或外科操作對(duì)人或動(dòng)物進(jìn)行治療而引起的病癥或疾病)導(dǎo)致所述對(duì)象的細(xì)胞或組織的損傷、破壞或溶解，引起釋放其他促炎性細(xì)胞因子。
本發(fā)明提供了用于治療對(duì)象的醫(yī)原性事件的方法，其包含給所述對(duì)象口服或粘膜施用基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，特別是當(dāng)所述肽調(diào)變基因轉(zhuǎn)錄因子如NFκB/Rel蛋白的轉(zhuǎn)移和/或活性、或?qū)е翹FκB/Rel蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞因子基因表達(dá)的抑制。當(dāng)所述醫(yī)原性事件包含所述對(duì)象的細(xì)胞或組織的破壞或溶解、或所述對(duì)象內(nèi)的病原體的破壞或溶解的情況時(shí)，特別適合通過口服或粘膜治療該對(duì)象，例如其中所述溶解的原因是以藥物組合物治療所述對(duì)象，例如該藥物組合物選自抗原、疫苗、抗體、抗凝劑、抗生素、抗毒素、抗菌劑、抗寄生蟲劑、抗原蟲劑、抗真菌劑、抗病毒劑、細(xì)胞毒劑、細(xì)胞抑制劑、溶栓劑。當(dāng)所述溶解的原因是以病毒例如溶解性噬菌體治療所述對(duì)象時(shí)，該治療也是有用的。本發(fā)明還提供了包含NFκB下調(diào)性肽或其功能性類似物的信號(hào)分子在制備用于口服或粘膜治療對(duì)象在發(fā)生醫(yī)原性事件后出現(xiàn)的促炎性細(xì)胞因子應(yīng)答的藥物組合物這的用途。
可以本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)行粘膜或口服治療的疾病或病癥的其他實(shí)例包括急性炎癥性疾病，例如(超)急性移植排異反應(yīng)、敗血癥/SIRS(例如燒傷后)和急性自身免疫性疾病。
具體而言，本發(fā)明提供了口服或粘膜治療急性全身性疾病如敗血癥/SIRS。敗血癥/SIRS是針對(duì)多種有害損傷(特別是感染如細(xì)菌感染引起的損傷，但也可以是熟知的且常見的非感染性損傷)的急性全身性炎癥反應(yīng)。見于敗血癥/SIRS的全身性炎癥反應(yīng)由免疫過程引起，所述免疫過程由多種免疫性介質(zhì)如細(xì)胞因子、趨化因子、一氧化氮、以及肌體的其他介導(dǎo)免疫的化合物而激活。免疫性介質(zhì)常見為敗血癥/SIRS中所見的引起威脅生命的全身性疾病。
本發(fā)明提供了用于治療對(duì)象的敗血癥/SIRS的方法，其包含給所述對(duì)象口服或粘膜施用基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，特別是當(dāng)所述肽調(diào)變基因轉(zhuǎn)錄因子如NFκB/Rel蛋白的轉(zhuǎn)移和/或活性、或?qū)е翹FκB/Rel蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞因子基因表達(dá)的抑制的情況下。當(dāng)所述敗血癥/SIRS的基礎(chǔ)在于所述對(duì)象的細(xì)胞或組織正在被破壞或溶解、或所述對(duì)象內(nèi)的病原體正在被破壞或溶解的時(shí)候，特別適合于通過口服或粘膜治療該對(duì)象。本發(fā)明還提供了基因調(diào)節(jié)性肽，具體為NFκB下調(diào)性肽或其功能性類似物，在制備用于治療對(duì)象的全身性炎癥反應(yīng)綜合征或敗血癥的藥物組合物中的用途。
基因調(diào)節(jié)性肽的基因調(diào)節(jié)活性，具體為如選自LQG、AQG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、LQGA(SEQ ID NO3)、VLPALP(SEQ ID NO4)、ALPALP(SEQ ID NO5)、VAPALP(SEQ IDNO6)、ALPALPQ(SEQ ID NO7)、VLPAAPQ(SEQ ID NO8)、VLPALAQ(SEQ ID NO9)、LAGV(SEQ ID NO10)、VLAALP(SEQ IDNO11)、VLAALP(SEQ ID NO11)、VLPALA(SEQ ID NO12)、VLPALPQ(SEQ ID NO13)、VLAALPQ(SEQ ID NO14)、VLPALPA(SEQ ID NO15)、GVLPALP(SEQ ID NO16)、LQGVLPALPQVVC(SEQ ID NO17)、LPGCPRGVNPVVS(SEQ ID NO18)、LPGC(SEQ IDNO19)、MTRV(SEQ ID NO20)、MTR、VVC的NFκB調(diào)節(jié)性肽的基因調(diào)節(jié)活性表現(xiàn)如下。經(jīng)典地，很多基因并不是受進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，而是受結(jié)合于細(xì)胞表面特異性受體的分子的調(diào)節(jié)。細(xì)胞表面受體與其配體之間的相互作用可繼而引起一連串的細(xì)胞內(nèi)事件，包括所謂第二信使(甘油二酯、Ca2+、環(huán)核苷酸)的細(xì)胞內(nèi)水平的變化。第二信使隨后經(jīng)由環(huán)AMP、環(huán)GMP、鈣活化的蛋白激酶、和二酰基甘油(diaglycerol)活化的蛋白激酶C引起蛋白質(zhì)磷酸化等改變。很多此類針對(duì)配體與細(xì)胞表面受體的結(jié)合的經(jīng)典應(yīng)答發(fā)生于細(xì)胞漿內(nèi)，其并不導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)的基因立即活化。但是已知一些受體-配體相互作用可使得一組特異的且有限的基因發(fā)生迅速的細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活化，但在準(zhǔn)確確定這種活化是如何實(shí)現(xiàn)的這方面進(jìn)展很緩慢。在少數(shù)情況中，已經(jīng)表征了應(yīng)答于細(xì)胞表面信號(hào)的轉(zhuǎn)錄蛋白。
細(xì)胞表面相互作用引起的已有的非活化的轉(zhuǎn)錄因子被活化的最清楚的實(shí)例之一是核因子(NF)κB，其最初是因?yàn)槠浯碳淋巴細(xì)胞內(nèi)編碼κ型免疫球蛋白輕鏈的基因的轉(zhuǎn)錄而鑒定的。κ基因中的NKκB的結(jié)合位點(diǎn)是十分清楚的(見例如P.A.Baeuerle and D.Baltimore，1988，Science242540)，這為分析是否存在該活性因子提供了分析方法。淋巴細(xì)胞的細(xì)胞漿中的所述因子與抑制劑形成復(fù)合物。以溫和變性條件在體外處理分離的復(fù)合物可使所述復(fù)合物解離，由此釋放出NKκB以結(jié)合其DNA位點(diǎn)?，F(xiàn)已知多種刺激可引起活性NFκB在細(xì)胞內(nèi)釋放，所述刺激包括以細(xì)菌脂多糖(LPS)和細(xì)胞外多肽以及刺激細(xì)胞內(nèi)磷酸激酶的化學(xué)分子(如佛波酯)處理細(xì)胞。因此，由許多可能的刺激引發(fā)的磷酸化事件可使NFκB轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)。所述活性因子然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，其僅僅刺激那些具有活性NFκB的結(jié)合位點(diǎn)的基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如上所述的多種短肽對(duì)NFκB活性具有調(diào)節(jié)活性。
考慮到炎癥反應(yīng)參與介質(zhì)的順序釋放以及循環(huán)的白細(xì)胞的募集，而白細(xì)胞在炎癥區(qū)域被激活并釋放出更多的介質(zhì)(Nat.Med.71294；2001)，本發(fā)明人認(rèn)為可將NFκB調(diào)節(jié)性肽應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，例如通過施用藥物組合物，并提供了將其用于醫(yī)學(xué)的方法?？紤]到NFκB被廣泛認(rèn)為是疾病的一種主要的效應(yīng)分子(A.S.Baldwin，J.Clin.Invest.，2001，1073-6)，因此眾多人正在開發(fā)可用于治療慢性和急性病癥的安全的NFκB抑制劑。
本發(fā)明在此提供了，例如可與使用灌注液對(duì)移植物進(jìn)行灌注的方法同時(shí)或分別進(jìn)行的，以口服或粘膜施用的藥物組合物治療所述移植物的受者，所述藥物組合物包含至少一種基因調(diào)節(jié)性肽，優(yōu)選地為在此提供的NFκB下調(diào)性肽；由此可顯著減輕由于移植物和/或受者中的NFκB活化而引起的缺血性或植入后損傷，延長(zhǎng)移植物的存活和使用?，F(xiàn)提供所述用途還可降低慢性移植排異反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，提高移植物的存活。本發(fā)明提供了用于避免所述移植物的受者發(fā)生急性且特別是慢性移植排異反應(yīng)、并提高移植物存活的方法，其包含給所述受者口服和粘膜施用基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，在此也稱為信號(hào)分子。優(yōu)選地所述肽的長(zhǎng)度為3至15個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地所述肽的長(zhǎng)度為3至9個(gè)氨基酸，最優(yōu)選地所述肽的長(zhǎng)度為4至6個(gè)氨基酸。特別優(yōu)選地，所述信號(hào)分子能夠抑制NFκB/Rel蛋白的活性。
功能性類似物在此是指信號(hào)分子效應(yīng)和活性，例如可通過測(cè)定相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)移而進(jìn)行測(cè)定，例如NFκB采用NFκB分析法，而AP-1采用AP-1分析法，和通過采用在此所提供的其他方法。片段在其一端或兩端可以略微小或略大(即1或2個(gè)氨基酸)，但仍然產(chǎn)生功能活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用作信號(hào)分子或基因調(diào)節(jié)性肽的肽是化學(xué)修飾的肽。肽修飾包括磷酸化(如Tyr、Ser或Thr殘基)、N端乙酰化、C端酰胺化、C端酰肼、C端連接甲酯、脂肪酸、磺基化(酪氨酸)、N端丹磺?；?、N端琥珀酰化、三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酸(PAM3 Cys-OH)以及Cys殘基的法呢基化?？稍诶珉膬?yōu)化方法中對(duì)肽進(jìn)行系統(tǒng)性化學(xué)修飾。
可采用各種已知的方法獲得合成肽，這些方法包括固相肽合成(SPPS)和溶液相有機(jī)合成(SPOS)技術(shù)。SPPS是合成肽和小蛋白質(zhì)的快速、簡(jiǎn)便的方法。C端的氨基酸典型地通過與接頭分子形成酸不穩(wěn)定性鍵連接于交聯(lián)的聚苯乙烯樹脂。該樹脂不溶于合成法中所用的溶劑，因此可相對(duì)簡(jiǎn)單快速地洗去過多的試劑和副產(chǎn)品。肽或其功能性類似物、修飾物或衍生物可以其本體進(jìn)行施用或以其藥用可接受的酸或堿加成鹽而施用，所述酸或堿加成鹽可通過與無機(jī)酸(例如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫磺酸、和磷酸)反應(yīng)形成；或與有機(jī)酸(例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、和反丁烯二酸)反應(yīng)形成；或與無機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀)反應(yīng)形成；或與有機(jī)堿(例如單、雙、三烴基和芳基胺和取代的乙醇胺)反應(yīng)形成。所選的肽及任何衍生的本體還可綴合糖、脂質(zhì)、其他多肽、核酸和PNA；并作為綴合物在原位起作用或在達(dá)到靶組織或器官后在局部釋放。
應(yīng)答于各種病理生理學(xué)信號(hào)和發(fā)育信號(hào)，NFκB/Rel轉(zhuǎn)錄因子家族被激活并在它們之間形成不同類型的異二聚體和同二聚體，以調(diào)節(jié)含有κB-特異性結(jié)合位點(diǎn)的靶基因的表達(dá)。NFκB轉(zhuǎn)錄因子是以Rel同源結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣鞯南嚓P(guān)蛋白質(zhì)家族的異或同二聚體。它們形成兩個(gè)亞家族，即含有活化結(jié)構(gòu)域的亞家族(p65-RELA、RELB、和c-REL)和不含活化結(jié)構(gòu)域的亞家族(p50、p52)。典型的NFκB是p65(RELA)和p50(NFκB1)的二聚體。在活化的NFκB二聚體中，已知p50-p65異二聚體參與增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，而p50-p50同二聚體參與轉(zhuǎn)錄抑制。不過，已知p65-p65同二聚體對(duì)靶基因既具有轉(zhuǎn)錄激活活性也具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些真核細(xì)胞基因的啟動(dòng)子中存在不同NFκB二聚體的具有不同親和性的κB DNA結(jié)合位點(diǎn)，且活化的NFκB的同和異二聚體之間的平衡最終決定細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的性質(zhì)和水平。術(shù)語“NFκB調(diào)節(jié)性肽”在此是指能夠調(diào)變NFκB/Rel轉(zhuǎn)錄因子家族成員的激活的肽或其功能性類似物或修飾物或衍生物。特別適合用于本發(fā)明的方法和組合物的此類肽的實(shí)例選自VLPALPQVVC(SEQ ID NO21)、LQGVLPALPQ(SEQ IDNO22)、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、GVLPALPQ(SEQ ID NO23)、VLPALP(SEQ ID NO4)、VLPALPQ(SEQ IDNO13)、GVLPALP(SEQ ID NO16)、VVC、MTRV(SEQ ID NO20)、和MTR。調(diào)變NFκB的活化可增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。此外，其也可導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制?？稍诙鄬用嬲{(diào)節(jié)NFκB的活化。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IκB蛋白質(zhì)對(duì)于非活性NFκB二聚體在細(xì)胞漿和細(xì)胞核之間的動(dòng)態(tài)往返及其被磷酸化而終止和蛋白酶體降解、NFκB因子的直接磷酸化、乙?；⒁约盎罨腘FκB二聚體之間的NFκB亞單位的動(dòng)態(tài)重組，均是NFκB活化以及NFκB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)步驟。因此，NFκB調(diào)節(jié)性肽能夠調(diào)變受控于NFκB/Rel轉(zhuǎn)錄因子家族的基因的轉(zhuǎn)錄。調(diào)變包括轉(zhuǎn)錄的上調(diào)或下調(diào)。
術(shù)語“藥物組合物”在此意在同時(shí)含蓋活性調(diào)節(jié)性肽或類似物本身或含有調(diào)節(jié)性肽或類似物以及藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的組合物?？山邮艿碾牡南♂寗├鐬樯睇}水或磷酸緩沖鹽溶液。在所提供的特別有用的藥物組合物中，所述基因轉(zhuǎn)錄因子包含NFκB/Rel蛋白。例如，為了對(duì)抗例如來自腦死亡供者的移植物發(fā)生缺血再灌注損傷，或?yàn)轭A(yù)防在移植物冷藏運(yùn)輸過程中的缺血再灌注損傷，在此推薦使用可抑制所述NFκB/Rel蛋白的轉(zhuǎn)移和/或活性的藥物組合物。該組合物可以是在此所述的移植物保藏液或灌注液，其包含基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物。所述的肽可選自LQG、AQG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、LQGA(SEQ ID NO3)、VLPALP(SEQ IDNO4)、ALPALP(SEQ ID NO5)、VAPALP(SEQ ID NO6)、ALPALPQ(SEQ ID NO7)、VLPAAPQ(SEQ ID NO8)、VLPALAQ(SEQ IDNO9)、LAGV(SEQ ID NO10)、VLAALP(SEQ ID NO11)、VLAALP(SEQ ID NO11)、VLPALA(SEQ ID NO12)、VLPALPQ(SEQ IDNO13)、VLAALPQ(SEQ ID NO14)、VLPALPA(SEQ ID NO15)、GVLPALP(SEQ ID NO16)、LQGVLPALPQVVC(SEQ ID NO17)、LPGCPRGVNPVVS(SEQ ID NO18)、LPGC(SEQ ID NO19)、MTRV(SEQ ID NO20)、MTR、VVC、或其功能性類似物，但也可選擇其他的基因調(diào)節(jié)性肽。如上所述，在特定情況中，優(yōu)選地所述藥物組合物是高滲的。也可在所述灌注液中加入抗凝劑，例如肝素，或在預(yù)期移植物會(huì)出現(xiàn)播散性血管內(nèi)凝血(DIC)的情況下(例如建議尸體供者)可在上述灌注液中加入(重組)活化蛋白C。在活化蛋白C溶解了引起缺血的彌漫性凝結(jié)物的情況下，灌注液中的NFκB調(diào)節(jié)性肽可有助于降低再灌注損傷。在大多數(shù)情況中，以所述保藏液或灌注液進(jìn)行治療包含在移植物自供者取出后給所述移植物提供所述信號(hào)分子。特別有用的是以上述經(jīng)典的藥物組合物之一進(jìn)一步治療所述受者，以進(jìn)一步降低移植排異反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，特別是對(duì)于移植物的HLA類型與受者的HLA類型不相合的那些情況更是如此。
