專利名稱：氚化的生長激素促分泌素 mk－0677的制作方法
由垂體分泌的生長激素，刺激能夠生長的身體的所有組織的生長。此外，已知生長激素對于身體的代謝過程具有如下基本作用(1)增加身體所有細胞的蛋白質(zhì)合成的速度；(2)減少身體的細胞中的碳水化合物的利用的速度；(3)增加游離脂肪酸的轉(zhuǎn)移和將脂肪酸用于能量。在生長激素分泌中的缺陷可導致各種醫(yī)學疾病，諸如侏儒癥。
已知釋放生長激素的多種途徑。例如，化學品諸如精氨酸，L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)，胰高血糖素，血管升壓素，和胰島素誘導低血糖癥，以及活動諸如睡眠和運動，其通過以某種方式作用在下丘腦從而也許減少促生長素抑素的分泌或增加已知促分泌素生長釋放因子(GRF)或未知內(nèi)源生長激素釋放激素的分泌或所有這些來間接導致生長激素從垂體中釋放。
至于術(shù)語“生長激素促分泌素”(GHS)指在動物中直接或間接刺激或增加生長激素釋放的任何化合物或試劑。生長激素促分泌素(特別是具有放射性標記的生長激素促分泌素)作為體外了解生長激素分泌是怎樣在垂體水平被調(diào)節(jié)的獨特工具是有用的。這包括在被認為或已知影響生長激素分泌的許多因子諸如年齡、性別、營養(yǎng)因素、葡萄糖、氨基酸、脂肪酸以及空腹和非空腹狀態(tài)的評價中的應用。此外，生長激素促分泌素在評價其它激素是怎樣調(diào)節(jié)生長激素釋放活性中是有用的。例如，已經(jīng)確定生長激素抑素抑制生長激素釋放。作為重要的和需要研究它們對生長激素釋放的影響的其它激素包括性激素，例如，睪酮，雌二醇，和孕酮；腎上腺激素，例如，皮質(zhì)醇和其它皮質(zhì)激素類，腎上腺素和去甲腎上腺素；胰和胃腸激素，例如胰島素，胰高血糖素，促胃液素，胰泌素；血管活性肽，例如，鈴蟾肽、神經(jīng)激肽；和甲狀腺激素，例如，甲狀腺素和三碘甲腺原氨酸。還可將生長激素促分泌素用于研究一些垂體激素，例如生長激素和內(nèi)啡肽對垂體的可能的反向或正向反饋影響以調(diào)節(jié)生長激素的釋放。在科學上的特別重要性是應用生長激素促分泌素來闡明調(diào)節(jié)生長激素釋放的亞細胞機制。
本領(lǐng)域已知確定作為生長激素促分泌素的化合物的活性的方法。例如，Smith，et al.，Science，260，1640-1643(1993)描述的來自體內(nèi)(ex vivo)的測定(見本文圖2正文)，但是該測定需要使用細胞培養(yǎng)物并不給出競爭性結(jié)合活性的指示。因此，開發(fā)用于鑒定和表征在生長激素促分泌素的活性中具有作用的細胞受體的放射性配體將是理想的。獲得放射性配體用在測試化合物的生長激素促分泌素活性的測定中也將是理想的。
這些研究通常需要高特異性活性的放射性配體。以前使用來自GHRP-6的[T]-標記或[125I]-標記的肽配體開發(fā)結(jié)合測定取得了有限的成功。見R.F.Walker，et al.Neuropharmacol.989，28，1139和C.Y.Bowerset al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.1991，178，31.通常，這些肽配體的結(jié)合是低親和性的并且具有非常高的能力。而且，結(jié)合親和性與肽的生長激素分泌活性不相關(guān)。結(jié)合和生長激素分泌活性的相關(guān)性的缺乏最可能是放射性配體的相對低的特異性活性(在[T]GHRP-6的情形中)和非-特異性結(jié)合特性的結(jié)果。
