專利名稱：用于促進和增強神經(jīng)修復和再生的肌肉來源的細胞(mdc)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般的涉及肌肉來源的細胞的用途，所述細胞優(yōu)選從骨骼肌獲得，此處稱為MDC，以促進和增強神經(jīng)細胞和神經(jīng)元組織的再生和修復。本發(fā)明進一步涉及用于修復神經(jīng)組織的方法的MDC，尤其是在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，以及它們有助于神經(jīng)元組織發(fā)育的能力。這些方法可用于治療中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)紊亂并緩解、減輕、改善或消除動物的神經(jīng)病學或神經(jīng)退行性疾病的癥狀，尤其是哺乳動物，包括人。
背景技術：
神經(jīng)系統(tǒng)用作廣泛分離的身體部件之間的通訊網(wǎng)絡并迅速工作以控制對刺激的反應、處理信息并產生控制復雜行為的復雜信號模式。
脊椎動物如哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，其中包含腦和脊髓，它們通過神經(jīng)(也稱為神經(jīng)細胞、神經(jīng)元或神經(jīng)元細胞)連接到很多周圍結構，例如感覺器官、肌肉和腺體。CNS也連接到周圍神經(jīng)細胞簇，稱為神經(jīng)節(jié)，它們在周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間通訊中發(fā)揮作用。盡管不同物種間神經(jīng)連接模式有很大不同，單個神經(jīng)元(或神經(jīng)細胞)的特性在動物神經(jīng)系統(tǒng)中大致相同。成熟的脊椎動物如哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)由神經(jīng)元和膠質細胞如星形膠質細胞和少突膠質細胞組成。神經(jīng)細胞、神經(jīng)節(jié)和感覺器官組成周圍神經(jīng)系統(tǒng)。
神經(jīng)系統(tǒng)包含大量高度特化的細胞，它們一起相互作用以完成基本任務并發(fā)揮與其在系統(tǒng)中位置相關的功能。例如，神經(jīng)細胞和骨骼肌之間形成的神經(jīng)肌肉連接由三種類型細胞組成肌肉細胞、神經(jīng)細胞和施旺細胞。每種細胞具有如下述非常不同的作用，然而它們協(xié)同工作允許肌肉刺激和收縮。肌肉細胞是特化的收縮細胞。其細胞質充滿蛋白質絲的有組織陣列，其中包括大量肌動蛋白絲。在這些蛋白質纖維中間也散布有很多線粒體，它們供應ATP作為收縮裝置的能量來源。
神經(jīng)肌肉連接的神經(jīng)細胞刺激肌肉細胞收縮，從而傳遞來自腦或脊髓的興奮性信號給肌肉。神經(jīng)細胞極其長；其包含細胞核的主體可距離肌肉連接一米或更遠。因此，神經(jīng)細胞的細胞骨架發(fā)育良好，使得可以維持不尋常的細胞形狀，并經(jīng)長神經(jīng)細胞“突起”從細胞一端向另一端有效運輸物質。神經(jīng)細胞質膜含有離子泵和通道蛋白，這些蛋白已經(jīng)被神經(jīng)細胞利用，使得動作電位形式的電信號或脈沖可以以秒的分數(shù)從細胞的一端向另一端傳播，從而傳遞動作信號。
神經(jīng)肌肉連接的最后細胞是施旺細胞。施旺細胞是特化的質膜產生細胞，產生的質膜包裹神經(jīng)細胞的延長部分。周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的施旺細胞形成髓磷脂并鋪下很多層膜而在神經(jīng)細胞突起(稱為軸突)周圍形成絕緣的髓鞘。
新神經(jīng)細胞的產生也稱為神經(jīng)發(fā)生過程，一般在脊椎動物哺乳動物的出生后早期完成。到哺乳動物發(fā)育的出生后晚期，CNS含有多種類型的神經(jīng)細胞的完整補充。多數(shù)成年哺乳動物如人和非人靈長類不能產生新神經(jīng)細胞，當損傷或疾病引起不可替代的神經(jīng)元細胞和組織的破壞或死亡時這導致嚴重問題。
CNS紊亂和疾病包括多種不利狀況，如神經(jīng)退行性疾病例如帕金森病及其相關的運動障礙；阿爾茨海默?。欢喟l(fā)性硬化癥(MS)，肌萎縮性側索硬化癥(ALS)，亨廷頓?。患毙阅X損傷例如中風、腦癱、頭部損傷；和其它中樞神經(jīng)功能障礙例如癲癇、抑郁、精神分裂癥和癱瘓。隨著老齡人口的增長，現(xiàn)在人的預期壽命更長和更長壽，這些紊亂和疾病正變得愈加明顯。以上疾病中的很多，尤其是老年人的疾病，與CNS特定區(qū)域中細胞的退化或異常相關，致使CNS或周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞不能行使正常功能。現(xiàn)有神經(jīng)細胞的功能異常不是細胞完全喪失，而是包括大面積CNS紊亂、疾病和功能障礙。神經(jīng)元細胞異?？赡苁且驗樯窠?jīng)元不適當激發(fā)或神經(jīng)遞質的異常合成、加工和/或釋放。涉及受破壞或功能障礙的神經(jīng)細胞和組織的其它疾病和紊亂包括創(chuàng)傷或組織損傷或多種類型例如鈍傷、燒傷、背部損傷、肌肉損傷和勃起功能障礙等。
根據(jù)在身體上的位置，腦中基底神經(jīng)節(jié)退化可導致發(fā)生具有很多認知和運動癥狀的疾病?；咨窠?jīng)節(jié)包含很多不同區(qū)域，包括紋狀體，即含有尾狀核和豆狀核、蒼白球、黑質、無名質、腹側蒼白球、Meynert基底核(將膽堿能發(fā)射傳遞到大腦皮層)、腹側蓋區(qū)和下丘腦核。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基底神經(jīng)節(jié)的很多區(qū)域經(jīng)歷退化或局部退化，特別是在疾病中如阿爾茨海默病或運動障礙和疾病如亨廷頓舞蹈癥或帕金森病。
脫髓鞘疾病包括CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元細胞病變，它們導致這兩個系統(tǒng)內和之間的錯誤的信號傳導。髓鞘、細胞鞘用于提高髓鞘圍繞的軸突和軸突突起的多種電化學性能，它們也提供對神經(jīng)元的營養(yǎng)支持。在CNS中，少突膠質細胞產生髓鞘，而在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中施旺細胞產生這種絕緣物質。脫髓鞘疾病多發(fā)性硬化(MS)和肌營養(yǎng)不良是與需要治療的神經(jīng)損傷相關的疾病類型。
越來越需要減輕和克服CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性紊亂和疾病的新治療和方法。盡管已經(jīng)發(fā)展了多種治療方案，因為缺乏持續(xù)性長期作用、與其使用相關的并發(fā)癥、和/或隨著時間缺乏易操作性作用和效力，具有長期使用很多治療導致的缺陷。例如，精神安定藥和藥劑已被用于治療CNS紊亂并取得有限成功。由于這些藥劑跨過血腦屏障的能力有限而隨著出現(xiàn)問題。耐藥性也會出現(xiàn)，特別是長期向患者給藥時，因此限制了治療的有效性。對策如增加給藥量以獲得更高效力，可能導致不良副作用，例如，遲發(fā)性運動障礙、振顫、和其它無意識動作。已經(jīng)嘗試用移植技術進行神經(jīng)移植，然而所用細胞類型經(jīng)常不能分化成正確的神經(jīng)元表型、或者在導入宿主或接受者后存活時間很短。
哺乳動物CNS中細胞的低更新率和成年哺乳動物不能在損傷或疾病如神經(jīng)退行性疾病后再生或替換神經(jīng)元細胞都支持這種觀念，即成年CNS不含有且不能產生神經(jīng)干細胞或早期細胞，這些細胞表現(xiàn)自我更新，因而產生更多后代神經(jīng)元細胞。一般來說，干細胞的幾個典型特點是它們可以更新并維持自身、增殖、產生很多分化的功能性后代并在損傷或疾病后再生組織。因而干細胞一般是多潛能的并具有在自然或誘導的細胞死亡、疾病、損傷或功能障礙后替換細胞損失的功能。損傷或死亡后產生新CNS細胞在哺乳動物物種中很少見(Kaplan，1981，J.Comp.Neurol.，195323；Bayer，1985，Ann.New YorkAcad.Sci.，457163；美國專利6,497,872)，進一步支持成年哺乳動物CNS不含有多能神經(jīng)干細胞的理論，這些細胞可以替換因損傷或疾病而丟失的神經(jīng)元細胞。
在治療多種類型的神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷中，需要重復性和有效的細胞來源，它們可以導入或移植到需要治療的宿主所需要量來提供。用于治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病的多種細胞類型的報告包括自發(fā)存在的細胞系、永生化細胞系、原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)物、如描述于Gage等人的美國專利5,082,670中的細胞，其中使用遺傳修飾以表達酪氨酸羥化酶的成纖維細胞從而允許產生多巴胺以在植入后治療帕金森病、和如描述于Weiss等人的美國專利6,497,872中的細胞，其中披露神經(jīng)元干細胞從胎兒或成人神經(jīng)組織分離、用生長因子處理并允許在移植入宿主之前分化成神經(jīng)細胞類型。
因此，對于使用具有多種能力的可靠細胞類型有明確和充分的需求，這些能力是支持神經(jīng)細胞生長和存活，促進或增強損傷神經(jīng)再生，和促進或增強移植或植入組織的神經(jīng)支配，這些組織用于治療多種神經(jīng)系統(tǒng)相關損傷、破壞、疾病、紊亂或功能異常。還需要可局部或系統(tǒng)性給予接受組織的細胞，以修復、改善、消除或恢復例如與周圍神經(jīng)退化或炎癥相關的功能。如此處所述的本發(fā)明致力于解決在神經(jīng)病理學和神經(jīng)細胞和組織疾病治療、改善、修復和恢復領域的這種需要。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一方面提供利用優(yōu)選分離自骨骼肌的肌肉來源的細胞(此處稱為MDC)支持神經(jīng)系統(tǒng)、尤其是周圍神經(jīng)的神經(jīng)細胞再生的方法。MDC是一類早期肌肉來源的細胞，包括成肌細胞，具有整合入再生神經(jīng)、尤其是周圍神經(jīng)區(qū)域的能力，并促進或增強受破壞的神經(jīng)組織的治療和/或修復。此外，與未受損肌肉相比，MDC顯示修復神經(jīng)受損的肌肉中周圍神經(jīng)和骨骼肌纖維的潛能。如此處所用，術語“周圍神經(jīng)”表示中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的所有神經(jīng)組織，包括脊神經(jīng)、顱神經(jīng)、自主神經(jīng)、背根神經(jīng)節(jié)和自主神經(jīng)節(jié)。在一些方面，受神經(jīng)損傷上調的神經(jīng)營養(yǎng)因子能提高用MDC注射到疾病、破壞、損傷或功能障礙組織的治療。作為對來自受破壞的組織和器官的局部環(huán)境信號(例如生長和分化因子)的應答，MDC也能有助于修復損傷組織，例如神經(jīng)和肌肉組織。在一些方面，通過連續(xù)培養(yǎng)物鋪板除去非肌肉細胞和成纖維細胞可以富集成肌細胞MDC，并且這些富集、培養(yǎng)的成肌細胞MDC可被用于此處描述的方法。
本發(fā)明的另一方面提供MDC的可靠來源，當引入或移植到發(fā)生神經(jīng)破壞、損傷或疾病的區(qū)域時，這些MDC能增殖并維持持續(xù)的存活力。根據(jù)該方面，提供利用MDC的方法以富集成在需要的地方存活的細胞群體，從而治療、改善或消除神經(jīng)和神經(jīng)組織的損傷、疾病或破壞。MDC來源適用于自體移植物中神經(jīng)元細胞和/或組織修復和再生。有些情況下，MDC可適用于同種異體移植物和異種移植物而無需考慮腫瘤形成或排斥，因為這些細胞可具有免疫優(yōu)先，這允許它們逃過宿主免疫系統(tǒng)導致排斥如移植物-宿主排斥的監(jiān)測。
另一方面，本發(fā)明提供支持神經(jīng)細胞和組織存活、再生和修復的方法，其中包含將MDC引入到損傷、破壞、疾病或功能障礙組織的位點上或其周圍，以支持進行MDC治療的組織或組織區(qū)域中神經(jīng)細胞的神經(jīng)支配(或再支配)、再生和修復。MDC包含活的、非成纖維細胞的、結蛋白陽性的、成肌細胞的、早期肌肉來源的細胞的富集群體。通過在組織培養(yǎng)容器中進行至少兩次連續(xù)鋪板以除去成纖維細胞、非肌肉和非成肌細胞，可以富集用于本發(fā)明方法的MDC。MDC對于導入的組織可以是自體的。
在這些方面的另一方面，本發(fā)明提供用MDC細胞促進和/或增強移植組織或器官中神經(jīng)元存活和再生并刺激移植組織或器官由宿主組織或器官的神經(jīng)纖維的神經(jīng)支配。根據(jù)該方面，或者單獨或者與生理學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑一起，沿著移植和宿主組織之間的邊界給予MDC或者給予到該邊界附近。因此，根據(jù)這些方法，MDC可防止或延緩例如由對組織或器官的嚴重燒傷或外傷或鈍傷導致破壞的周圍皮膚軸突的退化，從而增強這些軸突支配自體皮膚移植物的能力。在相關方面，MDC攜帶編碼一種或更多神經(jīng)營養(yǎng)或生長因子的一種或更多異源多核苷酸，這些因子由MDC體內表達并有助于用于本方法的MDC的神經(jīng)保護和改善特性。
在本發(fā)明的另一方面，利用MDC促進和/或增強經(jīng)歷手術重連接的切斷或部分切斷的組織或肢體的神經(jīng)支配或再支配。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，MDC施用到損傷位點例如遠位點、近位點或兩者都有，并且或者單獨或者與生理學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑一起給予。MDC的神經(jīng)保護特性促進重連接的組織的神經(jīng)支配或再支配和切斷的軸突間的功能性連接的恢復。本發(fā)明的該方面的MDC也可工程化以表達一種或更多神經(jīng)營養(yǎng)或生長因子，這些因子在體內表達后能增強用于本方法的MDC的神經(jīng)保護和改善特性。