本發(fā)明還提供了移植物保藏液或移植物灌注液，其包含作為信號(hào)分子的能夠調(diào)變基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)移和/或活性的肽或功能性類似物。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，此液體還包含(重組)活化蛋白C，特別是對(duì)于所述基因轉(zhuǎn)錄因子包含NFκB/Rel蛋白或AP-1蛋白的情況。加入到此液體中的肽，例如LQG、AQG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、LQGA(SEQ ID NO3)、VLPALP(SEQ ID NO4)、ALPALP(SEQ ID NO5)、VAPALP(SEQ ID NO6)、ALPALPQ(SEQ IDNO7)、VLPAAPQ(SEQ ID NO8)、VLPALAQ(SEQ ID NO9)、LAGV(SEQ ID NO10)、VLAALP(SEQ ID NO11)、VLPALA(SEQ IDNO12)、VLPALPQ(SEQ ID NO13)、VLAALPQ(SEQ ID NO14)、VLPALPA(SEQ ID NO15)、GVLPALP(SEQ ID NO16)、VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL(SEQ IDNO24)、RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT(SEQ IDNO25)、SKAPPPSLPSPSRLPGPS(SEQ ID NO26)、LQGVLPALPQVVC(SEQ ID NO17)、SIRLPGCPRGVNPVVS(SEQ IDNO27)、LPGCPRGVNPVVS(SEQ ID NO18)、LPGC(SEQ ID NO19)、MTRV(SEQ ID NO20)、MTR、和VVC等等，可通過例如所述固相合成法制備。
應(yīng)答于各種病理生理學(xué)信號(hào)和發(fā)育信號(hào)，NFκB/Rel轉(zhuǎn)錄因子家族被激活并在它們之間形成不同類型的異二聚體和同二聚體，以調(diào)節(jié)含有κB-特異性結(jié)合位點(diǎn)的靶基因的表達(dá)。NFκB轉(zhuǎn)錄因子是以Rel同源結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣鞯南嚓P(guān)蛋白質(zhì)家族的異或同二聚體。它們形成兩個(gè)亞家族，即含有活化結(jié)構(gòu)域的亞家族(p65-RELA、RELB、和c-REL)和不含活化結(jié)構(gòu)域的亞家族(p50、p52)。典型的NFκB是p65(RELA)和p50(NFκB1)的二聚體。在活化的NFκB二聚體中，已知p50-p65異二聚體參與增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，而p50-p50同二聚體參與轉(zhuǎn)錄抑制。不過，已知p65-p65同二聚體對(duì)靶基因既具有轉(zhuǎn)錄激活活性也具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些真核細(xì)胞基因的啟動(dòng)子中存在不同NFκB二聚體的具有不同親和性的κB DNA結(jié)合位點(diǎn)，且活化的NFκB的同和異二聚體之間的平衡最終決定細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的性質(zhì)和水平。術(shù)語“NFκB調(diào)節(jié)性肽”在此是指能夠調(diào)變NFκB/Rel轉(zhuǎn)錄因子家族成員的激活的肽或其功能性類似物或修飾物或衍生物。NFκB的活化可調(diào)節(jié)基因以增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。此外，其也可調(diào)節(jié)基因以導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制?？稍诙鄬用嬲{(diào)節(jié)NFκB的活化。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IκB蛋白質(zhì)對(duì)于非活性NFκB二聚體在細(xì)胞漿和細(xì)胞核之間的動(dòng)態(tài)往返及其被磷酸化而終止和蛋白酶體降解、NFκB因子的直接磷酸化、乙?；?、以及活化的NFκB二聚體之間的NFκB亞單位的動(dòng)態(tài)重組，均是NFκB活化以及NFκB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)步驟。因此，NFκB調(diào)節(jié)性肽能夠調(diào)變受控于NFκB/Rel轉(zhuǎn)錄因子家族的基因的轉(zhuǎn)錄。調(diào)變包括轉(zhuǎn)錄的上調(diào)或下調(diào)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽或其功能性衍生物或類似物可用于制備藥物組合物?？捎糜诩尤氲酱怂幬锝M合物中的NFκB下調(diào)性肽的實(shí)例是VLPALPQVVC(SEQ ID NO21)、LQGVLPALPQ(SEQ ID NO22)、LQG、LQGV(SEQ ID NO1)、GVLPALPQ(SEQ ID NO23)、VLPALP(SEQ ID NO4)、VVC、MTR和環(huán)狀LQGVLPALPQVVC(SEQ IDNO17)。可采用(生物)分析方法發(fā)現(xiàn)更多的基因調(diào)節(jié)性肽和功能性類似物，例如在此提供了NFκB轉(zhuǎn)移分析。最重要的NFκB下調(diào)性肽是VLPALPQVVC(SEQ ID NO21)、LQGVLPALPQ(SEQ ID NO22)、LQG、LQGV(SEQ ID NO1)、和VLPALP(SEQ ID NO4)。這些肽也能夠使細(xì)胞減少產(chǎn)生NO。在此也提供了包含至少兩種寡肽或其功能性類似物的組合物的用途，所述至少兩種寡肽或其功能性類似物各自能夠下調(diào)NFκB，并由此能夠使細(xì)胞減少產(chǎn)生NO和/或TNF-α，特別是其中所述至少兩種寡肽選自LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、和VLPALP(SEQ ID NO4)。有用的NFκB上調(diào)性肽是VLPALPQ(SEQ IDNO13)、GVLPALP(SEQ ID NO16)和MTRV(SEQ ID NO20)。已經(jīng)提到，可采用適當(dāng)?shù)?生物)分析方法發(fā)現(xiàn)更多的基因調(diào)節(jié)性肽。優(yōu)選地，本發(fā)明所用的基因調(diào)節(jié)性肽是短肽。優(yōu)選地，所述肽的長(zhǎng)度為3至15個(gè)氨基酸，且能夠調(diào)變基因表達(dá)，例如調(diào)變細(xì)胞中的細(xì)胞因子的基因表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，肽是能夠通過細(xì)胞膜的信號(hào)分子，也就是說，肽具有膜通透性。更加優(yōu)選地，其中所述引導(dǎo)肽長(zhǎng)度為3至9個(gè)氨基酸，最優(yōu)選地，其中所述引導(dǎo)肽的長(zhǎng)度為4至6個(gè)氨基酸。
功能性衍生物或類似物在此涉及的是信號(hào)分子的效應(yīng)或活性，例如其可通過測(cè)定相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)移而被測(cè)定，例如用于NFκB的NFκB分析，或用于AP-1的AP-1分析，或通過在此所述的其他方法測(cè)定。片段可以在一側(cè)或兩側(cè)更短或更長(zhǎng)一些(即1或2個(gè)氨基酸)，但仍舊具有功能活性。這樣的生物分析法包括用于獲得肽或其修飾物調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力或傾向的有關(guān)信息的分析方法。以例如15體、或12體、或9體、或8體、或7體、或6體、或5體、或4體或3體的肽進(jìn)行篩選，可得到形成相互作用位點(diǎn)的一段線性氨基酸的有價(jià)值的信息，并得以鑒別具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力或傾向的基因調(diào)節(jié)性肽?；蛘{(diào)節(jié)性肽可被修飾以改變其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力或傾向這可通過體外生物分析如報(bào)道分子分析而容易地測(cè)定。例如，某個(gè)位點(diǎn)的某個(gè)氨基酸可以被具有相似或不同特性的另一個(gè)氨基酸取代。在尋找能夠調(diào)變基因表達(dá)的信號(hào)分子時(shí)，涉及將各個(gè)氨基酸以丙氨酸殘基進(jìn)行系統(tǒng)性取代的丙氨酸(Ala)-取代篩選是對(duì)基因調(diào)節(jié)性肽的氨基酸組成進(jìn)行修飾的合適的方法。當(dāng)然，這種取代篩選或圖譜分析也可以用Ala以外的其他氨基酸進(jìn)行，例如使用D-氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，衍生自天然存在的多肽的肽被鑒定為能夠調(diào)變細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)。隨后，制備了該基因調(diào)節(jié)性肽的各種合成的Ala突變體。與所述基因調(diào)節(jié)性多肽相比較，自這些Ala突變體中篩選出調(diào)節(jié)基團(tuán)表達(dá)的能力得到增強(qiáng)或提高的那些突變體。
此外，可使用D-和/或L-立體異構(gòu)體化學(xué)合成基因調(diào)節(jié)性肽、或其修飾物或類似物。例如，制備了天然來源的多肽的逆向反轉(zhuǎn)(retro-inverso)基因調(diào)節(jié)性肽。多肽逆向反轉(zhuǎn)的概念(使用D-氨基酸以相反的順序合成含有天然L-氨基酸的母序列)已經(jīng)成功地用于合成肽。對(duì)肽鍵進(jìn)行逆向反轉(zhuǎn)修飾已經(jīng)成為一種廣泛應(yīng)用的設(shè)計(jì)新的生物活性分子的擬肽方法，其已經(jīng)應(yīng)用于很多具有生物學(xué)活性的肽的家族。肽的序列、氨基酸組成和長(zhǎng)度將影響是否可進(jìn)行正確的合成和純化。這些因素還決定了終產(chǎn)物的可溶性。通常，粗制的肽的純度隨長(zhǎng)度的增加而降低。對(duì)于15個(gè)殘基以下的序列，肽的產(chǎn)率通常是滿意的，且制備此類肽通常不存在困難。肽的總體氨基酸組成是一個(gè)重要的設(shè)計(jì)變量。組成對(duì)肽的溶解性有很大影響。疏水性殘基例如Leu、Val、Ile、Met、Phe和Trp含量高的肽，其要么在水性溶液中具有有限的溶解性，要么完全不溶。在這些情況下，難以將所述肽用于實(shí)驗(yàn)，且難以在需要的時(shí)候純化所述肽。為達(dá)到良好的溶解性，應(yīng)該將疏水性氨基酸的含量控制在低于50％，并保證每5個(gè)氨基酸中至少有1個(gè)帶電荷的殘基。在生理pH，Asp、Glu、Lys和Arg均具有帶電荷的側(cè)鏈。單個(gè)的保守性取代，例如以Gly取代Ala、或在N-或C-端加上一組極性殘基，均可提高溶解性。含有多個(gè)Cys、Met、或Trp殘基的肽也難以以高純度獲得，這部分是因?yàn)檫@些殘基易于發(fā)生氧化和/或副反應(yīng)。可能的話，要盡量減少序列中的這些殘基?；蛘撸蓪?duì)一些殘基進(jìn)行保守取代。例如，可用正亮氨酸取代Met，而Ser有時(shí)可作為Cys的反應(yīng)性較低的取代基。如果自一個(gè)蛋白質(zhì)序列制備多個(gè)連續(xù)的或重疊的肽，改變每個(gè)肽的起始點(diǎn)可在親水性和疏水性殘基之間建立更好的平衡。改變各個(gè)肽中所含的Cys、Met、和Trp殘基的數(shù)目可產(chǎn)生類似的效果。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，能夠調(diào)變基因表達(dá)的基因調(diào)節(jié)性肽是化學(xué)修飾的肽。肽的修飾包括磷酸化(如Tyr、Ser或Thr殘基)、N端乙?；?、C端酰胺化、C端酰肼、C端連接甲酯、脂肪酸、磺基化(酪氨酸)、N端丹磺酰化、N端琥珀酰化、三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酸(PAM3Cys-OH)以及Cys殘基的法呢基化?？稍诶缁蛘{(diào)節(jié)性肽優(yōu)化方法中對(duì)基因調(diào)節(jié)性肽進(jìn)行系統(tǒng)性化學(xué)修飾。
可采用各種已知的方法獲得合成肽，這些方法包括固相肽合成(SPPS)和溶液相有機(jī)合成(SPOS)技術(shù)。SPPS是合成肽和小蛋白質(zhì)的快速、簡(jiǎn)便的方法。C端的氨基酸典型地通過與接頭分子形成酸不穩(wěn)定性鍵連接于交聯(lián)的聚苯乙烯樹脂。該樹脂不溶于合成法中所用的溶劑，因此可相對(duì)簡(jiǎn)單快速地洗去過多的試劑和副產(chǎn)品。
本文中所述的肽，例如LQG、AQG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、LQGA(SEQ ID NO3)、VLPALP(SEQ IDNO4)、ALPALP(SEQ ID NO5)、VAPALP(SEQ ID NO6)、ALPALPQ(SEQ ID NO7)、VLPAAPQ(SEQ ID NO8)、VLPALAQ(SEQ IDNO9)、LAGV(SEQ ID NO10)、VLAALP(SEQ ID NO11)、VLPALA(SEQ ID NO12)、VLPALPQ(SEQ ID NO13)、VLAALPQ(SEQ IDNO14)、VLPALPA(SEQ ID NO15)、GVLPALP(SEQ ID NO16)、VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL(SEQ IDNO24)、RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT(SEQ IDNO25)、SKAPPPSLPSPSRLPGPS(SEQ ID NO26)、LQGVLPALPQVVC(SEQ ID NO17)、SIRLPGCPRGVNPVVS(SEQ IDNO27)、LPGCPRGVNPVVS(SEQ ID NO18)、LPGC(SEQ ID NO19)、MTRV(SEQ ID NO20)、MTR、和VVC，是通過固相合成法，采用基于芴基甲氧基羰基(Fmoc)/叔丁基的方法，以2-氯三苯甲基氯化物樹脂作為固相支持物，而制備的。以三苯甲基官能團(tuán)保護(hù)谷氨酰胺的側(cè)鏈。肽以手工方法合成。每個(gè)結(jié)合由以下步驟組成(i)以二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶脫除α-氨基Fmoc-保護(hù)，(ii)在DMF/N-甲基甲酰胺(NMP)中將Fmoc氨基酸(3eq)與二異丙基碳二亞胺(DIC)/1-羥基苯并三唑(HOBt)結(jié)合，和(iii)在DMF/NMP中以乙酸酐/二異丙基乙胺(DIEA)給剩下的氨基官能團(tuán)加帽。合成反應(yīng)完成后，以三氟乙酸(TFA)/H2O/三異丙基硅烷(TIS)的95∶2.5∶2.5的混合物處理所述肽的樹脂。30分鐘后加入TIS直至脫色。將溶液真空干燥，以二乙醚沉淀肽。將粗制肽溶解于水(50-100mg/ml)，并以反相高效液相色譜法(RP-HPLC)純化。HPLC條件為柱Vydac TP21810C18(10×250mm)；洗脫體系0.1％TFA梯度體系(v/v，溶于水)(A)和0.1％TFA(v/v，溶于乙腈(ACN))(B)；流速6ml/min；190-370nm測(cè)定吸光度。使用了不同的梯度體系。例如，對(duì)于肽LQG和LQGV(SEQ ID NO1)10分鐘100％A，繼而線性梯度0-10％B，50分鐘。例如，對(duì)于肽VLPALP(SEQ IDNO4)和VLPALPQ(SEQ ID NO13)5分鐘5％B，繼而線性梯度1％B/分鐘。在40℃，低壓條件下，通過旋轉(zhuǎn)膜蒸發(fā)將收集到的級(jí)份濃縮至大約5ml。以乙酸鹽形式的陰離子交換樹脂(Merck II)在柱上洗脫2次使得殘余的TFA與乙酸鹽進(jìn)行交換。將洗脫物濃縮并凍干28小時(shí)。隨后將制備的肽溶解于PBS，備用。
