專利名稱：用于合成性表面活性劑的新穎的脂質(zhì)混合物的制作方法
背景技術(shù)：
內(nèi)源性肺表面活性劑降低了肺泡表面上氣液界面的表面張力，這防止了肺在呼氣末的塌陷。表面活性劑不足是早產(chǎn)兒的一種常見疾病，并會(huì)引起呼吸窘迫綜合征(RDS)，其能被制劑有效地治療，該制劑是切碎的哺乳動(dòng)物肺的脂質(zhì)提取物或肺灌洗液。所述的制劑是已知的改良的天然表面活性劑，它們主要由磷脂(PLs)例如磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰甘油(PG)和疏水性表面活性劑蛋白B和C(SP-B和SP-C)組成。
為清楚起見，以下是本專利申請(qǐng)中引用的一列PLs-磷脂酰膽堿PC，-磷脂酰乙醇胺PE，-磷脂酰甘油PG，-磷脂酰肌醇PI，-磷脂酰絲氨酸PS，-鞘磷脂SM，-1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油，通常已知為二棕櫚?；?磷脂酰甘油DPPG，-1，2--二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿，通常已知為二棕櫚酰基-磷脂酰膽堿DPPC，-1-棕櫚酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油，通常已知為棕櫚?；?油基-磷脂酰甘油POPG，-1-棕櫚?；?2-油基-sn-甘油-3-磷酸膽堿，通常已知為棕櫚?；?油基-磷脂酰膽堿POPC，-1，2-二油基-sn-甘油-3-磷酸甘油，通常已知為二油基-磷脂酰甘油DOPG，
-1-棕櫚?；?2-亞油基-sn-甘油-3-磷酸膽堿，通常已知為棕櫚酰基-亞油基-磷脂酰膽堿PLPC，-1-硬脂?；?2-花生四烯基(arachidonoyl)-sn-甘油-3-磷酸膽堿，通常已知為硬脂?；?花生四烯?；?磷酸膽堿(SAPC)，-1-棕櫚?；?2-花生四烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(PAPC)，-1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，通常已知為二棕櫚?；?磷脂酰乙醇胺DPPE，-1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，通常已知為二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺DSPE，-1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸，通常已知為二棕櫚?；?磷脂酰絲氨酸DPPS。
磷脂的甘油部分主要用長(zhǎng)鏈脂肪酸(C14-C20)酯化，脂肪酸依次能是飽和(例如肉豆蔻、棕櫚和硬脂酸)、單不飽和(例如油酸)或多不飽和的(例如亞油酸和花生四烯酸)。
包含作為特征殘基的中性或兩性離子部分例如甘油(PG)、纖維醇(PI)和絲氨酸(PS)的磷脂是已知的酸性磷脂。酸性磷脂的其它實(shí)例有DPPG、POPG和DPPS。
表面活性劑通常以水混懸液的形式通過氣管滴入到肺而用于早產(chǎn)兒。它們也能給予被各種病狀，包括嚴(yán)重的肺功能不全例如成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)侵襲的成人。
從生物物理學(xué)和藥理學(xué)/治療學(xué)觀點(diǎn)來說，為了具有最佳的性質(zhì)，表面活性劑制劑應(yīng)該i)有效降低表面張力；ii)具有良好的擴(kuò)散速度；iii)具有低粘度以便在通過氣管內(nèi)滴入給予微量時(shí)能使在水性介質(zhì)中的濃縮混懸液制劑在肺泡水平上具有最佳的輸送和分布性質(zhì)。
表面活性劑降低表面張力的能力以及其它參數(shù)例如擴(kuò)散速度能在體外使用幾種方法來測(cè)定，例如Schurch，S.，Bachofen，H.Goerke，J.，Possmayer，H.(1989)″俘獲肺泡法再現(xiàn)原位肺表面活性劑單層的行為?！錔.Appl.Physio.，672389-2396記載的“俘獲肺泡法”。
表面活性劑制劑的一個(gè)最重要的脂質(zhì)成分是1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)，因?yàn)樵趬嚎s期間它在氣-液界面形成了單分子膜，在表面壓縮期間能經(jīng)受相轉(zhuǎn)變(固化)，因此穩(wěn)定了具有不同大小的肺泡系統(tǒng)。
一般公認(rèn)的是，為了獲得良好的活性，酸性磷脂是最重要的，因?yàn)樗鼈兡艽龠M(jìn)DPPC的擴(kuò)散。
另一方面，高濃度的飽和PL例如DPPC能影響脂質(zhì)混懸液的其它性質(zhì)，例如制劑的粘度。
制備小量濃縮混懸液的可能性是通過氣管內(nèi)滴入施用表面活性劑給予低體重新生兒的特別重要的特征。
可作為治療用的改良天然表面活性劑具有一般包括在25到50mg/ml之間的濃度。它們中僅有一個(gè)，“固爾蘇”，是可在較高濃度，即80mg/ml使用的。
從動(dòng)物組織獲得的表面活性劑制劑總之是有一些缺點(diǎn)的，例如它們?cè)谟邢蘖恐械目捎眯浴⑸a(chǎn)和滅菌過程的復(fù)雜性和有關(guān)的生產(chǎn)成本后果是，已經(jīng)作出了許多努力來制備合成性表面活性劑。