本發(fā)明的另一方面提供可用于體外培養(yǎng)系統(tǒng)的MDC，用于測試或篩選藥物、化合物、試劑和分子等，它們是潛在的神經(jīng)治療劑，以確認它們允許MDC支持在損傷、破壞、疾病或功能障礙的神經(jīng)元組織中的神經(jīng)細胞生長和/或再生、和/或影響神經(jīng)元細胞行為、生長、存活、活性或功能的效力。根據(jù)該方面，提供使用MDC篩選這些潛在神經(jīng)治療劑和藥物的方法，MDC優(yōu)選例如用一種或更多生長或營養(yǎng)因子如NGF、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白或其它因子處理并在體外培養(yǎng)。另外，如果MDC培養(yǎng)物不經(jīng)生長或營養(yǎng)因子預處理，這些培養(yǎng)物可用于評價或測試候選或待測化合物、物質、藥、藥物或其它試劑影響(例如刺激、誘導等)MDC支持神經(jīng)支配和/或神經(jīng)細胞生長和/或再生的能力。這樣的測試方法可涉及用測試物質處理MDC培養(yǎng)物；將處理的MDC引入神經(jīng)組織損傷、疾病或破壞的位點；并比較相對于未處理MDC支持接受者中神經(jīng)支配或神經(jīng)細胞生長而言，處理后MDC支持具有神經(jīng)組織疾病、破壞或損傷的接受者中神經(jīng)支配或神經(jīng)細胞生長的能力。適當?shù)膶φ绽缥刺幚砼囵B(yǎng)物包括在測試和篩選方法中。
本發(fā)明的另一方面提供將MDC引入或移植到具有神經(jīng)退行性疾病、紊亂、損傷或功能障礙的宿主的方法，其中所述方法包含向宿主組織引入MDC或其生理學可接受的組合物。作為早期肌肉來源的細胞如成肌細胞的富集的終末群體，MDC可通過一系列鋪板和培養(yǎng)步驟從骨骼肌中分離。培養(yǎng)富集提供用于此處描述方法的MDC的終末群體。MDC是活的、非成纖維細胞的、結蛋白陽性的細胞，它們可形成肌肉纖維(肌纖維)并也能促進、增強或改善神經(jīng)支配和神經(jīng)細胞和組織破壞的修復。在細胞連續(xù)鋪板到新容器中期間，從非MDC型細胞如成纖維細胞和脂肪細胞、內皮細胞和結締組織細胞中富集并分離MDC(包括成肌細胞、衛(wèi)星細胞和早期肌肉來源的細胞例如肌肉干細胞)?？蛇M行連續(xù)鋪板約3-7天或4-6天或3-5天，直至非成纖維細胞的MDC在培養(yǎng)物中保留并增殖。培養(yǎng)期間，通過將肌肉細胞的細胞懸液傳代到新組織培養(yǎng)皿或瓶(可以包被或不包被膠原)，貼壁的成纖維細胞和非肌肉細胞基本上從連續(xù)細胞培養(yǎng)物中消耗盡。在連續(xù)鋪板中，貼壁成纖維細胞被除去。將肌肉細胞連續(xù)傳代到具有新培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)皿或瓶中，例如以約24小時間隔，直至MDC以存活并增殖的細胞保留富集在培養(yǎng)物中，而例如在一系列超過約2次鋪板例如約3-7次鋪板、4-6次鋪板、或3-5次鋪板的最后，幾乎沒有成纖維細胞成分。MDC的終末群體被富集為能形成肌肉纖維細胞，例如成肌細胞或早期肌肉來源的細胞，當注射到動物組織例如肌肉組織中時，其中MDC存活，細胞群恢復并增殖。所得這種終末MDC細胞群體被導入需要治療的宿主中，例如以治療神經(jīng)退行性疾病。根據(jù)需要，這些MDC也可用載體轉染或轉導，這些載體可表達基因產物例如異源基因產物如生長因子、生長因子受體、肽神經(jīng)遞質或參與神經(jīng)遞質合成的酶，包括氨基酸、生物胺和神經(jīng)肽。
在具體方面，本發(fā)明涉及利用MDC支持移植或植入組織神經(jīng)支配、或神經(jīng)組織再生的方法，其中當導入到組織環(huán)境中時，MDC增殖并存活數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或更長時間，以支持神經(jīng)組織的神經(jīng)支配或再生。當注射到需要修復神經(jīng)細胞和組織的組織位點時，MDC可暴露于因子、信號和引入或移植的周圍環(huán)境中的其它成分。另外，可工程化MDC以含有和表達某些蛋白，這些蛋白可改善或促進和/或增強移植或植入組織的神經(jīng)支配、或修復肌肉和/或神經(jīng)細胞生長。因此，在神經(jīng)組織環(huán)境中，產生或傳遞的信息能影響神經(jīng)元細胞系的細胞發(fā)育以修復該環(huán)境中的缺陷、損傷和破壞等。
本發(fā)明也提供利用此處描述的從骨骼肌中分離并富集的MDC而基于細胞的治療方法，用于治療、修復或幫助恢復疾病、損傷、破壞或功能障礙的肌肉組織以及相伴隨神經(jīng)細胞或組織的破壞。在此方面，本發(fā)明提供作為基于細胞的治療的MDC，用于治療導致多種泌尿生殖功能障礙的神經(jīng)組織破壞，特別是在盆腔內根治性手術如前列腺切除術后特別是根治性前列腺切除術后，其中神經(jīng)組織例如海綿體神經(jīng)組織和/或盆神經(jīng)組織被破壞。另外在此方面，本發(fā)明提供作為基于細胞的治療的MDC，用于治療勃起功能障礙，這頻繁伴隨前列腺切除術，特別是根治性前列腺切除術后海綿體神經(jīng)組織和/或盆腔神經(jīng)組織被破壞。根據(jù)本發(fā)明，MDC促進神經(jīng)元存活和再生，也能支持組織，例如，破壞、損傷、疾病、或移植的組織的神經(jīng)支配，因而允許修復神經(jīng)組織并伴隨提供對術后相關功能障礙如勃起功能障礙的治療和改善。本發(fā)明的這方面也對盆神經(jīng)修復有用；前列腺切除術和其它盆腔手術期間可能發(fā)生盆神經(jīng)破壞。這些神經(jīng)損傷伴隨膀胱排空障礙，如此處實施例5中所述。因此，本發(fā)明的MDC對治療由于尿道括約肌去神經(jīng)支配引起的內在括約缺陷是有優(yōu)勢的。根據(jù)此方面，MDC可給予到神經(jīng)損傷位點或目標器官的神經(jīng)支配位點，例如陰莖、膀胱或括約肌，或兩者都給予。
本發(fā)明另一方面提供治療或修復神經(jīng)和肌肉組織破壞、損傷或功能障礙的方法，優(yōu)選在相同位點或相同位置，如修復與勃起功能障礙相關的神經(jīng)組織破壞和盆神經(jīng)破壞。在具體方面，MDC促進或增強前列腺手術后的神經(jīng)恢復和勃起功能或膀胱功能恢復。在另一方面，MDC促進或增強前列腺切除術或盆腔手術后的神經(jīng)恢復和盆神經(jīng)功能的恢復。本方法涉及將MDC引入包括神經(jīng)和肌肉組織兩者的破壞、損傷或功能障礙位點，并允許細胞增殖、分化并在所述區(qū)域恢復細胞群，以修復有需要患者的神經(jīng)和肌肉組織。
另一方面，從下面的詳細描述和舉例說明中，本發(fā)明具有的特征和優(yōu)點將顯而易見。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及基于細胞的治療方法，用肌肉來源的細胞(MDC)例如成肌細胞或早期肌肉來源的細胞治療、修復、改善或緩解神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)和/或肌肉組織和器官的損傷、疾病、破壞、或功能障礙，這些細胞分離自肌肉組織起始材料如骨骼肌細胞群體。獲得用于這種治療的MDC的方法在此處描述；這些方法也已經(jīng)描述于共同所有和共同未決的專利申請美國序號09/302,896和09/549,937，其全部內容引入此處作為參考。
本發(fā)明提供身體早期肌肉細胞尤其是自體細胞的易獲得的來源，所述細胞可用于治療和修復神經(jīng)退行性破壞和神經(jīng)細胞和組織的疾病、紊亂和損傷例如神經(jīng)肌肉疾病。如果可用于例如累及神經(jīng)和肌肉組織兩者的疾病、紊亂、損傷或功能障礙，特別是在相同位置，MDC也有利的用于治療和修復肌肉相關損傷、疾病、破壞或功能障礙。
另外和如果期望或需要，MDC可被遺傳修飾以含有表達載體例如質?；虿《?，其中含一個或多個被表達的異源多核苷酸，并且其表達產物在引入MDC的位點體內產生。因此，所述細胞可被遺傳工程化以含有一或多個核酸序列，這些序列編碼一或多個活性分子并表達這些分子，包括蛋白質、多肽、肽、激素、代謝物、藥物、酶等。因此MDC可用于表達生物活性物質，例如神經(jīng)遞質或生長因子，并可以作為這些物質的長期局部遞送系統(tǒng)在損傷、破壞、疾病或功能障礙位點或其附近起作用。
可用多種本領域技術人員已知的分子技術和方法對MDC進行遺傳工程化，例如轉染、感染、轉導或直接DNA注射。此處所用的轉導一般表示通過引入病毒或非病毒載體到細胞中而已被遺傳工程化以含有一或多種編碼外源或異源產物的多核苷酸的細胞。優(yōu)選病毒載體。轉染更常見地表示已被遺傳工程化以含有一或多種編碼外源產物的多核苷酸的細胞，這些多核苷酸位于質?；蚍遣《据d體中。MDC可以被不同載體轉染或轉導并因此用作基因遞送載體以允許感興趣基因產物在所述組織或器官位點或其附近被表達和生產。
盡管優(yōu)選病毒載體，本領域技術人員將意識到對細胞進行遺傳工程操作以含有編碼期望蛋白或多肽、細胞因子和其它等的核酸序列可用本領域已知的方法實施，例如美國專利5,538,722描述的內容，包括融合、轉染、由DEAE-Dextran或磷酸鈣沉淀介導的脂轉染(Grahamand Van Der Eb，1973，Virology，52456-467；Chen and Okayama，1987，Mol.Cell.Biol.72745-2752；Rippe et al.，1990，Mol.Cell.Biol.，10689-695)；使用高速微粒的基因轟擊(Yang etal.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，879568-9572)；微注射(Harland and Weintraub，1985，J.Cell Biol.，1011094-1099)；電穿孔(Tur-Kaspa etal.，1986，Mol.Cell.Biol.，6716-718；Potter etal.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，817161-7165)；負載DNA(載體)的脂質體(Fraley et al.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，763348-3352)；lipofectamine-DNA復合體；細胞超聲處理(Fechheimer et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，848463-8467)；受體介導的轉染(Wu and Wu，1987，J.Biol.Chem.，2624429-4432；Wu and Wu，1988，Biochemistry，27887-892)；等。在另一個方案中，逆轉錄病毒或質粒載體可被包裹在脂質體中、或偶聯(lián)到脂質上，然后導入細胞中。此外，cDNA、合成產生的DNA或染色體DNA可以被用作載體插入片段，使用已知并由本領域技術人員實施的方法和方案。
生產復制缺陷型逆轉錄病毒的標準方案在以下參考文獻中提供，例如M.Kriegler，1990，″Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，″W.H.Freeman Co.，NY；和E.J.Murry，Ed.，1991，″Methods in Molecular Biology，″vol.7，HumanaPress，Inc.，Clifton，N.J.，其中包括以下步驟1)將外源遺傳材料整合到質粒中；2)用質粒轉染包裝細胞系并用包裝細胞系生產重組逆轉錄病毒；3)從組織培養(yǎng)基中收集病毒顆粒；和4)用病毒顆粒感染靶細胞。
含所有表達必需元件的表達載體有商品供應并且本領域技術人員已知。見例如Sambrook et al.，1989，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；F.M.Ausubel et al.(eds)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，Inc.，New York，NY；D.N.Glover(ed)，1985，DNACloningA Practical Approach，Volumes I and II；M.L.Gait(ed)，1984，Oligonucleotide Synthesis；Hames and Higgins(eds)，1985，Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins(eds)，1984，Transcription and Translation；R.I.Freshney(ed)，1986，Animal Cell Culture；Immobilized Cells and Enzymes，1986，(IRL Press)；Perbal，1984，A Practical Guide toMolecular Cloning；The Series，Methods in Enzymology，Academic Press，Inc.；J.H.Miller and M.P.Calos(eds)，1987，Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells，Cold Spring HarborLaboratory；Wu and Grossman(eds)，Methods in Enzymology，Vol.154；Wu(ed)，Methods in Enzymology，Vol.155。
根據(jù)本發(fā)明一個實施方案，用于轉染或感染的媒介物或載體構建體的例證性實例包括復制缺陷型病毒載體、DNA病毒或RNA病毒(逆轉錄病毒)載體，如腺病毒、單純皰疹病毒、修飾的HIV載體和腺伴隨病毒載體。優(yōu)選的是腺病毒載體。這些載體包括用于表達異源分子如生物活性分子(例如蛋白質、多肽或肽)的一種或更多啟動子?？梢允褂玫暮线m啟動子包括但不限于腺病毒啟動子如腺病毒主要晚期啟動子；異源啟動子如巨細胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動子；誘導型啟動子如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子；熱休克啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子；逆轉錄病毒LTR(包括修飾的逆轉錄病毒LTR)；β-肌動蛋白啟動子；和人生長激素啟動子。所述啟動子也可以是控制編碼所述多肽的核酸序列的天然啟動子。優(yōu)選病毒載體一般來源于非細胞致病性真核病毒，其中非必需基因已經(jīng)被感興趣核酸序列替換。非細胞致病性病毒包括逆轉錄病毒，其經(jīng)過病毒基因組RNA逆轉錄成DNA并隨后原病毒整合入宿主細胞DNA而復制。