RAW 264.7巨噬細(xì)胞得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection，Manassas，VA)，培養(yǎng)于37℃，5％CO2，使用DMEM，含10％FBS和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)。細(xì)胞(1×106/ml)與肽(10μg/ml)孵育于2ml的體積中，培養(yǎng)8后將細(xì)胞洗滌并用于提取細(xì)胞核。
按照Schreiber et al的方法(Schrieber et al.1989，Nucleic AcidsResearch 17)制備核提取物和進(jìn)行EMSA。簡(jiǎn)言之，通過細(xì)胞裂解繼而細(xì)胞核裂解制備來自經(jīng)肽刺激的或未經(jīng)肽刺激的巨噬細(xì)胞的核提取物。將細(xì)胞懸于400μl緩沖液(10mM HEPES(pH 7.9)，10mM KCl，0.1mM KCl，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑)，充分震蕩15s，4℃放置15min，15,000rpm離心2min。沉淀的核重懸于緩沖液(20mM HEPES(pH 7.9)，10％甘油，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑)，冰上放置30min，然后將裂解物在15,000rpm離心2min。將含有溶解的核蛋白的上清液置于-70℃直至用于電泳遷移率改變分析(EMSA)。
電泳遷移率改變分析如下進(jìn)行將來自對(duì)照(RAW 264.7)的和來自肽處理的RAW 264.7細(xì)胞的核提取物與32P標(biāo)記的代表NFκB結(jié)合序列的合成的雙鏈探針(5′AGCTCAGAGGGGGACTTTCCGAGAG 3′(SEQID NO28))進(jìn)行孵育。隨后，按照生產(chǎn)商(Promega，Madison，WI)的說明，將探針以T4多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記。將退火的探針與核提取物進(jìn)行孵育，具體如下在EMSA中，結(jié)合反應(yīng)混合物(20μl)含有溶于結(jié)合緩沖液中的0.25μg的聚(dI-dC)(Amersham Pharmacia Biotech)和20,000rpm的32P標(biāo)記的DNA探針，結(jié)合緩沖液的組成為5mM EDTA，20％Ficoll，5mM DTT，300mM KCl和50mM HEPES。通過加入細(xì)胞提取物(10μg)起始結(jié)合反應(yīng)并在室溫持續(xù)30分鐘。通過以6％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，將DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物與游離的寡核苷酸分離。將膠干燥并曝光于x-光片。
轉(zhuǎn)錄因子NFκB參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。制備來自以LPS和肽處理的RAW264.7細(xì)胞或來自以LPS處理的RAW264.7細(xì)胞的核蛋白提取物。為了確定所述肽是否調(diào)變NFκB轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，在這些提取物上進(jìn)行EMSA。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這些肽的確能夠調(diào)變NFκB的轉(zhuǎn)移，因?yàn)闃?biāo)記的NFκB的寡核苷酸被降低了。在該實(shí)驗(yàn)中，顯示出調(diào)變NFκB的轉(zhuǎn)移的肽是VLPALPQVVC(SEQ ID NO21)、LQGVLPALPQ(SEQ IDNO22)、LQG、LQGV(SEQ ID NO1)、GVLPALPQ(SEQ ID NO23)、VLPALP(SEQ ID NO4)、VLPALPQ(SEQ ID NO13)、GVLPALP(SEQID NO16)、VVC、MTRV(SEQ ID NO20)、MTR。
RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM，含有10％或2％FBS、青霉素、鏈霉素和谷氨酰胺，37℃，5％CO2。細(xì)胞接種于12-孔板(3×106細(xì)胞/ml)，總體積為1ml，2小時(shí)后，以LPS(E.coli 026B6；DifcoLaboratories，Detroit，MI，USA)和/或基因調(diào)節(jié)性肽(1microgr/ml)進(jìn)行刺激。孵育30分鐘后，將板離心并收集細(xì)胞用于制備核提取物。根據(jù)Schreiber et al制備核提取物并進(jìn)行EMSA。將細(xì)胞收集于管中，5分鐘，2000rpm(每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù))，4℃(Universal 30RF，HettichZentrifuges)。以冰冷的Tris緩沖鹽(TBS pH 7.4)洗滌沉淀，并重懸于400μl的低滲緩沖液A(10mM HEPES pH 7.9，10mM KCl，0.1mMEDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑雞尾酒(CompleteTMMini，Roche))中，并置于冰上15分鐘。加入25微升10％NP-40，離心樣品(2分鐘，4000rpm，4℃)。收集上清液(細(xì)胞漿成分)存放于-70℃，以50μl緩沖液A洗滌含有細(xì)胞核的沉淀，重懸于50μl緩沖液C(20mM HEPES pH 7.9，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑雞尾酒以及10％甘油)。在4℃搖動(dòng)樣品至少60分鐘。最后離心樣品，將上清液(細(xì)胞核成分)存放于-70℃。
以Bradford試劑(Sigma)確定提取物中的最終蛋白質(zhì)濃度。為進(jìn)行電泳遷移率改變分析，合成了代表NFκB結(jié)合序列(5’-AGC TCA GAGGGG GAC TTT CCG AGA G-3’(SEQ ID NO28))的寡核苷酸。100pmol的有義和反義寡聚物進(jìn)行退火，按照生產(chǎn)商(Promega，Madison，WI)的說明，使用T4多核苷酸激酶以γ-32P-dATP對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。將核提取物(5-7.5μg)與75000cpm探針在含有0.5μg聚dI-dC(Amersham PharmaciaBiotech)的結(jié)合反應(yīng)混合物(20微升)和結(jié)合緩沖液BSB(25mM MgCl2，5mM CaCl2，5mM DTT和20％Ficoll)中在室溫孵育30分鐘。以4-6％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(150V，2-4小時(shí))將DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物與游離寡核苷酸分離。將膠干燥并曝光于x-光片。轉(zhuǎn)錄因子NFκB參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。制備分別來自LPS(1mg/ml)、肽(1mg/ml)或LPS+肽處理的和未處理的RAW264.7細(xì)胞的核蛋白提取物。為了確定這些肽是否調(diào)變NFκB轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，以這些提取物進(jìn)行EMSA。這些肽能夠調(diào)變NFκB的基礎(chǔ)水平和LPS誘導(dǎo)的NFκB水平。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，顯示出抑制LPS誘導(dǎo)的NFκB的轉(zhuǎn)移的肽是VLPALPQVVC(SEQ ID NO21)、LQGVLPALPQ(SEQ ID NO22)、LQG、LQGV(SEQ ID NO1)、GVLPALPQ(SEQ ID NO23)、VLPALP(SEQ ID NO4)、VVC、MTR和環(huán)狀LQGVLPALPQVVC(SEQ ID NO17)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的NFκB的轉(zhuǎn)移的肽是VLPALPQ(SEQ ID NO13)、GVLPALP(SEQID NO16)和MTRV(SEQ ID NO20)。VLPALPQVVC(SEQ IDNO21)、LQGVLPALPQ(SEQ ID NO22)、LQG和LQGV(SEQ ID NO1)降低了細(xì)胞核中的NFκB的基礎(chǔ)水平，而GVLPALPQ(SEQ IDNO23)、VLPALPQ(SEQ ID NO13)、GVLPALP(SEQ ID NO16)、VVC、MTRV(SEQ ID NO20)、MTR和LQGVLPALPQVVC(SEQ IDNO21)升高了細(xì)胞核中的NFκB的基礎(chǔ)水平。在其他實(shí)驗(yàn)中，QVVC也顯示出調(diào)變NFκB轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核(數(shù)據(jù)未顯示)。
通過NFκB分析鑒別基因調(diào)節(jié)性肽的其他模式細(xì)胞細(xì)胞被培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2。將細(xì)胞接種于12-孔板(通常1×106細(xì)胞/ml)，總體積1ml，2小時(shí)后以調(diào)節(jié)性肽進(jìn)行刺激，其中可存在或不存在其他的刺激，如LPS。孵育30分鐘后將板離心并收集細(xì)胞用于制備細(xì)胞漿或核提取物。
核提取物核提取物制備和EMSA可按照Schreiber et al.的方法(Schriber et al.1989，Nucleic Acids Research 17)進(jìn)行。將細(xì)胞收集于管中，5分鐘，2000rpm(每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù))，4℃(Universal 30RF，HettichZentrifuges)。以冰冷的Tris緩沖鹽(TBS pH 7.4)洗滌沉淀，并重懸于400μl的低滲緩沖液A(10mM HEPES pH 7.9，10mM KCl，0.1mMEDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑雞尾酒(CompleteTMMini，Roche))中，并置于冰上15分鐘。加入25微升10％NP-40，離心樣品(2分鐘，4000rpm，4℃)。收集上清液(細(xì)胞漿成分)存放于-70℃，以50μl緩沖液A洗滌含有細(xì)胞核的沉淀，重懸于50μl緩沖液C(20mM HEPES pH 7.9，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑雞尾酒以及10％甘油)。在4℃搖動(dòng)樣品至少60分鐘。最后離心樣品，將上清液(細(xì)胞核成分)存放于-70℃。
可以Bradford試劑(Sigma)確定提取物中的最終蛋白質(zhì)濃度。
EMSA為進(jìn)行電泳遷移率改變分析，合成了代表NFκB結(jié)合序列如(5’-AGC TCA GAG GGG GAC TTT CCG AGA G-3’(SEQ ID NO28))的寡核苷酸。100pmol的有義和反義寡聚物進(jìn)行退火，按照生產(chǎn)商(Promega，Madison，WI)的說明，使用T4多核苷酸激酶以γ-32P-dATP對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。將來自以調(diào)節(jié)性肽處理的或未處理的細(xì)胞的細(xì)胞漿提取物或核提取物(5-7.5μg)與75000cpm探針在含有0.5μg聚dI-dC(Amersham Pharmacia Biotech)的結(jié)合反應(yīng)混合物(20微升)和結(jié)合緩沖液BSB(25mM MgCl2，5mM CaCl2，5mM DTT和20％Ficoll)中在室溫孵育30分鐘。或者，來自未處理的細(xì)胞的或來自以刺激物處理的細(xì)胞的細(xì)胞漿和核提取物也可在結(jié)合反應(yīng)混合物和結(jié)合緩沖液中與探針孵育。以4-6％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(150V，2-4小時(shí))將DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物與游離寡核苷酸分離。將膠干燥并曝光于x-光片。肽可進(jìn)行生物素化并與細(xì)胞孵育。然后以磷酸緩沖鹽洗滌細(xì)胞，這些細(xì)胞是在存在或不存在特定刺激物(LPS，PHA，TPA，抗-CD3，VEGF，TSST-1，VIP或已知的藥物等等)的條件下收集的。培養(yǎng)后，裂解細(xì)胞，將含有200微克蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物(全細(xì)胞裂解物、細(xì)胞漿成分或細(xì)胞核成分)與50微升的Neutr-Avidin-plus珠孵育1h，4℃，并恒定搖動(dòng)。以裂解緩沖液在6000rpm離心1分鐘，如此洗滌珠5次。將珠在0.05N NaOH中室溫孵育1分鐘以水解蛋白質(zhì)-肽連鍵，由此洗脫蛋白質(zhì)并進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，隨后以瓊脂糖綴合的抗NFκB亞單位抗體進(jìn)行免疫沉淀或以針對(duì)所研究的靶向的抗體進(jìn)行免疫沉淀。水解蛋白質(zhì)-肽連鍵后，可以HPLS和質(zhì)譜分析來分析樣品?？刹捎蒙飩鞲衅骷夹g(shù)分析純化的NFκB亞單位或細(xì)胞裂解物與生物素化的調(diào)節(jié)性肽之間的相互作用。肽可標(biāo)記上FITC，并在存在或不存在各種刺激物的條件下與細(xì)胞孵育。培養(yǎng)后，可采用熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)(細(xì)胞膜染色和/或細(xì)胞內(nèi)染色)分析細(xì)胞，或制備細(xì)胞裂解物并采用HPLC和質(zhì)譜分析進(jìn)行分析?？刹捎肗FκB轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(報(bào)道基因分析)和基因陣列技術(shù)來確定肽的調(diào)節(jié)作用。
HPLC和質(zhì)譜分析分析在存在或不存在(調(diào)節(jié)性)肽的條件下孵育純化的NFκB亞單位或細(xì)胞漿/核提取物，以8N鹽酸胍和0.1％三氟乙酸進(jìn)行稀釋(2∶1)，注入以溶劑A(0.1％三氟乙酸)平衡的反相HPLC柱(Vydac C 18)，并以梯度為0至100％的洗脫液B(90％乙腈溶于溶劑A)進(jìn)行洗脫。收集含有NFκB亞單位的級(jí)份并濃縮。級(jí)份然后被溶解至合適的體積并可采用質(zhì)譜分析進(jìn)行分析。
實(shí)施例本發(fā)明具體涉及神經(jīng)系統(tǒng)疾病或所謂的神經(jīng)免疫性疾病的治療，優(yōu)選地為口服治療，所述疾病例如為精神分裂癥、躁狂抑郁癥及其他雙相性精神障礙、產(chǎn)后精神病、孤獨(dú)癥、慢性疲勞綜合征(CFS)、纖維肌痛綜合征、阿耳茨海默病、情緒障礙和某些類型的應(yīng)激。盡管這些綜合征和/或疾病的病因和發(fā)病機(jī)制有很大不同，但實(shí)際上神經(jīng)系統(tǒng)疾病在發(fā)病機(jī)制上具有共同的炎癥性和免疫調(diào)變性途徑。