WO 9722367提供刺激內(nèi)源生長激素釋放并具有高特異性放射化學活性的[35S]放射性標記的化合物。所述化合物作為非肽的生長激素促分泌素屬于在WO 94113696/EP0615977和Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，7001-7005(1995 7月)中公開螺環(huán)(Spiro)化合物。這些化合物具有刺激天然或內(nèi)源生長激素釋放的能力。在本文公開的優(yōu)選的化合物中的是具有高生長激素分泌活性的N-[1(R)-[(1，2-二氫-1-甲磺?；輀3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1t-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺。這些化合物是作為未標記化合物被公開的。本發(fā)明的目標存在于提供WO 94113696/EP0615977中描述的類型的放射性標記的化合物，以用在篩選方法分析中。通常，在其中需要特異性活性＞100Ci/mmol的情形中，放射性碘是研究受體的標記的選擇。見K.G.McFarthing，In Receptor-Ligand InteractionsA PracticalApproach；Hulme，E.C.，Ed.；Oxford University Press，Oxford，1992；Chapter 1。但是，鹵素原子(例如，氯，溴)在芐基基團的對位位置或在螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲基-氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺的螺-二氫吲哚苯基基團的5-位置的結(jié)合導致在來自大鼠垂體細胞的生長激素釋放上的固有活性的＞20倍的喪失。這說明在這些位置上的碘取代(諸如用125I)將不提供高效配體。而且，碘具有高程度的親脂性并可進一步改變配體的親和性。增加的親水性(水溶解性)通常與觀察到的放射性配體的“粘性”呈逆相關(guān)，所述配體的“粘性”經(jīng)常嚴格限制其在各種受體制劑中的有用性，見M.W.Cunningham，et al.In Radioisotopes in BiologyA Practical Approach；Slater，R.J.，Ed.；Oxford University Press，Oxford，1990；Chapter 6。在這點上注意與125I同族元素(1的X值＝1.12)相比，具有甲氨磺酰(methane sulfonamide)基團的配體應顯示減少的親脂性(NHSO，CH，的X值＝1.18)。見C.Hansch，et al.J.Med.Chem.1973，16，1207。此外，發(fā)現(xiàn)氨基官能度對于生物學活性是必需的并因此其與廣泛應用的Bolton-Hunter試劑的結(jié)合不是可行的備選方案。見，K.G.McFarthing，InReceptor-Ligand InteractionsA Practical Approach；Hulme，E.C.，Ed.；OxfordUniversity Press，Oxford，1992；Chapter 1。
在WO 9722367中，獲得了用[35S]進行放射性標記到高比活的N-[1(R)-[(1，2-二氫-1-甲磺?；輀3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1t-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺。
然而，使用35S標記的放射性配體的主要缺點是短半衰期和對廢物處理的要求。如已經(jīng)在上面指出的，以前使用衍生自GHRP-6的氚標記的肽配體開發(fā)的結(jié)合測定取得了有限的成功。令人驚奇的是，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)可以充分高比活提供三-氚化的-2-氨基-N-[(1R)-2-[1，2-二氫-1-(甲磺酰)螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基]-2-氧代-1-[(苯基甲氧基)甲基]乙基]-2-甲基-，單甲磺酸酯(monomethanesulfonate)，可將其成功用在結(jié)合測定中。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及放射性標記的生長激素促分泌素，其包括下式的至少一個化合物
其中，R1-R6互相獨立的是H或T，并且其中R1-R6的至少一個是T。