逆轉錄病毒已經(jīng)被批準用于人基因治療試驗。一般來說，所述逆轉錄病毒是復制缺陷的，即能指導期望蛋白合成但不能制造感染性顆粒。可以從中衍生逆轉錄病毒質粒載體的逆轉錄病毒包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒、脾壞死病毒、逆轉錄病毒如勞斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒。一般來說，用于創(chuàng)建病毒載體的逆轉錄病毒優(yōu)選在某些方面被減弱或突變以預防疾病傳播。如果希望，可以用感染性復制缺陷性病毒載體在體內注射細胞之前對細胞進行遺傳工程操作。在此方面，所述載體可以導入逆轉錄病毒生產細胞進行雙嗜性包裝。肌肉來源的前體細胞自然擴張入臨近區(qū)域避免大量注射入感興趣位點或注射在該位點。
載體一般基本不含原核DNA并可以包含多種不同功能的核酸序列。這種功能性序列的實例包括核酸如DNA或RNA，包含轉錄和翻譯起始的序列和終止調節(jié)序列，包括啟動子(例如強啟動子、誘導型啟動子和其它等)和增強子，例如它們在食管或小腸細胞中有活性。另外作為所述功能性序列的部分還包括編碼感興趣蛋白、多肽或肽的開放讀碼框(核酸序列)。為了定點整合也可以包括旁側序列。在某些情況下，5’-旁側序列可允許同源重組，因此改變轉錄起始區(qū)的性質，從而例如提供誘導型或非誘導型轉錄以增加或降低轉錄水平。
所使用的載體通常也包括復制起點和在宿主細胞中復制必需的其它基因，這已經(jīng)被本領域技術人員常規(guī)使用。作為實例，包含復制起點和由特定病毒編碼的與復制相關的任何蛋白的復制系統(tǒng)可以被包括為所述構建體的部分。復制系統(tǒng)的選擇必須確保編碼復制必需產物的基因不能最終轉化MDC自身。這種復制系統(tǒng)由如下述的復制缺陷性腺病毒代表，例如G.Acsadi et al.，1994，Hum.Mol.Genet.3579-584和EB病毒。復制缺陷性載體、特別是復制缺陷性逆轉錄病毒載體的實例是下文描述的BAG，Price et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84156；和Sanes et al.，1986，EMBO J.，53133。將會理解，最終基因構建體可以含有一個或多個感興趣基因例如編碼生物活性代謝分子的基因。
一般來說，期望由MDC表達的核酸序列是結構基因或其功能片段、節(jié)段或該基因部分的序列，所述序列對用作遞送媒介物的細胞是異源的并且編碼期望的蛋白或多肽產物。所編碼和表達的產物可以是細胞內的，即保留在細胞的細胞質、核或細胞器中，或可以由細胞分泌。為了分泌，可以保留所述結構基因上的天然信號序列，或可以使用所述結構基因上不天然存在的信號序列。當多肽或肽是較大蛋白的片段時，可以提供信號序列，以便通過分泌和在加工位點的加工，期望蛋白將具有天然序列。根據(jù)本發(fā)明使用的感興趣基因的實例包括編碼細胞生長因子、抑制分子、細胞分化因子、細胞信號轉導因子和程序性細胞死亡因子的基因。
優(yōu)選存在標記物以選擇含所述載體構建體的細胞。該標記物可以是誘導型或非誘導型基因并將一般的允許分別在誘導或不誘導時進行陽性選擇。常用標記物基因的實例包括新霉素、二氫葉酸還原酶、谷氨酰胺合成酶等。所用載體也一般的包括復制起點和在宿主細胞中復制必需的其它基因，這已經(jīng)被本領域技術人員常規(guī)使用。作為例子，含復制起點和由特定病毒編碼的與復制相關的任何蛋白的復制系統(tǒng)可以被包括為所述構建體的部分。
在一個實施方案中，最終基因構建體優(yōu)選含有至少一個基因或多核苷酸序列，它們編碼產物并優(yōu)選編碼生物活性產物，這可用于治療中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的特定紊亂。在某些情況下，生物活性產物可用于治療肌肉相關紊亂、疾病或功能障礙。在另一些方面，比如同時治療神經(jīng)和肌肉障礙、疾病或功能障礙，提供一或多種編碼影響神經(jīng)細胞/組織的產物的基因或多核苷酸和一或多種編碼影響肌肉細胞/組織的產物的基因或多核苷酸。生長因子產物可以被表達和分泌；這種產物包括蛋白質、肽、有絲分裂原、或對生長、增殖、分化或趨向性有影響的其它分子。能被用于治療CNS障礙的生長因子產物的非限制性實例包括神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4、白細胞介素、成纖維細胞生長因子1和2(FGF-1，F(xiàn)GF-2)、胰島素樣生長因子、糖皮質激素、促生長素抑制素、血小板來源的生長因子(PDGF)、破傷風類毒素、TGF-α和β、表皮生長因子和視黃酸。此外，可以修飾MDC以表達和生產生長因子受體如前述生長因子的受體或trk家族神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體(例如trk、trkB、trkC)，或表達和生產神經(jīng)遞質或其受體例如血清素、L-多巴、多巴胺、速激肽、P物質、腎上腺素和去甲腎上腺素、腦啡肽、GABA、乙酰膽堿、谷氨酸、谷氨酰胺、組胺、和其它等。
對于基于MDC的治療，優(yōu)選從自體或異體(例如同種異體)的人或動物來源獲得骨骼肌外植體。自體動物或人來源特別適合。然而，同種異體或非自體供體包括MDC的成人、胎兒、胚或胎兒供體細胞來源以及異種來源都包括在本發(fā)明內。在CNS情況下，對宿主使用異種來源的MDC不如身體其他位點關鍵，因為CNS自身傾向于是免疫優(yōu)勢的。因此當有對異種植入物的免疫應答時，相對于身體其它位置的反應而顯著降低。然而，為確保使用異種植入物時不被排斥，可以使用降低或消除對引入或植入細胞或組織的免疫應答的方法。因此，通過使用免疫抑制藥物(如環(huán)孢霉素)或通過用局部給藥的免疫抑制劑的局部免疫抑制治療(例如Rossini的美國專利5,026,365描述用于局部免疫抑制的膠囊化方法)，宿主或受體可以被免疫抑制。替代性方法可以涉及采用同源重組的基因替換或敲除，如去除MHC或HLA基因以降低供體細胞的抗原性；表面修飾；或組織分型以匹配供體和受體的組織相容性類型，特別是同種異體供體細胞。(也見，例如，Weiss等人的美國專利6,497,872)。
為向接受的宿主，優(yōu)選哺乳動物包括人引入或移植根據(jù)本發(fā)明的MDC和/或含MDC的組合物，制備單核的MDC懸液，優(yōu)選如此處所述從骨骼肌來源或自體骨骼肌來源。以可有效在組織或器官中恢復細胞群體和再生的量，將MDC引入或給予接受者(動物，例如哺乳動物，包括人)的組織或器官中?？梢杂脴藴逝R床技術確定為治療、修復、促進、增強、或改善對組織或器官的損傷、狀況、病理、紊亂或破壞的MDC有效量。MDC的“有效量”或“藥學有效量”表示在根據(jù)本發(fā)明使用MDC的情況下，治療、修復、促進、增強、改善和其它相似處理疾病、狀況、病理、紊亂、損傷、破壞或功能障礙的有效量。在一個具體實施方案中，有效MDC量包含在神經(jīng)破壞、疾病或損傷位點有效促進或增強軸突再生和/或神經(jīng)元存活的量；在另一個實施方案中，有效MDC量包含有效促進或增強與神經(jīng)破壞或神經(jīng)病變相關組織中的神經(jīng)支配的量；在另一個實施方案中，有效量MDC包含在相同組織位點或位置有效修復周圍神經(jīng)和肌肉組織的量；在另一個實施方案中，有效MDC量包含有效促進或增強宿主組織或器官中組織或器官移植物或植入物的神經(jīng)支配的量；在另一個實施方案中，有效MDC量包含有效支持周圍神經(jīng)尤其是自主神經(jīng)再生的量，這些神經(jīng)在根治性盆腔手術尤其是根治性前列腺切除術中受到損傷；在另一個實施方案中，有效MDC量包含前列腺切除術后有效促進或增強組織的神經(jīng)支配的量；和在另一個實施方案中，有效MDC量包含有效促進或增強切斷或部分切斷的組織或肢體在手術重連接后的神經(jīng)支配的量；在另一個實施方案中，有效MDC量包含有效預防或延緩周圍皮膚軸突在破壞或損傷后的退化。對于所包括的實施方案這些有效量可以相同或不同并容易由執(zhí)業(yè)醫(yī)生確定。如果與MDC一起在給藥制劑中聯(lián)合使用另一種治療劑，治療劑的有效量表示有效提供所述治療劑治療作用的量。制劑中待使用的精確劑量也依賴于給藥途徑以及個體患者的狀態(tài)如年齡、健康和生命體征統(tǒng)計、和疾病、狀況或紊亂的嚴重程度。給藥劑量應該根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)生基于對患者評價和患者生理條件和病史的考慮的判斷決定。此外，體外測試任選可用于幫助確定最佳劑量范圍?？蓮膩碓从隗w外或體內動物模型測試系統(tǒng)的劑量-反應曲線外推出有效劑量。
MDC可包含組合物，包括懸液。這些懸液含有在生理學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑中的本發(fā)明MDC。MDC懸液中的細胞數(shù)目和給藥模式可根據(jù)待治療位點和狀況而變化。作為本發(fā)明的非限制性實例，注射約1-1.5×104到1.5×1010、或約1-1.5×106到1-1.5×108、或約1-1.5×106MDC用于治療約8mm直徑的組織或器官破壞區(qū)域，例如用于包含肌肉和/或神經(jīng)組織的區(qū)域。應該理解，有經(jīng)驗的執(zhí)業(yè)醫(yī)生可根據(jù)每個病例確定的要求、限制和/或優(yōu)化而確定和調整用于基于MDC的治療中的MDC的量。包含MDC的組合物的其它非限制性實施例包括組織工程化的構建體，例如含膠原的支架和基質、小腸粘膜下層(SIS)和SIS凝膠，例如共同未決的專利申請美國序號10/081,835，其內容引入此處作為參考。對于提供MDC的支持結構和防止MDC從注射或植入位點的不期望遷移，這些構建體特別有利。
用于給予受試者的MDC懸液可包含例如在無菌溶液中的約104到1010細胞/ml或約104到108細胞/ml或約104到106細胞/ml，無菌溶液例如生理鹽水或作為胎牛血清替代物而改進含受試者血清的完全培養(yǎng)基。另外，MDC懸液可以是無血清、無菌溶液，如凍存液(CeloxLaboratories，St.Paul，MN)。然后MDC懸液可通過注射引入供體組織的一個或更多位點。例如通過注射或移植將MDC引入中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中被破壞的區(qū)域，允許修復這種損傷或破壞，如通過產生適當細胞類型、通過修復損傷或破壞的回路、通過促進或增強神經(jīng)細胞支配和/或通過提供神經(jīng)遞質以恢復或改善神經(jīng)功能。MDC提供可靠的既非致腫瘤也非永生化的細胞來源，這些作用通過轉染或轉化而導致。
神經(jīng)紊亂和CNS或周圍神經(jīng)破壞的動物模型適于證明MDC用于治療神經(jīng)紊亂、破壞和損傷的功效。例如，MDC可給予以任何方式獲得的具有異常神經(jīng)病或神經(jīng)退行性癥狀的任何動物，包括作為試驗操作造成的機械、化學或電解損傷的結果而獲得，這些操作如神經(jīng)區(qū)域抽吸、神經(jīng)組織或細胞凍傷或衰老過程。小鼠和大鼠是可接受模型系統(tǒng)的實例。
MDC可作為含生理學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥學或生理學可接受的制劑或組合物被給予，并給予感興趣受體動物的組織，包括人和非人哺乳動物?？赏ㄟ^重懸細胞在合適液體或溶液中來制備含MDC的組合物，液體或溶液如無菌生理鹽水或其它生理學可接受的水性注射液體。這些組合物中的待使用成分的量可由本領域技術人員常規(guī)確定。也可在給予MDC之前、之后或與之一起給予或共同給予生長因子和其它類似物。
可通過非胃腸道的注射途徑給予MDC或其組合物，包括皮下、靜脈內、肌內和胸骨內。其它給藥方式包括但不限于鼻內、鞘內、皮內、經(jīng)皮、經(jīng)腸、注射插管、時控釋放、經(jīng)口和舌下途徑。在本發(fā)明一個實施方案中，可由內窺鏡手術介導給予MDC。為治療多種影響腦的神經(jīng)疾病或紊亂，可將MDC引入覆蓋腦室的組織。幾乎所有受疾病或紊亂影響的腦區(qū)的腦室系統(tǒng)允許更容易接近腦部的不同區(qū)域。例如為了治療，可植入裝置如插管和滲透泵以給予MDC、遺傳修飾的MDC或MDC和生長因子，優(yōu)選包含藥學可接受的組合物。直接將MDC注射到組織如腦室組織也是合適的給藥方式。而后，作為疾病或損傷的結果，MDC可遷移到需要治療的那些區(qū)域。例如，通過MDC或其后代，與很多腦區(qū)緊密接觸的腦室有益于分泌或引入的神經(jīng)物質擴散入治療位點中或其周圍。
例如為向接受者注射給藥，含MDC的組合物是無菌溶液或懸液或可以重懸于藥學或生理學可接受的水性或油性介質例如SIS凝膠中，其中可含有防腐劑、穩(wěn)定劑和提供與接受者體液(即血液)等滲的溶液或懸液的物質。適用的賦形劑的非限制性實例包括水、磷酸鹽緩沖液(pH7.4)、0.15M氯化鈉水溶液、右旋糖、甘油、稀乙醇、和類似物、及其混合物。穩(wěn)定劑實例是聚乙二醇、蛋白質、糖、氨基酸、無機酸、和有機酸，它們可單獨或混合使用。給藥量以及給藥途徑根據(jù)個體基礎確定，并對應本領域技術人員已知的相似類型的應用或適應癥中使用的量。
為使例如組織或器官移植和植入中的基于細胞的治療成功性最大，希望供體和受體之間的免疫學匹配盡可能接近。如果沒有自體來源可以用，可以分析供體和受體的I類和II類組織相容性抗原以確定可用的最接近匹配。這使免疫排斥降到最低或使之消除，并降低免疫抑制或免疫調節(jié)治療的需要。如果需要，可以在注射或移植程序之前、期間和/或之后開始免疫抑制或免疫調節(jié)治療。例如環(huán)孢霉素A或其它免疫抑制藥物可被給予所述移植受體。也可在移植之前用本領域已知的替代方法誘導免疫耐受(例如D.J.Watt et al.，1984，Clin.Exp.Immunol.55419；D.Faustman et al.，1991，Science 2521701)。