患有心理學(xué)疾病的患者中存在的免疫異常的證據(jù)清楚地說明免疫系統(tǒng)參與了疾病的發(fā)生。神經(jīng)免疫性疾病已經(jīng)被認(rèn)為是發(fā)生心理或神經(jīng)病理學(xué)情況的共同致病因素。神經(jīng)化學(xué)和免疫學(xué)證據(jù)指出發(fā)病機(jī)理存在多種途徑；在此，我們討論的是炎癥性疾病在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用。例如，慢性疲勞綜合征是一種女性常見的疾病，通常在經(jīng)前期加重且出現(xiàn)于體力活動(dòng)后。體征和癥狀包括疲乏、肌痛和低熱，這與輸注細(xì)胞因子如白介素-1的患者所出現(xiàn)的情況相似。一般來說，在神經(jīng)免疫性疾病的發(fā)生過程中，TNF-α家族和其他促炎性細(xì)胞因子在腦脊液(CSF)中明顯升高，說明腦部存在炎癥病灶，引起針對(duì)CNS的不同區(qū)域的大量破壞性和退行性反應(yīng)。嚴(yán)重的情緒障礙是自青少年早期開始的引起喪失能力的主要原因和疾病負(fù)擔(dān)的最主要原因，超過了心血管疾病、癡呆、肺癌和糖尿病。如上所述，炎性細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞在情緒障礙的病理生理學(xué)中具有重要的作用，最近還發(fā)現(xiàn)，患有雙相性精神障礙的患者中的T細(xì)胞和單核細(xì)胞具有較高的促炎性水平。成功治療這些影響成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的破壞性和退行性疾病需要能夠同時(shí)降低組織損傷的速度和程度，并恢復(fù)或替代被破壞的組織。神經(jīng)影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，成人的腦在應(yīng)答組織損害時(shí)自發(fā)出現(xiàn)功能性組織結(jié)構(gòu)。這種代償機(jī)制的程度是有限的，因此需要開發(fā)積極的干擾方法。如果損傷是局限的或通過促炎性調(diào)節(jié)物導(dǎo)致CNS中的抑制或途徑改變，替代單一一種神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)激素或營(yíng)養(yǎng)因子是足夠的。海馬區(qū)是具有有絲分裂活性的神經(jīng)元前體細(xì)胞的來源，其被認(rèn)為可替代神經(jīng)元和髓鞘細(xì)胞。控制這些細(xì)胞并維持其他細(xì)胞的健康和活性為慢性CNS疾病提供了一種新的觀點(diǎn)和希望。一些區(qū)域如成人齒狀回的細(xì)胞可以成為調(diào)控腦的免疫調(diào)變和生長(zhǎng)支持及其自記憶和認(rèn)知直至其內(nèi)分泌和免疫學(xué)活性等功能的關(guān)鍵途徑之一。由于具有復(fù)雜的特性，一些迄今尚未鑒定的環(huán)境因素與易感性基因之間的相互作用均可引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病。綜合起來，這些因素引發(fā)一系列事件，包括免疫系統(tǒng)的參與、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、特別是軸突和神經(jīng)膠質(zhì)的急性炎癥性損傷、功能恢復(fù)和結(jié)構(gòu)修復(fù)、炎癥后的神經(jīng)膠質(zhì)增生、以及神經(jīng)退化。這一系列過程是以能夠恢復(fù)的發(fā)作轉(zhuǎn)變?yōu)檫z留永久缺陷的發(fā)作為特征的臨床過程的基礎(chǔ)，這些發(fā)作通常稱為心理疾病。
對(duì)于更加詳細(xì)的實(shí)例，盡管存在數(shù)種類型的可能具有明顯遺傳學(xué)發(fā)病原因的孤獨(dú)癥(經(jīng)常在出生后已經(jīng)存在)，但最常見的類型出現(xiàn)于正常出生之后很長(zhǎng)時(shí)間以后，并與促炎性細(xì)胞因子失調(diào)相關(guān)聯(lián)。根據(jù)新的流行病學(xué)調(diào)查，孤獨(dú)癥類疾病已經(jīng)被認(rèn)為是常見的兒童精神心理疾病。這些持續(xù)一生的疾病被證明具有很強(qiáng)的遺傳學(xué)決定因素和多基因方式的遺傳性，對(duì)此已經(jīng)鑒定了一些孤獨(dú)癥易感區(qū)域。孤獨(dú)癥患者存在平行的免疫異常的證據(jù)支持免疫系統(tǒng)參與發(fā)病。在此簡(jiǎn)要介紹孤獨(dú)癥的分子遺傳學(xué)進(jìn)展以及最近出現(xiàn)的有關(guān)疾病發(fā)病率和引發(fā)因素的問題。就神經(jīng)免疫假說分析了一些特定的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的神經(jīng)化學(xué)和免疫學(xué)證據(jù)。例如，妊娠和產(chǎn)后階段是免疫系統(tǒng)的重要調(diào)變劑，且在妊娠期間的免疫抑制之后是產(chǎn)后免疫的激活。在另一個(gè)實(shí)例中，孤獨(dú)癥受到特定的食物過敏癥甚至是早期應(yīng)用疫苗的影響，所述疫苗可可改變天然或獲得性免疫的調(diào)節(jié)并導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌功能障礙。此外，神經(jīng)系統(tǒng)疾病還與患者親人的自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)。Comi AM et al.(J Child Neurol 1999 Jun；14(6)388-94)評(píng)估了自身免疫性疾病的發(fā)病率以及孤獨(dú)癥的各種出生前和出生后事件，并采用問卷方式調(diào)查了61個(gè)孤獨(dú)癥患者和46個(gè)健康對(duì)照的家庭。孤獨(dú)癥患者的家庭中患自身免疫性疾病的數(shù)量更多；46％中有兩個(gè)或兩個(gè)以上患有自身免疫性疾病。隨著患有自身免疫性疾病的家庭成員的數(shù)量從1個(gè)上升為3個(gè)，患孤獨(dú)癥的風(fēng)險(xiǎn)變得更高，其可能性比例(odds ratio)分別為從1.9上升至5.5。與對(duì)照(2％和4％)相比，在孤獨(dú)癥兒童的母親和一級(jí)親屬中有更多人患自身免疫性疾病(16％和21％)，可能性比例分別為8.8和6.0。在兩組中最常見的自身免疫性疾病是1型糖尿病、成人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺機(jī)能減退和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。46％的孤獨(dú)癥組報(bào)道有親屬患有類風(fēng)濕疾病，而對(duì)照為26％。出生前母親泌尿道感染、上呼吸道感染和陰道感染；窒息；早產(chǎn)和顛癇在孤獨(dú)癥組中更加常見，不過這種差異不具有顯著性。過敏癥在對(duì)照組為39％，而在孤獨(dú)癥組僅為11％。孤獨(dú)癥中自身免疫性疾病數(shù)量的增加說明，免疫系統(tǒng)功能失調(diào)與多種環(huán)境因素相互作用，在孤獨(dú)癥的發(fā)病中起作用。根據(jù)Edelson SB和Cantor DS(Toxicol Ind Health 1998Jul-Aug；14(4)553-63)，過去40年間醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)展為孤獨(dú)癥的潛在神經(jīng)學(xué)機(jī)制提供了證據(jù)。神經(jīng)系統(tǒng)疾病譜行為中所見的各種神經(jīng)功能異常的病因在當(dāng)前似乎仍然沒有結(jié)論，但越來越多的證據(jù)支持這樣一種觀點(diǎn)，認(rèn)為長(zhǎng)期暴露于有毒物，即異生素制劑(xenobiotic agents)，可導(dǎo)致針對(duì)發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，這可能是定義這些人群中的生理學(xué)和行為學(xué)數(shù)據(jù)的最佳模型。此外，對(duì)18個(gè)孤獨(dú)癥兒童進(jìn)行血液分析發(fā)現(xiàn)，其中的16個(gè)兒童顯示出一些毒性化合物的水平超過成人高限。在未發(fā)現(xiàn)毒性化合物水平升高的2例中，發(fā)現(xiàn)其D-葡糖二酸異常，提示異常的異生素影響了肝臟的解毒過程。因此提出異生素毒素與免疫系統(tǒng)功能異常的相互作用和持續(xù)性和/或進(jìn)展性內(nèi)源性毒性這樣一種機(jī)制，認(rèn)為其與孤獨(dú)癥譜中所出現(xiàn)的行為有關(guān)。Jyonouchi H et al(J Neuroimmunol 2001Nov 1；120(1-2)170-9)測(cè)定了具有發(fā)育遲緩和孤獨(dú)癥譜疾病的兒童(ASD，N＝71)、發(fā)育正常的同胞(N＝23)、和對(duì)照(N＝17)兒童中的天然和過繼性免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)促炎性和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的產(chǎn)生與患有孤獨(dú)癥譜疾病和發(fā)育遲緩的兒童的天然和過繼性免疫應(yīng)答之間存在明確的關(guān)聯(lián)。脂多糖(LPS)是天然免疫的刺激劑，在其作用下，來自59/71(83.1％)的ASD患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β、和/或IL-6高于對(duì)照PBMC產(chǎn)生的對(duì)照平均值(CM)(＞2SD)。在沒有刺激物的條件下，ASD PBMC產(chǎn)生了高于對(duì)照水平的促炎性/反向調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子。在具有刺激物植物血球凝集素(PHA)、破傷風(fēng)、IL-12p70和IL-18的情況下，根據(jù)刺激物的不同，來自47.9％至60％的ASD患者的PBMC產(chǎn)生了超過CM值＞2SD的TNF-α。這些結(jié)果說明，在許多ASD兒童中，過度的天然免疫應(yīng)答是NFκB誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)的結(jié)果，其中最為明顯的是TNF-α的產(chǎn)生。此外，根據(jù)Messahel S et al(NeurosciLett 1998Jan 23；241(1)17-20)，蝶呤類、新蝶呤和生物蝶呤天然存在于體液包括尿液中。已知新蝶呤水平升高與細(xì)胞免疫系統(tǒng)活化相關(guān)聯(lián)，而生物蝶呤降低對(duì)于神經(jīng)遞質(zhì)的合成是至關(guān)重要的。還有提示認(rèn)為一些孤獨(dú)癥兒童可患有自身免疫性疾病。為了研究這一問題，上述作者還對(duì)一組學(xué)齡前孤獨(dú)癥兒童、其同胞和年齡相配的對(duì)照兒童的尿液中的蝶呤類進(jìn)行了HPLC分析。與對(duì)照相比，孤獨(dú)癥兒童的尿液中的新蝶呤和生物蝶呤均升高，而其同胞顯示出中間值。
在另一個(gè)實(shí)例中，慢性疲勞綜合征(CFS)是一種臨床情況，其特征為嚴(yán)重的疲乏無力和一組主要特征為主訴無法集中注意力和短期記憶障礙、睡眠障礙以及肌肉骨骼疼痛的癥狀。目前，只能在排除引起慢性疲勞性疾病的其他醫(yī)學(xué)和精神原因之后才能診斷慢性疲勞綜合征的。對(duì)于這種疾病目前還沒有確診的體征或明確的診斷測(cè)試。迄今也沒有確定的治療方法。最近的回顧性研究提示，一些患有慢性疲勞綜合征的人可隨時(shí)間而改善，但大多數(shù)的功能性受損持續(xù)多年。CFS的特征在于無法以已知的臨床疾病解釋的虛弱乏力，持續(xù)時(shí)間＞6個(gè)月，活動(dòng)水平較已往的健康人降低＞50％，并伴有流感樣癥狀(如咽痛、腺體腫大、低熱、肌痛、關(guān)節(jié)痛、頭痛)以及神經(jīng)心理學(xué)表現(xiàn)(如注意力無法集中、活動(dòng)耐力下降、和睡眠障礙)。CFS往往起病突然。經(jīng)過細(xì)致研究其免疫學(xué)功能、活化和細(xì)胞因子失調(diào)，關(guān)于CFS的介導(dǎo)因素的理解已經(jīng)有了相當(dāng)大的進(jìn)展。越來越多的獨(dú)立研究報(bào)道了T和B淋巴細(xì)胞的異常和NK細(xì)胞功能異常，其中有研究者在NK細(xì)胞功能水平與疾病的嚴(yán)重程度之間建立了關(guān)聯(lián)。鑒于在T細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞上測(cè)定到T細(xì)胞活化的標(biāo)記物異常升高，因此建議該疾病被命名為慢性免疫激活綜合征。
過去10年間，研究者證實(shí)患有CFS的個(gè)體具有顯著升高的活化CD8+T細(xì)胞群體，降低的天然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞毒活性和淋巴增殖活性，血清腫瘤壞死因子(TNF)-α和β升高，以及在外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中可檢測(cè)到TNF-β、白介素(IL)-1β和IL-6的mRNA。CFS患者作為一個(gè)群體，與對(duì)照相比，其可溶性TNF受體I型(sTNF-RI)、sIL-6R和β2-微球蛋白(β2-m)水平顯著升高，但I(xiàn)L-1受體拮抗劑(IL-1Ra)不升高。相關(guān)性和群體分布研究(包括淋巴表型分別和功能以及可溶性介質(zhì)表達(dá)水平)揭示CFS患者中存在至少兩種主要的非重疊的類別1.TNF-α/β表達(dá)失調(diào)伴有血清IL-1α、IL-4、sIL-2R和IL-1Ra水平改變，PBMC相關(guān)的IL-1β、IL-6、和TNF-βmRNA的表達(dá)，以及T活化；或2.相關(guān)的sTNF-R1、sIL-6R和β2-微球蛋白表達(dá)失調(diào)和顯著降低的淋巴增殖和NK細(xì)胞毒活性。此外，穩(wěn)態(tài)應(yīng)變(allostasis)-通過改變達(dá)到穩(wěn)定性的能力-對(duì)于生存是至關(guān)重要的，而許多心理疾病的表現(xiàn)在于缺乏這種穩(wěn)定性。通過穩(wěn)態(tài)應(yīng)變，自主神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸、和心血管、新陳代謝和免疫系統(tǒng)保護(hù)肌體對(duì)抗內(nèi)源性和外源性應(yīng)激。對(duì)應(yīng)激的這種適應(yīng)性調(diào)節(jié)的代價(jià)是穩(wěn)態(tài)應(yīng)變負(fù)荷(allostatic load)，即穩(wěn)態(tài)應(yīng)變系統(tǒng)(allostatic system)的長(zhǎng)期活性過高或活性過低引起的損耗。
肌體對(duì)挑戰(zhàn)的應(yīng)答的核心是雙重的，啟動(dòng)穩(wěn)態(tài)應(yīng)變應(yīng)答(allostaticresponse)以起始復(fù)雜的適應(yīng)過程，然后在危險(xiǎn)過去之后關(guān)閉該應(yīng)答。最常見的穩(wěn)態(tài)應(yīng)變應(yīng)答涉及交感神經(jīng)系統(tǒng)和HPA軸。對(duì)于這些系統(tǒng)，活化則自神經(jīng)和腎上腺髓質(zhì)釋放兒茶酚胺，引起垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素。促腎上腺皮質(zhì)激素轉(zhuǎn)而介導(dǎo)腎上腺皮質(zhì)釋放皮質(zhì)醇。失活使得系統(tǒng)回到皮質(zhì)醇和兒茶酚胺分泌的基線水平，這通常發(fā)生于危險(xiǎn)過去之后。不過，如果失活不充分將使得應(yīng)激激素過多。經(jīng)過數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年，暴露于應(yīng)激激素分泌過高導(dǎo)致所謂的穩(wěn)態(tài)應(yīng)變負(fù)荷及其免疫生理病理學(xué)結(jié)果。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一生過程中，穩(wěn)態(tài)應(yīng)變負(fù)荷可導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)應(yīng)變系統(tǒng)損耗或耗竭。晚年的虛弱通常是穩(wěn)態(tài)應(yīng)變系統(tǒng)耗竭的結(jié)果。HPA軸的調(diào)節(jié)與認(rèn)知之間的脆弱連接位于海馬區(qū)。腦部該區(qū)域的損耗導(dǎo)致HPA軸失調(diào)和認(rèn)知障礙。實(shí)際上，一些(但不是全部)老年人具有短暫的、閱讀和空間記憶障礙以及HPA軸活性過高，所有這些均可以追溯到海馬的炎癥性損害。最近的數(shù)據(jù)顯示，類似的情況也存在于具有無法解釋的情緒障礙的年輕人中。在一種類型的穩(wěn)態(tài)應(yīng)變負(fù)荷中，一些穩(wěn)態(tài)應(yīng)變系統(tǒng)的不充分的應(yīng)答引發(fā)其他穩(wěn)態(tài)應(yīng)變系統(tǒng)的代償性增強(qiáng)。當(dāng)一個(gè)系統(tǒng)不能充分應(yīng)答于應(yīng)激性刺激時(shí)，其他系統(tǒng)的活性回增強(qiáng)，這是因?yàn)樵摰突钚缘南到y(tǒng)不能提供正常的反向調(diào)節(jié)。例如，如果面對(duì)應(yīng)激時(shí)皮質(zhì)醇分泌沒有升高，那么炎性細(xì)胞因子(其受到皮質(zhì)醇的反向調(diào)節(jié))的分泌會(huì)升高。增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)的不利結(jié)果是，例如，受累的個(gè)體會(huì)極易發(fā)生自身免疫和炎癥性紊亂，后者通常因HPA軸的遺傳決定的低反應(yīng)性而加重。