根據(jù)Wilson(Expert Opin Pharmacother 2001，2，1479-1493)，合成性表面活性劑的優(yōu)越性在于沒有表面活性劑蛋白的“人造”表面活性劑，僅包括合成性化合物的混合物，主要是磷脂及模仿脂質(zhì)組合物和天然表面活性劑性能制備的其它脂類；和“重構(gòu)”表面活性劑是人造表面活性劑，其中已經(jīng)加入了分離自動(dòng)物或通過重組技術(shù)制備的表面活性劑蛋白，例如WO95/32992記載的物質(zhì)，或是合成性表面活性劑蛋白類似物例如WO89/06657、WO92/22315和WO00/47623記載的物質(zhì)。
重構(gòu)表面活性劑的開發(fā)在很大程度上集中在表面活性劑蛋白類似物上，而對(duì)脂質(zhì)組合物的觀注較少。
有關(guān)在開發(fā)中的合成性表面活性劑的組合物和脂質(zhì)混合物濃度的信息沒有多少。
在III期、關(guān)鍵的、隱蔽的、多國(guó)的隨機(jī)試驗(yàn)中，給予5.8ml/kg或175ml/kg Surfaxin用以比較它與Exosurf在防止RDS方面的性質(zhì)(Moya F.等Abstract n.2643 of the Annual Meeting of thePaediatric Academy Societies，San Francisco，May 1-4，2004)。從這些值中能推斷出，Surfaxin的是以30mg/ml的濃度給予的。
Surfaxin，也就是報(bào)道的KL-4表面活性劑，是合成性含肽表面活性劑，其通過在有機(jī)溶劑中混合3∶1重量比的磷脂二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)和1-棕櫚?；?2-油基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPG)以及棕櫚酸(PA)(與磷脂相比為15％重量)來制備。
在先前的研究中還使用了兩個(gè)濃度26.6mg/ml和35mg/ml，以磷脂濃度表示(Am J Respir Crit Care Med 1996，vol 153，第404-410頁)。
現(xiàn)有技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中，下列文獻(xiàn)報(bào)道了有關(guān)人造和/或重構(gòu)表面活性劑脂質(zhì)組合物的數(shù)據(jù)。
Suzuki等(Eur J Respir Dis 1986，69，336-345)描述了由低分子量表面活性劑蛋白和由DPPC以及1，2-二棕櫚酰基sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPG)以80∶20重量比組成的磷脂混合物構(gòu)成的表面活性劑的體外和體內(nèi)的性質(zhì)。盡管據(jù)報(bào)道不飽和的磷脂促進(jìn)了在氣液界面的有效擴(kuò)散，但是發(fā)現(xiàn)DPPG在與小載脂蛋白重組的DPPC系統(tǒng)中優(yōu)于不飽和的PG。
在Notter等(Clin Perinatology 1987，14，433-479)中，綜述了脂質(zhì)或磷脂例如二油基-PC、PE、膽固醇、短鏈飽和-PC、脂肪酸和甘油對(duì)DPPC再分散性的作用。一般的結(jié)果是與單用DPPC相比已經(jīng)提高了動(dòng)態(tài)再分散。在文章中還報(bào)道了由DPPC∶卵-PG以7∶3的比例構(gòu)成的人造表面活性劑已經(jīng)在文獻(xiàn)中被使用了。
在Darfler FJ(In Vitro Cell Dev Biol.1990，26(8)，779-83)中，從純化的合成性脂質(zhì)中制備了適合用在組織培養(yǎng)中的不含蛋白的脂質(zhì)微乳液以生成能被過濾滅菌的均勻、水溶性的、穩(wěn)定性混懸液。觀察對(duì)中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用發(fā)現(xiàn)，微乳液組合物是最優(yōu)的。表2中報(bào)道的制備的微乳液包含α-生育酚和至少為16.3％的膽固醇醋酸酯。
在Scripps名義下的WO 89/06657和WO 92/22315是針對(duì)SP-B的多肽類似物，盡管在說明書中一般性地報(bào)道了(表面活性劑組合物的，編者注釋)脂質(zhì)部分有優(yōu)選約50到約90，更優(yōu)選約50到約75重量百分比的DPPC，剩余的是不飽和PC、PG、三酰基甘油、棕櫚酸、鞘磷脂或其混合物，然而在這兩個(gè)申請(qǐng)的實(shí)施例中，評(píng)價(jià)了包含4或10mg/ml的DPPC∶PG為3∶1(75∶25)重量比的混合物的表面活性劑實(shí)例的體外性質(zhì)。為了研究體內(nèi)性質(zhì)，使用了20mg/ml濃度的相同混合物，在一些例子中還包含棕櫚酸。