與本發(fā)明一致，可將MDC給予CNS或周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織，其中包含神經(jīng)細胞或其它細胞類型，如腦、脊髓、周圍神經(jīng)以及肌肉組織(即骨骼/橫紋肌或平滑肌)，以治療具有異常神經(jīng)病或神經(jīng)退行性癥狀、紊亂、狀況或影響的動物中的多種疾病、功能障礙、損傷和破壞。脫髓鞘疾病、外周神經(jīng)退化和肌營養(yǎng)不良疾病是本發(fā)明細胞和方法適用的狀況實例。對于前腦區(qū)域受影響的那些神經(jīng)疾病和紊亂，例如帕金森病、亨廷頓氏病或阿爾茨海默病，MDC、表達神經(jīng)或生長因子的MDC、和/或MDC和生長因子可被引入前腦腦室。作為更具體的實例，對于帕金森病，紋狀體受低水平多巴胺影響。因此，MDC和多巴胺例如表達多巴胺的MDC或聯(lián)合多巴胺一起給予MDC可以被使用(例如，向側腦室給藥)以治療或修復受影響的紋狀體細胞并提供多巴胺以在需要的地方增加這種神經(jīng)化合物的水平。這樣的用途提供超過使用藥物左旋多巴的優(yōu)點，對于左旋多巴患者可能隨著時間產生耐受或產生不利的副作用。對于緊鄰腦室周圍的CNS組織，治療可包含向腰池給藥以使循環(huán)遍及CNS。為治療運動神經(jīng)元疾病如肌萎縮性側索硬化(ALS)、或為治療脫髓鞘疾病如MS，單獨MSC或與其它治療物質組合的MDC可以被給予到中央管。
MDC和使用MDC的方法可被用于治療多種CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、疾病和損傷。作為治療靶的神經(jīng)退行性紊亂、疾病和損傷的非限制性實例包括，例如，帕金森病及其相關運動障礙；阿爾茨海默??；多發(fā)性硬化(MS)；肌萎縮性側索硬化(ALS)；亨廷頓??；急性腦損傷例如中風、腦癱、頭部損傷；脊髓創(chuàng)傷、損傷或感染；糖尿??；和其它CNS功能障礙例如癲癇、抑郁、精神分裂和癱瘓；和周圍神經(jīng)損傷、退化或炎癥。其它疾病包括脫髓鞘疾病如腦硬化、彌漫性腦硬化、播散性靜脈周腦脊髓炎、視神經(jīng)脊髓炎、多發(fā)性硬化(Charcot andMarburg型)、視神經(jīng)脊髓炎、同心硬化、急性播散性腦脊髓炎、后腦脊髓炎、疫苗接種后腦脊髓炎、急性出血性白質腦病、進行性多病灶性白質腦病、特發(fā)性多神經(jīng)炎、白喉神經(jīng)病、Pelizaeus-Merzbacher病、腦橋中央髓鞘溶解癥(central pontine myelinosis)、海綿樣腦白質營養(yǎng)不良和腦白質營養(yǎng)不良(Alexander型)。
在其它實施方案中，MDC和使用MDC的方法可被用于促進和/或增強移植組織或器官與宿主組織和器官之間的神經(jīng)元突起如軸突和樹突的存活和/或生長。非限制性實例包括例如在修復嚴重燒傷或發(fā)生周圍神經(jīng)破壞的其它皮膚組織損傷中的自體、同種異體或異種皮膚或皮膚替代物移植。然而另一個非限制性實例包括根據(jù)本發(fā)明的MDC用于促進和/或增強經(jīng)受手術重連接的截斷肢體或器官中的神經(jīng)元存活和神經(jīng)支配或再支配的用途。在相關實例中，MDC可被用于促進和/或增強移植的自體、同種異體或異種組織和器官的神經(jīng)支配。
本發(fā)明包括的另一個實施方案涉及MDC用于治療神經(jīng)源性背痛和其它與腰髓破壞或疾病相關的疼痛狀況例如坐骨神經(jīng)痛的用途。背痛尤其是下背痛經(jīng)常是來自由于腰神經(jīng)根病、骨侵入(bonyencroachment)或病毒感染對脊髓神經(jīng)的損傷或刺激。根據(jù)本發(fā)明的MDC可提供支持恢復與背部、脊髓或脊椎的疾病、狀況或紊亂相關的破壞或損傷的神經(jīng)，并進而降低疼痛。
MDC在治療脫髓鞘疾病中特別有優(yōu)勢。引入要求再髓鞘化位點的MDC可以用作有益的再髓鞘化治療劑。為了引入所述MDC使之可以與待修復的脫髓鞘化軸突結合，所述MDC可一次或更多次注射到脫髓鞘化靶區(qū)域或其周圍的位點，即具有脫髓鞘化軸突的位點。此外，正如通過β-半乳糖苷酶標記物表達觀察到的，已經(jīng)顯示所述MDC可存活更長時間，例如引入腦中后超過4周，和最高達10周或更長，從而證實它們用于處理和治療對于神經(jīng)退行性疾病、障礙和損傷的有效性和效力。
在另一個實施方案中，已經(jīng)暴露于神經(jīng)營養(yǎng)或神經(jīng)病學因子如NGF的MDC培養(yǎng)物、或MDC的克隆或亞克隆，可用于篩選潛在治療藥物、化合物、藥劑、物質或組合物。這些測試物質，以不同量和不同時間，可加到培養(yǎng)的MDC中，以確定或監(jiān)測細胞對這些測試物質的反應。所述細胞的細胞生長調節(jié)和物理特性變化可通過用顯微鏡觀察細胞增殖來確定，其中使用或不使用其它已知技術如免疫染色等。如果用測試物質誘導新的或增加水平的蛋白如酶、受體、其它細胞表面分子、或神經(jīng)遞質、氨基酸、神經(jīng)肽或生物胺的表達，本領域已知并實際應用的技術可用于鑒定這些分子的水平或其改變。這些技術舉例但非限制性的包括用抗特異性分子抗體的免疫組織化學，或生化分析如蛋白質陣列、酶陣列、受體結合陣列、酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)、放射免疫測試(RIA)、Western印跡和高效液相色譜(HPLC)。對于核酸分析，可用Northern印跡確定所述分子或產生所述分子的酶的mRNA水平；也可使用聚合酶鏈式反應(PCR)。
在相關實施方案中，如此處所述制備的MDC培養(yǎng)物、或其克隆或亞克隆可被用于篩選測試物質、化合物、藥物(drug)、藥劑(pharmaceutical)、化學品和有潛力用作神經(jīng)病藥物的其它試劑，它們可以改善或提高MDC促進或增強神經(jīng)治療和修復的能力。這些測試物質，以不同量和不同時間，可加到培養(yǎng)的MDC中。然后可用常規(guī)測試如免疫染色檢查所述MDC，以確定所述暴露細胞是否對所述測試物質應答而被誘導分化成神經(jīng)元表型。
作為本領域常規(guī)已知，商用試劑如抗體可被用于確定細胞標記物和鑒定表面蛋白，它們典型表達于所述細胞表面。例如，對于神經(jīng)細胞類型，04抗體(Boerhinger Mannheim)結合少突膠質細胞及其前體；幾種可獲得抗體結合星形細胞，例如RNA2抗體(ATCC TIB-119；以及ATCC CRL-2534、CRL-2535或CRL-2541；和抗破傷風類毒素抗體(TT，Boerhinger Mannheim)結合神經(jīng)元?？箻擞浳锶缃Y蛋白、CD56、Sca-1等的其它抗體可用于確定細胞的細胞表面標記物譜。用MDC培養(yǎng)物，可實施篩選和測試方法用于評價生物劑(如藥物)對用于所述方法的細胞增殖或對其存活或功能的潛在有害影響。作為指導，細胞鋪板密度可以是約5-10×105細胞/ml、或約5-10×106細胞/ml。
生物劑對細胞如神經(jīng)元細胞或MDC的作用基于相對于一種或多種對照培養(yǎng)物關于表型變化、表達表型比、細胞存活力和基因表達變化的顯著差異來確定。生物劑的非限制性實例包括加入培養(yǎng)基中的營養(yǎng)因子如EGF、FGF、BDNF、CNTF、TGFα、GDNF和其它等。FGF已知可增加神經(jīng)元比率；CNTF已知可增加少突膠質細胞的比率。通過用顯微鏡觀察細胞形態(tài)和生長可以分析細胞的物理變化?？捎秒娚矸治龃_定任意的測試生物劑是否可影響細胞膜特性如靜息膜電位、誘發(fā)電位、電流方向和離子特征以及離子通道的動力學。這些類型的分析的實施可使用本領域中進行分析的任何方法，例如細胞外單單元電壓記錄、細胞內電壓記錄、電壓鉗、膜片鉗和鈣成像技術。這些方法也可包括使用電壓敏感的染料、光學成像和離子敏感電極。如此處理的細胞，優(yōu)選包含生理的組合物，可被移植入動物以進行進一步體內評價，如確定長期存活、以及多種免疫學和生化特性，以及治療或支持神經(jīng)疾病和障礙的治療。
在另一個實施方案中，通過使用被引入接受的宿主動物組織位點的MDC，本發(fā)明提供向包括人的接受的哺乳動物宿主細胞和組織的離體基因遞送。所述MDC也可使用工程化以含有編碼期望基因產物的異源基因的腺病毒載體而被病毒轉導。這樣的離體方法提供高效病毒基因轉移的優(yōu)點，它比直接基因轉移方法效率更高。離體方法涉及使用從肌肉組織獲得和分離的MDC。用作MDC來源的肌肉活體組織可以從損傷位點或從臨床醫(yī)生更容易獲得的另一個區(qū)域獲得。
將會意識到，根據(jù)本發(fā)明，克隆分離物可以用多種本領域已知的方法來源于MDC群體，例如用在組織培養(yǎng)基中有限稀釋鋪板的方法。克隆分離物包含遺傳學相同的細胞，它們來源于單個獨立的細胞。此外，可在有限稀釋后用FACS分析獲得克隆分離物，以達到每孔單個細胞從而建立克隆分離的細胞系。MDC克隆分離物可用于本方法，以及用于工程化所述細胞而表達一種或更多生物活性分子，或用于基因治療。
在另一個實施方案中，首先用工程化病毒載體感染MDC，其中病毒載體含有至少一種編碼期望產物的異源多核苷酸，所述細胞懸浮于生理學可接受的載體或賦形劑如鹽水或磷酸鹽緩沖液中，然后將MDC給予到宿主的適當位點。與本發(fā)明一致，期望產物由所注射細胞表達，并因此將所述產物引入宿主中。引入和表達的產物可用于治療、修復或改善損傷、功能障礙或疾病，這是由于本發(fā)明MDC在長時間期間表達，以及在宿主組織中具有長期存活(超過2周，優(yōu)選超過4周，更優(yōu)選超過6周，和最優(yōu)選超過8周)。
舉例說明而非限制性的，約105到1012、或106到1012、或106到108、或108到1012、或108到1010、或1010到1012懸于生理相容介質中的MDC細胞可以被植入期望組織用于70kg人的基因治療。本發(fā)明MDC的這個數(shù)目可以從來源于人的單個100mg骨骼肌產生。為治療具體的損傷位點，遺傳工程化的MDC到給定損傷組織或位點的注射液中包含溶液或懸液中的治療有效量的細胞，例如約105到1012細胞/cm3治療組織，所述細胞在生理學可接受的介質中。
在本發(fā)明另一個實施方案中，在適當指導和被批準的條件和規(guī)則下，人胎兒或胚MDC可被用于移植方法和治療，而具有最少或沒有由于潛在供體-宿主不相容性的排斥問題。例如，來自胎兒肢體肌肉(早期骨骼肌)的人MDC被發(fā)現(xiàn)是免疫耐受的并表現(xiàn)高水平存活，因為它們在注射后能在SCID小鼠中維持超過2周(例如見PCT/US01/12084)。因此，在適當指導、規(guī)則和條件下，人胎兒MDC可被使用并經(jīng)連續(xù)鋪板而富集，用于此處所述的治療和移植。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及MDC用于促進和/或增強移植或植入組織或器官的神經(jīng)支配或再支配的用途。具體然而非限制性的實例涉及使用移植組織治療燒傷。灼燒相關損傷經(jīng)常伴隨皮膚的周圍神經(jīng)的破壞，導致感覺過敏、感覺遲鈍和其它感覺缺陷。當前，自體全厚度皮膚移植物、游離皮瓣和蒂狀皮瓣是能恢復感覺功能的治療選擇。然而，甚至在最佳條件下，由于移植或植入組織的不完全神經(jīng)支配，感覺仍有障礙。更有甚者，在使用組織工程化皮膚替代物進行移植時，例如種植自體角質細胞和成纖維細胞的膠原基質時，觸覺的恢復甚至更不令人滿意。本發(fā)明允許將MDC應用到損傷如燒傷位點，以增強損傷的周圍神經(jīng)元突起如軸突和樹突的存活，并促進和/或增強移植或植入組織或器官如皮膚和皮膚替代物的神經(jīng)支配。在根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案中，MDC可被注射或施用到移植或植入組織或器官自身上。
也可將MDC種植到任何數(shù)量的用作皮膚替代物的組織工程化構建體或工程化材料中，以促進和/或增強神經(jīng)再生入皮膚替代物內。這樣的皮膚替代物可以單獨或組合包含任意的以下成分無細胞的尸體皮膚基質、聚乳酸、透明質酸、聚乙醇酸、聚環(huán)氧乙烷、聚對苯二甲酸丁二醇酯、硅酮、自體和/或同種異體的培養(yǎng)的成纖維細胞、自體和/或同種異體的培養(yǎng)的角質細胞、自體和/或同種異體的培養(yǎng)的表皮、自體和/或同種異體的培養(yǎng)的上皮、去表皮的真皮、膠原海綿、膠原-脫乙酰殼多糖海綿、脫乙酰殼多糖-交聯(lián)膠原-糖胺聚糖基質、膠原凝膠、polyglactin網(wǎng)、小腸粘膜下層(SIS)。本發(fā)明的該實施方案也涉及含異源核酸序列的MDC的用途，其中所述異源核酸序列編碼多種改善性蛋白或多肽的表達，包括但不限于神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(NT3)、腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和膠質細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)。將會明白以上實例只是代表性和非限制性的，因為也可給予MDC以促進其它移植或植入組織的神經(jīng)支配、或神經(jīng)再支配，包括但不限于平滑肌、骨骼肌、血管組織和腺體組織。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及促進或增強組織或器官移植物或組織或器官植入物在宿主或器官中的神經(jīng)支配的方法，其中包含將肌肉來源的細胞(MDC)引入包含所述組織或器官移植物或植入物與所述宿主組織或器官之間邊界的區(qū)域。熟練的從業(yè)者將會認識到，所述MDC可以注射或引入到或臨近移植或植入組織或器官與宿主組織或器官之間形成的邊界、邊緣、邊沿、邊或周緣，或其區(qū)域。通過這種方法，MDC促進宿主組織或器官與組織或器官移植物或植入物之間神經(jīng)纖維的存活和生長，并因此促進神經(jīng)支配。在所述方法的一個實施方案中，所述MDC或者對宿主組織或器官、或者對組織或器官移植物或植入物是自體的。在所述方法的另一個實施方案中，用于移植或植入的組織或器官選自消化、生殖、心血管、泌尿、呼吸、上皮、結締、神經(jīng)元、內分泌、皮膚、平滑肌、骨骼肌組織或器官、或其部分或節(jié)段。在所述方法的另一個實施方案中，所述組織或器官移植物或植入物包含設計為具有模擬天然組織特性的皮膚替代物或工程化材料。在所述方法的另一個實施方案中，所述皮膚替代物或工程化材料包括無細胞的尸體皮膚基質、聚乳酸、透明質酸、聚乙醇酸、聚環(huán)氧乙烷、聚對苯二甲酸丁酯、硅酮、自體的培養(yǎng)的成纖維細胞、異體的培養(yǎng)的成纖維細胞、自體的培養(yǎng)的角質細胞、異體的培養(yǎng)的角質細胞、自體的培養(yǎng)的表皮、異體的培養(yǎng)的表皮、自體的培養(yǎng)的上皮、異體的培養(yǎng)的上皮、去表皮的真皮、膠原海綿、膠原-脫乙酰殼多糖海綿、脫乙酰殼多糖-交聯(lián)膠原-糖胺聚糖基質、膠原凝膠、polyglactin網(wǎng)、或小腸粘膜下層(SIS)中的一種或多種。