用于本文時，術(shù)語“放射性標記的生長激素促分泌素”指在上文中描述的個體化合物以及在上文中描述的化合物的混合物。因此，本發(fā)明的放射性標記的生長激素促分泌素還可通過所述化合物的每個分子出現(xiàn)的T的平均數(shù)目來表征。
用于本文時“T”指氚原子。
術(shù)語“三-氚化的-2-氨基-N-[(1R)-2-[1，2-二氫-1-(甲磺酰)螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基]-2-氧代-1-[(苯基甲氧基)甲基]乙基]-2-甲基-，單甲磺酸酯”指上文描述的放射性配體，其中在所述放射性配體中存在平均數(shù)約3T。
術(shù)語“MK0677”指上述指出的式的未標記的化合物，其中R1-R6是氫。用于本文時，術(shù)語“T-MK0677”指本發(fā)明的氚-放射性標記的生長激素促分泌素。
已經(jīng)在專利EP 0615977公開了未標記的化合物的結(jié)構(gòu)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，上文描述的放射性標記的生長激素促分泌素具有介于86.4 Ci/mmole和115.2 Ci/mmole之間的比活。在一個更加優(yōu)選的實施方案中，上文描述的放射性標記的生長激素促分泌素具有97.5Ci/mmole的比活。
本發(fā)明提供將上文描述的放射性標記的生長激素促分泌素應用于鑒定可與生長激素促分泌素受體結(jié)合的化合物。還提供了鑒定作為生長激素促分泌素受體的細胞受體的上文描述的放射性標記的生長激素的應用。此外，可將上文描述的放射性標記的生長激素促分泌素用于鑒定作為生長激素促分泌素的化合物的活性。
而且，本發(fā)明提供合成放射性標記的生長激素促分泌素的方法，所述方法包括使具有下式 的化合物與X-α-氨基異丁酸-[甲基-T]反應，其中將X定義為保護基，如果出現(xiàn)，隨后將所述保護基去除并且如果需要形成鹽。
本發(fā)明還涉及可通過上文所述的方法獲得的放射性標記的生長激素促分泌素。
除此之外，本發(fā)明涉及鑒定在宿主中被表達為生長激素促分泌素受體的細胞受體的方法，所述方法包括使細胞受體與上文描述的放射性標記的生長激素促分泌素接觸并確定所述放射性標記的生長激素促分泌素的結(jié)合是否已經(jīng)發(fā)生。所述宿主可以是組織，初級細胞或被認為表達生長激素促分泌素受體的培養(yǎng)的細胞。
本發(fā)明提供一種鑒定可與生長激素促分泌素受體結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括在存在上文描述的放射性標記的生長激素促分泌素存在時，使所述化合物與表達生長激素促分泌素受體的宿主接觸，并監(jiān)測所述化合物是否影響放射性標記的生長激素促分泌素與生長激素促分泌素受體的結(jié)合。所述宿主可以是組織樣品，初級細胞或培養(yǎng)的細胞，所述培養(yǎng)的細胞天然表達生長激素促分泌素受體，或被生長激素促分泌素受體瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(Sambrook et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA)。
而且，本發(fā)明還提供鑒定作為生長激素促分泌素的化合物的活性的方法，所述方法包括在上文描述的放射性標記的生長激素促分泌素存在時，使被認為具有生長激素促分泌素活性的化合物與表達生長激素促分泌素受體的宿主接觸，并監(jiān)測被認為具有生長激素促分泌素的活性的化合物是否影響上文描述的放射性標記的生長激素促分泌素與生長激素促分泌素受體的結(jié)合。所述宿主可以是組織樣品，初級細胞或培養(yǎng)的細胞，所述培養(yǎng)的細胞天然表達生長激素促分泌素受體，或被生長激素促分泌素受體瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，USA)。
本發(fā)明還提供通過上文描述的方法鑒定的化合物或其藥用鹽。此外，本發(fā)明提供包括上文描述的化合物和藥用載體的藥物組合物。
用于本文的短語“藥用的”指在合理醫(yī)療診斷范圍內(nèi)，適合于用在與人和動物組織的接觸中而不會造成過量毒性、刺激作用、變態(tài)反應或其它問題或并發(fā)癥，與合理的益處/風險比率相稱的那些化合物，材料，組合物，和/或劑型。