在Cochrane等(Science，1991，254，566-568)中，研究了由DPPC和PG 3∶1、DPPC和1-棕櫚?；?2-油基PG(POPG)3∶1、DPPC和1-棕櫚?；?2-油基PC(POPC)3∶1構(gòu)成的簡(jiǎn)單肽例如KL4和PL的體外特性。KL4以3％的濃度被檢測(cè)，而其它肽的濃度為3-5％。還檢測(cè)了3％KL4在3∶1比例的DPPC∶POPG(單不飽和磷脂)和15％棕櫚酸的脂質(zhì)混合物中的體內(nèi)性質(zhì)。作者一般性地推斷，這些簡(jiǎn)單肽和DPPC∶POPG的組合物在27天齡胎兔和130齡胎恒河猴中提供了良好的表面活性劑。
在Yu等(Biochimica and Biophysica Acta 1992，1126，26-34)中，使用搏動(dòng)起泡技術(shù)來研究二元磷脂混合物的表面活性，其中混合物包含結(jié)合了1％SP-B的7∶3w/w比例的DPPC和不飽和酸性PLs例如卵-PG、POPG或卵-磷脂酸。
在Byk Gulden名義下的針對(duì)SP-C多肽類似物的專利申請(qǐng)WO95/32992中，一般性地報(bào)道了，磷脂部分能包含DPPC、POPG(或PG)和鹽例如氯化Ca或Mg或Na以降低粘度。在實(shí)施例中，已經(jīng)使用了DPPC∶POPG∶棕櫚酸 7∶3∶0.25+CaCl2的混合物。
Curstedt等(9thInternational Workshop on SurfactantReplacement，Jerusalem，May 22-25，1994)報(bào)道了與下列脂質(zhì)混合物重組的SP-C類似物的體外活性DPPC∶POPC∶DOPG 55∶35∶10，其中POPG和DOPG是單不飽和磷脂；DPPC∶PG 7∶3；DPPC∶PG∶棕櫚酸68∶22∶9，有或沒有CaCl2。與其它脂質(zhì)混合物相比，包含DPPC∶PG∶棕櫚酸68∶22∶9的制劑具有更快的吸收速率和更低的平衡表面張力。
Krill等(Chemistry and Physics of Lipids71，47-59，1994)得到了同樣的結(jié)論，在針對(duì)評(píng)價(jià)表面活性劑組合物體外性質(zhì)的研究中，其中組合物由合成性蛋白B片段、DPPC和POPG構(gòu)成，他們暗示了存在棕櫚酸有助于建立DPPC的穩(wěn)定脂膜，這能達(dá)到低表面張力值。沒有報(bào)道指出這些成分的比例。
在本申請(qǐng)人名義下的WO00/47623中，針對(duì)SP-C類似物肽，一般性地報(bào)道了適宜的脂質(zhì)/磷脂可以選自PC(優(yōu)選DPPC)、PG、棕櫚酸、三?；视?、鞘磷脂。在實(shí)施例中，已經(jīng)在體外檢測(cè)了由一個(gè)主張的肽例如SP-C(LKS)構(gòu)成的并結(jié)合了DPPC∶PG 7∶3w/w或DPPC∶PG∶棕櫚酸68∶22∶9w/w/w的表面活性劑制劑。
在Palmblad等(Biochem J 1999，339，381-386)中，報(bào)道了與WO00/47623相同的數(shù)據(jù)。在文章中，還陳述了最佳的體外特性來自包含SP-C(LKS)、SP-DPPC和PG的制劑，即當(dāng)從脂質(zhì)混合物省略了棕櫚酸時(shí)。
Diemel等(J Biol Chem，2002，227，21179-21188)報(bào)道了由SP-B和DPPC∶DPPG 80∶20或DPPC∶POPG 80∶20或DPPC∶POPC∶DPPG60∶20∶20構(gòu)成的表面活性劑混合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。
在較后的混合物中，使用了飽和(DPPG)和單不飽和(POPC)磷脂。
WO 02/06301涉及治療與脂質(zhì)氧化或微生物增殖有關(guān)的疾病的方法，包括給予含有藥理學(xué)有效量的抗氧化劑或抗菌性肺表面活性劑蛋白化合物例如蛋白A和D及其衍生物的組合物。在文章中一般性地陳述了與本申請(qǐng)一致的方法，包括給予結(jié)合了其可以是有機(jī)溶劑、磷脂酰膽堿、膽固醇或表面活性劑磷脂的載體的所述化合物。在實(shí)施例中，使用了由卵磷脂酰膽堿、二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)、膽固醇和1-油基-2-亞油基-sn-甘油-3磷酸膽堿(分別為1∶1∶0.15∶0.15，w/w)組成的表面活性劑脂質(zhì)混合物作為底物來檢查肺表面活性劑蛋白預(yù)防脂質(zhì)氧化的能力。在這個(gè)混合物中，卵-PC和DPPC，以43％的量存在，而1-油基-2-亞油-sn-甘油基-3磷酸膽堿和膽固醇以7％的量存在，分別相對(duì)于混合物總重。該混合物不包含酸性磷脂。
US 2002/0072540是針對(duì)含有肺表面活性劑的肺表面活性劑組合物，當(dāng)在室溫下在0.9％w/w氯化鈉中以10％的濃度作為粉末或顆粒分散時(shí)，在溶脹過程中，通過偏振顯微鏡方法觀察，其在約0.5分鐘到約120分鐘內(nèi)能形成氣液固界面的雙折射網(wǎng)或細(xì)管。在文章中一般性地陳述了根據(jù)本發(fā)明的肺表面活性劑組合物含有磷脂例如飽和和不飽和磷脂或其混合物。磷脂可以包含二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)。