在所述方法的另一個實施方案中，所述皮膚替代物或工程化材料與皮膚組織或皮膚組織成分組合引入。皮膚組織或皮膚組織成分的示例性例子包括但不限于角質細胞、成纖維細胞、黑素細胞、樹突細胞、附器細胞(adnexal cells)、神經(jīng)元細胞、膠質細胞、內皮細胞、或平滑肌細胞。在該方法的另一個實施方案中，所述MDC攜帶至少一種編碼異源蛋白或多肽的異源多核苷酸，以增強移植組織或器官的神經(jīng)支配。合適蛋白或多肽的例子包括但不限于生長因子、生長因子受體、肽神經(jīng)遞質、或參與神經(jīng)遞質合成的酶中的一種或多種。更具體的，合適生長因子包括但不限于神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4、白細胞介素、成纖維細胞生長因子1(FGF-1)、成纖維細胞生長因子2(FGF-2)、胰島素樣生長因子(IGF)、糖皮質激素、促生長素抑制素、血小板來源的生長因子(PDGF)、破傷風類毒素、TGF-α、TGF-β、表皮生長因子或視黃酸。合適的生長因子受體包括但不限于trk家族神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體、神經(jīng)生長因子(NGF)受體、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)受體、腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)受體、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3受體、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4受體、白細胞介素受體、成纖維細胞生長因子1(FGF-1)受體、成纖維細胞生長因子2(FGF-2)受體、胰島素樣生長因子(IGF)受體、糖皮質激素受體、血小板來源的生長因子(PDGF)受體、TGF-α受體、TGF-β受體、表皮生長因子(EGF)受體或視黃酸受體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括涉及關于MDC用作基于細胞的療法治療勃起功能障礙的方法，所述疾病經(jīng)常伴隨前列腺切除術特別是根治性前列腺切除術，其中神經(jīng)組織如海綿體神經(jīng)組織被破壞。根據(jù)本發(fā)明，MDC可以支持組織例如破壞、損傷、疾病、或移植的組織的神經(jīng)支配，從而允許神經(jīng)組織修復，并同時提供勃起功能障礙的治療和改善。這種特性對于此處實施例2和4描述的方法特別有利。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及促進或增強前列腺切除術后的神經(jīng)恢復和勃起功能恢復，其中包含向需要這種治療的患者給予有效量的自體的肌肉來源的細胞(MDC)，以促進或增強患者的神經(jīng)恢復和勃起功能恢復。在一個實施方案中，所述MDC給予到一個或多個前列腺切除術的吻合位點。MDC也可給予到以下組織或器官或其周圍海綿體神經(jīng)、盆神經(jīng)、腹下神經(jīng)、盆叢、和盆腔自主神經(jīng)節(jié)，或給予入陰莖。在一個實施方案中，在前列腺切除術后一定時間如6個月、1年或更長，如通過膀胱鏡檢查再次給予MDC。在另一個實施方案中，通過將肌肉細胞懸液鋪板為至少兩次連續(xù)培養(yǎng)物而從所述懸液中富集MDC，從而消除成纖維細胞和非肌肉細胞并富集單核的MDC終末群體，其中包含成肌細胞作為富集的肌肉來源的細胞群體。在另一個實施方案中，從骨骼肌組織獲得所述MDC。在另一個實施方案中，給予所述MDC的量為約105到106細胞/cm3患者組織。在另一個實施方案中，與生理學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑一起給予所述MDC。在另一個實施方案中，將所述MDC的克隆群體引入患者。
實施例提供下述實施例是為了舉例說明本發(fā)明，而不是用于限制本發(fā)明的目的。
實施例1材料和方法動物正常小鼠(和Mdx小鼠(C57BL/10ScSn DMDmdx/J)，如果使用)購買自Jackson Laboratories；如果使用，mdx/scid小鼠從mdx和scid小鼠(C57BL/6J-Prkdcscid/S2J，免疫缺陷)的近交獲得。所述mdx小鼠的特征是在肌纖維膜中缺少肌營養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)，這導致肌纖維退化和壞死。用于這些實驗的所有動物操作方案被匹茲堡兒童醫(yī)院IACUC委員會批準(操作方案編號7/00和3/02)。
肌肉來源的細胞(MDC)MDC來自C57BL/6J小鼠(5日齡)的原代骨骼肌，其中使用涉及每兩天或更長時間連續(xù)或系列對細胞鋪板的培養(yǎng)技術，從而產生富集的單核的、結蛋白陽性的、成肌細胞性MDC的終末群體，這是每隔至少兩天系列或連續(xù)傳代到新培養(yǎng)板中的所述肌細胞懸液的結果，基本上沒有成纖維細胞和非肌肉細胞并富集存活的培養(yǎng)MDC的終末群體。從這種技術獲得細胞的克隆群體可使用本領域使用的操作方案如有限稀釋來建立。
MDC分離和培養(yǎng)MDC分離自起始肌肉組織如骨骼肌樣品以獲得富集的MDC群體。為此，進行系列鋪板和培養(yǎng)步驟，從而導致富集MDC終末群體，其特征是作為早期肌肉來源的細胞如成肌細胞，它們是存活的、非成纖維細胞的、結蛋白陽性的、單核的和已形成的肌纖維。在系列鋪板、或傳代/培養(yǎng)操作的最后分離得到MDC，其中操作包含連續(xù)對所述肌肉細胞起始樣品進行鋪板。在連續(xù)將細胞鋪板到新培養(yǎng)容器期間，MDC(包括成肌細胞和早期肌肉來源的細胞)被從非MDC類型如成纖維細胞和脂肪細胞、內皮細胞和結締組織細胞中富集和分離。可以超過約二天如約3-7天或4-6天或3-5天進行所述連續(xù)鋪板，直至如上述的增殖性、非成纖維細胞的MDC保留并在培養(yǎng)物中占優(yōu)勢。在培養(yǎng)期間，通過將肌肉細胞的細胞懸液傳代到包被或不包被膠原的新組織培養(yǎng)皿或瓶中，貼壁的成纖維細胞和非肌肉細胞基本被從連續(xù)細胞培養(yǎng)物中去除。初步去除貼壁的成纖維細胞發(fā)生在將所述肌肉細胞起始樣品放入培養(yǎng)容器中約1-24小時之后，在此之后用新培養(yǎng)基例如以約24小時間隔將所述細胞連續(xù)傳代到新組織容器即新培養(yǎng)皿或瓶中，直至MDC的終末群體作為存活并增殖的細胞保留并富集于培養(yǎng)物中，同時幾乎沒有成纖維細胞成分，例如這是在一系列約2-7次鋪板、3-7次鋪板、4-6次鋪板或3-5次鋪板之后。這種MDC的終末群體在形成肌肉纖維的細胞中被富集，如成肌細胞或早期肌肉來源的細胞，并且當注射或引入動物組織或器官如肌肉組織中時具有如此處所述的功能，在這些組織或器官中所述MDC存活、恢復細胞群體并增殖。如果期望，這些MDC也可以用載體轉染或感染，這些載體可以表達基因產物如異源基因產物如生長因子、生長因子受體、肽神經(jīng)遞質、或參與神經(jīng)遞質合成的酶，這些神經(jīng)遞質包括氨基酸、生物胺和神經(jīng)肽。因此，通過將起始肌肉細胞懸液鋪板成至少兩次連續(xù)培養(yǎng)物從而消除成纖維細胞和非肌肉細胞并富集單核的、早期肌肉來源的細胞或成肌細胞的終末群體，可以從所述起始肌肉細胞懸液中獲得并富集MDC。
對于使用小鼠的具體試驗，取出小鼠后肢骨骼肌并解剖分離出骨。用解剖刀將肌肉切碎成粗漿液。在37℃在0.2％XI型膠原酶(Sigma-Aldrich)中酶促解離所述肌肉組織1小時，然后在3500rpm離心5分鐘。收集細胞，在制備成2.4U/ml HBSS(GIBCO BRL)的dispase酶(GIBCO BRL)中保溫45分鐘，然后在稀釋于HBSS中的0.1％胰酶-EDTA(GIBCO BRL)中保溫30分鐘。酶促解離之后，再次3500rpm離心肌肉細胞并重懸于含DME的增殖培養(yǎng)基(PM)，其中補充含有10％馬血清、10％FBS、0.5％雞胚提取物和1％青霉素-鏈霉素(全部購自GIBCO BRL)。
在這些試驗中，在一系列培養(yǎng)物轉移操作之后，其中涉及用容器如組織培養(yǎng)瓶(或皿)如T25、T50、T150進行連續(xù)傳代(也見US SerialNo.09/302,896和09/549,937)以培養(yǎng)所述細胞，從而分離MDC。所述容器可以用膠原包被(I型膠原，Sigma Aldrich)。初步重懸于PM中之后，此試驗中的起始肌肉細胞懸液在膠原包被的瓶中鋪板如約2小時。允許成纖維細胞貼壁如約1-2小時之后，將非成纖維細胞轉移到其它瓶中。所述細胞在37℃、100％濕度、95％空氣/5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約1天如24小時之后，收集瓶中的活細胞，3500rpm離心約5分鐘，再轉移到新瓶中。一般來說，此時約1×104-5×104活細胞被轉移到新培養(yǎng)皿中。如以約24小時間隔，重復進行這種系列轉移和鋪板活細胞到新培養(yǎng)皿/瓶中的操作，直至在后來的鋪板(也稱預鋪板(“preplates”))中，成纖維細胞被除去且培養(yǎng)物中富集結蛋白陽性的、早期肌肉來源的成肌細胞性細胞。在這種系列鋪板操作的最后，即在最后一次鋪板時，富集的MDC終末群體包含活的、生長中的、結蛋白陽性的(大于約50％)、單核的肌肉來源的細胞，它們被用于注射并能產生肌肉纖維。
在幾天期間中進行系列鋪板和培養(yǎng)，直至培養(yǎng)皿中去除成纖維細胞和非肌肉細胞且只有MDC作為單核的成肌細胞被富集并保持存活和生長。培養(yǎng)物中獲得活MDC的系列鋪板和培養(yǎng)過程涉及在初步將肌肉細胞樣品鋪板后約3-7天、或約3-6天。連續(xù)轉移和鋪板非成纖維細胞的細胞到新培養(yǎng)皿/瓶中允許富集非成纖維細胞的、單核的、結蛋白陽性的早期MDC，它們在注射到動物中后在適當環(huán)境中產生肌纖維。
流式細胞術為檢測表面標記物表達，MDC分別與直接的和偶聯(lián)生物素的大鼠抗小鼠單克隆抗體(如特異性抗c-kit、CD34、CD56、Sca-1和CD45的抗體；所有抗體來自Pharmingen)保溫30分鐘，將鏈親和素-別藻藍蛋白偶聯(lián)物加入生物素化抗體標記的細胞中保溫20分鐘。在FACSCalibur(Becton Dichinson，San Jose，CA)流式細胞儀上用Cell Quest軟件分析標記的細胞。
組織學肌肉和組織切片固定于1％戊二醛中，用X-gal底物在37℃保溫過夜，然后用伊紅復染。用抗小鼠抗β-半乳糖苷酶的第一抗體(1∶100，Chemicon，Temecula，CA)進行β-半乳糖苷酶/GFAP/Hoechst共定位以顯示供體來源的細胞。
統(tǒng)計分析通過對組織化學和免疫組織化學染色的肌肉切片進行計算機圖像分析，來測量注射MDC和偽注射組織中的神經(jīng)面積以及肌纖維直徑。使用成對t檢驗比較注射MDC和偽注射組織之間的差異。對于平均值之間差異，P＜0.05的水平被認為具有顯著性。
實施例2本實施例描述在根治性前列腺切除術大鼠模型中使用MDC的神經(jīng)恢復和勃起功能改善。盡管外科技術在發(fā)展，勃起功能障礙(ED)是接受根治性前列腺切除術的男性的常見后果。作為對環(huán)境提示的反應以及根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)MDC促進和/或增強中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的軸突再生。由于MDC能促進周圍神經(jīng)再生，進行試驗評價MDC作為根治性前列腺切除術后勃起功能障礙的治療劑。
如上所述從正常成年小鼠的后肢取骨骼肌活組織并用于預鋪板技術以獲得MDC。從鋪板/培養(yǎng)技術(即約5-6天的系列培養(yǎng))分離的異體小鼠MDC用工程化以表達β-半乳糖苷酶報告基因的逆轉錄病毒轉導。大鼠海綿體神經(jīng)截斷用作根治性前列腺切除術后勃起功能障礙的模型。三個試驗組包括(1)對照組(C，n＝5)；(2)雙側海綿體神經(jīng)截斷、偽注射組(T，n＝6)；和(3)雙側海綿體神經(jīng)截斷、并在截斷位點接受MDC注射(3×105細胞/每側)組(M，n＝6)。手術后兩周，與壓力傳感器連接的PE 20管插入海綿體并在電刺激(20Hz，0.5ms，10V)盆神經(jīng)期間測量海綿體內壓(ICP)。然后處死動物并取海綿體神經(jīng)截斷位點周圍的組織進行LacZ染色。
C、T和M組的最大ICP分別是115±11.2cmH2O、25.4±6.6cmH2O和52.5±9.5cmH2O。MDC處理組(M組)的ICP顯著大于偽注射組(p＜0.05)。LacZ染色顯示在注射MDC區(qū)域周圍有很多LacZ(+)細胞。這些結果表明MDC能修復損傷周圍神經(jīng)并改善勃起功能的免疫組織學和功能性證據(jù)。根據(jù)本發(fā)明，勃起功能障礙是在根治性前列腺切除術時使用MDC治療的候選狀況。
實施例3根據(jù)本發(fā)明的MDC用于燒傷相關周圍神經(jīng)破壞的動物模型。從裸鼠背部切除2.5cm2全厚度皮膚區(qū)域以模擬嚴重燒傷的作用。在試驗組中，在移植組織工程化皮膚替代物之前根據(jù)本發(fā)明的MDC被施用到全部損傷區(qū)域。而在對照組中，移植前不施用MDC。所述皮膚替代物包含種植人角質細胞和成纖維細胞的膠原海綿基質。在移植后40、70和120天處死小鼠，重構皮膚的活組織樣品用于免疫組化和組織學分析以證明神經(jīng)再生和支配。通過抗體染色蛋白質基因產物9.5(PGP9.5)，即一種神經(jīng)元細胞特異性表型標志物，而檢測軸突。通過抗體染色蛋白S100，即一種表達于膠質細胞中的鈣結合蛋白，來檢查移植組織中及其周圍施旺細胞的存在和豐度。
實施例4本實施例描述用于調查治療方法的臨床研究和方案以及相關試驗，所述治療方法通過注射自體MDC用于在根治性前列腺切除術時預防、降低或改善壓力性尿失禁和勃起功能障礙的問題。