此外，分娩后的數(shù)月是一些女性容易發(fā)生嚴(yán)重情緒障礙的時(shí)間。該疾病可對(duì)常規(guī)的精神治療方法產(chǎn)生抗性。產(chǎn)后抑郁癥或產(chǎn)后精神病的病例通常出現(xiàn)在已往具有嚴(yán)重抑郁或雙相性精神障礙的女性。關(guān)于產(chǎn)后精神病是否是一種獨(dú)立的診斷或其是否代表一種快速發(fā)展的精神病，即其是一種潛在的雙相性(或躁狂抑郁型)精神障礙的表現(xiàn)，存在大量爭(zhēng)論。迄今，現(xiàn)有的精神病學(xué)研究支持后一種觀點(diǎn)。
本發(fā)明提供了用于治療被認(rèn)為患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的個(gè)體的方法，其具體的目的在于減少神經(jīng)免疫性疾病的心理學(xué)表現(xiàn)的發(fā)生頻率，降低其持久的影響，且特別涉及治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或情緒障礙的炎癥性成分，以緩解因釋放額外的促炎性細(xì)胞因子而導(dǎo)致的癥狀，特別是在疾病的進(jìn)展期，以防止因疾病進(jìn)展引起的能力喪失并促進(jìn)CNS組織修復(fù)。本發(fā)明提供了用于治療對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，特別是用于口服施用，所述對(duì)象例如是靈長(zhǎng)類，并提供了用于治療對(duì)象的與額外的促炎性細(xì)胞因子釋放相關(guān)的疾病的方法，所述對(duì)象例如是靈長(zhǎng)類，包含給對(duì)象施用本發(fā)明的信號(hào)分子，優(yōu)選地是此類信號(hào)分子的混合物。本發(fā)明的目的在于對(duì)抗參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，并通過靶向NFκB誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)而治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的炎癥性成分。作為(可能是基于CNS的)NFκB表達(dá)的結(jié)果，毒性炎性介質(zhì)釋放，持續(xù)破壞血腦屏障，損傷軸突和神經(jīng)膠質(zhì)。一氧化氮可直接作用于正常的或少髓鞘(hypomyelinated)軸突，瞬時(shí)阻斷傳導(dǎo)并可逆性增加已經(jīng)受損的途徑所引起的缺陷。隨著急性炎癥的消除，這些途徑解除了一氧化氮誘導(dǎo)的生理學(xué)傳導(dǎo)的阻斷。隨著存活的功能性途徑重建至細(xì)胞和系統(tǒng)的水平，癥狀也改善。綜合起來，這些機(jī)制說明了疾病早期的緩解。但組織的弱點(diǎn)易于暴露。當(dāng)混合高軸突發(fā)放頻率，一氧化氮引起軸突發(fā)生結(jié)構(gòu)改變(且為不可逆的)。作為急性炎癥過程的一部分，由反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)促進(jìn)因子促進(jìn)內(nèi)源性重新形成髓鞘。不過，星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性封閉了病灶，神經(jīng)膠質(zhì)增生成為進(jìn)一步重新形成髓鞘的物理屏障，對(duì)積累的缺陷的適應(yīng)性調(diào)節(jié)能力降低，標(biāo)志著轉(zhuǎn)變?yōu)槌志萌毕蓦A段。鑒于持久喪失功能可以由炎癥不完全恢復(fù)引起，本發(fā)明提供了用于調(diào)變被認(rèn)為有此需要的對(duì)象的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，期包含給所述對(duì)象施用信號(hào)分子，所述信號(hào)分子包含短的、基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物，其中所述信號(hào)分子施用的量足以調(diào)變正在惡化的情況。信號(hào)分子優(yōu)選地是短肽，優(yōu)選地期長(zhǎng)度至多為30個(gè)氨基酸，或是所述短肽的功能性類似物衍生物。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肽是寡肽，長(zhǎng)度為大約3至大約15個(gè)氨基酸優(yōu)選地為4至12個(gè)，更加優(yōu)選地為4至9個(gè)，最優(yōu)選地為4至6個(gè)氨基酸，或是所述寡肽的功能性類似物或衍生物。對(duì)于口服施用，長(zhǎng)度優(yōu)選地為3至6個(gè)，更加優(yōu)選地為3至5個(gè)，最優(yōu)選地3或4個(gè)氨基酸。最優(yōu)選地用于口服治療的肽選自LQG、QVV、PALP(SEQ ID NO34)、AQG、LAG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、或LAGV(SEQID NO10)。當(dāng)然，此類信號(hào)分子可以更長(zhǎng)，例如使之延長(zhǎng)(在N-和/或C-端)更多氨基酸或其他側(cè)鏈，而當(dāng)分子進(jìn)入目的地后可例如通過(酶性)裂解使之去除，不過，由于本發(fā)明的肽或功能性類似物小于15個(gè)氨基酸，優(yōu)選地小于9個(gè)氨基酸，更加優(yōu)選地小于6個(gè)氨基酸，因此其在口服施用后易于被腸粘膜攝取，且易于穿過血腦屏障。此外，本發(fā)明所提供的此種小肽十分穩(wěn)定，藥物半衰期大于4個(gè)小時(shí)。因此，本發(fā)明還提供了用于治療、優(yōu)選地口服治療情緒障礙的方法，所述情緒障礙如產(chǎn)后抑郁癥或產(chǎn)后精神病，并提供了本發(fā)明的信號(hào)分子在制備用于治療產(chǎn)后抑郁癥或產(chǎn)后精神病的藥物組合物中的用途，特別是通過至少部分恢復(fù)或模擬基因調(diào)節(jié)性肽LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、和VLPALP(SEQ ID NO4)及其功能性類似物的抗炎癥活性。在所提供的一個(gè)具體方法中，其中所述信號(hào)分子調(diào)變基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)移和/或活性。當(dāng)所述基因轉(zhuǎn)錄因子包含NFκB/Rel蛋白或AP-1蛋白時(shí)，這是特別有用的。上述多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病均涉及由NFκB和AP-1活化引起的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)升高，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述NFκB/Rel蛋白或AP-1蛋白的轉(zhuǎn)移和/或活性被抑制。這樣，通過根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行口服治療，抑制了腦組織如神經(jīng)的髓鞘層的破壞或那些破壞腦組織的斑塊形成，基于由細(xì)胞因子和趨化因子釋放失調(diào)引起的自身免疫或促炎性破壞，這些損害十分明顯。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽選自合成肽LQG、AQG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、LQGA(SEQ ID NO3)、VLPALP(SEQ ID NO4)、ALPALP(SEQ ID NO5)、VAPALP(SEQ ID NO6)、ALPALPQ(SEQ IDNO7)、VLPAAPQ(SEQ ID NO8)、VLPALAQ(SEQ ID NO9)、LAGV(SEQ ID NO10)、VLAALP(SEQ ID NO11)、VLPALA(SEQ IDNO12)、VLPALPQ(SEQ ID NO13)、VLAALPQ(SEQ ID NO14)、VLPALPA(SEQ ID NO15)、GVLPALP(SEQ ID NO16)、LQGVLPALPQVVC(SEQ ID NO17)、LPGCPRGVNPVVS(SEQ IDNO18)、LPGC(SEQ ID NO19)、MTRV(SEQ ID NO20)、MTR、VVC，其用于制備藥物組合物。如上所述，NFκB和AP-1的活化導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的額外表達(dá)。炎性細(xì)胞因子可表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、血管周圍細(xì)胞和粘附或遷移的白細(xì)胞，其均誘導(dǎo)多種促炎性和促凝效應(yīng)?？傊?，這些作用傾向于引起炎癥、血栓形成和出血。從臨床醫(yī)學(xué)角度，本發(fā)明提供了在活體對(duì)象的組織中選擇性調(diào)控NFκB-依賴性基因表達(dá)的機(jī)會(huì)，例如在靈長(zhǎng)類動(dòng)物，其能夠使得基本上上調(diào)如IL-10的抗炎癥性反應(yīng)，并基本上下調(diào)如TNF-α、一氧化氮(NO)、IL-5、IL-6和IL-1β介導(dǎo)的促炎癥性反應(yīng)。
本發(fā)明因此提供了NFκB調(diào)節(jié)性肽或其衍生物在制備藥物組合物用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的用途，優(yōu)選地在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，并提供了一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，特別是治療靈長(zhǎng)類動(dòng)物的方法。優(yōu)選地所述治療包含給對(duì)象施用包括NFκB下調(diào)性肽或其功能性類似物的藥物組合物。有用的NFκB下調(diào)性肽的實(shí)例是VLPALPQVVC(SEQ ID NO21)、LQGVLPALPQ(SEQ ID NO22)、LQG、LQGV(SEQ ID NO1)、GVLPALPQ(SEQ ID NO23)、VLPALP(SEQ ID NO4)、VVC、MTR和環(huán)狀LQGVLPALPQVVC?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法找到更多的下調(diào)性肽和功能性類似物。NFκB下調(diào)性肽中最優(yōu)越的是VLPALPQVVC(SEQ IDNO21)、LQGVLPALPQ(SEQ ID NO22)、LQG、LQGV(SEQ IDNO1)、和VLPALP(SEQ ID NO4)。這些也能夠降低細(xì)胞產(chǎn)生NO。在此還提供了使用包括至少兩種寡肽或其功能性類似物的組合物治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的反復(fù)性疾病，其中每一種均能下調(diào)NFκB，并因此能夠降低細(xì)胞產(chǎn)生NO和/或TNF-α，特別是其中所述至少兩種寡肽選自LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、和VLPALP(SEQ ID NO4)，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽或其功能性衍生物或類似物用于制備用于口服治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物。NFκB調(diào)節(jié)性肽單獨(dú)施用或與其他治療同時(shí)施用，所述肽(或類似物)的濃度優(yōu)選地為大約1至大約1000mg/l，但肽也可以其本身施用，例如置于沖擊注射劑或口服制劑中。對(duì)于急性病例，推薦劑量為1至5mg/kg體重，例如每8小時(shí)沖擊注射(bolus injection)或輸注，直至患者穩(wěn)定，不過，隨后的維持劑量?jī)?yōu)選地口服施用。例如當(dāng)預(yù)期或已經(jīng)診斷出現(xiàn)大的不良反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選地要監(jiān)測(cè)所治療的患者的血漿中的細(xì)胞因子的情況，例如TNF-α、IL-6或IL-10的水平，當(dāng)所述水平達(dá)到正常時(shí)，要停用本發(fā)明的治療。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選地給患有嚴(yán)重和急性雙相性精神障礙的患者沖擊注射NFκB下調(diào)性肽如AQGV(SEQ ID NO2)、LQGV(SEQ ID NO1)或VLPALP(SEQ ID NO4)，劑量為2mg/kg，并繼續(xù)輸注NFκB下調(diào)性肽如AQGV(SEQ ID NO2)、LQGV(SEQ ID NO1)或VLPALP(SEQ IDNO4)或其功能性類似物，劑量為1mg/kg體重，每8小時(shí)一次。劑量可以增加或降低，例如取決于患者血漿或CSF中的細(xì)胞因子情況的監(jiān)測(cè)結(jié)果。如上所述，疾病的進(jìn)展主要由細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)。例如，CSF中的TNF-α家族明顯升高。細(xì)胞因子和趨化因子的下調(diào)或T細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子可防止T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞到達(dá)CNS，由此進(jìn)一步下調(diào)那些在腦和脊髓中產(chǎn)生病變的促炎癥反應(yīng)。細(xì)胞遷移至CNS并隨后釋放促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的模型可參見下文，并能夠以本發(fā)明的肽通過調(diào)節(jié)NFκB、T調(diào)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育、以及干預(yù)早期或前體基因(pregenes)如C-jun或C-erg而治療。對(duì)病理學(xué)家來說，神經(jīng)系統(tǒng)疾病通常是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為急性局灶性炎癥性脫髓鞘和軸突喪失，重新形成髓鞘十分有限。因此，炎癥的首要特點(diǎn)是勿庸置疑的，并且是調(diào)變免疫系統(tǒng)的治療的關(guān)鍵所在。不過，仍存在一些方面限制了針對(duì)疾病的炎癥成分的治療策略的治療效果。當(dāng)前，以皮質(zhì)類固醇進(jìn)行免疫抑制無法特異性終止炎癥。此外，目前在美國(guó)和歐洲研究中所流行的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的炎癥形式，例如上文就孤獨(dú)癥所闡述的，其部分地對(duì)本發(fā)明的NFκB下調(diào)性肽反應(yīng)良好。
在此還提供了包括至少兩種寡肽或其功能性類似物的組合物的用途，其中每一種均能下調(diào)NFκB，并由此降低細(xì)胞產(chǎn)生NO和/或TNF-α，特別是其中所述至少兩種寡肽選自LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、和VLPALP(SEQ ID NO4)。有用的NFκB上調(diào)性肽是VLPALPQ(SEQ ID NO13)、GVLPALP(SEQ ID NO16)和MTRV(SEQID NO20)。如上所述，可通過合適的(生物)分析方法發(fā)現(xiàn)更多的基因調(diào)節(jié)性肽。優(yōu)選地，在此所用的基因調(diào)節(jié)性肽是短肽。優(yōu)選地，所述肽的長(zhǎng)度為3至15個(gè)氨基酸，更加優(yōu)選地，其中所述引導(dǎo)肽長(zhǎng)度為3至9個(gè)氨基酸，最優(yōu)選地，其中所述引導(dǎo)肽的長(zhǎng)度為4至6個(gè)氨基酸，并能夠調(diào)變細(xì)胞的基因例如細(xì)胞因子的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，肽是能夠穿過細(xì)胞膜的信號(hào)分子，也就是說，肽具有膜通透性。
實(shí)施例本發(fā)明特別涉及多發(fā)性硬化的治療，優(yōu)選地為口服治療，且特別涉及該疾病的進(jìn)展期出現(xiàn)的炎癥性損害的治療，優(yōu)選地為口服治療，如治療反復(fù)急性發(fā)作，即通常所知的多發(fā)性硬化(MS)的復(fù)發(fā)或惡化，即復(fù)發(fā)性/緩解性疾病。