Evans等(Lipids 15，524-535)報(bào)道大多數(shù)完全飽和磷脂的表面粘度是非常高的，某些不飽和磷脂的表面粘度是非常低的。他們還報(bào)道了膽固醇降低了DPPC單分子層的表面粘度。然而他們沒有教導(dǎo)如何調(diào)節(jié)表面活性劑制劑磷脂混合物的組合物，以便降低其粘度而在膜壓縮期間保持有效降低較低表面張力的能力。
在大多數(shù)涉及脂質(zhì)混合物作為用于肺表面活性劑載體的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中，含有飽和PLs尤其是等于或大于70％重量的DPPC并結(jié)合了PG或POPG的脂質(zhì)組合物已經(jīng)被使用了或建議作為優(yōu)選，尤其是用于降低表面張力到較低的值。
然而，相對(duì)高含量的飽和PLs可以通過提高制劑粘度而影響流變學(xué)性質(zhì)，尤其是當(dāng)需要濃縮的，即等于或大于約30mg/ml，優(yōu)選大于40mg/ml，更優(yōu)選大于50mg/ml的合成表面活性劑組合物時(shí)。高粘度確實(shí)能負(fù)面地影響表面活性劑的擴(kuò)散以及其由此向肺支氣管肺泡部分的分布(King等Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2002，282，L277-L284)。此外，為了制備含有具有可接受的粘度并較高含量飽和PLs的脂質(zhì)混合物的濃縮混懸液，需要采取加熱和強(qiáng)力攪拌的操作。
考慮到這些缺點(diǎn)，提供能用在合成性表面活性劑制備中的脂質(zhì)混合物將是非常有利的，其中的合成表面活性劑當(dāng)達(dá)到體外和體內(nèi)良好的性質(zhì)時(shí)，其能保持濃縮表面活性劑制劑的較低粘度，以在給予后有利其輸送和分布到肺支氣管肺泡部分。
發(fā)明概述本發(fā)明針對(duì)的是脂質(zhì)混合物，其用于制備含有至少為95％重量磷脂的合成性表面活性劑，所述磷脂含有至少為40％重量，優(yōu)選含有40％到65％重量，更優(yōu)選含有45％到60重量％，特別是包含在45％到55％重量之間的1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)；大于10％重量，優(yōu)選大于20％重量，更優(yōu)選包含在20％到45％重量之間，特別是在30％到40％重量之間的多不飽和磷脂；和大于10％重量，優(yōu)選包含在10％到30％重量之間更優(yōu)選包含15％到30％重量的飽和或單不飽和酸性磷脂，所有的量都基于脂質(zhì)混合物的總量來計(jì)算；任選還含有至多5％重量的中性脂質(zhì)。
已經(jīng)真正發(fā)現(xiàn)通過使用具有這種組合的脂質(zhì)混合物能制備表現(xiàn)良好體外性質(zhì)特征，即在膜壓縮期間的低表面張力和快速分散速率以及良好的生物活性的表面活性劑制劑。在未成熟新生兔中進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確實(shí)證明了包含本發(fā)明脂質(zhì)混合物的重構(gòu)表面活性劑產(chǎn)生了高潮氣量和肺氣體量值。
尤其是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含大于30％重量的不飽和PLs和大于10％重量的酸性磷脂的重構(gòu)表面活性劑，在肺氣體量值方面與那些包含較低量的相比能產(chǎn)生更好的性能。
包含本發(fā)明脂質(zhì)混合物的合成性表面活性劑具有能使?jié)饪s水性混懸液制劑有等于或大于30mg/ml，優(yōu)選大于40mg/ml，更優(yōu)選大于50mg/ml到80mg/ml的磷脂混合物的技術(shù)特性，其特征在于低粘度，有利的是包含在5到20厘泊之間，優(yōu)選6到15厘泊之間，從而有利其在給藥后輸送和分布到肺。
發(fā)明詳述本發(fā)明脂質(zhì)混合物和相應(yīng)的合成性表面活性劑制劑的特性將在以下詳述中描述。
有利的是脂質(zhì)混合物含有至少95％重量，優(yōu)選至少98％重量的磷脂。磷脂部分包含至少為40％重量，優(yōu)選包含在40％到65％重量之間，更優(yōu)選包含在45％到60％重量之間且尤其是包含在45％到55％重量的1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)，以脂質(zhì)混合物總重計(jì)算。
DPPC能通過合成途徑制備或由天然資源獲得。
有利的是磷脂部分包含大于10％重量，優(yōu)選大于20％重量，更優(yōu)選包含在20％到45％重量之間尤其是在30％到40％重量之間的多不飽和磷脂，以脂質(zhì)混合物總重計(jì)算。
對(duì)于多不飽和磷脂，我們意指以前定義的磷脂(PLs)，其中至少一個(gè)酯化脂肪酸殘基在脂鏈中包含不止一個(gè)雙鍵。典型的多不飽和脂肪酸殘基是亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸。這個(gè)類型的多不飽和磷脂有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)和鞘磷脂(SM)。