至少18歲具有前列腺癌并準備接受根治性前列腺切除術的男性，并且乙肝、丙肝、HIV和牛蛋白變應原檢測陰性，這樣的男性符合參與研究的標準。知情同意參與研究的合格患者按初次門診程序訪問泌尿診所，其中用針刺活組織檢查技術收集肌肉細胞。樣品經(jīng)連續(xù)細胞鋪板/培養(yǎng)技術處理，從而得到富集的非成纖維細胞、活的、增殖中的、單核的、肌肉來源細胞(成肌細胞)終末群體，它們可以產生肌管。細胞處理遵守良好組織規(guī)范以預防污染并保留組織功能和完整性，并包括明確規(guī)定的組織和細胞操作、處理和鑒定程序。富集的MDC終末群體在培養(yǎng)中擴展以獲得更多數(shù)目的細胞用于隨后用途。
幾周后，分離并擴增的MDC被冷凍并運輸?shù)秸{查醫(yī)生。擴增MDC在含人血清白蛋白(HSA)的低溫介質中冷凍下提供給醫(yī)生。然后所述MDC被解凍并用生理鹽水稀釋，由醫(yī)生或臨床醫(yī)師注射給患者。接觸患者尿道周圍組織的材料包括患者自身的MDC、懸浮并運送細胞的冷凍介質和用于稀釋注射混合物的生理鹽水。
在直接觀察下所得懸液在患者接受根治性前列腺切除術時被注射到尿道吻合處。在治療后1、3、6和12個月評價患者不利事件和尿失禁以及性功能的發(fā)生率。如果在6個月隨訪時沒有改善，通過簡單的門診膀胱鏡檢查注射程序而無需重復肌肉活組織檢查，患者可以選擇用所述肌肉細胞注射進行重復治療。
從由于注射MDC懸液而增加的物理量可以預期出現(xiàn)初步治療作用。然而，所述細胞可保持存活并在注射處維持更長期作用。最終，并且不希望受理論約束，所述組織環(huán)境“指導”所注射MDC重建為與天然尿道括約肌相似的組織，進而隨時間改善尿失禁。在根治性前列腺切除術的吻合位點注射MDC可用于在恢復過程中保護陰莖神經(jīng)和促進或增強勃起功能恢復。
本實施例涉及多達20位患者的小規(guī)模、單中心研究，意圖鑒定建議治療方案的安全性和潛在療效。患者用作自身對照，在治療前和治療后多個時間點定量和定性測量評價尿失禁和勃起功能。在治療后一年對患者進行隨訪為了注射，自體MDC懸于生理鹽水中。
在根治性前列腺切除術時使用以下操作方案1.用標準技術，準備患者作根治性前列腺切除術。切除前列腺并重新吻合膀胱頸和尿道后，在手術結束時實施注射MDC。
2.用等體積生理鹽水稀釋，使冷凍的MDC解凍，并將MDC懸液吸入注射器。
3.根據(jù)制造商使用說明連接預充注射器與注射針。
4.直接觀察下，將針尖插入尿道和尿道周圍組織，并緩慢注射準備的MDC懸液。在吻合處周圍的三個位置進行這種操作。
5.記錄注射的細胞懸液位置和體積。
在膀胱內注射6個月時，如果沒有改善并且患者要求重復注射，遵照以下操作方案1.用標準技術，給予適當麻醉以插入膀胱鏡，使患者準備進行膀胱鏡檢查。
2.準備帶透鏡和穿尿道針的膀胱鏡，仔細觀察確保針尖包含在遠端膀胱鏡外套之內。
3.仔細推進膀胱鏡到預期位置。
4.用等體積生理鹽水稀釋從而解凍MDC懸液，并將MDC懸液吸入注射器。
5.根據(jù)制造商使用說明連接預充注射器與注射針。
6.直接觀察下，將針尖插入尿道括約肌，并緩慢注射準備的MDC懸液到粘膜下尿道壁中。
7.如果必要，在尿道周圍多個位置繼續(xù)注射直至觀察到尿道關閉。
8.記錄注射的細胞懸液位置和體積。
MDC注射需要的培訓和經(jīng)驗包括熟悉根治性前列腺切除術、膀胱鏡檢查和在尿道周圍注射膨脹劑。
本領域臨床醫(yī)生和醫(yī)師知道壓力性尿失禁和勃起功能障礙是根治性前列腺癌手術中兩種最常見和令人煩惱的并發(fā)癥。由于內源性括約肌缺陷(ISD)的壓力性尿失禁是遠端尿道括約肌內在性功能異常的結果。對于人，通常在根治性前列腺切除術后發(fā)生ISD。隨著每年手術次數(shù)的增加，前列腺切除術后尿失禁患病率繼續(xù)增加。在一系列60位患者中，67％前列腺切除術后尿失禁是單獨由于ISD，這是用LPP技術作為評價基礎得出的(Carlson，K.V.and Nitti，V.W.，Preventionand management of incontinence following radicalprostatectomy.Urol.Clon North Am，28595，2001)。在另一項研究中，對接受根治性前列腺切除術的20位患者進行前瞻性尿動力學評價，在這20位患者中有17位發(fā)現(xiàn)術后內在性括約肌壓力組分。(Pfister，C.et al.，Assessment of the intrinsic urethralsphincter component function in postprostatectomy urinaryincontinene.Neurourol Urodyn，21194，2002)。
勃起功能障礙(ED)定義為持續(xù)性不能實現(xiàn)或維持性滿足需要的勃起。ED估計單獨在美國就影響高達約3千萬男性(World HealthOrganization International Consultation on Impotence.(WHO，1stInternational Consultation in Impotence，PlymbridgeDistributors Ltd，Plymouth，UK，1998)。生活質量數(shù)據(jù)已經(jīng)記載勃起功能障礙對其他慢性健康狀況如抑郁的重要性。由此，ED不僅破壞性的影響男性而且也影響其性伴侶。盡管外科技術已有進展，但ED仍然經(jīng)常在接受根治性前列腺切除術后男性中發(fā)生。在那些重新勃起的人中恢復可能被延長，在術后長達36個月的觀察中啟動并維持勃起得到緩慢改善。與去除神經(jīng)血管束上面的前列腺相關的創(chuàng)傷可能產生神經(jīng)麻痹(neuropraxia)。進而，局部炎癥和免疫應答也可引起ED。常規(guī)治療如Viagra對有心血管疾病史的男性并不總是有效或安全。
向下尿道注射MDC的非臨床試驗已經(jīng)在多種動物研究中進行?？偟膩碚f，這些研究包括1)初步評價注射到小鼠模型的膀胱壁后MDC的持續(xù)性和分化；2)在自體大鼠模型中與注射牛膠原比較評估注射MDC的持續(xù)性；3)評估在大鼠尿失禁模型中尿道周圍注射異體MDC；4)前列腺切除術后尿失禁模型中的MDC結果；和5)在前列腺切除術模型中注射MDC對勃起功能障礙的作用。這些研究提供關于前列腺手術后用MDC和注射治療人的可行性模型。
前列腺切除術后壓力性失禁模型為產生與人患者中根治性前列腺切除術類似的內源性括約肌缺陷，在成年Sprague-Dawley大鼠(n＝16)中燒灼尿道中段旁側的周圍組織。燒灼一周后，將LacZ轉染的1.5×106MDC注射到尿道中段周圍。所述16只大鼠分成3組，MDC注射后2、4或6周進行評價。作為對照，接受燒灼的9只大鼠一周后注射Hanks’s平衡鹽溶液(HBSS)。用垂直傾斜桌/膀胱內壓力鉗技術測量滲尿點壓力(LPP)來研究括約肌功能。用快速肌球蛋白重鏈和lacZ染色評價所述MDC的位置。
電燒灼尿道對膀胱功能沒有影響。注射MDC后2、4和6周后大鼠的平均LPP分別是38.2±2.2cmH2O、43.1±2.6cmH2O和51.5±0.9cmH2O。注射HBSS后2、4和6周后大鼠的平均LPP分別是17.2±1.4cmH2O、26.9±1.9cmH2O和25.5±1.3cmH2O。與時間匹配的對照組比較時，每個對應的注射MDC組中LPP增加顯著更高(p＜0.001)。組織學分析顯示所述MDC有助于橫紋肌和神經(jīng)再生。因此，尿道周圍注射MDC修復ISD大鼠的破壞的尿道括約肌。
前列腺切除術后勃起功能障礙模型支配海綿體的神經(jīng)對雄性啟動和維持勃起是關鍵的。該神經(jīng)的損傷是根治性前列腺切除術后勃起功能障礙的主要來源。本試驗的目的是確定在根治性前列腺切除術的大鼠模型中MDC是否促進和/或增強周圍軸突再生、并從而導致更快從勃起功能障礙中恢復。
在本試驗和與實施例2所述類似的試驗中，如此處所述，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)以富集包括成肌細胞的早期肌肉來源細胞，從而從骨骼肌中獲得MDC。海綿體神經(jīng)橫斷用作根治性前列腺切除術后勃起功能障礙的模型。三個試驗組包括對照組(C，n＝6)；雙側海綿體神經(jīng)橫斷組(T，n＝6)；雙側海綿體神經(jīng)橫斷并注射賦形劑組(V，n＝6)；和雙側海綿體神經(jīng)橫斷并在損傷位點注射MDC(3×105細胞/每側)組(V，n＝6)。手術兩周后，切斷恥骨聯(lián)合并向側邊縮回髖骨以暴露遠端海綿體神經(jīng)。刺激電極放置在盆神經(jīng)上，而記錄電極放置在損傷位點遠側。每次刺激(X Hz，0.25ms，10V)后測量復合動作電位(CAP)。與壓力傳感器連接的PE 20管插入海綿體，在電刺激(20Hz，0.5ms，10V)盆神經(jīng)期間測量海綿體內壓(ICP)。
本試驗的結果顯示，與T和V組比較，M組中海綿體神經(jīng)的CAP幅度更大。然而M組的CAP沒有對照組大。M組的平均最大ICP(52.5±9.5cmH2O)也顯著大于T組(25.4±6.6cmH2O)，(p＜0.05)。C組的ICP是115±11.2cmH2O。此分析表明，當從與電場刺激后ICP的相關性來看，CAP可用作神經(jīng)恢復的良好指標。與僅偽注射組比較，對于海綿體損傷大鼠，給予MDC促進恢復CAP并改善勃起功能。因此，在涉及陰莖神經(jīng)破壞的ED模型中，在神經(jīng)破壞位點周圍注射MDC改善了勃起功能，因而支持使用MDC作為根治性前列腺切除術后勃起功能障礙恢復的促進劑。
風險分析和評價與男人中根治性前列腺切除術相關的風險與注射MDC完全分離。參與注射MDC以治療ED的臨床研究相關的風險包括與以下相關的內容膀胱鏡檢查膀胱鏡檢查風險預期很少發(fā)生(約在1-10％人中出現(xiàn))，并包括可能不適、出血、和感染。罕見的副作用(預期在少于1％人中發(fā)生)包括檢查后不能排尿與膀胱穿孔。
肌肉活組織檢查肌肉活組織檢查的風險預期很少發(fā)生(約在1-10％人中出現(xiàn))并包括可能的傷口感染、血腫和疼痛。
靜脈穿刺靜脈穿刺的風險包括出血、不適、輕微頭痛、疼痛、瘀傷，和罕見的取血位置的感染。
細胞注射細胞注射的潛在風險包括免疫應答，盡管這種風險預期是最低限度的，因為使用自體細胞并篩選患者對可能存在的痕量牛蛋白的潛在反應。
尿道導管插入尿道導管插入的風險預期很少發(fā)生(約在1-10％人中出現(xiàn))，并包括可能短暫的不能排尿、插入導管期間的不適、尿道感染、出血和不適或疼痛。
尿動力學研究尿動力學研究的風險與尿道導管插入相似，并包括可能短暫的不能排尿、插入導管期間的不適、尿道感染和出血牛皮膚點刺試驗確定是否患者對牛(母牛)蛋白過敏的皮膚點刺變態(tài)反應試驗的潛在風險可以包括少量出血、疼痛、皮疹、或可能的過敏性休克。另外的風險預期與注射膠原的標準治療相關的風險相當，并且包括可能的連續(xù)失禁、失禁增加、尿潴留、感染、膀胱出口阻塞、發(fā)熱、形成腫瘤、注射材料移位和對注射試劑的變態(tài)反應。由于使用自體細胞并基于動物模型研究的滿意結果，細胞注射的風險預期是最低限度的。
臨床調查的目標要求和待驗證的預期性能本研究目標是確定建議治療方案的安全性和潛在療效。所述MDC治療的預期性能包括在剩余尿液體積、尿道感染、其它不利事件的發(fā)生率方面的合理安全性，以及在改善患者生活質量(QOL)、滲尿點壓力(LPP)、失禁發(fā)生次數(shù)/24小時期間方面的對預防尿失禁和性功能障礙的療效。
待評價的風險和可預見不良反應通過注射后膀胱鏡檢查評價出血和穿孔的風險。通過患者報告、每日患者排尿記錄和治療后1、3、6和12個月的臨床隨訪來評價連續(xù)失禁、尿道感染、尿潴留、注射細胞移位和對注射試劑的變態(tài)反應的風險。
待評估的具體假設待評估的假設是，在出血、穿孔、尿道感染和排尿后剩余發(fā)生率方面，所述MDC治療是相當安全的，并且在改善生活質量(QOL)、減少失禁發(fā)生次數(shù)/24小時期間和增加LPP和改善勃起功能方面觀察到具有療效的證據(jù)。
調查設計對具有合理選擇的待實施的調查類型的描述本研究設計作為小規(guī)模、單中心的前瞻性調查，其中多達20位患者作為自身對照。本設計適于初步確認建議治療方案的安全性和潛在療效。
對照人群在本研究中患者用作自身對照，評價治療前與治療后不同時間的定量和定性尿失禁測量值。
避免偏差依賴于客觀性測量如膀胱日志(bladder diary)，包括24小時墊收集和失禁發(fā)生頻率，使由于使用患者自身對照帶來的潛在偏差降到最小。
主要和次要的終點(結局)主要終點包括不良事件發(fā)生率；經(jīng)尿動力學研究觀察到的valsalva LPP；膀胱日志中記錄的失禁發(fā)生頻率；和UCLA前列腺癌排尿控制和性功能評分。次要終點包括患者生活質量/患者滿意度調查(退出時)；和剩余尿液體積。
經(jīng)合理選擇的待測變量參與研究者的待測變量包括病史、生命體征、膀胱日志、性功能、CBC、血液化學、尿分析、妊娠狀態(tài)、尿道高運動性(如果有)、剩余尿液體積和經(jīng)膀胱鏡檢查的尿道外觀、經(jīng)尿動力學的滲尿點壓力。
評價、記錄和分析變量的方法和時間選擇標準化數(shù)據(jù)格式用于記錄數(shù)據(jù)。用標準方法確定病史、身體檢查、生命體征、CBC、血液化學、尿分析和妊娠狀態(tài)。經(jīng)膀胱日志并通過完成UCLA前列腺癌指數(shù)來評價排尿控制和性功能評分。經(jīng)膀胱鏡檢查評價尿道和膀胱的外觀。經(jīng)尿動力學評價滲尿點壓力(LPP)。經(jīng)標準超聲技術評價排尿后剩余尿液體積。變量評價的時間選擇在以下事件時間表中給出。
事件時間表
M-1注射后1月x1活組織檢查/注射前*陽性浸片試驗要求尿培養(yǎng)x2活組織檢查/注射后除了表中選定的事件，經(jīng)注射后24到48小時內電話聯(lián)系患者評價任何不利作用的發(fā)生率。對于總時間15或18個月的研究中，第6個月接受第二次注射的患者的隨訪回到第一次注射的時間表(即隨后24-48小時、和1、3、6和12個月)。
入選和排除標準符合參與研究的人將滿足以下入選標準(1)提供書面知情同意；(2)至少18歲；(3)有局限性前列腺癌并安排根治性前列腺切除手術；(4)沿尿道和膀胱內有有活力的粘膜內層；(5)乙肝、丙肝和HI V檢測陰性；(6)對可能的痕量牛蛋白敏感性檢測陰性；(7)尿培養(yǎng)陰性、或陽性培養(yǎng)，預期到治療時清除；(8)具有至少1年預期壽命；(9)同意參與本方案要求的隨訪評價；和(10)PTT INR在正常范圍內。滿足以下排除標準的人將不予登記(1)已知具有膀胱輸尿管反流、膀胱過度活動癥、逼尿肌不穩(wěn)定、或高壓不穩(wěn)定；(2)正接受急迫性尿失禁藥物治療；(3)有神經(jīng)源性尿失禁；(4)有留置的導尿管；(5)有神經(jīng)肌肉疾病(如肌營養(yǎng)不良、多發(fā)性硬化癥)；(6)有糖尿??；(7)在可能的注射位點有組織纖維化；(8)有能導致顯著的手術后并發(fā)癥的任何狀況，包括正處于感染或因膀胱出口阻塞引起的剩余尿量增加(即重復的PVR＞150mL)；(9)病態(tài)肥胖(定義為超過理想體重100磅)并預期不能從治療中受益；(10)正處于膀胱炎或尿道炎或與之相關的急性病況；(11)由于疾病狀態(tài)或慢性類固醇或免疫抑制劑致使免疫系統(tǒng)受損；或(12)由于試驗或對照產品標簽的禁忌癥和/或警告而排斥治療的任何情況。