多發(fā)性硬化(MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原型的炎性的自身免疫性疾病，終身發(fā)病危險(xiǎn)為1/400，它可能是年輕成人中最為常見的神經(jīng)失能的原因。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，可以誘導(dǎo)出試驗(yàn)性自身免疫性/過敏性腦脊髓炎(EAE)，其中研究了MS。EAE和MS的惡化都是細(xì)胞因子和趨化因子所介導(dǎo)的。在惡化過程中，腦脊液中的TNF-α家族和其它的促炎性細(xì)胞因子被極大地增多。與所有的復(fù)雜性疾病一樣，疾病是由于仍未明確的環(huán)境因素和易患基因之間的相互作用所造成的?？偟恼f，這些因素促發(fā)了一連串的事件，包括免疫系統(tǒng)的參與、軸突和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的急性炎性損傷、功能恢復(fù)和結(jié)構(gòu)修復(fù)、炎癥后神經(jīng)膠質(zhì)增生、和神經(jīng)退行性變。這些過程的連續(xù)參與構(gòu)成了發(fā)作與恢復(fù)、遺留有持久缺陷的發(fā)作、和繼發(fā)性進(jìn)展所刻畫的臨床過程的基礎(chǔ)。盡管這些分型的每一種分型的有限的成功，但是每個(gè)多發(fā)性硬化的患者都從將對(duì)發(fā)病學(xué)的提高了的了解應(yīng)用到臨床處理中尋找更好的回報(bào)。
現(xiàn)在，多發(fā)性硬化是在全世界都被認(rèn)識(shí)的疾病，約有2-5百萬例發(fā)病的個(gè)體。對(duì)于病理學(xué)家而言，多發(fā)性硬化是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的疾病，表現(xiàn)為急性局灶性炎性脫髓鞘和軸突缺失，以及局限的髓鞘再生，最終造成了慢性多病灶硬化性斑點(diǎn)，疾病即取名于此。T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的炎性過程發(fā)展成了MS的脫髓鞘。因此，炎癥的基本性質(zhì)是無可爭(zhēng)議的，并將仍是調(diào)控免疫系統(tǒng)的治療的中心內(nèi)容。但是，一些部分限制了獨(dú)特地定向?qū)辜膊〉难仔猿煞值牟呗缘闹委煰熜?。目前，利用干擾素β或共聚物I的免疫抑制不能終止炎性過程，這些治療可以減輕但不能消除炎癥。此外，目前更特異地干涉炎性過程是不可能的，因?yàn)檠装Y的促發(fā)(病毒誘導(dǎo)對(duì)自身免疫性)和受影響的患者的CNS中的特異的靶抗原還都不清楚。
對(duì)于患者，多發(fā)性硬化意味著明確的無限多種癥狀以及必然的復(fù)發(fā)話題和不可預(yù)測(cè)的過程。對(duì)于神經(jīng)病學(xué)家，多發(fā)性硬化是一種年輕成人的疾病，其診斷是根據(jù)不同時(shí)間內(nèi)的影響腦和脊髓的不同部位的至少兩個(gè)脫髓鞘病變的臨床和旁臨床(paraclinical)證據(jù)。對(duì)于臨床學(xué)家，多發(fā)性硬化是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原型的炎性的自身免疫性疾病，其中所得到的知識(shí)橫跨了基礎(chǔ)和臨床神經(jīng)科學(xué)的學(xué)科范圍，這已經(jīng)容許建立合理的治療策略。對(duì)于所有的這些組，多發(fā)性硬化仍是一種困難的疾病，對(duì)此的解決方法似乎是可行的卻仍是難以捉摸的。
少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是一種多發(fā)性硬化中的免疫攻擊的主要靶點(diǎn)，它合成并維持最多到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的40個(gè)相鄰神經(jīng)軸突的髓鞘。完整的髓鞘由一層致密膜所構(gòu)成，它螺旋狀地包圍在軸突周圍，以形成跳躍式軸突傳導(dǎo)所必需的絕緣的分段的鞘。電位門控的鈉離子通道簇集在髓鞘節(jié)段之間的無髓鞘的Ranvier結(jié)上，從中動(dòng)作電位可以被傳播并被動(dòng)地傳送下到髓鞘的神經(jīng)節(jié)段以促發(fā)下一個(gè)結(jié)上的另一個(gè)動(dòng)作電位。脫髓鞘對(duì)跳躍式傳導(dǎo)的后果解釋了多發(fā)性硬化的許多臨床和實(shí)驗(yàn)室的特點(diǎn)。部分脫髓鞘的軸突以減慢的速度傳導(dǎo)沖動(dòng)—解釋了誘發(fā)電位傳導(dǎo)的特征性延遲。脫髓鞘的軸突可以自發(fā)放電并表現(xiàn)出增高了的機(jī)械敏感性—說明了眼部運(yùn)動(dòng)時(shí)的閃光(壓眼閃光)和曲頸時(shí)沿脊柱或肢體向下傳導(dǎo)的放電的感覺(Lhermitte癥狀和征象)。部分脫髓鞘的軸突的傳導(dǎo)的安全系數(shù)是失代償?shù)模荒艹惺軠囟壬咚T導(dǎo)的膜電容的減低，并且傳導(dǎo)失敗—導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)或熱水澡之后的特征性的癥狀和體征的表現(xiàn)(Uhthoff現(xiàn)象)。
在相鄰的脫髓鞘軸突之間可以出現(xiàn)假突觸傳遞(交叉應(yīng)答)，造成了發(fā)作性癥狀—三叉神經(jīng)痛、共濟(jì)失調(diào)、和發(fā)音困難、或持續(xù)1分鐘或2分鐘的以及常由觸摸或移動(dòng)所觸發(fā)的肢體的痛性強(qiáng)直性體位。多發(fā)性硬化的個(gè)體在體力和腦力工作期間特有地容易疲倦，并且需要更長(zhǎng)的時(shí)間恢復(fù)，盡管對(duì)此了解的很少，但這可能是多因素的，多發(fā)性硬化中的乏力可以是非常失能的，甚至是孤立的乏力。
多發(fā)性硬化影響的女性是男性的兩倍；這種不能解釋的偏差與在許多其它的公認(rèn)的自身免疫性疾病中所見的相似。該病具有約每年每100,000例中的7例的發(fā)病率，患病率為每100,000例中的120例，以及終身發(fā)病危險(xiǎn)為1/400。80％患者表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性/緩解性疾病，以及通常地，該病變經(jīng)過復(fù)發(fā)和完全恢復(fù)、復(fù)發(fā)和持久缺陷、以及繼發(fā)性進(jìn)展的階段。在約四分之一的患者中，多發(fā)性硬化從未影響到每日的日?；顒?dòng)；相反地，最多到15％的患者在短時(shí)間內(nèi)成為嚴(yán)重失能的。發(fā)作在隨機(jī)的間隔內(nèi)發(fā)生，但最初平均為每年1次，之后穩(wěn)定下降。在20％患者中，疾病從發(fā)病開始就是進(jìn)展性的，因此命名為原發(fā)性進(jìn)展—影響脊髓以及，較少地影響視神經(jīng)、大腦、或小腦。疾病的開始通常是在30或40歲，但是2％的多發(fā)性硬化患者在10歲之前發(fā)病，以及5％的在16歲之前。在兒童中，觀察連續(xù)的自然病史常常只能建立與急性播散性腦脊髓炎(ADEM)的區(qū)別。總體上，預(yù)期壽命為從疾病發(fā)病開始后的至少25年，以及絕大多數(shù)患者死于無關(guān)病因。
健康個(gè)體截留自身反應(yīng)性的髓鞘T細(xì)胞，推測(cè)這是調(diào)節(jié)T細(xì)胞正常地檢查維護(hù)的。解釋這些自身免疫性疾病中的免疫調(diào)節(jié)的故障的一個(gè)假說是分子模擬，它提出特異性HLA/II型MHC分子(遺傳危險(xiǎn)的一個(gè)成分)的裂隙中所呈現(xiàn)的肽(環(huán)境因素)與自身抗原是免疫學(xué)不可區(qū)分的，因此對(duì)感染的適當(dāng)?shù)膽?yīng)答生成了對(duì)抗少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞-髓鞘單位的一些成分的不適當(dāng)?shù)难装Y。與所有的器官特異性自身免疫性疾病共有的是，這種全身的缺陷沒有造成對(duì)整個(gè)靶器官的持久的自身免疫性攻擊，而是造成了短暫的和空間隔離的炎性病變。
調(diào)節(jié)失敗導(dǎo)致了自身反應(yīng)性T細(xì)胞的擴(kuò)增、活化以及進(jìn)入到循環(huán)中；它們表達(dá)粘附因子并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的交互變化，容許通過血腦屏障進(jìn)入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。在此，活化的T細(xì)胞再次遇到抗原并激活小膠質(zhì)細(xì)胞(CNS巨噬細(xì)胞)；它們反過來表達(dá)II型分子，再次呈遞抗原給T細(xì)胞，并建立了促炎性環(huán)，它提供了富含活化T細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞以及一些中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。
釋放出有毒的炎性介質(zhì)，維持血腦屏障的故障并導(dǎo)致了軸突和神經(jīng)膠質(zhì)的損傷。一氧化氮可以直接地作用于正常的或低髓鞘的軸突，短暫地阻斷傳導(dǎo)并可逆地增加已經(jīng)失代償?shù)耐緩剿鸬娜毕?。?dāng)急性炎癥消退時(shí)，從一氧化氮誘導(dǎo)的生理的傳導(dǎo)阻斷中釋放出途徑。當(dāng)幸存的功能性途徑在細(xì)胞和系統(tǒng)水平被重建時(shí)，也改善了癥狀?？偟恼f，這些機(jī)制說明了疾病早期的緩解。但是，容易暴露出組織易損性。當(dāng)混合有高的軸突發(fā)放頻率時(shí)，一氧化氮引起了軸突的結(jié)構(gòu)(因此是不可逆的)的改變。通過神經(jīng)元分光鏡標(biāo)記物N-乙酰天冬氨酸(NAA)的減少組織學(xué)地和放射學(xué)地顯示出急性炎性斑點(diǎn)上的軸突橫斷面。在后來的18個(gè)月期間，這些橫斷的軸突經(jīng)受了華勒變性，但是作用似乎不能擴(kuò)展病變或描繪臨床缺陷。
作為急性炎性過程促進(jìn)內(nèi)源性髓鞘再生的一部分，活性的星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放出細(xì)胞因子和促生長(zhǎng)因子。但是，隨著時(shí)間，星狀膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性封閉了病變以及神經(jīng)膠質(zhì)增生引起了對(duì)進(jìn)一步髓鞘再生的生理屏障，減少了適應(yīng)蓄積的缺陷的能力，以及使得轉(zhuǎn)化到持久缺陷的階段。
因?yàn)榧膊“l(fā)作的不完全恢復(fù)可以引起永久的失能，復(fù)發(fā)的頻率與在多發(fā)性硬化的復(fù)發(fā)-緩解期內(nèi)的失能的蓄積相關(guān)。考慮到病毒感染觸發(fā)復(fù)發(fā)的可能性，I型干擾素因?yàn)樗鼈兊目共《咀饔檬紫缺挥糜诙喟l(fā)性硬化。事實(shí)上，它們的作用機(jī)制是免疫學(xué)的和復(fù)雜的我們提出了促炎性細(xì)胞因子的功能性拮抗以及II型MHC抗原表達(dá)的下調(diào)的證據(jù)；但是可以同樣好地證明其它的作用模式—包括對(duì)血腦屏障(BBB)的作用。
僅僅在兩種干擾素β-1a制劑而不是干擾素β-1b的試驗(yàn)中，復(fù)發(fā)率的改變也伴隨有失能的蓄積的減少。但是，復(fù)發(fā)相關(guān)的缺陷的蓄積的下降可以解釋這種減少，而不是對(duì)繼發(fā)性進(jìn)展的作用。
三種其它的試劑減少了復(fù)發(fā)性-緩解性多發(fā)性硬化的復(fù)發(fā)頻率，和失能的蓄積；每種都有與β干擾素相似的療效以及可接受的副作用。醋酸格拉默(Copaxone，Teva)，是一種偶然注意到的抑制試驗(yàn)性自身免疫性/過敏性腦脊髓炎的合成多肽的混合物，可能是通過抑制髓鞘堿性蛋白(MBP)與T細(xì)胞受體的結(jié)合或改變髓鞘自身反應(yīng)性T細(xì)胞的表型。根據(jù)來自一個(gè)251例患者的試驗(yàn)的結(jié)果，其中在治療組中每年的復(fù)發(fā)率被減少了25％，在美國(guó)和歐洲批準(zhǔn)了該藥用于治療復(fù)發(fā)性-緩解性多發(fā)性硬化。
硫唑嘌呤通過抑制嘌呤合成抑制了淋巴細(xì)胞增殖，并可能具有與β干擾素相似的療效，盡管試驗(yàn)數(shù)據(jù)是以較不嚴(yán)格的方式得到的并被更坦白地報(bào)告的。
米托蒽醌通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制了分裂和未分裂細(xì)胞的DNA的修復(fù)和合成；它可能比β干擾素的毒性更大，但是在美國(guó)已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療進(jìn)展的復(fù)發(fā)性疾病，包括在進(jìn)展期具有高復(fù)發(fā)頻率的患者。
考慮到抑制復(fù)發(fā)和限制它們的后果的能力是部分的，沒有見多識(shí)廣的分析家而已合理地推論出(盡管他們的成就)β干擾素是多發(fā)性硬化的決定性的治療。制藥工業(yè)對(duì)此的應(yīng)答是贊助已有藥物(例如β干擾素和環(huán)磷酰胺)的聯(lián)合治療的研究，但至今沒有令人注目的協(xié)同獲益的證據(jù)，與此一起的是對(duì)新的免疫治療策略的重要投資。在北美，干擾素β-1b和β-1a和醋酸格拉默被廣泛地處方給復(fù)發(fā)性MS的患者。但是，這些藥物有著明顯的限制，包括費(fèi)用(每年11,000美元)、不方便(腸外給藥)、副作用的頻率(特別是許多患者在每次注射干擾素后的數(shù)小時(shí)的“流感樣”癥狀)和對(duì)疾病過程的相當(dāng)溫和的總體影響(例如，復(fù)發(fā)率的減少小于35％)。此外，在復(fù)發(fā)性/緩解性MS的治療開始后超過1年的干擾素β的治療療效仍不清楚。全國(guó)多發(fā)性硬化學(xué)會(huì)已經(jīng)發(fā)布了practive原則，推薦這些藥物在所有臨床顯著的、復(fù)發(fā)性MS的患者的應(yīng)用。其它定向?qū)筂S的治療包括用定向?qū)挂环N細(xì)胞因子例如TNF-α、IL-6或IL-12的(單克隆)抗體治療MS患者。但是，盡管少數(shù)人不同意使用這些細(xì)胞因子阻斷劑例如抗TNF-α治療可能是一種治療MS患者的輔助治療，但是已經(jīng)出現(xiàn)了與單一細(xì)胞因子中和治療相關(guān)的副作用。也因?yàn)槲粗脑?，單一?xì)胞因子阻斷蛋白可以引起抗雙鏈DNA抗體的形成，以及在反復(fù)治療后蓄積的ANA發(fā)生率可以高達(dá)50％。雖然如此，抗TNF-α抗體治療與狼瘡樣癥狀相關(guān)。在少數(shù)這樣治療的患者中也已經(jīng)報(bào)告了脫髓鞘疾病和再生障礙性貧血。反復(fù)施與嵌合體的治療性抗體的主要問題是免疫原性，以及高達(dá)60％的抗體治療的患者發(fā)生了人抗嵌合體的抗體(HACA)，它與輸液反應(yīng)相關(guān)并減低了治療療效。
本發(fā)明提供了一種治療相信是患有多發(fā)性硬化的對(duì)象特別是人的方法，以及特異地瞄準(zhǔn)于減少?gòu)?fù)發(fā)或惡化的頻率、和持續(xù)作用，以緩解在復(fù)發(fā)期間的附加的促炎性細(xì)胞因子的釋放所引起的癥狀，預(yù)防在復(fù)發(fā)后的疾病進(jìn)展所引起的失能，以及促進(jìn)復(fù)發(fā)后的組織修復(fù)。
本發(fā)明提供了一種用于在一個(gè)對(duì)象特別是人中發(fā)生的復(fù)發(fā)性/緩解性多發(fā)性硬化的復(fù)發(fā)期間的口服治療的藥物組合物，以及一種用于在與附加的促炎性細(xì)胞因子釋放相關(guān)的惡化的復(fù)發(fā)期間的口服治療的方法，例如在患有MS或EAE的靈長(zhǎng)類中，包括使對(duì)象接受一種發(fā)明的信號(hào)分子，優(yōu)選的是這些信號(hào)分子的混合物。復(fù)發(fā)期間的最優(yōu)選的口服治療是選自LQG、QVV、PALP(SEQ ID NO34)、AQG、LAG、LQGV(SEQID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、或LAGV(SEQ ID NO10)的一種肽或肽的混合物。
此外，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防相信需要這種預(yù)防的對(duì)象的多發(fā)性硬化的發(fā)生的方法，特別是用于治療在出現(xiàn)一種神經(jīng)衰竭的征象后的患者的方法，例如已經(jīng)觀察到視神經(jīng)炎但沒有發(fā)生MS，以及發(fā)明的信號(hào)分子用于生產(chǎn)預(yù)防多發(fā)性硬化、用于治療對(duì)象發(fā)生的復(fù)發(fā)性/緩解性多發(fā)性硬化的藥物組合物的用法，特別是人類對(duì)象，以及一種用于治療與附加的促炎性細(xì)胞因子釋放相關(guān)的惡化的方法，特別是人類對(duì)象。