用于本文時，“藥用鹽”指被鑒定的試劑的衍生物，其中通過獲得其的酸或堿鹽來修飾這些來源試劑。藥用鹽的實例包括，但不限于，堿性殘基諸如酰胺的礦物鹽或有機酸鹽；酸性殘基諸如羧酸的堿性鹽或有機鹽；等。所述藥用鹽包括形成的來源化合物的常規(guī)非毒性鹽或季銨鹽，例如，來自非毒性無機或有機酸。例如，這些常規(guī)非毒性鹽包括衍生自無機酸諸如鹽酸的，氫溴酸的，硫酸的，氨基磺酸的，磷酸的，硝酸的等的那些；和制備自有機酸諸如乙酸的，丙酸的，琥珀酸的，羥基乙酸(glycolic)的，硬脂酸的，乳酸的，蘋果酸的，酒石酸的，檸檬酸的，抗壞血酸的，pamoic，馬來酸的，羥基馬來酸的，苯基乙酸的，谷氨酸的，苯甲酸的，水楊酸的，磺胺酸的，2-乙酸基苯甲酸的，反丁烯二酸的，苯磺酸的，甲苯磺酸的，甲磺酸的，乙烷二磺酸的，草酸的，羥乙磺酸的等的那些。
通過常規(guī)化學方法，可自包含堿性或酸性部分的來源試劑合成本發(fā)明的藥用鹽。通常，這些鹽可通過使這些化合物的游離酸或堿形式與化學計算量的在水中或在有機溶劑，或在兩者的混合物中的合適的堿或酸反應來進行制備；通常，優(yōu)選非水性的介質(zhì)如醚，乙酸乙酯，乙醇，異丙醇，或乙腈。合適的鹽的列表見于Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1985，p.1418，將其內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。
可對通過本發(fā)明方法鑒定的試劑進行修飾從而獲得(i)修飾的作用位點，活性光譜，和/或(ii)效能增加，和/或(iii)毒性減少(提高的治療指數(shù))，和/或(iv)減少的副作用，和/或(v)修飾的作用的開始，效果的持續(xù)時間，和/或(vi)修飾的動力學參數(shù)(再吸收，分布，代謝和分泌)，和/或(vii)修飾的物理-化學參數(shù)(溶解性，吸濕性，顏色，味道，氣味，穩(wěn)定性，狀態(tài))，和/或(viii)提高的一般特異性，器官/組織特異性，和/或(ix)最佳的應用形式和路徑，上述修飾是通過(i)羧基基團的酯化作用，或(ii)羥基基團與碳氫酸(carbon acids)的酯化作用，或(iii)羥基基團與，例如磷酸鹽、焦磷酸鹽或硫酸鹽或半琥珀酸鹽的酯化作用，或(iv)藥用鹽的形成或(v)藥用復合物的形成，或(vi)藥用活性聚合物的形成，或(vii)親水性部分的引入，或(viii)在aromates或側(cè)鏈上的取代基的引入/交換，取代模式的變化，或(ix)通過引入電子等排或生物電子等排部分進行修飾，或(x)合成同源化合物，或(xi)引入支化側(cè)鏈，或(xii)將烷基取代基轉(zhuǎn)變成環(huán)狀類似物，或(xiii)將羥基基團衍生化為縮酮，乙縮醛，或(xiv)N-乙?；癁轷０罚被姿岜锦?，或(xv)合成曼尼期堿，亞胺，或(xvi)將酮或醛轉(zhuǎn)化為席夫堿類，肟，乙縮醛，縮酮，烯醇酯，噁唑烷，thiozolidines或其組合進行；和(b)將所述修飾的產(chǎn)物與適合于芳香或香味組合物或產(chǎn)物的藥用載體或載體/稀釋劑一起進行配制。
可以使用任何常規(guī)載體材料。所述載體材料可以是適合于eteral、經(jīng)皮或腸胃外施用的有機或無機的載體材料。合適的載體包括水、明膠、阿拉伯膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石、植物油、聚亞烷基二醇、凡士林等。而且，藥用制劑可包含其它藥用活性劑?？蓪⒘硗獾奶砑觿┲T如芳香劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑等按照藥用組合的被接受的習慣加入。
本發(fā)明還涉及基本如上文描述的、特別是參考下面的實施例的放射性標記的配體、化合物、方法、過程、應用和組合物。
附圖簡述

圖1顯示終產(chǎn)物，三-氚化的-2-氨基-N-[(1R)-2-[1，2-二氫-1-(甲磺酰)螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基]-2-氧代-1-[(苯基甲氧基)甲基]乙基]-2-甲基-單甲磺酸酯的分析的質(zhì)譜分析的結(jié)果。術(shù)語[3H]指氚(T)。