同意參與研究并滿足所有入選標準后，在收集肌肉活組織時將患者登記入研究中。向同意參與本研究并滿足研究入選標準的患者給予指導使之完成三天研究日志的方法。完成膀胱和性功能調查問卷以及總體改善調查問卷。也收集患者血液和尿液樣品供實驗室分析，包括篩選血源病毒?；颊呓邮艹暀z查確定剩余尿液體積。此外，患者接受變態(tài)反應皮膚試驗以確定他們對可能的痕量牛蛋白是否敏感。
約兩周后，患者按初步門診程序看泌尿科醫(yī)生，其中使用針活組織檢查技術收集肌肉細胞。活組織檢查后約4周，患者回到醫(yī)院接受根治性前列腺切除手術，其中用小針將患者自身的處理后細胞注射到尿道周圍?；颊咭蔡峁┯糜谠u價的研究日志、完成QOL和總體改善調查問卷，收集尿樣品用于實驗室分析，并經(jīng)超聲確定剩余尿液體積。
注射后約24到48周，通過電話聯(lián)系患者確定是否有任何不良作用發(fā)生。在1、3、6和12個月時患者回來接受隨訪。每次隨訪時，患者提供包括24小時墊收集的膀胱日志、完成QOL調查問卷、收集血液和尿液樣品供分析、并接受超聲以確定剩余尿液體積。在第6個月時間點上，患者也接受膀胱鏡檢查以評價尿道組織外觀、接受尿動力學研究以評價滲尿點壓力。如果在第6個月隨訪時沒有改善，患者可以選擇用肌肉細胞注射重復治療，而不需重復采集肌肉活組織。這種病例的隨訪回到第一次注射的時間表(即隨后24-48小時和1、3、6和12個月)?；罱M織穿刺針用于肌肉組織收集。生理鹽水用于稀釋和解凍冷凍的MDC，所述MDC冷凍于含HSA的冷凍介質中。所述MDC可以含有痕量牛血清。
患者保持在本研究中直到注射其MDC后完成12個月的隨訪。如果在任何時間患者聲明他們不希望繼續(xù)參與，他們可以無偏見或無護理損失地退出。根據(jù)主要研究人員的判斷，如果認為對患者的醫(yī)療護理有最佳利益，可以讓患者退出研究。選擇退出研究的患者被請求完成退出訪問程序，但沒有這樣做的義務。
本研究計劃多達20位患者。預期患者登記能在一年內完成。每位登記患者接受一次初次注射，如果患者沒有改善或回到基線允許在第6個月隨訪時再次接受注射。從最后注射算起隨訪患者一年?；颊呓M織樣品由發(fā)起人在注射MDC后保留18個月，隨后被破壞。
實施例5本實施例描述膀胱周圍神經(jīng)病大鼠模型中的MDC誘導的神經(jīng)恢復。盆神經(jīng)創(chuàng)傷在根治性盆腔手術如前列腺切除術期間常見并能導致嚴重的排尿功能障礙。這些功能障礙對大多數(shù)當前治療方法都是難以治療的。向盆神經(jīng)損傷位點或其周圍給予MDC，代表治療神經(jīng)性排尿紊亂的新方法。
方法從正常成年大鼠的腓腸肌分離MDC并如前所述經(jīng)鋪板和培養(yǎng)技術純化。單側盆神經(jīng)橫斷用于研究成年雌性大鼠的周圍神經(jīng)再生。三個試驗組包括(C)對照組(n＝5)；(S)單側盆神經(jīng)橫斷并給予偽注射組(n＝5)；(M)單側盆神經(jīng)橫斷并給予MDC注射(3×105細胞/位點)組(n＝5)。注射后兩周，在電刺激神經(jīng)節(jié)前盆神經(jīng)橫斷位置近端時測量膀胱內壓。刺激前即刻，切除對側(未損傷)的主盆神經(jīng)節(jié)(MPG)以確保任何觀察到的膀胱活動一定是由于單側(損傷側)輸入。試驗后，處死大鼠，取出單側MPG并測試腦啡肽免疫反應性(ENK-IR)以評價膀胱發(fā)射神經(jīng)元的存活。
結果手術后兩周，C、S和M組的最大膀胱內壓分別是31.7±10.3cmH2O、9.6±4.5cmH2O、15.2±7.7cmH2O。與正常對照動物(C)比較，偽注射大鼠(S)的壓力反應顯著降低(p＜0.01)。與S組比較，M組的壓力反應顯著更高(p＜0.01)但未達到正常水平。橫斷神經(jīng)節(jié)前盆神經(jīng)后，與M組相比，S組中細胞周圍腦啡肽-免疫反應性(ENK-IR)靜脈曲張的強度顯著降低。與C組相比，在S組中MPG中腦啡肽染色陽性的面積顯著降低(p＜0.001)(47.6±2.3比87.0±3.5％的總MPG面積)。然而，C組和M組之間MPG中腦啡肽染色陽性的面積沒有顯著差異(92.1±3.3％比88.7±2.0％)。這些結果證明在周圍神經(jīng)損傷模型中MDC可以促進神經(jīng)元存活和再生。
本說明書引用的所有專利申請、公開申請、專利、文本和參考文獻的全部內容引入此處作為參考，以更完整的描述本發(fā)明涉及領域的技術狀態(tài)。
因為可以對以上方法和組合物作多種改變而不偏離如所述的本發(fā)明范圍和精神，以上描述中含有的、附圖
中表示的、或附屬權利要求書中定義的所有主題都應認為是例證性的，而非限制性意義。
權利要求
1.促進或增強破壞、損傷、疾病或功能障礙的神經(jīng)組織的存活、再生、和/或神經(jīng)支配的方法，其中包含將肌肉來源的細胞(MDC)引入接受者中組織破壞、損傷、疾病、或功能障礙位點或其周圍，引入量可以有效促進或增強破壞、損傷、疾病或功能障礙的神經(jīng)組織的存活、再生、和/或神經(jīng)支配。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述MDC對于引入的組織是自體的。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述MDC與需要治療的接受者是組織相容性匹配的。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述MDC從骨骼肌組織獲得。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其中引入所述MDC的量為約105-106細胞/cm3待治療組織，所述MDC位于生理學可接受的介質中。
6.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述MDC的克隆群體被引入所述接受者。
7.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述MDC攜帶至少一種異源多核苷酸，所述多核苷酸編碼促進或增強神經(jīng)支配的異源蛋白質或多肽。
8.根據(jù)權利要求7的方法，其中所述蛋白或多肽選自生長因子、生長因子受體、肽神經(jīng)遞質和參與神經(jīng)遞質合成的酶中的至少一種。
9.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述生長因子選自神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4、白細胞介素、成纖維細胞生長因子1(FGF-1)、成纖維細胞生長因子2(FGF-2)、胰島素樣生長因子(IGF)、糖皮質激素、促生長素抑制素、血小板來源的生長因子(PDGF)、破傷風類毒素、TGF-α、TGF-β、表皮生長因子或視黃酸。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述蛋白或多肽是神經(jīng)生長因子(NGF)。
11.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述生長因子受體選自trk神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體、神經(jīng)生長因子(NGF)受體、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)受體、腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)受體、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3受體、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4受體、白細胞介素受體、成纖維細胞生長因子1(FGF-1)受體、成纖維細胞生長因子2(FGF-2)受體、胰島素樣生長因子(IGF)受體、糖皮質激素受體、血小板來源的生長因子(PDGF)受體、TGF-α受體、TGF-β受體、表皮生長因子(EGF)受體或視黃酸受體。
12.根據(jù)權利要求7的方法，其中所述MDC用含所述至少一種異源多核苷酸的病毒載體轉導。
13.根據(jù)權利要求7的方法，其中所述MDC用含所述至少一種異源多核苷酸的質粒DNA轉染。
14.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述病毒載體選自腺病毒、單純皰疹病毒、腺伴隨病毒和逆轉錄病毒。
15.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述病毒載體是復制缺陷型病毒載體，選自腺病毒、單純皰疹病毒、腺伴隨病毒和逆轉錄病毒。
16.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述組織損傷、破壞、疾病、或功能障礙包含選自下組的疾病、紊亂、或狀況中風、脊髓損傷、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮性側索硬化癥、癲癇、帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、心臟驟停后缺血、糖尿病、周圍神經(jīng)損傷、周圍神經(jīng)炎癥、自主神經(jīng)損傷、盆神經(jīng)破壞、燒傷、鈍傷、背部損傷、背部疼痛、或坐骨神經(jīng)痛。
17.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述MDC從肌肉細胞懸液中富集，這是通過將所述懸液鋪板為至少兩次連續(xù)培養(yǎng)物以消除成纖維細胞和非肌肉細胞并富集單核的MDC終末群體而實現(xiàn)的。
18.根據(jù)權利要求17的方法，其中所富集的單核的MDC終末群體包含成肌細胞。
19.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述MDC與生理學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑組合給予。
20.修復有需要的接受者中相同組織位點或位置的周圍神經(jīng)和肌肉組織的方法，其中包含向組織位點或位置引入肌肉來源的細胞(MDC)，MDC引入量可以有效再生所述組織位點和使所述組織的細胞群恢復以修復所述神經(jīng)和肌肉組織。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述MDC對于引入的神經(jīng)組織是自體的。
22.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述MDC與需要治療的接受者是組織相容性匹配的。
23.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述MDC從骨骼肌組織獲得。
24.根據(jù)權利要求20的方法，其中引入所述MDC的為量約105-106細胞/cm3待治療組織，所述MDC位于生理學可接受的介質中。
25.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述MDC的克隆群體被引入所述接受者。
26.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述MDC攜帶至少一種異源多核苷酸，所述多核苷酸編碼促進或增強神經(jīng)支配的異源蛋白質或多肽。
27.根據(jù)權利要求26的方法，其中所述蛋白或多肽選自生長因子、生長因子受體、肽神經(jīng)遞質和參與神經(jīng)遞質合成的酶中的至少一種。
28.根據(jù)權利要求27的方法，其中所述生長因子選自神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4、白細胞介素、成纖維細胞生長因子1(FGF-1)、成纖維細胞生長因子2(FGF-2)、胰島素樣生長因子(IGF)、糖皮質激素、促生長素抑制素、血小板來源的生長因子(PDGF)、破傷風類毒素、TGF-α、TGF-β、表皮生長因子或視黃酸。
29.根據(jù)權利要求26的方法，其中所述蛋白或多肽是神經(jīng)生長因子(NGF)。
30.根據(jù)權利要求27的方法，其中所述生長因子受體選自trk神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體、神經(jīng)生長因子(NGF)受體、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)受體、腦來源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)受體、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3受體、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4受體、白細胞介素受體、成纖維細胞生長因子1(FGF-1)受體、成纖維細胞生長因子2(FGF-2)受體、胰島素樣生長因子(IGF)受體、糖皮質激素受體、血小板來源的生長因子(PDGF)受體、TGF-α受體、TGF-β受體、表皮生長因子(EGF)受體或視黃酸受體。
31.根據(jù)權利要求26的方法，其中所述MDC用含所述至少一種異源多核苷酸的病毒載體轉導。
32.根據(jù)權利要求26的方法，其中所述MDC用含所述至少一種異源多核苷酸的質粒DNA轉染。
33.根據(jù)權利要求31的方法，其中所述病毒載體選自腺病毒、單純皰疹病毒、腺伴隨病毒和逆轉錄病毒。
34.根據(jù)權利要求31的方法，其中所述病毒載體是復制缺陷型病毒載體，選自腺病毒、單純皰疹病毒、腺伴隨病毒和逆轉錄病毒。