優(yōu)選地全身施與這樣的一種信號(hào)分子或混合物，例如通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)或皮下給藥，并導(dǎo)致惡化期期間的附加釋放的促炎性細(xì)胞因子的作用的減輕。在嚴(yán)重病例中，可以考慮鞘內(nèi)給藥。但是，最優(yōu)選的治療包括粘膜給藥，優(yōu)選的口服給藥。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于調(diào)節(jié)相信需要這種調(diào)節(jié)的對(duì)象的MS的復(fù)發(fā)性/緩解性疾病的方法，包括給所述的對(duì)象提供一種信號(hào)分子，包括一種短的基因調(diào)節(jié)性肽，或其功能性類似物，其中口服施與足以調(diào)節(jié)醫(yī)源性事件的所述的信號(hào)分子。信號(hào)分子優(yōu)選的是短肽，優(yōu)選的是最大長(zhǎng)度為30個(gè)氨基酸，或它的功能性類似物或衍生物。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，肽是一種長(zhǎng)度從約3個(gè)到15個(gè)氨基酸的寡肽，優(yōu)選的是4到12個(gè)，更優(yōu)選的是4到9個(gè)，最優(yōu)選的是長(zhǎng)度3-4到6個(gè)氨基酸或它的功能類似物或衍生物。當(dāng)然，這樣的信號(hào)分子可以是更長(zhǎng)的，例如通過用更多的氨基酸或其它的側(cè)基團(tuán)將其延伸(N和/或C末端)，當(dāng)分子進(jìn)入到最后的目的地時(shí)，可以將其降解(例如酶降解)。特別的，提供了一種方法，其中所述的信號(hào)分子調(diào)節(jié)了基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)移和/或活性。當(dāng)所述的基因轉(zhuǎn)錄因子包括NFκB/Rel蛋白或AP-1蛋白時(shí)，這是特別有用的。因?yàn)镹FκB和AP-1的活化，上面所提及的許多復(fù)發(fā)性/緩解性事件誘導(dǎo)了炎性細(xì)胞因子表達(dá)的增加，以及在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種方法，其中抑制了所述的NFκB/Rel蛋白或AP-1蛋白的轉(zhuǎn)移和/或活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的肽選自肽LQG、AQG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、LQGA(SEQ ID NO3)、VLPALP(SEQ ID NO4)、ALPALP(SEQ ID NO5)、VAPALP(SEQ ID NO6)、ALPALPQ(SEQ ID NO7)、VLPAAPQ(SEQID NO8)、VLPALAQ(SEQ ID NO9)、LAGV(SEQ ID NO10)、VLAALP(SEQ ID NO11)、VLPALA(SEQ ID NO12)、VLPALPQ(SEQID NO13)、VLAALPQ(SEQ ID NO14)、VLPALPA(SEQ ID NO15)、GVLPALP(SEQ ID NO16)、LQGVLPALPQVVC(SEQ ID NO17)、LPGCPRGVNPVVS(SEQ ID NO18)、LPGC(SEQ ID NO19)、MTRV(SEQ ID NO20)、MTR、VVC?？诜委熥顑?yōu)選的肽選自肽LQG、QVV、PALP(SEQ ID NO34)、AQG、LAG、LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、或LAGV(SEQ ID NO10)。如所述的，炎性細(xì)胞因子的附加表達(dá)常常是因?yàn)镹FκB和AP-1的活化。內(nèi)皮細(xì)胞(例如經(jīng)創(chuàng)傷)、血管周圍細(xì)胞和粘附的或遷移的白細(xì)胞可以表達(dá)炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)多種促炎性和促凝血的作用。這些作用一起使得易感于炎癥、血栓形成和出血。對(duì)于臨床和醫(yī)療的興趣和價(jià)值，本發(fā)明提供了選擇性控制活體對(duì)象的組織和器官的NFκB依賴性基因表達(dá)的機(jī)會(huì)，優(yōu)選的是在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，它容許明顯上調(diào)例如IL-10所介導(dǎo)的抗炎性反應(yīng)以及明顯下調(diào)TNF-α、一氧化氮(NO)、IL-5、IL-6、IL-12和IL-1β所介導(dǎo)的促炎性反應(yīng)。
與單一細(xì)胞因子治療比較，例如抗TNF-α、抗IL-5、抗IL-6、抗IL-12、抗IL-23、抗IL-12p40、抗IL-23p40或抗IL-1β抗體的用法，使用發(fā)明的NFκB下調(diào)性肽或其功能性類似物具有的主要優(yōu)點(diǎn)是下調(diào)促炎性細(xì)胞因子的主要網(wǎng)絡(luò)。
本發(fā)明因此提供了NFκB調(diào)節(jié)性肽或其衍生物用于生產(chǎn)用于治療優(yōu)選的是在靈長(zhǎng)類動(dòng)物的MS中所見的復(fù)發(fā)性/緩解性疾病的藥物組合物的用法，以及提供了一種治療特別是在靈長(zhǎng)類動(dòng)物的MS中所見的復(fù)發(fā)性/緩解性疾病的方法。優(yōu)選的是治療包括給對(duì)象施與包括NFκB下調(diào)性肽或其功能性類似物的藥物組合物。有用的NFκB下調(diào)性肽的實(shí)例是VLPALPQVVC(SEQ ID NO21)、LQGVLPALPQ(SEQ ID NO22)、LQG、LQGV(SEQ ID NO1)、GVLPALPQ(SEQ ID NO23)、VLPALP(SEQ ID NO4)、VVC、MTR和環(huán)狀LQGVLPALPQVVC(SEQ IDNO17)。利用在此所提供的方法可以找到更多的下調(diào)性肽和功能性類似物。在NFκB下調(diào)性肽中最突出的是VLPALPQVVC(SEQ ID NO21)、LQGVLPALPQ(SEQ ID NO22)、LQG、LQGV(SEQ ID NO1)、和VLPALP(SEQ ID NO4)。也能減少細(xì)胞的NO的產(chǎn)生。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療患有如MS復(fù)發(fā)過程中所見的復(fù)發(fā)性/緩解性疾病的對(duì)象的方法，其采用本發(fā)明的方法和信號(hào)分子，同時(shí)或至少有時(shí)采用阻斷單一一種細(xì)胞因子的蛋白質(zhì)，例如抗TNF-α、抗IL-5、抗IL-6、抗IL-12、抗IL-23、抗IL-12p40、抗IL23p40或抗IL-1β抗體或其功能性類似物。在此還提供了本發(fā)明的信號(hào)分子在制備用于治療被認(rèn)為患有MS并接受抗TNF-α、抗IL-5、抗IL-6、抗IL-12、抗IL-23、抗IL-12p40、抗IL23p40或抗IL-1β抗體治療的對(duì)象的藥物組合物中的用途。在此還提供了使用包括至少兩種寡肽或其功能性類似物的組合物治療MS中所見的復(fù)發(fā)性/緩解性疾病，其中每一種均能夠下調(diào)NFκB，并由此降低細(xì)胞產(chǎn)生NO和/或TNF-α，特別是其中所述至少兩種寡肽選自LQGV(SEQ ID NO1)、AQGV(SEQ ID NO2)、和VLPALP(SEQ ID NO4)。應(yīng)答于MS中所見的復(fù)發(fā)性/緩解性疾病過程中肌體接收到的各種信號(hào)，NFκB/Rel轉(zhuǎn)錄因子家族被激活并在它們之間形成各種異和同二聚體以調(diào)節(jié)含有κB-特異性結(jié)合位點(diǎn)的靶基因的表達(dá)。NFκB轉(zhuǎn)錄因子是以Rel同源結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣鞯南嚓P(guān)蛋白家族的異或同二聚體。它們形成兩個(gè)亞家族，即含有活化結(jié)構(gòu)域的亞家族(p65-RELA、RELB、和c-REL)和不含活化結(jié)構(gòu)域的亞家族(p50、p52)。典型的NFκB是p65(RELA)和p50(NFκB1)的二聚體。在活化的NFκB二聚體中，已知p50-p65異二聚體參與增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，而p50-p50同二聚體參與轉(zhuǎn)錄抑制。不過，已知p65-p65同二聚體對(duì)靶基因既具有轉(zhuǎn)錄激活活性也具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些真核細(xì)胞基因的啟動(dòng)子中存在不同NFκB二聚體的具有不同親和性的κB DNA結(jié)合位點(diǎn)，且活化的NFκB的同和異二聚體之間的平衡最終決定細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的性質(zhì)和水平。術(shù)語“NFκB調(diào)節(jié)性肽”在此是指能夠調(diào)變NFκB/Rel轉(zhuǎn)錄因子家族成員的激活的肽或其功能性類似物或修飾物或衍生物。NFκB的活化可調(diào)節(jié)基因以增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。此外，其也可調(diào)節(jié)基因以導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。調(diào)變包括轉(zhuǎn)錄的上調(diào)或下調(diào)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽或其功能性衍生物或類似物可用于制備藥物組合物，用于口服治療MS中所見的復(fù)發(fā)性/緩解性疾病。NFκB調(diào)節(jié)性肽可與其他MS治療方法同時(shí)施用，所述肽(或類似物)的濃度優(yōu)選地為大約1至大約1000mg/l，但肽也可以其本身施用，例如置于沖擊注射劑中。最初推薦劑量為1至5mg/kg體重，例如每8小時(shí)沖擊注射(bolus injection)或輸注，直至患者穩(wěn)定，不過，由于能夠進(jìn)行口服治療，因此其后得以快速轉(zhuǎn)換至口服施用。例如當(dāng)預(yù)期或已經(jīng)診斷出現(xiàn)大的不良反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選地要監(jiān)測(cè)所治療的患者的血漿中的細(xì)胞因子的情況，例如TNF-α、IL-6或IL-10的水平，當(dāng)所述水平達(dá)到正常時(shí)，要停用本發(fā)明的治療。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，給患有嚴(yán)重和急性加重(復(fù)發(fā))的患者沖擊注射NFκB下調(diào)性肽如AQGV(SEQ ID NO2)、LQGV(SEQ ID NO1)或VLPALP(SEQ ID NO4)，劑量為2mg/kg，并繼續(xù)輸注NFκB下調(diào)性肽如AQGV(SEQ ID NO2)、LQGV(SEQ ID NO1)或VLPALP(SEQ ID NO4)或其功能性類似物，劑量為1mg/kg體重，每8小時(shí)一次?？诜委熼_始使用的劑量為0.01至10mg/kg體重，且優(yōu)選地為0.1至1mg/kg體重，直至復(fù)發(fā)得到穩(wěn)定。劑量可以增加或降低，例如取決于患者血漿或CSF中的細(xì)胞因子情況的監(jiān)測(cè)結(jié)果。當(dāng)然，如果復(fù)發(fā)看起來性質(zhì)較輕，則口服治療是開始的首選。如上所述，在實(shí)驗(yàn)性自身免疫/過敏性腦脊髓炎(EAE)和MS中，加重和疾病的進(jìn)展主要由細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)。當(dāng)MS惡化過程中，CSF和血漿中的TNF-α家族明顯升高。IL-12的活性通常也升高。這些細(xì)胞因子和趨化因子的下調(diào)或T細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子可防止T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞到達(dá)CNS，由此進(jìn)一步下調(diào)那些在腦和脊髓中產(chǎn)生病變的促炎癥反應(yīng)。細(xì)胞遷移至CNS并隨后釋放促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的模型具體見于復(fù)發(fā)性/緩解性疾病過程中，并能夠以本發(fā)明的肽通過調(diào)節(jié)NFκB、T調(diào)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育、以及干預(yù)早期或前體基因如C-jun或C-erg而治療。在此給出的治療方案也可用于其他疾病，這些疾病類似于或包括多發(fā)性硬化的惡化及其變體、釋放額外的促炎性細(xì)胞因子EAE及其他基于感染性和/或免疫的腦膜腦病，例如見于麻疹即SSPE、腮腺炎、出血性病毒感染、進(jìn)展性多灶性腦病或乳頭狀瘤病毒(JC病毒)疾病、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎引起的免疫性腦病、伴有腦病的瘧疾、血管圓線蟲病及其他寄生蟲腦炎、萊姆病、皰疹病毒1-8疾病包括mono樣病毒(mono like viruses)如EBV、CMV和HHV6、立克次體病即斑疹傷寒、Rocky Mountain斑疹熱和Q熱、衣原體病即沙眼、NSU、衣原肺炎、支原體關(guān)節(jié)炎和腦炎、HIV-1和2型腦炎和癡呆、蟲媒病毒病、披膜病毒病和其他慢病毒或Bunya病毒或黃病毒病。其他形式的感染性和/或炎性腦膜腦炎為繼續(xù)細(xì)菌性感染、螺旋體感染(神經(jīng)梅毒)、Lyme neuroborreliosis、結(jié)核、病毒感染(腸道病毒、腮腺炎病毒、單純皰疹病毒2型、披膜病毒(蟲媒病毒)、HIV 1型和2型、HTLV-1感染)。真菌感染(新型隱球菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、巴西芽生菌、申氏孢子絲菌、莢膜組織胞漿菌、Psuedallescheria boydii和Dermatiaceous fungi、大部分機(jī)會(huì)性感染如假絲酵母和曲霉菌和結(jié)合菌)、原蟲感染(腦型瘧疾、弓形體病、錐蟲屬、耐格里屬和蠕蟲)、神經(jīng)肉樣瘤病(neurosarcoidosis)、克雅氏病、以及免疫接種后的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。
粘膜和口服施用實(shí)驗(yàn)1材料和方法雌性NOD小鼠飼養(yǎng)在無病原體條件下，Lucky Farm，Balkbrug，荷蘭。所有小鼠均自由獲得食物和水。
21-22周齡糖尿病雌性NOD小鼠(n＝5)給予4周時(shí)間自由獲得含有4IU/ml hCG(pregnyl；批號(hào)235863)或基因調(diào)節(jié)性肽LQGV(SEQ IDNO1)、GVLPALPQ(SEQ ID NO23)和VLPALP(SEQ ID NO4)的混合物(各1微克/微升)。對(duì)照小鼠僅給予白水。4周中，每天觀察處理的小鼠的飲水行為、小便，并觀察其毛皮。
結(jié)果在4周處理過程中，未處理的小鼠飲用很多水，因?yàn)槊刻煨枰谄渌刑砑铀移渚哂袧B出的毛皮，這是重度糖尿病小鼠的常見體征。以含有hCG或基因調(diào)節(jié)性肽混合物的水處理的小鼠自實(shí)驗(yàn)開始4天后飲用正常量的水，且因此在測(cè)試過程中其毛皮正常。
結(jié)論實(shí)驗(yàn)說明，由于以商品化hCG制劑口服治療和以基因調(diào)節(jié)性肽口服治療，本已患有糖尿病的小鼠與對(duì)照組相比其調(diào)變癥狀較輕。因此，口服hCG制劑或基因調(diào)節(jié)性肽的治療確實(shí)具有可觀察到的治療效果，且粗制hCG制劑和基因調(diào)節(jié)性肽能夠經(jīng)口或通過消化道而被攝取。
實(shí)驗(yàn)2材料和方法雌性NOD小鼠飼養(yǎng)在無病原體條件下，Lucky Farm，Balkbrug，荷蘭。所有小鼠均自由獲得食物和水。
12-14周齡非糖尿病雌性NOD小鼠(n＝14-16)給予7周時(shí)間自由獲得含有4IU/ml的來自4個(gè)不同批次的hCG(pregnyl；批號(hào)235863，248455，293703和313692)的水或僅給予白水。治療結(jié)束時(shí)，通過測(cè)定尿中的葡萄糖來評(píng)價(jià)小鼠的糖尿病。通過連續(xù)兩次尿糖測(cè)定認(rèn)定小鼠的糖尿病。
結(jié)果以白水處理的16只小鼠中的5只在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)具有糖尿病，而以批號(hào)235863處理的16只小鼠中的2只、以批號(hào)248455處理的16只小鼠中的3只、以批號(hào)293703處理的14只小鼠中的1只、以及以批號(hào)313692處理的14只小鼠中的2只具有糖尿病。
結(jié)論實(shí)驗(yàn)說明，以商品化hCG制劑口服治療處理的NOD小鼠在治療過程中具有降低的糖尿病發(fā)病率。此外，實(shí)驗(yàn)還說明，不同批號(hào)之間的Pregnyl的治療效果有差異。
實(shí)驗(yàn)3材料和方法雌性NOD小鼠飼養(yǎng)在無病原體條件下，Lucky Farm，Balkbrug，荷蘭。所有小鼠均自由獲得食物和水。
11-13周齡非糖尿病雌性NOD小鼠(n＝9)給予5周時(shí)間，每周3次，每次1滴(50微升)含有基因調(diào)節(jié)性肽LQGV(SEQ ID NO1)、GVLPALPQ(SEQ ID NO23)和VLPALP(SEQ ID NO4)(個(gè)1微克/ml)的水或白水。將水滴灌入口腔的頰囊內(nèi)。處理后，小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)15周。待31-33周齡時(shí)，通過測(cè)定尿中的葡萄糖來評(píng)價(jià)小鼠的糖尿病。通過連續(xù)兩次尿糖測(cè)定認(rèn)定小鼠的糖尿病。然后將小鼠處死，通過FACS分析來確定MP12/20強(qiáng)陽性骨髓細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。