優(yōu)選的多不飽和磷脂是1-棕櫚?；?2-亞油基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(PLPC)、1-棕櫚酰基-2-花生四烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(PAPC)和1-硬脂酰基-2-花生四烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(SAPC)。
多不飽和磷脂通常是商業(yè)上可得到的，并且能通過合成途徑制備或從自然資源，例如哺乳動(dòng)物的組織獲得。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，作為多不飽和磷脂的來源，可使用天然提取物。例如，分離自卵(卵-PE)的磷脂酰乙醇胺或包含從肝(肝-PL)分離得到的多不飽和脂肪酸的磷脂混合物也是能被使用的。卵-PE包含不同的酯化酸，其中有多不飽和亞油酸和花生四烯酸。肝-PL通常具有平均重量百分比為約50％PC、25％PE、10％鞘磷脂、15％酸性磷脂的組成，其中一些PL類被多不飽和酸酯化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該使用能使脂質(zhì)混合物的最終組合物滿足本發(fā)明脂質(zhì)混合物需要的這樣一種量的卵-PE和/或肝-PL。
有利的是，磷脂部分包含大于10％重量，優(yōu)選包含在10％到30％重量之間，更優(yōu)選包含在15％到30％重量之間的飽和或單不飽和酸性磷脂，以脂質(zhì)混合物的總量計(jì)算。
對(duì)于飽和的酸性磷脂，我們意指磷脂例如磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸，其中酯化的脂肪酸是飽和的，而對(duì)于單不飽和酸性磷脂，我們意指那些至少一個(gè)酯化脂肪酸是單不飽和的物質(zhì)。飽和PLs的典型實(shí)施例有1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸甘油(DPPG)和1，2-二油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(DOPG)和1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸(DPPS)。單不飽和PLs的實(shí)例有1-棕櫚?；?2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)和1-棕櫚酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC)。優(yōu)選的是，本發(fā)明脂質(zhì)混合物中的酸性磷脂將是1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸甘油(DPPG)、1-棕櫚酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)及其混合物。
除了DPPC、多不飽和磷脂和飽和或單不飽和酸性磷脂外，本發(fā)明脂質(zhì)混合物的磷脂部分還能包含其它的磷脂，其中酯化脂肪酸是飽和或單不飽和的。所述類別的典型磷脂有1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)和1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)。
有利的是，在本發(fā)明的脂質(zhì)混合物中，飽和和不飽和(單不飽和和多不飽和)磷脂的比例將包含在65∶35到40∶60重量之間，優(yōu)選在55∶45和45∶55重量之間，酸性磷脂和其它磷脂的比例將包含在10∶90到30∶70重量之間，優(yōu)選在15∶85到25∶75重量之間。
任選的是，本發(fā)明的脂質(zhì)混合物包含至多5％重量，優(yōu)選等于或小于2％重量的中性脂質(zhì)。中性脂質(zhì)包含三?；视汀⒛懝檀?、膽固醇酯和脂肪酸例如棕櫚酸。
優(yōu)選的中性脂質(zhì)是膽固醇，因?yàn)樗梢杂兄诮档椭|(zhì)混合物的粘度。
作為本發(fā)明脂質(zhì)混合物的實(shí)施例，已經(jīng)使用的是DPPC∶PLPC∶SAPC∶DPPG∶POPG重量比為45∶30∶10∶5∶10和DPPC∶肝PL∶POPG重量比為50∶40∶10。
本發(fā)明的脂質(zhì)混合物在重構(gòu)表面活性劑制備中是特別有用的。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有前述脂質(zhì)混合物并結(jié)合了表面活性劑蛋白(分離自動(dòng)物或通過重組技術(shù)例如WO95/32992記載的技術(shù)生成)，或結(jié)合了表面活性劑蛋白SP-B或SP-C的合成性類似物(例如WO89/06657、WO92/22315和WO00/47623記載的物質(zhì))或其混合物的重構(gòu)表面活性劑。
蛋白能是任意的表面活性劑蛋白，其選自SP-A、SP-B、SP-C、SP-D或其合成或重組的類似物。
本發(fā)明的重構(gòu)表面活性劑也能含有多粘菌素，優(yōu)選多粘菌素B，作為表面活性劑蛋白SP-B的官能取代基。