35.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述組織損傷、破壞、疾病、或功能障礙包含選自下組的疾病、紊亂、或狀況中風、脊髓損傷、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮性側索硬化癥、癲癇、帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、心臟驟停后缺血、糖尿病、周圍神經(jīng)損傷、周圍神經(jīng)炎癥、自主神經(jīng)損傷、盆神經(jīng)破壞、燒傷、鈍傷、背部損傷、背部疼痛、或坐骨神經(jīng)痛。
36.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述MDC從肌肉細胞懸液中富集，這是通過將所述懸液鋪板為至少兩次連續(xù)培養(yǎng)物以消除成纖維細胞和非肌肉細胞并富集單核的MDC終末群體而實現(xiàn)的。
37.根據(jù)權利要求36的方法，其中所富集的單核的MDC終末群體包含成肌細胞。
38.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述MDC與生理學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑組合給予。
39.促進或增強宿主組織或器官中組織或器官移植物或植入物神經(jīng)支配的方法，其中包含將肌肉來源的細胞(MDC)引入接受者中包含所述組織或器官移植物或植入物、和所述宿主組織或器官之間邊界的區(qū)域，所述MDC的引入量可以有效促進或增強所述宿主組織或器官和所述組織或器官移植物之間的神經(jīng)支配。
40.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述MDC促進所述組織或器官移植物或植入物、和所述宿主組織或器官之間神經(jīng)纖維的存活和生長。
41.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述MDC對于(i)所述宿主組織或器官或者(ii)所述組織或器官移植物或植入物是自體的。
42.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述組織或器官移植物或植入物選自消化、生殖、心血管、泌尿、呼吸、上皮、結締、神經(jīng)元、內分泌、皮膚、平滑肌、骨骼肌組織或器官、或其部分或節(jié)段中的一種或多種。
43.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述組織或器官移植物或植入物包含具有模擬天然組織特性的皮膚替代物或工程化材料。
44.根據(jù)權利要求43的方法，其中所述皮膚替代物或工程化材料包含無細胞的尸體皮膚基質、聚乳酸、透明質酸、聚乙醇酸、聚環(huán)氧乙烷、聚對苯二甲酸丁二醇酯、硅酮、自體的培養(yǎng)的成纖維細胞、異體的培養(yǎng)的成纖維細胞、自體的培養(yǎng)的角質細胞、異體的培養(yǎng)的角質細胞、自體的培養(yǎng)的表皮、異體的培養(yǎng)的表皮、自體的培養(yǎng)的上皮、異體的培養(yǎng)的上皮、去表皮的真皮、膠原海綿、膠原-脫乙酰殼多糖海綿、脫乙酰殼多糖-交聯(lián)膠原-糖胺聚糖基質、膠原凝膠、polyglactin網(wǎng)、或小腸粘膜下層(SIS)。
45.根據(jù)權利要求43的方法，其中所述皮膚替代物或工程化材料與皮膚組織、或皮膚組織成分組合引入。
46.根據(jù)權利要求45的方法，其中所述皮膚組織或皮膚組織成分選自角質細胞、成纖維細胞、黑素細胞、樹突細胞、附器細胞、神經(jīng)元細胞、膠質細胞、內皮細胞、或平滑肌細胞中的一種或多種。
47.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述MDC攜帶至少一種異源多核苷酸，所述多核苷酸編碼增強移植組織或器官神經(jīng)支配的異源蛋白質或多肽。
48.根據(jù)權利要求47的方法，其中所述蛋白或多肽選自生長因子、生長因子受體、肽神經(jīng)遞質或參與神經(jīng)遞質合成的酶中的至少一種。
49.根據(jù)權利要求48的方法，其中所述生長因子選自神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4、白細胞介素、成纖維細胞生長因子1(FGF-1)、成纖維細胞生長因子2(FGF-2)、胰島素樣生長因子(IGF)、糖皮質激素、促生長素抑制素、血小板來源的生長因子(PDGF)、破傷風類毒素、TGF-α、TGF-β、表皮生長因子或視黃酸。
50.根據(jù)權利要求49的方法，其中所述蛋白或多肽是神經(jīng)生長因子(NGF)。
51.根據(jù)權利要求48的方法，其中所述生長因子受體選自trk神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體、神經(jīng)生長因子(NGF)受體、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)受體、腦來源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)受體、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3受體、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4受體、白細胞介素受體、成纖維細胞生長因子1(FGF-1)受體、成纖維細胞生長因子2(FGF-2)受體、胰島素樣生長因子(IGF)受體、糖皮質激素受體、血小板來源的生長因子(PDGF)受體、TGF-α受體、TGF-β受體、表皮生長因子(EGF)受體或視黃酸受體。
52.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述MDC從肌肉細胞懸液中富集，這是通過將所述懸液鋪板為至少兩次連續(xù)培養(yǎng)物以消除成纖維細胞和非肌肉細胞并富集單核的MDC終末群體而實現(xiàn)的。
53.根據(jù)權利要求52的方法，其中所富集的單核的MDC終末群體包含成肌細胞。
54.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述MDC與需要治療的接受者是組織相容性匹配的。
55.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述MDC從骨骼肌組織獲得。
56.根據(jù)權利要求39的方法，其中引入所述MDC的量為約105-106細胞/cm3組織或器官，所述MDC位于生理學可接受的介質中。
57.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述MDC的克隆群體被引入所述受體。
58.促進或增強切斷或部分切斷的組織或肢體神經(jīng)支配的方法，其中包含將肌肉來源的細胞(MDC)引入受試者的切斷或部分切斷的組織或肢體，所述MDC的引入量可以有效促進或增強所述組織或肢體的神經(jīng)支配。
59.根據(jù)權利要求58的方法，其中將所述MDC引入到所述切斷組織或肢體的遠端位點、近端位點、或遠端位點和近端位點中的一個或多個位點。
60.根據(jù)權利要求58的方法，其中所述MDC或分別給予或與生理學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑組合給予。
61.根據(jù)權利要求58的方法，其中所述MDC被工程化而攜帶編碼異源蛋白或多肽的至少一種異源多核苷酸，所述蛋白或多肽用于增強移植組織或器官的神經(jīng)支配。
62.根據(jù)權利要求61的方法，其中所述蛋白或多肽選自生長因子、生長因子受體、肽神經(jīng)遞質或參與神經(jīng)遞質合成的酶中的至少一種。
63.根據(jù)權利要求58的方法，其中所述MDC從肌肉細胞懸液中富集，這是通過將所述懸液鋪板為至少兩次連續(xù)培養(yǎng)物以消除成纖維細胞和非肌肉細胞并富集單核的MDC終末群體而實現(xiàn)的。
64.根據(jù)權利要求63的方法，其中所富集的單核的MDC終末群體包含成肌細胞。
65.根據(jù)權利要求58的方法，其中所述MDC與需要治療的接受者是組織相容性匹配的。
66.根據(jù)權利要求58的方法，其中所述MDC從骨骼肌組織獲得。
67.根據(jù)權利要求58的方法，其中引入所述MDC的量為約105-106細胞/cm3組織或器官，所述MDC位于生理學可接受的介質中。
68.根據(jù)權利要求58的方法，其中所述MDC的克隆群體被引入所述接受者。
69.促進或增強前列腺切除術后的神經(jīng)恢復和勃起功能恢復的方法，其中包含將自體的肌肉來源的細胞(MDC)給予有需要的患者，所述MDC的引入量可以有效促進或增強所述患者的神經(jīng)恢復和勃起功能恢復。
70.根據(jù)權利要求69的方法，其中在前列腺切除術吻合處的一個或多個位點給予所述MDC。
71.根據(jù)權利要求69的方法，其中在海綿體神經(jīng)、盆神經(jīng)、腹下神經(jīng)、盆叢、和盆腔自主神經(jīng)節(jié)或其周圍給予所述MDC。
72.根據(jù)權利要求69的方法，其中所述MDC給予到陰莖中。
73.根據(jù)權利要求69的方法，其中所述前列腺切除術是根治性前列腺切除術。
74.根據(jù)權利要求69的方法，進一步包含手術后經(jīng)膀胱鏡檢查向所述患者再給予MDC。
75.根據(jù)權利要求69的方法，其中所述MDC從肌肉細胞懸液中富集，這是通過將所述懸液鋪板為至少兩次連續(xù)培養(yǎng)物以消除成纖維細胞和非肌肉細胞并富集單核的MDC終末群體而實現(xiàn)的。
76.根據(jù)權利要求75的方法，其中所富集的單核的MDC終末群體包含成肌細胞。
77.根據(jù)權利要求69的方法，其中所述MDC從骨骼肌組織獲得。
78.根據(jù)權利要求69的方法，其中將給予的所述MDC的量為約105-106細胞/cm3患者組織。
79.根據(jù)權利要求69的方法，其中所述MDC與生理學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑聯(lián)合給予。
80.根據(jù)權利要求69的方法，其中所述MDC的克隆群體被引入所述患者。
81.預防或減緩組織破壞后周圍皮膚軸突退化的方法，其中包含將肌肉來源的細胞(MDC)引入接受者的破壞組織中，所述MDC的引入量可以有效預防或減緩周圍皮膚軸突的退化。
82.根據(jù)權利要求81的方法，其中作為組織損傷、疾病或功能障礙的結果所述周圍皮膚軸突已被破壞。
83.根據(jù)權利要求82的方法，其中所述組織損傷、疾病或功能障礙選自炎癥、燒傷、創(chuàng)傷、鈍傷、或損害。
84.促進或增強神經(jīng)破壞、疾病或損傷位點的軸突再生和/或神經(jīng)元存活的方法，其中包含將肌肉來源的細胞(MDC)引入接受者的組織破壞、疾病或損傷位點中，所述MDC的引入量可以有效促進或增強軸突再生和/或神經(jīng)元存活。
85.根據(jù)權利要求84的方法，其中所述MDC從肌肉細胞懸液中富集，這是通過將所述懸液鋪板為至少兩次連續(xù)培養(yǎng)物以消除成纖維細胞和非肌肉細胞并富集單核的MDC終末群體而實現(xiàn)的。
86.根據(jù)權利要求85的方法，其中所富集的單核的MDC終末群體包含成肌細胞。
87.根據(jù)權利要求84的方法，其中所述MDC從骨骼肌組織獲得。
88.促進或增強前列腺切除術或盆腔手術期間破壞的盆神經(jīng)的神經(jīng)恢復和修復的方法，其中包含將自體的肌肉來源的細胞(MDC)給予有需要的患者，給予所述MDC的量可以有效促進或增強所述患者在前列腺切除術或盆腔手術期間破壞的盆神經(jīng)的神經(jīng)恢復和修復。
89.根據(jù)權利要求88的方法，其中所述MDC從肌肉細胞懸液中富集，這是通過將所述懸液鋪板為至少兩次連續(xù)培養(yǎng)物以消除成纖維細胞和非肌肉細胞并富集單核的MDC終末群體而實現(xiàn)的。
90.根據(jù)權利要求89的方法，其中所富集的單核的MDC終末群體包含成肌細胞。
91.根據(jù)權利要求88的方法，其中所述MDC從骨骼肌組織獲得。
92.根據(jù)權利要求88的方法，其中給予所述MDC的量為約105-106細胞/cm3患者組織。
93.根據(jù)權利要求88的方法，其中所述MDC與生理學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑聯(lián)合給予。
94.根據(jù)權利要求88的方法，其中所述MDC的克隆群體被給予所述患者。
95.根據(jù)權利要求88的方法，其中所述前列腺切除術是根治性前列腺切除術。
96.評價測試物質對肌肉來源的細胞(MDC)支持神經(jīng)支配或神經(jīng)細胞生長能力的影響的方法，其中包含(a)用所述測試物質處理MDC培養(yǎng)物；(b)將所處理的MDC引入神經(jīng)組織損傷、疾病、或破壞的位點；和(c)比較相對于未處理MDC支持接受者組織中神經(jīng)支配或神經(jīng)細胞生長的能力，在具有神經(jīng)組織疾病、破壞、或損傷的接受者的組織中處理的MDC支持神經(jīng)支配或神經(jīng)細胞生長的能力。
97.根據(jù)權利要求96的方法，其中所述MDC從肌肉細胞懸液中富集，這是通過將所述懸液鋪板為至少兩次連續(xù)培養(yǎng)物以消除成纖維細胞和非肌肉細胞并富集單核的MDC終末群體而實現(xiàn)的。
全文摘要
本發(fā)明描述涉及使用肌肉來源的細胞(MDC)的方法，所述細胞優(yōu)選從骨骼肌獲得，以支持受損傷組織和器官的神經(jīng)支配和修復，特別是與神經(jīng)損傷或神經(jīng)病變相關的那些。本發(fā)明涉及用于促進或增強神經(jīng)細胞神經(jīng)支配的方法的MDC，尤其是在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，以及當MDC引入到由于損傷、破壞、疾病或功能障礙而需要修復的組織或器官位點或其附近時它們有助于神經(jīng)元組織發(fā)育的能力。這些方法可用于治療中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)紊亂并緩解、減輕或消除動物的神經(jīng)病學或神經(jīng)退行性疾病的癥狀，尤其是哺乳動物，包括人。所述方法也可用于在神經(jīng)和肌肉組織類型損傷、破壞或功能障礙后治療這些組織。
文檔編號A61P25/00GK1812800SQ200480018035
公開日2006年8月2日 申請日期2004年4月26日 優(yōu)先權日2003年4月25日
發(fā)明者M·B·錢切洛爾, J·瓦爾, B·明納里 申請人:匹茲堡大學