圖2A顯示了T-MK0677與人胚腎HEK 293(EBNA)細胞膜的結(jié)合曲線。術(shù)語[3H]指氚(T)。
圖2B顯示了通過不同的生長激素促分泌素受體拮抗劑，T-MK0677與人胚腎HEK 293(EBNA)細胞膜的競爭性結(jié)合。術(shù)語[3H]指氚(T)。
實施例
實施例1.1制備4-(2-氟-苯基)-1-甲基-哌啶-4-腈 將NaH分散體(55％在油中，5.92g，148mmol，4.65當量)加入2-氟苯基乙腈(5g，37mmol，1.16當量)在DMSO(75mL)的溶液中，劇烈攪拌。30分鐘后，將在DMSO(75mL)中的2，2′-二氯-N-甲基二乙基胺鹽酸鹽(6.12g，31.8eq.1eq.)的溶液逐滴加入，并將所述混合物于75℃攪拌4小時30分。然后加入冰水(300g)，并用二乙醚抽提混合物。與鹽酸(2N)一起搖動所述合并的醚溶液。棄去有機層。用碳酸氫鈉(84g)堿化水層，并用二乙醚抽提。蒸發(fā)溶劑后，用快速分離色譜(flash chromatography)純化得到的油。分離一個級分，將其在真空中進行蒸發(fā)和干燥，得到棕色油形式的3.0g(43％)的4-(2-氟-苯基)-1-甲基-哌啶-4-腈。ISP-MSm/e＝218.1([M]+)。
實施例1.2制備1′-甲基螺(二氫吲哚-3，4′-哌啶) 將無水乙醇(7.6mL，165mmol，12當量)緩慢加入冷(0℃)氫化鋁鋰(2.09g，55mmol，4.0當量)在二甲氧基乙烷(70mL)的混懸液中。加入后，將所述混合物緩慢加熱回流。在30分鐘時間內(nèi)，加入4-(2-氟-苯基)-1-甲基-哌啶-4-腈在二甲氧基乙烷(30mL)的溶液。在72小時內(nèi)維持回流。將反應混合物冷卻至室溫并用水(2.2mL)、氫氧化鈉水溶液(15％，2mL)，最終水(7mL)分解。
30分鐘后，過濾所述混合物，并用溫二氯甲烷漂洗濾餅兩次。將濾餅在真空中干燥，產(chǎn)生黃色固體形式的2.12g(76％)的1′-甲基螺(二氫吲哚-3，4′-哌啶)。ISP-MSm/e＝203.1([M+H]+)。
實施例1.3制備N-甲磺?；?N′-甲基螺(二氫吲哚-3，4′-哌啶) 在30分鐘內(nèi)，將在二氯甲烷中的甲磺酸氯化物溶液(10mL)緩慢加入冷(0℃)1′-甲基螺(二氫吲哚-3，4′-哌啶)在二氯甲烷中的溶液(40mL)中。于0℃2小時20分后，將溶液用二氯甲烷(150mL)稀釋，將其傾注到碳酸氫鈉水溶液中(250mL)，用鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥，過濾，然后在真空中干燥。獲得黃色半固體形式的2.85g的N-甲磺?；?N′-甲基螺(二氫吲哚-3，4′-哌啶)。ISP-MSm/e＝281.2([M+H]+).
實施例1.4制備N-甲磺?；?N′-羧基苯氧基螺(二氫吲哚-3，4′-哌啶) 于20℃，將N-甲磺?；?N′-甲基螺(二氫吲哚-3，4′-哌啶)和氯甲酸苯酯在二氯甲烷中的溶液攪拌20小時。將反應混合物用氫氧化鈉水溶液，然后用水洗滌。濃縮后，通過快速分離色譜進行純化。分離一個級分，在真空中蒸發(fā)和干燥，得到作為白色固體的3.0g的N-甲磺?；?N′-羧基苯氧基螺(二氫吲哚-3，4′-哌啶)。ISP-MSm/e＝387.2([M+H]+)。
實施例1.5制備螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1，2-二氫-1-(甲磺酰) 將N-甲磺?；?N′-羧基苯氧基螺(二氫吲哚-3，4′-哌啶)(3.0g，7.76mmol)和氫氧化鉀(6.0g，90.9mmol，11.7當量)在乙二醇(45mL)中的溶液于160-170℃在氮氣下攪拌105分鐘。將反應混合物冷卻到室溫，用冰水(400mL)稀釋并用二氯甲烷抽提。用水洗滌有機層并在真空中濃縮，得到1.87g的白色固體形式的螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1，2-二氫-1-(甲磺酰)。
ISP-MSm/e＝267.2([M+H]+).