對(duì)于SP-C的合成類似物，優(yōu)選的是，將使用根據(jù)單字母氨基酸編碼的通式(I)肽FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n(XbB)n(XcB)mXdGALLΩGL(I)其中X是選自I、L和nL(正亮氨酸)的氨基酸；B是選自K、I、W、F、Y和鳥氨酸的氨基酸；Z是S，任選被通過酯鍵與側(cè)鏈相連的包含12-22個(gè)碳原子的?；〈?；Ω是選自M、I、L和nL(正亮氨酸)的氨基酸；a是從1到19的整數(shù)，優(yōu)選1到11；b是從1到19的整數(shù)，優(yōu)選1到8；
c是從1到21的整數(shù)，優(yōu)選1到5；d是從0到20的整數(shù)，優(yōu)選1到11；e是0或1；f是0或1；n是0或1；m是0或1；其中，優(yōu)選的是-n+m≥0；-f≥e，-(XaB)n(XbB)n(XCB)mXd是具有最大22個(gè)氨基酸，優(yōu)選10到22的序列。
甚至更優(yōu)選的是使用式(II)的肽IPSSPVHLKRLBLLLLLLLLILLLILGALLΩGL(II)其中B是選自K、W、F、Y和鳥氨酸的氨基酸；Ω是選自M、I、L和nL(正亮氨酸)的氨基酸；其中絲氨酸能任選被?；?，例如被棕櫚酰基?；?br> 下文中報(bào)道的非?；问降碾?SP-C33)是本發(fā)明最優(yōu)選的IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL(SP-C33)所述的肽能根據(jù)WO00/47623報(bào)道的方法制備。
重構(gòu)表面活性劑中的表面活性劑蛋白或肽的量將在為混合物總重0.1％到5％之間，優(yōu)選0.5％到3％，更優(yōu)選在1％到2％之間的范圍內(nèi)變化。
主張的重構(gòu)表面活性劑將通過在有機(jī)溶劑中混合帶有肽或蛋白的脂質(zhì)混合物溶液，隨后干燥該制劑直至獲得干燥的粉末來制備。
本發(fā)明還涉及含有包含本發(fā)明脂質(zhì)混合物的合成表面活性劑的藥物制劑，用于給予需要表面活性劑不足治療性治療的受治者。
所述的藥物制劑將通過氣管內(nèi)給予或通過在水性介質(zhì)中的混懸液形式的噴霧劑或通過在適宜推進(jìn)劑的氣溶膠中給予。優(yōu)選的是，它們將作為在0.9％氯化鈉水溶液中的混懸液經(jīng)氣管內(nèi)給予。有利的是，表面活性劑的濃度(以磷脂的含量表示)將大于30mg/ml，優(yōu)選大于40mg/ml，更優(yōu)選大于50mg/ml，甚至更加優(yōu)選在50到80mg/ml之間。
在包含于50到80mg/ml之間的表面活性劑濃度下，在250℃時(shí)使用在100到500s-1范圍內(nèi)的切變率測(cè)定的表面活性劑粘度將有利地包含在2到30厘泊之間，優(yōu)選在5到20厘泊之間，更優(yōu)選包含在6到15厘泊之間，甚至更加優(yōu)選在6到10厘泊之間。
合有本發(fā)明脂質(zhì)混合物的表面活性劑能夠被用于治療所有的表面活性劑不足病例，典型的是治療新生兒呼吸窘迫綜合征(NRDS)、成人急性窘迫綜合征(ARDS)、胎便吸入綜合征(MAS)、幾類肺炎和支氣管肺發(fā)育不良。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將通過以下實(shí)施例進(jìn)行說明。
實(shí)施例1-重構(gòu)表面活性劑的制備材料磷脂1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸甘油(DPPG)、1-棕櫚?；?2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)、1-棕櫚?；?2-亞油基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(PLPC)、1-硬脂?；?2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(SAPC)和從肝(肝-PL)中分離得到的磷脂混合物已經(jīng)用于制備脂質(zhì)混合物并且是商業(yè)上可得到的。
肽SP-C33根據(jù)WO00/47623報(bào)道的方法合成。
重構(gòu)表面活性劑的制備將溶解在氯仿/甲醇98∶2(v/v)中的脂質(zhì)，分別與重量比為45∶30∶10∶5∶10和50∶40∶10的DPPC∶PLPC∶SAPC∶DPPG∶POPG和DPPC∶肝PL∶POPG混合，以便獲得根據(jù)本發(fā)明所教導(dǎo)的脂質(zhì)混合物(脂質(zhì)混合物A和B)。相應(yīng)的重構(gòu)表面活性劑制劑(表面活性劑A和B)通過向脂質(zhì)混合物中加入2％重量的SP-C33來制備。表面活性劑A在氮?dú)庀抡舭l(fā)，并分別以10mg/ml和80mg/ml的脂質(zhì)濃度重新混懸在150mmol/l NaCl中，而表面活性劑B則以80mg/ml的脂質(zhì)濃度重新混懸。
表面活性劑的B肝-PL磷脂組合物的特征如下磷脂酰膽堿(PC)50％、磷脂酰乙醇胺(PE)25％、鞘磷脂(SM)10％、酸性磷脂15％。
實(shí)施例2-體外活性在俘獲性氣泡表面活性劑計(jì)(surfactometer)中測(cè)定表面性質(zhì)。室中充滿了蔗糖溶液并注入了2μl表面活性劑A(10mg/ml)；然后吹入10微升空氣產(chǎn)生氣泡。從膜吸收和隨后的準(zhǔn)靜態(tài)循環(huán)面積壓縮期間氣泡的形狀來測(cè)定氣液界面的表面張力。