結(jié)果以白水滴處理的9只小鼠中的8只在31-33周齡時(shí)具有糖尿病，而以含有基因調(diào)節(jié)性肽的水處理的9只小鼠中的5只在31-33周齡時(shí)具有糖尿病。
結(jié)論實(shí)驗(yàn)說明，以基因調(diào)節(jié)性肽對(duì)NOD小鼠進(jìn)行粘膜治療降低了糖尿病的發(fā)病率。
實(shí)驗(yàn)4材料和方法雌性NOD小鼠飼養(yǎng)在無病原體條件下，Lucky Farm，Balkbrug，荷蘭。所有小鼠均自由獲得食物和水。
13-14周齡非糖尿病雌性NOD小鼠(n＝10)給予5周時(shí)間，每天1滴(50微升)含有基因調(diào)節(jié)性肽LQG、LQGV(SEQ ID NO1)、VLPALP(SEQ ID NO4)、VVC和MTRV(SEQ ID NO20)各20mcg的PBS或僅1滴PBS。將水滴灌入口腔的頰囊內(nèi)?？诜委熀?，小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)20周。每周通過測(cè)定尿中的葡萄糖來評(píng)價(jià)小鼠的糖尿病。通過連續(xù)兩次尿糖測(cè)定認(rèn)定小鼠的糖尿病。
結(jié)果處理結(jié)束后9周，以口服PBS處理的所有10只小鼠均具有糖尿病，而以基因調(diào)節(jié)性肽(LQG、LQGV(SEQ ID NO1)、VLPALP(SEQID NO4)、VVC和MTRV(SEQ ID NO20))混合物口服處理的10只小鼠僅有4只具有糖尿病。不過，基因調(diào)節(jié)性肽的抗糖尿病作用在過了一段時(shí)間后似乎減弱，因?yàn)樘幚斫Y(jié)束后20周，10只小鼠中的8只具有糖尿病。
結(jié)論實(shí)驗(yàn)說明，以基因調(diào)節(jié)性肽對(duì)NOD小鼠進(jìn)行口服治療延緩了糖尿病的發(fā)病。
糖尿病發(fā)病率

高血糖引起的炎癥性和血管并發(fā)癥在1型和2型糖尿病中均常見，且隨著時(shí)間的推移，在患病對(duì)象中預(yù)示著顯著的發(fā)病率和早期死亡率。盡管多項(xiàng)研究提示葡萄糖本身在調(diào)變細(xì)胞特性、細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境方面具有直接的不良反應(yīng)的作用，但最近的研究也提示，蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)的非酶性糖基化的產(chǎn)物—高度糖化終產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGE)—在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中的作用。
多項(xiàng)流行病學(xué)研究已經(jīng)提示，循環(huán)胰島素水平升高本身可導(dǎo)致出現(xiàn)心血管風(fēng)險(xiǎn)。其他因素，例如高脂血癥和血糖水平間斷升高，與特征為胰島素水平升高的綜合征如代謝綜合征或綜合征X密切相關(guān)。在這方面，NFκB的活化在動(dòng)脈硬化、缺血再灌注損傷、和糖尿病的發(fā)病中具有特殊的作用。例如，NFκB靶基因，例如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和血管細(xì)胞粘附分子-1，早已被認(rèn)為參與最早期的動(dòng)脈粥樣化形成。實(shí)際上，在血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的細(xì)胞核中以及人動(dòng)脈粥樣化中的單核吞噬細(xì)胞的細(xì)胞核中均鑒定到了RelA/p65，即NFκB的成分之一。
高血糖癥在1型和2型中的后果均是產(chǎn)生高度糖化終產(chǎn)物(AGE)。蛋白質(zhì)的非酶性糖化(glycation)/氧化的這些產(chǎn)物與其關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體RAGE(AGE受體)之間的相互作用，導(dǎo)致NFκB在內(nèi)皮細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞和VSMC中活化，其過程至少部分涉及活性氧中間物的產(chǎn)生并激p21ras和ERK1/2激酶。最近發(fā)現(xiàn)，一種特異性AGE，即蛋白質(zhì)的羧基(甲基賴氨酸)加成物，結(jié)合RAGE并在體外和體內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞活化。明確將RAGE與這些配體介導(dǎo)的效應(yīng)相關(guān)聯(lián)的證據(jù)是在存在RAGE的阻斷抗體、可溶性RAGE(sRAGE；細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、或?qū)⒁环N其中僅缺失了受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體轉(zhuǎn)瞬時(shí)染入攜帶野生型RAGE的細(xì)胞的情況下，通過阻斷AGE介導(dǎo)的NFκB活化而證實(shí)的。在后一種情況中，由于AGE刺激的NFκB的活化被顯著抑制，產(chǎn)生了一種顯性負(fù)效應(yīng)。此外，胰島素的一種新特性在于其能夠激活異戊(間)二烯基轉(zhuǎn)移酶、法呢基轉(zhuǎn)移酶和香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶(geranylgeranyltransferases)I和II。由于這些分子具有轉(zhuǎn)錄后修飾Ras、Rho和Rab蛋白的能力，其活化在其與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間建立了關(guān)聯(lián)。用胰島素(主要為生理學(xué)相關(guān)濃度)孵育VSMC提高了香葉基香葉基化(geranylgeranylated)Rho-A的生物利用度，由此引出一種機(jī)制，將胰島素水平升高與NFκB活化聯(lián)系在一起。在VSMC中，胰島素、AGE、高血糖癥或血管緊張素II協(xié)同增強(qiáng)NFκB的活化，達(dá)到比這些介質(zhì)中的任何一種單獨(dú)應(yīng)用時(shí)更高的程度。還已知胰島素使得脈管系統(tǒng)能夠準(zhǔn)備好，以便當(dāng)其接觸這些傳統(tǒng)介質(zhì)時(shí)活化程度升高；2型糖尿病或胰島素抗性綜合征的血管微環(huán)境富含能夠?qū)е翹FκB活化這一共同通路的因子。在上述實(shí)驗(yàn)中，以基因調(diào)節(jié)性肽口服治療前糖尿病性NOD小鼠降低了糖尿病的發(fā)病率，說明該治療對(duì)胰腺的炎癥、β細(xì)胞破壞和自身免疫過程的抑制作用。此外，當(dāng)在糖尿病的后期(已經(jīng)患糖尿病的小鼠)開始治療時(shí)，我們觀察到長(zhǎng)時(shí)間高血糖癥的炎癥效應(yīng)被抑制和炎癥的臨床癥狀的降低，這是通過其引水行為的改變、尿液減少以及毛皮的外觀而觀察到的。葡萄糖耐量和/或長(zhǎng)期高血糖癥的正在發(fā)生的損害，隨著時(shí)間的推移，如果未能控制，可導(dǎo)致嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥，如腎衰/腎損害、大血管和微循環(huán)損害、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)系統(tǒng)病、腎病和加速動(dòng)脈硬化，而這可通過以下調(diào)NFκB的基因調(diào)節(jié)性肽進(jìn)行粘膜治療而對(duì)抗。NFκB是預(yù)防或抑制與糖尿病和胰島素抗性有關(guān)的從氧化的脂蛋白到AGE到高水平的葡萄糖或胰島素等大量有害分子的血管損害特性的靶向。NFκB是多效性轉(zhuǎn)錄因子。就1型和2型糖尿病(高胰島素血癥和高血糖癥)而言，大量環(huán)境刺激物，例如AGE、高血糖、和血管緊張素II引發(fā)導(dǎo)致NFκB活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在這些信號(hào)機(jī)制中，Ras、Rho-A、cdc42、和Rac1的作用十分顯著。NFκB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核引起大量參與宿主和細(xì)胞防御應(yīng)答的基因活化。在某些情況中，NFκB的活化導(dǎo)致“有益的”炎癥，表現(xiàn)為分解和再生，或?qū)е隆坝泻Φ摹毖装Y，引起組織破壞。不過，可能難以將NFκB引發(fā)的有益的炎癥自有害的炎癥中獨(dú)立出來，這是因?yàn)樵诤芏嗲闆r下，兩者的機(jī)制是先后起作用并有著微妙的平衡。本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)性肽在這方面對(duì)例如NFκB具有調(diào)節(jié)作用且具有重要的治療作用。
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<223>Synthetic peptide<400>34Pro Ala Leu Pro權(quán)利要求
1.用于治療患病個(gè)體的粘膜施用形式的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥理學(xué)有效量的基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物和藥物學(xué)可接受的稀釋劑。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述粘膜施用形式選自噴霧劑、液體和凝膠。
3.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述藥物組合物是口服施用形式的。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述口服施用形式選自膠囊、片劑、液體、口服懸液、乳劑和粉劑。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述疾病包含炎癥性疾病。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述炎癥性疾病包含慢性炎癥，例如糖尿病、多發(fā)性硬化或慢性移植排異反應(yīng)。
7.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述炎癥性疾病包含急性炎癥，例如感染性休克或過敏性休克或者急性或超急性移植排異反應(yīng)。
8.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述炎癥性疾病包含自身免疫性疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
9.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述炎癥性疾病包含過敏癥，例如哮喘或寄生蟲病。
10.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述炎癥性疾病包含針對(duì)感染物的過強(qiáng)的免疫應(yīng)答，所述感染物例如是病毒或細(xì)菌。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的粘膜施用形式的藥物組合物，其中所述治療個(gè)體包含全身性治療。
12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)移和/或活性。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述基因轉(zhuǎn)錄因子包含NFκB/Rel蛋白。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所述NFκB/Rel蛋白的轉(zhuǎn)移和/或活性被抑制。
15.權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物調(diào)節(jié)編碼炎性介質(zhì)的基因的表達(dá)。
16.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述炎性介質(zhì)包含細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子選自TNF-α、TGF-β、干擾素γ、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23和IL-40。
17.基因調(diào)節(jié)性肽在制備一種用于通過粘膜施用對(duì)疾病進(jìn)行全身性治療的藥物組合物中的用途。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述疾病包含慢性炎癥，例如糖尿病、多發(fā)性硬化或慢性移植排異反應(yīng)。
19.權(quán)利要求17的用途，其中所述疾病包含急性炎癥，例如感染性休克或過敏性休克或者急性或超急性移植排異反應(yīng)。
20.權(quán)利要求17的用途，其中所述疾病包含自身免疫性疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
21.權(quán)利要求17的用途，其中所述疾病包含過敏癥，例如哮喘或寄生蟲病。
22.權(quán)利要求17的用途，其中所述疾病包含針對(duì)感染物的過強(qiáng)的免疫應(yīng)答，所述感染物例如是病毒或細(xì)菌。
23.全身性治療個(gè)體的疾病的方法，其包含給個(gè)體施用一種粘膜施用形式的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥理學(xué)有效量的基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物和藥物學(xué)可接受的稀釋劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述粘膜施用形式選自噴霧劑、液體和凝膠。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述藥物組合物是口服施用形式的。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述口服施用形式選自膠囊、片劑、液體、口服懸液、乳劑和粉劑。
27.權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)的方法，其中所述疾病包含慢性炎癥，例如糖尿病、多發(fā)性硬化或慢性移植排異反應(yīng)。
28.權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)的方法，其中所述疾病包含急性炎癥，例如感染性休克或過敏性休克或者急性或超急性移植排異反應(yīng)。
29.權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)的方法，其中所述疾病包含自身免疫性疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
30.權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)的方法，其中所述疾病包含過敏癥，例如哮喘或寄生蟲病。
31.權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)的方法，其中所述疾病包含針對(duì)感染物的過強(qiáng)的免疫應(yīng)答，所述感染物例如是病毒或細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及免疫介導(dǎo)的疾病如過敏癥、自身免疫性疾病、移植相關(guān)性疾病和其他炎癥性疾病。本發(fā)明特別涉及通過口服或粘膜施用含有基因調(diào)節(jié)性肽的藥物組合物而對(duì)炎癥性疾病進(jìn)行全身性治療。本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其用于粘膜施用以治療患病對(duì)象，所述藥物組合物包含藥理學(xué)有效量的基因調(diào)節(jié)性肽或其功能性類似物以及藥物學(xué)可接受的稀釋劑。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1802166SQ200480015967
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2004年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月8日
發(fā)明者尼薩爾·艾哈邁德·卡恩, 羅貝特·本納, 格特·文斯沃特 申請(qǐng)人:比奧滕普特公司