實施例1.6制備螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1′-[(2R)-2-氨基-1-氧代-3-(苯基甲氧基)丙基]-1，2-二氫-1-(甲磺酰) 將水(20mL)，二環(huán)己基碳二亞胺(1.576g，7.64mmol，1.1當量)和1-羥基苯并三唑(1.02g，7.57mmol，1.09當量)和Boc-O-芐基-D-絲氨酸(2.26g，7.64mmol，1.10當量)加入螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1，2-二氫-1-(甲磺酰)(1.85g，6.94mmol)在乙酸異丙酯(50mL)的溶液中。將混合物于20℃攪拌5小時，然后進行過濾。
將固體過濾并用乙酸異丙酯(30mL)洗滌。分離水層，并用氫氧化鈉(sodium hydroxide)的水溶液(1M，30mL)、鹽酸水溶液(0.5M，2×30mL)和碳酸氫鈉水溶液(30mL)洗滌有機相。蒸發(fā)有機層，得到3.94g的淺白色(white light)固體。將該固體用乙醇(16mL)進行稀釋。加入甲磺酸(1.35mL，20.8mmol，3.0當量)。將所述混合物在40℃加溫7.5小時。
加入水(50mL)。將所述混合物冷卻至5℃達30分鐘并進行過濾。通過加入氫氧化鈉水溶液(3M，7.5mL)，將pH調(diào)到pH＞12。用乙酸異丙酯抽提所述混合物。濃縮后，通過快速分離色譜純化所述粗混合物。收集一個級分，在真空中蒸發(fā)和進行干燥，得到白色固體形式的2.32g的螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1′-[(2R)-2-氨基-1-氧代-3-(苯基甲氧基)丙基]-1，2-二氫-1-(甲磺酰)ISP-MSm/e＝444.2([M+H]+)。
實施例17制備三-氘化的2-氨基-N-[(1R)-2-[1，2-二氫-1-(甲磺酰)螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基]-2-氧代-1-[(苯基甲氧基)甲基]乙基]-2-甲基-單甲磺酸酯 其中R1-R6彼此獨立的是H或T。
將88.51mCi的N-Boc-α-氨基異丁酸-[甲基-T]，(100Ci/mmole，International Isotopes Clearing House，Inc.，Leawood，Kansas USA)的乙醇水溶液進行過濾并轉(zhuǎn)移到0.3mL的反應器中。將溶劑在氬氣下蒸發(fā)。N，N′二環(huán)己基碳二亞胺(0.206mg)和1-羥基苯并三唑(0.135mg)加入螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1′-[(2R)-2-氨基-1-氧代-3-(苯基甲氧基)丙基]-1，2-二氫-1-(甲磺酰)(0.444mg)在乙酸異丙酯的溶液中。加入水(13.5μL)。將所述混合物于室溫劇烈攪拌2小時。
用乙酸乙酯稀釋反應混合物并用飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌。在硫酸鈉上干燥有機溶液，并將溶劑在真空中蒸發(fā)。加入甲磺酸在乙醇中的溶液(0.4mL，5％v/v)。將該溶液于40℃攪拌過夜。
如上所述相同的方法(work-up)提供47.9mCi的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物具有按照HPLC的77％的放射化學純度。
通過HPLC(柱Zorbax Bonus RP5，5μm)純化產(chǎn)生17.78mCi的三-氚化的-2-氨基-N-[(1R)-2-[1，2-二氫-1-(甲磺酰)螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基]-2-氧代-1-[(苯基甲氧基)甲基]乙基]-2-甲基-單甲磺酸酯，其具有按照HPLC的99.5％放射化學純度。
固體反應產(chǎn)物的比活是97.5Ci/mmole(通過質(zhì)譜分析法確定，見圖1)。
實施例2結(jié)合測定實施例2.1膜制備使人胚腎HEK 293(EBNA)細胞生長在混懸液中并按照前面描述的方法(Schlaeger and Christensen，Cytotechnology，30，71-83，1999)對其進行轉(zhuǎn)染。將細胞于500rpm離心10分鐘，用PBS-0.7mM EDTA/(4℃)洗滌1次，并以2ml/g的細胞在PBS-EDTA-PI(具有蛋白酶抑制劑混合物)中重懸。在冰上用Ultra Turax level green 3×15″，間斷30″來破裂細胞。為了去除碎片，將混懸液在Sorvall SS34轉(zhuǎn)子中于2′000rpm離心20分鐘。收集上清液并在20′000rpm離心40分鐘。將沉淀重懸于PBS-EDTA。使用T-MK0677以飽和結(jié)合測定證實受體密度是4.9pmol/mg蛋白質(zhì)。