表面活性劑A證明了其在要求達(dá)到最小表面張力的表面面積壓縮方面中具有良好的性能。
實(shí)施例3-表面活性劑A的體內(nèi)活性在27天孕齡時(shí)通過剖宮產(chǎn)術(shù)分娩不足月的(足月＝31天)兔胎兒(n＝34)。分娩時(shí)，在腹膜內(nèi)用戊巴比妥鈉(0.1ml；6mg/ml)麻醉，切開氣管，在腹膜內(nèi)用泮庫溴銨(0.1-0.5ml；0.2mg/ml)使其麻痹并在37℃下保存在體積描記器系統(tǒng)中。對(duì)它們進(jìn)行機(jī)械通風(fēng)(ventilated)并行輸送100％氧的改良伺服操縱電子呼吸器。滴注表面活性劑后，首先將峰壓力升高到35cmH2O 1分鐘，以促進(jìn)表面活性劑在肺中的分布，然后降低到25cmH2O。然后在25cmH2O的峰壓力下對(duì)動(dòng)物進(jìn)行通風(fēng)15分鐘，降低到20cmH2O 5分鐘，進(jìn)一步在15cmH2O下進(jìn)行5分鐘，然后再次升高到25cmH2O進(jìn)行5分鐘。每隔5分鐘通過連接了體積描記器盒的呼吸速率計(jì)記錄潮氣量。
頻率是每分鐘40，吸氣∶呼氣時(shí)間比為1∶1。沒有使用呼氣末正壓。
將不成熟的新生兔在出生時(shí)隨機(jī)化以通過氣管插管接受2.5ml/kg體重的表面活性劑A(80mg/ml)。在對(duì)照動(dòng)物中，不向氣道中滴入物質(zhì)。所有的動(dòng)物都通風(fēng)30分鐘。
用Sun等，Eur Respir J 1991，4，364-370記載的體積描記器系統(tǒng)測(cè)定潮氣量(VT)，呼氣末肺氣體量(LGV)由肺體積和肺凈重之間的差異評(píng)價(jià)(Scherle等Mikroscopie 1970，26，57)。
在這些實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)表面活性劑A具有較高的潮氣量。肺氣體量值也顯著增加。
實(shí)施例4-表面活性劑B的體內(nèi)活性在與實(shí)施例3相同的動(dòng)物模型中比較表面活性劑B(80mg/ml)和商業(yè)上可得到的改良天然表面活性劑(固爾蘇)(80mg/ml)導(dǎo)致的潮氣量和肺氣體量根據(jù)本發(fā)明制備的重構(gòu)表面活性劑B顯示了能與改良的天然表面活性劑相比的活性。
權(quán)利要求
1.用于制備合成性表面活性劑的脂質(zhì)混合物，所述的脂質(zhì)混合物主要由以下物質(zhì)組成至少95％重量的磷脂，所述的磷脂含有至少為40％重量的1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)；大于10％重量的多不飽和磷脂；和大于10％重量的飽和或單不飽和酸性磷脂；所有的量都基于脂質(zhì)混合物的總重量計(jì)算。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的脂質(zhì)混合物，進(jìn)一步包含占脂質(zhì)混合物總重至多5％重量的中性磷脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的脂質(zhì)混合物，其中中性脂質(zhì)選自三酰基甘油、膽固醇、膽固醇酯和脂肪酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的脂質(zhì)混合物，其中DPPC的量在40％到65％重量之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的脂質(zhì)混合物，其中DPPC的量在45％到55％重量之間。
6.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的脂質(zhì)混合物，其中多不飽和磷脂的量大于20％重量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的脂質(zhì)混合物，其中多不飽和磷脂的量在30％到40％重量之間。
8.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的脂質(zhì)混合物，其中酸性磷脂的量在15％到30％重量之間。
9.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的脂質(zhì)混合物，其中多不飽和磷脂選自1-棕櫚?；?2-亞油基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(PLPC)、1-棕櫚?；?2-花生四烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(PAPC)和1-硬脂?；?2-花生四烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(SAPC)、分離自卵(卵-PE)的磷脂酰乙醇胺或從肝(肝-PL)分離得到的磷脂混合物。
10.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的脂質(zhì)混合物，其中酸性磷脂選自1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸甘油(DPPG)、1-棕櫚?；?2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)、1，2-二油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(DOPG)、1-棕櫚?；?2-油基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC)和1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸(DPPS)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的脂質(zhì)混合物，其中酸性磷脂選自DPPG、POPG及其混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11的脂質(zhì)混合物，其中飽和和不飽和(單不飽和和多不飽和)磷脂間的重量比例在65∶35到40∶60之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-11的脂質(zhì)混合物，其中酸性磷脂和其它磷脂間的重量比例在10∶90到30∶70之間。
14.含有權(quán)利要求1到13的脂質(zhì)混合物的重構(gòu)表面活性劑，其結(jié)合了一種或多種選自SP-A、SP-B、SP-C、SP-D、其合成或重組類似物的表面活性劑蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的重構(gòu)表面活性劑，其中表面活性劑蛋白以占總混合物重量的約0.1到5％的量存在。
16.根據(jù)權(quán)利要求14和15的重構(gòu)表面活性劑，其中表面活性劑蛋白是根據(jù)氨基酸單字母編碼的通式(I)SP-C的合成或重組類似物FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n(XbB)n(XcB)mXdGALLΩGL(I)其特征在于X是選自I、L和nL(正亮氨酸)的氨基酸；B是選自K、I、W、F、Y和鳥氨酸的氨基酸；Z是S，任選被通過酯鍵與側(cè)鏈相連的包含12-22個(gè)碳原子的?；〈籕是選自M、I、L和nL的氨基酸；a是從1到19的整數(shù)；b是從1到19的整數(shù)；c是從1到21的整數(shù)；d是從0到20的整數(shù)；e是0或1；f是0或1；n是0或1；m是0或1；其中-n+m≥0；-f＞e，-(XaB)n(XbB)n(XCB)mXd是最大具有22個(gè)氨基酸，優(yōu)選10至22的序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的重構(gòu)表面活性劑，其中SP-C類似物具有式(II)IPSSPVHLKRLBLLLLLLLLILLLILGALLΩGL(II)其中B是選自K、W、F、Y和鳥氨酸的氨基酸；和Ω是選自M、I、L和nL的氨基酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的重構(gòu)表面活性劑，其中SP-C類似物具有以下氨基酸組合IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL。
19.含有權(quán)利要求14-18的重構(gòu)表面活性劑的藥物制劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的藥物制劑，其為在0.9％氯化鈉水溶液中的混懸液形式，其中表面活性劑的濃度(以磷脂含量表示)大于30mg/ml。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的藥物制劑，其中表面活性劑的濃度大于40mg/ml。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的藥物制劑，其中表面活性劑的濃度大于50mg/ml。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的藥物制劑，其中表面活性劑的濃度在50mg/ml到80mg/ml之間。
24.根據(jù)權(quán)利要求19-23的藥物制劑，其特征在于粘度在5到20厘泊之間。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的藥物制劑，其特征在于粘度在6到15厘泊之間。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于合成性表面活性劑的新穎的脂質(zhì)混合物。特別的是，本發(fā)明提供了用于制備合成性表面活性劑的包含特定量的多不飽和磷脂的特定脂質(zhì)混合物。所述的表面活性劑及其藥物組合物能用于治療表面活性劑不足，如呼吸窘迫綜合征(RDS)。
文檔編號(hào)A61K9/12GK1809338SQ200480017324
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2004年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月30日
發(fā)明者J·約翰松, T·柯斯泰特, B·羅伯特松 申請(qǐng)人:奇斯藥制品公司