實施例2.2結(jié)合測定將膜重懸于結(jié)合緩沖液(25mM Hepes，pH7.4，25mM MgCl2，1mMCaCl2，0.1％BSA，0.03％Bacitracine(蛋白酶抑制劑))中至0.1-2μg/孔。
將結(jié)合緩沖液，T-MK0677(來自Amersham 10mM，97.5Ci/mmol，到10nM的終濃度)，未標記的配體(到1μM的終濃度)和重懸的膜(終濃度0.5μg/孔)加至200μl/孔的終體積到96孔微量培養(yǎng)板(Corning 3600非結(jié)合表面)中。將所述混合物于20℃溫育60分鐘。
用0.5μL/孔的在PBS中的0.5％聚乙烯亞胺(PEI)對濾板(PackardGF/B unifilter板)進行處理15分鐘。將結(jié)合的混和物經(jīng)過濾板進行過濾，用冰冷的PBS洗滌濾板3次。然后于50℃將濾板在預熱的培養(yǎng)器中干燥50分鐘。然后在每孔中將50μl的Microscint 0加入并在Packard Instruments的topcount中計算T衰變。
權(quán)利要求
1.一種放射性標記的生長激素促分泌素，其包括下式的至少一種化合物 ，其中R1-R6彼此獨立地是H或T，并且其中R1-R6中至少一個是T。
2.權(quán)利要求1的放射性標記的生長激素促分泌素，其中放射性標記的生長激素促分泌素的比活介于86.4Ci/mmole和115.2Ci/mmole之間。
3.權(quán)利要求2的放射性標記的生長激素促分泌素，其中放射性標記的生長激素促分泌素的比活是97.5Ci/mmole。
4.權(quán)利要求1-3的任一項的放射性標記的生長激素促分泌素用于鑒定可與生長激素促分泌素受體結(jié)合的化合物的應用。
5.權(quán)利要求1-3的任一項的放射性標記的生長激素促分泌素用于鑒定作為生長激素促分泌素受體的細胞受體的應用。
6.權(quán)利要求1-3的任一項的放射性標記的生長激素促分泌素用于鑒定作為生長激素促分泌素的化合物的活性的應用。
7.一種合成放射性標記的生長激素促分泌素的方法，其包括使具有下式的化合物 與X-(α-氨基異丁酸-[甲基-T]反應，和如果需要形成鹽，其中將X定義為保護基，所述保護基如果出現(xiàn)，隨后被去除。
8.一種鑒定作為生長激素促分泌素的細胞受體的方法，所述方法包括使被認為表達生長激素促分泌素受體的宿主與權(quán)利要求1-3的任一項的放射性標記的生長激素促分泌素接觸并確定結(jié)合是否已發(fā)生。
9.一種鑒定可與生長激素促分泌素受體結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括在權(quán)利要求1-3的任一項的放射性標記的生長激素促分泌素存在時，使所述化合物與表達生長激素促分泌素受體的宿主接觸，并監(jiān)測所述化合物是否影響權(quán)利要求1-3的任一項的放射性標記的生長激素促分泌素與生長激素促分泌素受體的結(jié)合。
10.一種鑒定作為生長激素促分泌素的化合物的活性的方法，所述方法包括在權(quán)利要求1-3的任一項的放射性標記的生長激素促分泌素存在時，使被認為具有生長激素促分泌素活性的化合物與表達生長激素促分泌素受體的宿主接觸，并監(jiān)測被認為具有作為生長激素促分泌素的活性的化合物是否影響權(quán)利要求1-3的任一項的放射性標記的生長激素促分泌素與生長激素促分泌素受體的結(jié)合。
11.一種通過權(quán)利要求9或10的任一項的方法被鑒定的化合物，或其藥用鹽。
12.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求11的化合物和藥用載體。
13.基本如上文所述的、尤其地，參考前述實施例的放射性標記的配體、化合物、方法、過程、應用和組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及氚化的生長激素促分泌素，可將其用于鑒定能夠與生長激素促分泌素受體結(jié)合的化合物，或具有如生長激素促分泌素的活性的化合物。
文檔編號A61K51/04GK1812815SQ200480018079
公開日2006年8月2日 申請日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月25日
發(fā)明者科妮莉亞·赫特爾, 菲利普·烏格寧, 桑納何·詹森－索夫曼, J-M·普蘭凱爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司